CN111607601A - 谷氨酸棒杆菌转录调控因子IpsA突变体及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了谷氨酸棒杆菌转录调控因子IpsA突变体及应用，谷氨酸棒杆菌转录调控因子IpsA突变体，编码所述IpsA突变体的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。本发明的谷氨酸棒杆菌转录调控因子突变ipsA(C331T)，与木糖利用操纵子基因的单碱基突变和阿拉伯糖转运蛋白基因的缺失突变有组合效应，能够提高谷氨酸棒杆菌木糖利用能力，及葡萄糖木糖的混糖利用能力。

Description

谷氨酸棒杆菌转录调控因子IpsA突变体及应用

技术领域

本发明属于生物工程技术与应用领域，具体地涉及一种谷氨酸棒杆菌转录调控因子IpsA突变体及应用。

背景技术

碳分解代谢物阻遏效应(Carbon Catabolite Repression,CCR)^[1]，是细菌和真菌中常见的一种全局调控现象，即细胞首先利用更易于分解的底物，而此底物的分解对其它底物存在遏制作用。葡萄糖抑制效应是最早被发现的碳分解代谢物阻遏效应，在不同微生物中广泛存在，其抑制作用的原理在不同细菌中机制不尽相同^[2]。

谷氨酸棒杆菌是最重要的工业氨基酸生产微生物，也被广泛应用于各类化学品、生物材料及生物燃料的生物转化^[3]。谷氨酸棒杆菌利用木质纤维素水解液生产高附加值化学品是当前的研究热点。谷氨酸棒杆菌中，通过外源引入和优化戊糖代谢途径提高木糖利用效率^[4,5]，但由于谷氨酸棒杆菌中戊糖和己糖间的碳代谢阻遏效应机制不清晰^[6]，纤维素水解液中混糖共利用仍是关键问题。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种谷氨酸棒杆菌转录调控因子IpsA突变体。

本发明的第二个目的是提供一种包含编码上述谷氨酸棒杆菌转录调控因子IpsA突变体的基因的菌株。

本发明的第三个目的是提供一种包含编码上述谷氨酸棒杆菌转录调控因子IpsA突变体的基因的菌株在提高糖利用的应用。

本发明的技术方案概述如下：

谷氨酸棒杆菌转录调控因子IpsA突变体，编码所述IpsA突变体的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

包含编码上述谷氨酸棒杆菌转录调控因子IpsA突变体的基因的菌株。

上述包含编码谷氨酸棒杆菌转录调控因子IpsA突变体的基因的菌株在提高糖利用的应用。

有益效果

本发明的谷氨酸棒杆菌转录调控因子突变ipsA(C331T)，与木糖利用操纵子基因的单碱基突变和阿拉伯糖转运蛋白基因的缺失突变有组合效应，能够提高谷氨酸棒杆菌木糖利用能力，及葡萄糖木糖的混糖利用能力。

附图说明

图1为pD-RM-BSXR整合载体的图谱。

图2为pD-RM-araE整合载体的图谱。

图3为pD-RM-IpsA整合载体的图谱。

图4为CGL11、Cev2-18-5、CGL11-RM-BSXR、CGL11-RM-BE和CGL11-RM-BEI以木糖为唯一碳源下的生长曲线。

图5为CGL11(A)、Cev2-18-5(E)、CGL11-RM-BSXR(B)、CGL11-RM-BE(C)和CGL11-RM-BEI(D)共利用葡萄糖木糖的生长、糖耗情况。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步说明，下述实施例是为了使本领域的技术人员能够更好地理解本发明，但对本发明不作任何限制。

本发明所用到的原始菌株谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)ATCC13032来源为ATCC(The Global Bioresource Center，http://www.atcc.org/),购买于2012年10月。

所用限制性内切酶、去磷酸化酶、DNA连接酶等分子生物学试剂从thermo公司购买(http://www.thermoscientificbio.com/fermentas)，所用其他生化试剂从生工生物工程(上海)股份有限公司购买(http://www.sangon.com/)。

