WO2009154122A1 - Ｄ－キシロース利用機能が向上したコリネ型細菌形質転換体 - Google Patents

Ｄ－キシロース利用機能が向上したコリネ型細菌形質転換体 Download PDF

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WO2009154122A1
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corynebacterium glutamicum
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湯川　英明
乾　将行
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財団法人地球環境産業技術研究機構
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Definitions

  • the present invention relates to D-xylose utilization technology. More specifically, the present invention relates to a coryneform bacterium transformant that has been subjected to a specific genetic manipulation in order to improve D-xylose utilization function, and a technique for producing a highly efficient organic compound thereby.
  • Cellulosic biomass is useful as a raw material for producing various organic acid compounds, ethanol, and the like by biological methods.
  • Cellulosic biomass unlike sugar-based biomass such as corn starch and sugar, can be obtained in a wide variety of inexpensive forms such as agricultural waste or wooden waste, and will be an obstacle to securing food resources in the future. This is because it is a raw material species that must not be released.
  • Cellulosic biomass consists of approximately 35% to 45% cellulose, 30% to 40% hemicellulose, 10% lignin and 10% other components by weight.
  • Cellulose is a polymer of glucose (hexose).
  • pentoses such as xylose and arabinose are main components.
  • D-xylose accounts for the majority of hemicelluloses of cellulosic biomass such as corn stover, wheat straw, rice straw, and bagasse. Therefore, in order to effectively use cellulosic biomass, it is indispensable to establish a highly efficient technique for using D-xylose by a biological method.
  • Saccharomyces cerevisiae which cannot use D-xylose in the wild type, is derived from Pichia stipitis, xylose reductase gene and xylitol dehydrogenase gene, and Saccharomyces cerevisiae.
  • a technique for imparting D-xylose utilization function by introducing three genes of the xylulokinase gene by plasmid and a technique for utilizing D-xylose by the resulting transformant Saccharomyces cerevisiae are disclosed.
  • Non-Patent Document 2 as a technique using Saccharomyces cerevisiae, in addition to expressing the xylose isomerase gene derived from the mold Piromyces sp., Xylulokinase gene derived from Saccharomyces cerevisiae, Ribulose 5- A transformant, Saccharomyces cerevisiae, in which the aldose reductase gene is highly expressed and highly expressing the phosphate isomerase gene, ribulose ⁇ ⁇ 5-phosphate emiperase gene, transketolase gene, and transaldolase gene, was prepared, and further, Anaerobic xylose-restricted chemostat (anaerobic, ylxylose-limitedmostchimostat), followed by anaerobic automated continuous-batch culture (anaerobic automated sequencing-batch reactor) Thus, a technique for isolating a mutant strain with improved D-xylose uptake and utilization rate and
  • Patent Document 2 Zymomonas mobilis that cannot use D-xylose in the wild type, Escherichia coli-derived xylose isomerase gene, xylulokinase gene, transketolase gene, and transaldolase gene
  • a technique using D-xylose using a transformant Zymomonas mobilis obtained by introducing and expressing the above four genes by a plasmid is disclosed.
  • Patent Document 3 is obtained by introducing and expressing four genes, a xylose isomerase gene derived from Escherichia coli, a xylulokinase gene, a transketolase gene, and a transaldolase gene, in Zymomonas mobilis.
  • a technique for utilizing D-xylose by a transformant Zymomonas mobilis in which the introduced gene is more stable is disclosed.
  • pentose simultaneous utilization to hexose has been achieved to some extent, the consumption rate (utilization rate) of D-xylose is insufficient compared with the consumption rate of D-glucose, and it is practically used. Further improvement is required as a technique for simultaneous use of hexose and pentose in a typical sense.
  • Non-patent document 3 and non-patent document 4 indicate that a microorganism having the simultaneous utilization of D-glucose and D-xylose can be obtained by destroying the ptsG (glucose phosphotransferase system (PTS) transport) gene involved in glucose uptake.
  • PTS glucose phosphotransferase system
  • Corynebacterium glutamicum and its recombinant strains can produce organic compounds without growth in the bioconversion reaction from sugars to organic compounds such as organic acids under reducing conditions. It is a microorganism useful for effective use (Patent Document 4).
  • Patent Document 4 since a reactor volume for growth is not required, a compact reactor design is possible.
  • the present inventors introduced a pyruvate ⁇ ⁇ decarboxylase gene and an alcohol dehydrogenase gene derived from Zymomonas mobilis into Corynebacterium glutamicum, and ethanol is produced with high efficiency by the transformant expressing the transgene. The technology is disclosed (Non-Patent Document 5).
