CN110551648A

CN110551648A - 发酵木糖生产琥珀酸的谷氨酸棒杆菌及用途

Info

Publication number: CN110551648A
Application number: CN201810541718.XA
Authority: CN
Inventors: 王智文; 孙曦; 毛雨丰; 陈聪; 陈涛
Original assignee: Tianjin University
Current assignee: Tianjin University
Priority date: 2018-05-30
Filing date: 2018-05-30
Publication date: 2019-12-10
Anticipated expiration: 2038-05-30
Also published as: CN110551648B

Abstract

本发明公开了发酵木糖生产琥珀酸的谷氨酸棒杆菌及用途，发酵木糖生产琥珀酸的谷氨酸棒杆菌，其分类命名为谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)Cev‑18‑5，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCC No.15040。本发明的发酵木糖生产琥珀酸的谷氨酸棒杆菌CGMCC No.15040能够在以木糖为唯一碳源的基本盐培养基快速生长，高效利用木糖，无需借助质粒或者诱导剂的使用。且厌氧条件下的琥珀酸产率也有明显提升，是良好的利用木质纤维素基生物质进行琥珀酸生产的平台菌株。

Description

发酵木糖生产琥珀酸的谷氨酸棒杆菌及用途

技术领域

本发明属于生物工程技术与应用领域，具体地涉及一种发酵木糖生产琥珀酸的谷氨酸棒杆菌菌株及用途。

背景技术

木质纤维素作为自然界广泛存在的可再生生物质资源，具有广阔的应用前景。而木糖是木质纤维素水解液中含量第二位的糖类，仅次于葡萄糖。因此有效地利用木糖是如何更好地高效地利用木质纤维素的关键因素之一。但目前已知的微生物中仅有少数具有很好的利用木糖的能力，包括谷氨酸棒杆菌在内的众多重要工业微生物都不具有良好的木糖利用能力，甚至完全无法利用木糖。

谷氨酸棒杆菌可以利用广谱的糖类，比如己糖和二糖，但是不能利用某些戊糖。谷氨酸棒杆菌不能利用木糖，其木糖代谢途径不完整。对于谷氨酸棒杆菌利用木糖的改造，可将木糖异构酶基因与木酮糖激酶基因克隆于多拷贝载体，但同时会存在葡萄糖阻遏现象。

而进化工程手段被广泛地用于底物利用改善等方面，通过微生物自身的进化突变，更直接地获得具有优良生长性状的菌株。但进化过程具有不确定性，伴随着有利突变产生的同时，一些无关的突变也可能产生，这些突变会造成菌株的基因组背景不明确，影响后续的基因工程操作，而有些突变甚至可能对菌株的某些特性产生负面的效果，限制了菌株今后的应用前景。因此无论通过基因工程手段还是进化工程方法改良菌株都具有明显的不足之处。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种发酵木糖生产琥珀酸的谷氨酸棒杆菌。

本发明的第二个目的是提供一种发酵木糖生产琥珀酸的谷氨酸棒杆菌的用途。

本发明的技术方案概述如下：

发酵木糖生产琥珀酸的谷氨酸棒杆菌，其分类命名为谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)Cev-18-5，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号 CGMCC No.15040。

上述发酵木糖生产琥珀酸的谷氨酸棒杆菌发酵木糖生产琥珀酸的用途。

有益效果

本发明的发酵木糖生产琥珀酸的谷氨酸棒杆菌CGMCC No.15040能够在以木糖为唯一碳源的基本盐培养基快速生长，高效利用木糖，无需借助质粒或者诱导剂的使用。且厌氧条件下的琥珀酸产率也有明显提升，是良好的利用木质纤维素基生物质进行琥珀酸生产的平台菌株。

附图说明

图1为pD-in-pta-ackA整合载体的图谱。

图2为pD-in-pta-ackA-BSXR整合载体图谱。

图3为好氧条件下菌株CGL11和Cev-18-5的生长曲线。

图4为好氧条件下菌株CGL11和Cev-18-5的木糖消耗曲线。

图5为菌株CGL11和Cev-18-5在厌氧条下分批摇瓶发酵结果示意图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步说明，下述实施例是为了使本领域的技术人员能够更好地理解本发明，但对本发明不作任何限制。