实施例1:重组菌株CGL11的构建

在谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)ATCC 13032中敲除副产物乙酸生成途径pta-ackA基因操纵子、副产物乙酸生成途径actA基因与副产物乳酸生产途径ldh基因，染色体上回补途径磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶ppc基因的起始密码子前插入P_sod强启动子、染色体上回补途径丙酮酸羧化酶pyc基因的起始密码子前插入P_sod强启动子、染色体上的磷酸戊糖途径转酮醛酶tkt基因的起始密码子前插入P_sod强启动子、染色体上的磷酸戊糖途径转酮醇酶tal基因的起始密码子前插入P_sod强启动子、染色体上乳酸脱氢酶ldh位点插入P_tuf强启动子过表达的阿拉伯糖转运蛋白基因araE，染色体上pta-ackA位点插入P_sod强启动子过表达的木糖利用操纵子基因xylAB，最终得到重组菌株CGL11。

改造的具体操作方法与所用引物等已在中国专利《利用秸秆水解液高产琥珀酸的谷氨酸棒杆菌及构建及应用》(申请公布号：CN107012161A)中进行了详尽的说明阐释。

实施例2:转录调控因子IpsA突变体获得及确认

中国专利《基于进化工程的木糖发酵谷氨酸棒杆菌及构建方法及应用》(申请号：CN201810541718X)中，我们得到了进化菌株Cev2-18-5(保藏编号CGMCC No.15040)，其好氧和厌氧条件下木糖消耗速率均大幅提高。对进化菌株Cev2-18-5和出发菌株CGL11进行全基因组测序。

具体操作如下：活化出发菌株CGL11、Cev2-18-5至5mLBHI试管220rpm，30℃过夜活化，按500μL的接种量转接到含20g L^-1葡萄糖的CGIII培养基(装液量50mL/500mL三角瓶)，220rpm、30℃培养12h。4℃、5000rpm离心收集菌体并使用CGXII洗菌体两次，转接至含有20gL^-1木糖的CGXII培养基中(装液量50mL/500mL三角瓶)，待菌株生长到对数中前期时，取2mL菌液4℃离心弃净上清，液氮冷冻10分钟后-80℃保存，随干冰寄送至金唯智公司进行全基因组测序。

结果显示Cev2-18-5的木糖利用操纵子基因xylAB的启动子区域的131位点发生了碱基置换突变(SEQ ID NO:14)，阿拉伯糖转运蛋白基因araE的启动子区域发生了21bp的删除突变(SEQ ID NO:15)，转录调控基因ipsA的331位发生了碱基置换突变(SEQ ID NO:1)。

以Cev2-18-5基因组为模板，以test-BSXR-A(SEQ ID NO:2)和test-BSXR-B(SEQID NO:3)、test-araE-A(SEQ ID NO:4)和test-araE-B(SEQ ID NO:5)、test-IpsA-A(SEQID NO:6)和test-IpsA-B(SEQ ID NO:7)为引物对三段突变区域进行PCR扩增，产物不经纯化即送金唯智公司进行Sanger测序，确认突变。

BHI培养基的配方为：牛脑心浸粉74g/L，溶解后定容分装，121℃高压蒸汽灭菌20min。

CGIII培养基的配方为：胰蛋白胨(tryptone)10g L^-1，酵母抽提物(yeastextract)10g L^-1，NaCl 2.5g L^-1，调至pH 7.0，115℃高压蒸汽灭菌30min。

CGXII培养基的配方为：(NH₄)₂SO₄(20g L^-1),urea(5g L^-1),KH₂PO₄(1g L^-1),K₂HPO₄(1g L^-1),MgSO₄·7H₂O(0.25g L^-1),CaCl₂(10mg L^-1)，biotin(0.4mg L^-1),MOPS(21g L^-1)(pH 7.0)。