  • Non-Patent Document 7 discloses a technique for imparting the availability of D-xylose by introducing and expressing xylose isomerase gene and xylulokinase gene derived from Escherichia coli in Corynebacterium glutamicum.
  • Corynebacterium glutamicum R (FERM P-18976) strain that does not have L-arabinose utilization ability is added to Escherichia coli-derived arabinose isomerase gene, librokinase gene, and ribulose.
  • a Corynebacterium glutamicum ATCC31831-derived proton symporter gene derived from Corynebacterium glutamicum ATCC31831 is further introduced into the Corynebacterium glutamicum transformant expressed by introducing the -5-phosphate 4-epimerase gene.
  • the new transformant thus created can greatly improve the rate of L-arabinose utilization, and completely inhibits glucose inhibition against L-arabinose utilization in the presence of both D-glucose and L-arabinose sugars. It is released and D-glucose and L-arabinose can be used at the same time. However, as described above, glucose suppression on D-xylose utilization in the presence of both D-glucose and D-xylose is completely released, and D-xylose and D-glucose are efficiently used in parallel and simultaneously. A corynebacterium transformant that can be produced has not yet been developed.
  • An object of the present invention is to provide a recombinant microorganism having an improved function of utilizing D-xylose necessary for effective utilization of cellulosic biomass resources, and a method for producing an organic compound using the microorganism.
  • the present inventor has conducted research, and a transformation created by introducing a specific foreign gene into a coryneform bacterium, that is, a foreign gene encoding a protein having a sugar transporter function. It was found that the body efficiently produces organic compounds from D-xylose.
  • the coryneform bacterium transformant can use “D-xylose and D-glucose (or D-glucose, D-xylose and L-arabinose) in parallel and simultaneously” or “ “With simultaneous use (ability)” means that the transformant is used in a medium containing a mixed sugar of D-xylose and D-glucose (or D-glucose, D-xylose and L-arabinose) as a carbon source. This means that when the organic compound is produced, the transformant can use these carbon sources in parallel and at the same rate of consumption.
  • the present invention has been completed based on the above findings, and provides the following methods for producing microorganisms and organic compounds. Since the recombinant microorganism of the present invention has an excellent simultaneous use performance of D-glucose and D-xylose, it provides a technology for easy production process design and operation of useful organic compounds from cellulosic biomass raw materials. It will be a technology that leads to doing.
  • a coryneform bacterial transformant wherein an exogenous gene encoding a protein having a sugar transporter function is introduced into a coryneform bacterium having D-xylose utilization ability.
  • DNA comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 13, or DNA comprising a base sequence complementary to the base sequence represented by SEQ ID NO: 13 and a string
  • the coryneform bacterium transformant according to (1) or (2) above which uses a DNA that encodes a polypeptide that hybridizes under a gentle condition and has a sugar transporter function.
  • Corynebacterium glutamicum R (FERM P-18976), cellobiose-utilizing recombinant strain or mutant strain FERM P-18979, FERM P- 18977 and FERM P-18978, succinic acid-producing recombinant strains FERM P-19446 and FERM P-19477, and ethanol-producing recombinant strains FERM P-17887, FERM P-17888, FERM P-19361 and FERM P (1) to (3) above, which is a coryneform bacterium of any one strain selected from the group consisting of -19362 and is provided with the ability to use D-xylose The coryneform bacterium transformant according to any one of the above.
  • coryneform bacterium transformant according to any one of (1) to (5), wherein D-glucose and D-xylose can be used in parallel and simultaneously.
  • coryneform bacterium transformant (9) The coryneform bacterium transformant according to (1) above, wherein the coryneform bacterium transformant is Corynebacterium glutamicum X5-Ind-araE / Plac-araBAD (Accession No. NITE BP-577). . (10) The coryneform bacterium transformant according to (1) above, wherein the coryneform bacterium transformant is Corynebacterium glutamicum X5-Ind-araE- ⁇ ldh / pEthAra (Accession No. NITE BP-581). .
  • D-xylose According to the present invention, efficient use of D-xylose becomes possible, and D-glucose and D-xylose can be used simultaneously in parallel and at the same rate of use. Effective use for various organic compounds can be realized by an efficient rational process.
  • FIG. 1 is a schematic diagram showing the vector pCRA811 prepared in Example 1 (1).
  • FIG. 2 is a view showing an ara gene map in Corynebacterium glutamicum ATCC31831.