本发明所用到的原始菌株谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)ATCC13032来源为ATCC(The Global Bioresource Center，http://www.atcc.org/)，购买于2012年10月；

原始菌枯草芽孢杆菌B.subtilis 168来源为BGSC(Bacillus Genetic StockCenter， http://www.bgsc.org/)，购买于2015年10月；

原始菌株野油菜黄单胞菌Xanthomonascampestrispv.campestris8004来源为BNCC(BeNa Culture collection,www.bncc.org.cn)。购买于2015年10月；

所用木糖，琥珀酸标准品从sigma公司(http://www.sigmaaldrich.com/sigma-aldrich)购买。

所用限制性内切酶、去磷酸化酶、DNA连接酶等分子生物学试剂从thermo公司购买(http://www.thermoscientificbio.com/fermentas)，所用其他生化试剂从生工生物工程(上海) 股份有限公司购买(http://www.sangon.com/)。

木糖的利用是木质纤维素基生物质利用的关键之一，而当前针对菌株进行木糖利用改造的工作多借助于质粒和诱导剂的参与，本工作的所有基因操作均为染色体无痕操作，菌株的遗产稳定性较好。在此基础上进一步借助进化工程手段，有效地提高了菌株对木糖的利用能力，是进一步利用木质纤维素基生物质进行琥珀酸生产的良好的平台菌株。

本发明的发酵木糖生产琥珀酸的谷氨酸棒杆菌，其分类命名为谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)Cev-18-5，于2017年12月8日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCC No.15040，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编100101。

实施例1

谷氨酸棒杆重组菌CGL8的构建

(1)本发明中所涉及谷氨酸棒杆菌无痕操作技术与工具载体pD-sacB的构建以及在谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)ATCC 13032中敲除

副产物乙酸生成途径pta-ackA基因操纵子、副产物乙酸生成途径actA基因与副产物乳酸生产途径ldh基因、染色体上回补途径磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶ppc基因的起始密码子前插入P_sod强启动子、染色体上回补途径丙酮酸羧化酶pyc基因的起始密码子前插入P_sod强启动子、染色体上的磷酸戊糖途径转酮醛酶tkt基因的起始密码子前插入P_sod强启动子、染色体上的磷酸戊糖途径转酮醇酶tal基因的起始密码子前插入P_sod强启动子、染色体上乳酸脱氢酶ldh 位点插入P_tuf强启动子过表达的阿拉伯糖转运蛋白基因araE，构建了重组的谷氨酸棒杆菌CGL8。

改造的具体操作方法与所用引物等已在专利《利用秸秆水解液高产琥珀酸的谷氨酸棒杆菌及构建及应用》(申请公布号：CN107012161A)中进行了详尽的说明阐释。

(2)染色体上乙酸生成途径pta-ackA基因操纵子位点插入P_sod强启动子(SEQ IDNO.1) 过表达的木糖利用操纵子基因xylAB的具体操作如下：

以公开专利CN107012161A实施例2中所得到的敲除载体pD-pta-ackA为模板，以pD-in-pta-ack-1(SEQ ID NO.2)/pD-in-pta-ack-2(SEQ ID NO.3)为引物，使用KOD-Plus-Neo 高保真DNA聚合酶进行PCR扩增得到引入酶切位点的片段pD-12(6177bp)，将该PCR片段进行切胶纯化回收后，将纯化后的pD-12片段用EcoRV单酶切，另外还需添加DpnI消化模板质粒骨架，且不需要进行去磷酸化处理，经连接、转化后得到整合载体pD-in-pta-ackA(见图1),测序检测无误。