实施例3：突变引入CGL11得到菌株CGL11-RM-BEI

将出发菌株CGL11染色体上的木糖利用操纵子基因xylAB的启动子和阿拉伯糖转运蛋白基因araE的启动子替换为突变后启动子,转录调控基因ipsA替换为突变后的转录调控基因的具体操作如下：

以进化菌株Cev2-18-5基因组为模板,以RM-BSXR-1(SEQ ID NO:8)和RM-BSXR-2(SEQ ID NO:9)为引物扩增木糖利用操纵子基因xylAB的启动子突变区域上下游共1kb片段，将该片段和pD-sacB质粒(商品)使用Thermo Fast digest BamHI/HindIII双酶切，经连接、转化后得到质粒pD-RM-BSXR(见图1)，测序检测无误。

以进化菌株Cev2-18-5基因组为模板,以RM-araE-1(SEQ ID NO:10)和RM-araE-2(SEQ ID NO:11)为引物扩增阿拉伯糖转运蛋白基因araE的启动子突变区域上下游共1kb片段，将该片段和pD-sacB质粒使用Thermo Fast digest BamHI/HindIII双酶切，经连接、转化后得到质粒pD-RM-araE(见图2)，测序检测无误。

以进化菌株Cev2-18-5基因组为模板,以RM-IpsA-1(SEQ ID NO:12)和RM-IpsA-2(SEQ ID NO:13)为引物扩增转录调控基因ipsA突变区域上下游共0.8kb片段，将该片段和pD-sacB质粒使用Thermo Fast digest BamHI/HindIII双酶切，经连接、转化后得到质粒pD-RM-IpsA(见图3)，测序检测无误。

将测序结果正确的pD-RM-BSXR质粒通过电转导入出发菌株CGL11中，按照公开专利(申请号：CN201710215458.2)中所述无痕操作方法得到染色体上木糖利用操纵子基因xylAB的启动子替换为突变后启动子的重构菌株CGL11-RM-BSXR，继续将测序结果正确的pD-RM-araE质粒通过电转导入出发菌株CGL11-RM-BSXR中，无痕操作方法得到染色体上阿拉伯糖转运蛋白基因araE的启动子突变的CGL11-RM-BE，继续将测序结果正确的pD-RM-IpsA质粒通过电转导入出发菌株CGL11-RM-BE中，无痕操作方法得到染色体上转录调控基因ipsA突变的CGL11-RM-BEI。

实施例4：谷氨酸棒杆菌转录调控因子IpsA突变体提高木糖利用效率

活化菌株CGL11、Cev2-18-5、CGL11-RM-BSXR、CGL11-RM-BE和CGL11-RM-BEI至5mLBHI试管220rpm，30℃过夜活化，按500μL的接种量转接到含20g L^-1葡萄糖的CGIII培养基(装液量50mL/500mL三角瓶)，220rpm、30℃培养12h。4℃、5000rpm离心收集菌体并使用CGXII洗菌体两次，转接至含有20g L^-1木糖的CGXII培养基中(装液量50mL/500mL三角瓶)，前12h每隔2h取样测OD₆₀₀，生长曲线如图4所示。12000rpm、5min离心取上清存样。

与出发菌株CGL11最大比生长速率0.15h^-1相比，CGL11-RM-BSXR的最大比生长速率达到了0.28h^-1，提高了86％，相较进化菌株最大比生长速率0.39h^-1，单点突变恢复了70％的性状，CGL11-RM-BE的最大比生长速率为0.36h^-1，CGL11-RM-BE的最大比生长速率为0.38h^-1，较出发菌株提高了153％，恢复了进化菌株90％以上的性状。比较菌株的木糖消耗速率，出发菌株CGL11的16h(糖未完全耗尽处)的平均糖耗速率为0.12g/L/h，进化菌株Cev2-18-5的平均糖耗速率为0.64g/L/h，反向代谢工程菌株CGL11-RM-BSXR的平均糖耗速率为0.34g/L/h，较出发菌株提高了183％，单点突变恢复了53％的性状，CGL11-RM-BE的平均糖耗速率为0.47g/L/h，CGL11-RM-BEI平均糖耗速率为0.63g/L/h，相较出发菌株提高了425％，较进化菌株恢复了98％。