  • FIG. 3 is a diagram showing a method for producing the vector Ind11-araE produced in Example 1, (3).
  • FIG. 4 shows aerobic conditions under the conditions of Corynebacterium glutamicum R / pCRA811 (Fig. 4 (1)) and Corynebacterium glutamicum Ind-araE / pCRA811 (Fig. 4 (2)).
  • FIG. 3 is a graph showing changes in D-xylose consumption and growth over time during culture in a BT medium containing D-xylose as a single carbon source.
  • FIG. 1 is a schematic diagram showing the vector pCRA811 prepared in Example 1 (1).
  • FIG. 2 is a view showing an ara gene map in Corynebacterium glutamicum ATCC31831.
  • FIG. 3 is a diagram showing a
  • FIG. 5 shows the conditions under the conditions of Corynebacterium®glutamicum R / pCRA811 (FIG. 5 (1)) and Corynebacterium®glutamicum Ind-araE / pCRA811 (FIG. 5 (2)). It is a figure which shows a time-dependent change of D-xylose consumption and lactic acid production
  • FIG. 6 shows aerobic conditions under the conditions of Corynebacterium glutamicum R / pCRA811 (FIG. 6 (1)) and Corynebacterium glutamicum Ind-araE / pCRA811 (FIG. 6 (2)).
  • FIG. 6 shows aerobic conditions under the conditions of Corynebacterium glutamicum R / pCRA811 (FIG. 6 (1)) and Corynebacterium glutamicum Ind-araE / pCRA811 (FIG. 6 (2)).
  • FIG. 3 is a graph showing time-dependent changes in D-glucose and D-xylose consumption and growth during culturing in a BT medium containing D-glucose and D-xylose as carbon sources.
  • FIG. 7 shows the conditions under the conditions of Corynebacterium®glutamicum R / pCRA811 (FIG. 7 (1)) and Corynebacterium®glutamicum Ind-araE / pCRA811 (FIG. 7 (2)). It is a figure which shows the time-dependent change of D-glucose and D-xylose consumption and lactic acid production in a mixed sugar having a content ratio of D-glucose and D-xylose of 2: 1.
  • FIG. 7 shows the conditions under the conditions of Corynebacterium®glutamicum R / pCRA811 (FIG. 7 (1)) and Corynebacterium®glutamicum Ind-araE / pCRA811 (FIG. 7 (2)). It
  • FIG. 8 is a schematic diagram showing the vector Plac-araBAD prepared in Example 6, item (1).
  • FIGS. 9 (1) and (2) show Corynebacterium glutamicum X5 / Plac-araBAD (FIG. 9 (1)) and Corynebacterium amicglutamicum X5-Ind-araE / Plac-araBAD ( FIG. 9 (2)) is a graph showing changes over time in sugar consumption and production of lactic acid in a mixed sugar having a D: glucose, D-xylose and L-arabinose content ratio of 5: 2.5: 1 under reducing conditions. It is.
  • FIG. 10 is a schematic diagram showing the vector pEthAra prepared in Example 9.
  • FIG. 9 (1) and (2) show Corynebacterium glutamicum X5 / Plac-araBAD (FIG. 9 (1)) and Corynebacterium amicglutamicum X5-Ind-araE / Plac-araBAD ( FIG. 9 (2)) is a graph showing
  • 11 shows the sugar consumption and the sugar consumption in a mixed sugar with a content ratio of D-glucose, D-xylose and L-arabinose of 5: 2.5: 1 by Corynebacterium glutamicum X5-Ind-araE- ⁇ ldh / pEthAra. It is a figure which shows the time-dependent change of ethanol production.
  • the coryneform bacterial transformant of the present invention has a foreign gene encoding a protein having a sugar transporter function and has D-xylose utilization ability. It was introduced into coryneform bacteria. By introducing a foreign gene encoding a protein having a sugar transporter function into a coryneform bacterium having D-xylose utilization ability, the D-xylose utilization ability of the coryneform bacterium is remarkably improved. Therefore, the coryneform bacterium transformant can use D-glucose and D-xylose in parallel and simultaneously.
  • the coryneform bacterium having D-xylose utilization ability into which an exogenous gene encoding a protein having a sugar transporter function in the present invention is particularly limited as long as it is a coryneform bacterium imparted with D-xylose utilization ability. Is not to be done. Wild strains of coryneform bacteria cannot utilize pentoses such as D-xylose.