以C.glutamicum ATCC 13032为模板，使用引物BSXR-1(SEQ ID NO.4)/BSXR-2(SEQ ID NO.5)进行PCR扩增，得到片段BSXR-12；以公开专利CN107012161A实施例6中所得到的表达载体pX-xylAB为模板，使用引物BSXR-3(SEQ ID NO.6)/BSXR-4(SEQ ID NO.7) 进行PCR扩增，得到片段BSXR-34。分别将2个片段切胶纯化回收后，以等摩尔比例的片段作为模板，用BSXR-1和BSXR-4作为引物，扩增得到两个片段的融合产物(3.5kb)。然后将片段和pD-in-pta-ackA质粒使用Thermo Fast digest NdeI/AflII双酶切，经连接、转化后得到染色体上pta-ackA位点插入P_sod强启动子过表达的木糖利用操纵子基因xylAB的整合载体pD-in-pta-ackA-BSXR(见图2),测序检测无误。将测序结果正确的质粒通过电转导入谷氨酸棒杆菌CGL8中，按照公开专利CN107012161A中所述无痕操作方法，得到染色体上乙酸生成途径pta-ackA基因操纵子位点插入P_sod强启动子(SEQ ID NO.1)过表达的木糖利用操纵子基因xylAB的谷氨酸棒杆菌CGL11。

本发明中的菌株代号如CGL8、CGL11等是为了方便描述，但不应理解为对本发明的限定。

表1菌株构建所用引物序列

实施例2：基于重组菌株CGL11进行以木糖为唯一碳源的实验室适应性进化

通过将谷氨酸棒杆菌CGL11在以木糖为唯一碳源的基本盐培养基CGXII中连续传代培养，提高谷氨酸棒杆菌利用木糖生长的能力。

具体操作如下：-80℃保藏的CGL11菌株，在30℃，220rpm下，利用试管BHI培养基活化过夜，在含有10g L^-1葡萄糖的CGIII培养基(装液量50mL/500mL三角瓶)培养12h。4℃，5000rpm离心收集菌体并用CGXII洗菌体两次。将悬浮的菌体转接至含有20g L^-1木糖、 1gL^-1酵母抽提物的CGXII培养基中(装液量25mL/250mL三角瓶)，使初始OD₆₀₀为1。监控12h、24h的OD₆₀₀，每隔24h转接至新鲜的含有20g L^-1木糖的CGXII培养基中，并通过调节接种量保证初始OD₆₀₀为1，每次转接前均保存菌种。转接第18次后发现12h菌体生长量(OD₆₀₀)由初次转接时的5.84提高到了15.34，提高了280％。将第18次转接得到的菌群命名为Cev-18。从中筛选得到具有高效利用木糖能力的进化菌株Cev-18-5。

将其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心进行保藏，菌种保藏号为： CGMCC No.15040。

CGIII的配方为：胰蛋白胨(tryptone)10g L^-1，酵母抽提物(yeast extract)10gL^-1，NaCl 2.5g L^-1，调至pH 7.0，115℃高压蒸汽灭菌30min。

CGXII的配方为：(NH₄)₂SO₄(20g L^-1)，urea(5g L^-1),KH₂PO₄(1g L^-1)，K₂HPO₄(1g L^-1), MgSO₄·7H₂O(0.25g L^-1)，CaCl₂(10mg L^-1)，biotin(0.4mg L^-1)，MOPS(21g L^-1)(pH7.0)。

BHI的配方为：脑心浸粉(BHI)74g L^-1，115℃高压蒸汽灭菌30min。

实施例3：好氧条件下以木糖为唯一碳源的生长曲线

活化出发菌株CGL11、Cev-18-5分别至5mL BHI试管220rpm，30℃过夜活化，按500μL的接种量转接到含20g L^-1葡萄糖的CGIII培养基，220rpm、30℃培养12h。4℃、5000rpm 离心收集菌体并使用CGXII洗菌体两次，转接至含有20g L^-1木糖的CGXII培养基中(装液量50mL/500mL三角瓶)，前12h每隔2h取样测OD₆₀₀，生长曲线如图3所示。12000rpm、 5min离心取上清存样。与出发菌株CGL11最大比生长速率0.15h^-1相比，进化菌株Cev-18-5 的最大比生长速率为0.39h^-1，相较出发菌株提高了160％。菌株的木糖消耗速率如图4所示，出发菌株CGL11的20h(糖未完全耗尽处)的平均糖耗速率为0.13g L^-1h^-1，Cev-18-5的平均糖耗速率为0.97g L^-1h^-1，比出发菌株提高了646％。