实施例5：谷氨酸棒杆菌转录调控因子IpsA突变体提高混糖同时利用效率

活化菌株CGL11、Cev2-18-5、CGL11-RM-BSXR、CGL11-RM-BE和CGL11-RM-BEI至5mLBHI试管220rpm，30℃过夜活化，按500μL的接种量转接到含20g L^-1葡萄糖的CGIII培养基(装液量50mL/500mL三角瓶)，220rpm、30℃培养12h。4℃、5000rpm离心收集菌体并使用CGXII培养基洗菌体两次，转接至含有10g L^-1木糖和10g L^-1葡萄糖的CGXII培养基中(装液量50mL/500mL三角瓶)，前12h每隔2h取样测OD₆₀₀，12000rpm、5min离心取上清存样。

菌株在混糖中的生长能力相差不大。混糖消耗能力相差较大(图5)，以12h时的糖耗速率比较：出发菌株几乎不能同时利用葡萄糖和木糖，总糖耗速率为0.77g/L/h，进化菌株能够同时利用葡萄糖和木糖，葡萄糖消耗速率为0.53g/L/h，木糖消耗速率为0.25g/L/h，总糖耗速率为0.78g/L/h，与出发菌株相似。重构菌株中CGL11-RM-BSXR的混糖共利用情况没有明显提高，而同时引入BSXR和araE两个突变的CGL11-RM-BE开始出现了木糖葡萄糖同时利用的情况，但葡萄糖消耗速率下降至0.38g/L/h，木糖消耗速率为0.21g/L/h，总糖速率下降至0.59g/L/h。引入转录调控基因IpsA突变的CGL11-RM-BEI葡萄糖木糖共利用能力进一步增强，葡萄糖消耗速率恢复至0.51g/L/h，木糖消耗速率进一步提升至0.26g/L/h，总糖速率达到0.78g/L/h。

参考文献：

1.Stülke,J.and W.Hillen,Carbon catabolite repression inbacteria.Current Opinion in Microbiology,1999,2(2):195-201.

2.Gorke,B.and J.Stulke,Carbon catabolite repression in bacteria:manyways to make the most out of nutrients.Nature Reviews:Microbiology,2008,6(8):613-24.

3.Lee,J.Y.,Y.A.Na,et al.,The Actinobacterium Corynebacteriumglutamicum,an Industrial Workhorse.J MicrobiolBiotechnol,2016,26(5):807-22.

4.Chen,Z.,J.Huang,et al.,Metabolic engineering of Corynebacteriumglutamicum for the production of 3-hydroxypropionic acid from glucose andxylose.Metabolic Engineering,2017,39:151-158.

5.Sasaki,M.,T.Jojima,et al.,Engineering of pentose transport inCorynebacterium glutamicum to improve simultaneous utilization of mixedsugars.Applied Microbiology and Biotechnology,2009,85(1):105-15.

6.Moon,M.W.,S.Y.Park,et al.,The phosphotransferase system ofCorynebacterium glutamicum:features of sugar transport and carbonregulation.Journal of Molecular Microbiology and Biotechnology,2007,12(1-2):43-50.