  • the method for imparting D-xylose utilization ability to coryneform bacteria is not particularly limited, and examples thereof include a method of introducing a D-xylose metabolism-related gene derived from another species into the coryneform bacteria.
  • Metabolism from D-xylose to D-xylulose-5-phosphate in prokaryotes and some molds is specifically: (a) xylose isomerase (hereinafter referred to as “catalyst”) that catalyzes the reaction from D-xylose to D-xylulose. (B) the xylulokinase that catalyzes the reaction from D-xylulose to D-xylulose-5-phosphate (hereinafter referred to as “XylB”, the gene It is carried out by a two-step reaction catalyzed by two enzymes (also referred to as “xylB”). In the present invention, the metabolic system can be used.
  • xylose-kinase isomerase gene derived from Escherichia coli (xylA) and a xylulokinase gene (xylB) as D-xylose metabolism-related genes in coryneform bacteria.
  • xylA xylose-kinase isomerase gene
  • xylB xylulokinase gene
  • a coryneform bacterium to which D-xylose utilization ability produced by such a technique is imparted can be used.
  • a transformant into which a gene derived from a species other than the above Escherichia coli is introduced may be used as a method for imparting D-xylose utilization ability.
  • genes encoding the D-xylose metabolism-related enzymes of (a) and (b) above may be present on the same locus, or these two genes may be present on different loci. May be.
  • An example in which two genes are present on the same locus is, for example, an operon formed by linking the genes (a) and (b) above.
  • the genes (a) and (b) are usually held in microorganisms having the ability to metabolize D-xylose.
  • Examples of the genes (a) and (b) in the present invention include Escherichia coli, Corynebacterium glutamicum (only xylB gene), Bacillus subtilis, Salmonella typhimurium (Salmonella). It is preferable to use an xylA gene derived from the same or different microorganism selected from the group consisting of typhimurium, Bacillus halodurans, Sinorhizobium meliloti, and Agrobacterium tumefaciens, and xylB gene. . Among these, in the present invention, the use of the xylA gene and xylB gene derived from Escherichia coli is most preferable.
  • a DNA fragment synthesized according to the sequence can be used as the gene encoding the D-xylose metabolism-related enzyme. Even when the DNA sequence is unknown, it is possible to obtain a fragment by a hybridization method or a PCR method based on an amino acid sequence conserved between D-xylose metabolism-related enzyme proteins. Furthermore, fragments can be obtained by degenerate PCR using mixed primers designed based on other known D-xylose metabolism-related gene sequences.
  • a gene encoding a D-xylose metabolism-related enzyme may have a part of its base sequence replaced with another base as long as the D-xylose metabolism activity of the polypeptide encoded by the gene is retained.
  • the base sequence may be deleted, a base may be newly inserted, and a part of the base sequence may be rearranged. Any of the derivatives of genes encoding these D-xylose metabolism-related enzymes can be used in the present invention.
  • the part of the base sequence may be, for example, 1 to several amino acids (usually 1 to 5, preferably 1 to 3, more preferably 1 to 2).
  • the base sequence of a gene encoding a D-xylose metabolism-related enzyme encodes a D-xylose metabolism-related enzyme derived from prokaryotes, that is, having the same amino acid sequence as a D-xylose metabolism-related enzyme naturally present in prokaryotes. Preferably it is.
  • the expression of prokaryotic D-xylose metabolism-related enzymes increases the likelihood that D-xylose metabolism-related enzymes will be expressed in active form in bacteria.
  • the coryneform bacterium serving as a host is not particularly limited as long as it has a metabolic conversion function of saccharides. Depending on the type of saccharide and the type of target organic compound, it may be necessary to introduce a new function such as the uptake of saccharides that are not originally possessed by coryneform bacteria, the metabolic pathway, or the conversion pathway to the target organic compound. In such a case, these functions may be imparted by a recombination technique or a mutagenesis treatment.
  • the coryneform bacterium used in the present invention is a group of microorganisms defined in Bargeys Manual Determinative Bacteriology, Vol. 8, 599 (1974), There is no particular limitation as long as it grows under aerobic conditions. Specific examples include Corynebacterium, Brevibacterium, Arthrobacter, Mycobacterium, Micrococcus, and the like.
  • Corynebacterium genus Corynebacterium glutamicum R (FERMFERP-18976), ATCC13032, ATCC13058, ATCC13059, ATCC13060, ATCC13232, ATCC13286, ATCC13287, ATCC13655, ATCC13745, ATCC13746, ATCC13761, ATCC14020, ATCC31831 etc. are mentioned.