实施例4：利用构建的菌株进行两阶段分批摇瓶厌氧发酵

琥珀酸发酵采用两阶段操作法:

第一阶段，取菌株CGL11、Cev-18-5的-80℃保藏的对数期种子培养液于冰上融化后分别全部接入装有50mL CGIII液体培养基的500mL锥形瓶中。30℃，220rpm过夜培养，按照 10％接种量转接至装有400ml CGXII种子培养基的1000ml锥形瓶,30℃，220rpm振荡培养至后对数期，此时OD₆₀₀约等于20。

第二阶段，把CGXII培养液无菌转入到预冷的400mL离心管中，4℃，5000g离心15分钟。用4℃预冷的CGXII培养基冲洗回收的菌体一次，再用3ml预冷的CGXII培养基重新悬浮菌体，然后将菌体离心转入到50ml小型厌氧血清瓶(发酵装液量25ml),添加200mMNaHCO₃提供羧化反应所需要的CO₂，30℃，220rpm进行厌氧阶段发酵。发酵初始OD₆₀₀约等于30，发酵的初始木糖浓度约为30g L^-1。

发酵结果如图5所示。比较12h处不同菌株的木糖消耗速率，Cev-18-5木糖消耗速率为 2.15g L^-1h^-1比出发菌株(1.39g L^-1h^-1)提高了54.6％。琥珀酸生产速率与木糖消耗速率展现出正相关性，出发菌株的琥珀酸生产速率为0.79g L^-1h^-1，Cev-18-5为1.65g L^-1h^-1，相较于进化菌株提高了108％。两株菌株的琥珀酸得率基本持平。

从发酵结果可以看出，本发明所得的高效利用木糖的进化菌株Cev-18-5在厌氧阶段的木糖利用能力有了很大的提高。琥珀酸产率有了明显的改善，具有很好的应用前景。

SEQ ID NO.1：

TAGCTGCCAATTATTCCGGGCTTGTGACCCGCTACCCGATAAATAGGTCGGCTGAAAAATTTCGTTGCAATATCAACAAAAAGGCCTATCATTGGGAGGTGTCGCACCAAGTACTTTTGCGAAGCGCCATCTGACGGATTTTCAAAAGATGTATATGCTCGGTGCGGAAACCTAC GAAAGGATTTTTTACCC。

序列表

<110> 天津大学

<120> 发酵木糖生产琥珀酸的谷氨酸棒杆菌及用途

<160> 7

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 192

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

tagctgccaa ttattccggg cttgtgaccc gctacccgat aaataggtcg gctgaaaaat 60

ttcgttgcaa tatcaacaaa aaggcctatc attgggaggt gtcgcaccaa gtacttttgc 120

gaagcgccat ctgacggatt ttcaaaagat gtatatgctc ggtgcggaaa cctacgaaag 180

gattttttac cc 192

<210> 2

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atcggatatc ctcgagctta agcctgcagg tgatttccac cgatgcctcc 50

<210> 3

<211> 54

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atcggatatc cctaggcata tgatgcatac tagtgaatcc atcgaagctg cggt 54

<210> 4

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

cgtcgctcga gcatatgtag ctgccaatta ttccggg 37

<210> 5

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

cgatgaaaac ggtgttgctc atgggtaaaa aatcctttcg tagg 44

<210> 6

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ctacgaaagg attttttacc catgagcaac accgttttca tcggcg 46

<210> 7

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

agtccttaag gtcgacagag tttgtagaaa cgcaaaaag 39

Claims

1.发酵木糖生产琥珀酸的谷氨酸棒杆菌，其分类命名为谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)Cev-18-5，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCC No.15040。

2.权利要求1所述菌株发酵木糖生产琥珀酸的用途。