序列表

<110> 天津大学

<120> 谷氨酸棒杆菌转录调控因子IpsA突变体及应用

<160> 15

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1083

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atgattatgg gtaggaaaca acaatacgga accctcgcgt ccatcgccgc gaaactaggt 60

atctcaagga ccacagtgtc caacgcctac aaccggccgg agcaactctc cgcagaactt 120

cgccaacgca tcctcgacac cgctgaagat atgggctatc tcggccctga tccggtggcc 180

cgcagccttc gtacacgcag agcaggcgca atcggagtgc tgcttactga ggacctcact 240

tatgccttcg aagatatggc ctccgtggac tttcttgccg gggtggctca agctgctgga 300

gacacccaac taacgctgat tcctgcctcg tccgcgagca gcgttgacca tgtctcggct 360

caacaattag tcaacaacgc tgcagttgac ggagtggtta tttactccgt tgccaagggt 420

gatccacaca tcgatgccat ccgtgcccgt ggtttgcccg cagtcatcgc cgaccagcct 480

gcacgcgaag aaggcatgcc gtttattgcc ccaaataacc gcaaagccat cgcccctgca 540

gctcaagcgc taatcgacgc cggccaccgc aaaatcggca tcctgtccat ccgcctagac 600

cgcgcaaaca acgacggcga agtcacccgc gagcgcctcg aaaacgccca ataccaggta 660

caacgcgacc gagtcagggg tgccatggaa gtctttatcg aagcgggaat cgatcccggc 720

accgtgccga tcatggaatg ctggatcaac aaccgccaac acaacttcga agtggccaaa 780

gaacttctag aaacacaccc agacctcacc gcagtactct gtaccgtcga tgcactggca 840

ttcggcgttc tggaatacct taaaagcgta ggtaaatcag cgcctgcaga tctatccctc 900

actggtttcg atggcaccca catggcactc gcacgggatc tcaccaccgt catccaaccc 960

aacaaactca aagggttcaa agccggcgaa acactgttga aaatgattga caaagaatac 1020

gtggaaccag aagtggaatt ggaaacttcc ttccacccag gttccacggt tgcgccaatc 1080

tag 1083

<210> 2

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ttccacttgt agattcgact cctat 25

<210> 3

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gattctgggg gagttacttt tggg 24

<210> 4

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

cttcggtcca aaattcttct gcccaatcag cc 32

<210> 5

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

cagttgatgc gagctagatt catgccg 27

<210> 6

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

gcggaaggct cgaaggaatg agggtc 26

<210> 7

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

ggtagctcgc ctcgccaaga tt 22

<210> 8

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

gaccgtcgga tcctaatggg gggtgaagag ctgtaaagta cc 42

<210> 9

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

tggttaagct ttagcgcggg tgcgagaaca ggttggcggt 40

<210> 10

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

gacattcgga tccccggaac tagctctgca atgac 35

<210> 11

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

ctggaaagct tgtaaagagc tgatataacg aagataaact tccgc 45

<210> 12

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

taccgggatc cccatcgccg cgaaactagg tatctcaagg ac 42

<210> 13

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

cggttaagct taacgccgaa tgccagtgca tcgacggtac 40

<210> 14

<211> 192

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

tagctgccaa ttattccggg cttgtgaccc gctacccgat aaataggtcg gctgaaaaat 60

ttcgttgcaa tatcaacaaa aaggcctatc attgggaggt gtcgcaccaa gtacttttgc 120

gaagcgccat ctgacggatt ttcaaaagat gtatatgctc ggtgcggaaa cctacgaaag 180

gattttttac cc 192

<210> 15

<211> 185

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

gccgttaccc tgcgaatgtc cacagggtag ctggtagttt gaaaatcaac gccgttgccc 60

ttaggattca gtaactggca cattttgtaa tgcgctagat ctgtgtgctc agtcttccag 120

gctgcttatc acagtgaaag caaaaccaat tcgtggctgc gaaagtcgta gccaccacga 180

agtcc 185

Claims (3)

1.谷氨酸棒杆菌转录调控因子IpsA突变体，其特征是编码所述IpsA突变体的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

2.包含编码权利要求1所述谷氨酸棒杆菌转录调控因子IpsA突变体的基因的菌株。

3.权利要求2的菌株的应用。

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