  • Brevibacterium spp. include Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869, Brevibacterium flavum MJ-233 (FERM BP-1497) or MJ-233AB-41 (FERM BP-1498), Another example is Brevibacterium ammoniagenes ATCC6872.
  • Arthrobacter examples include Arthrobacter globiformis ATCC8010, ATCC4336, ATCC21056, ATCC31250, ATCC31738 or ATCC35698.
  • Mycobacterium examples include Mycobacterium bovis ATCC19210 or ATCC27289.
  • Micrococcus genus micrococcus freudenreichii (Micrococcus freudenreichii) NO. 239 (FERM P-13221), Micrococcus leuteus (Micrococcus leuteus) NO. 240 (FERM P-13222), Micrococcus ureae (Micrococcus ureae) IAM1010
  • Micrococcus roseus IFO3764 and the like can be mentioned.
  • the coryneform bacterium is a coryneform bacterium that can actively or passively transport D-xylose into cells.
  • the transformed coryneform bacterium has a normally functioning glycolytic pathway and a pentose phosphate pathway.
  • the coryneform bacterium to be used preferably has high resistance to ethanol; organic acids such as lactic acid, acetic acid, formic acid and the like; and glycolysis products such as furfural and hydroxymethylfurfural.
  • the coryneform bacterium used in the present invention includes Corynebacterium glutamicum R (FERM P-18976, Japanese Patent Application No. 2002-252190 (Japanese Patent Laid-Open No. 2004-089029)) or Corynebacterium glutamicum ATCC31831. Etc. are preferred.
  • coryneform bacteria are wild-type mutant strains that exist in nature (for example, cellobiose-utilizing mutant strains: FERM P-18977, FERM P-18978) (Japanese Patent Application No. 2002-252190 (Japanese Patent Application Laid-Open No. 2004-089029)).
  • artificial genetically modified strains include, for example, ethanol-producing recombinant strains such as FERM P-17887 (FERM BP-7621), FERM P-17888 (FERM BP-7622) (PCT / JP01 / 04935 (International Publication WO01). / 096573)) and J. Mol. Microbiol.
  • coryneform bacteria having the ability to use D-xylose are Corynebacterium glutamicum R (FERM P-18976), cellobiose-utilizing recombinant strains or mutant strains (FERM P-18979, FERM P -18977 and FERM P-18978), succinic acid-producing recombinant strains (FERM P-19446 and FERM P-19477), and ethanol-producing recombinant strains (FERM P-17887 (FERM BP-7621), FERM P-17888 ( FERM BP-7622) and a strain described in J. Mol. Microbiol.
  • the strain is a coryneform bacterium and is provided with the ability to use D-xylose.
  • a particularly preferred coryneform bacterium in the present invention is Corynebacterium glutamicum R (FERM P-18976) imparted with the ability to use D-xylose.
  • a foreign gene encoding a protein having a sugar transporter function (also referred to as a sugar transporter gene) is added to a coryneform bacterium having D-xylose utilization ability. Is introduced. Thereby, the D-xylose utilization ability of the coryneform bacterium transformant can be further improved.
  • the protein having a sugar transporter function may be a protein having a function of transporting hexose and pentose, but among them, an L-arabinose transport system proton symporter is preferable.
  • a gene encoding a protein having a proton symporter function of L-arabinose transport system (also referred to as a proton symporter gene of L-arabinose transport system) ) Is preferably used.
  • the proton symporter gene for the L-arabinose transport system is known and is called araE.
  • araE gene sequences and enzyme properties have been reported in the following strains and the like. Bacillus subtilis (J.JBacteriol., Vol. 179, 7705-7711 (1997)), Klebsiella oxytoca 8017 (J. Bacteriol., Vol. 177, 5379-5380 (1995)), Escherichia coli (J. Biol. Chem., Vol. 263, 8003-8010 (1988)).
  • exogenous gene encoding a protein having a sugar transporter function in the present invention examples include Corynebacterium glutamicum ATCC31831, Escherichia coli, Bacillus ⁇ subtilis, Bacillus liceniformis (Bacillus).
  • licheniformis Bacillus coagulans, Lactobacillus sakei, Pediococcus Pentiococcus pentosaceus, Lactobacillus occus heyocto ), Leuconostoc mesenteroides, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus fermentum, Lactobacillus brevis, Leuconostoc citreum, Enterococcus faecium, Klebsiella physium, Klebsiella physium An araE gene derived from a microorganism selected from the group can be used.
  • exogenous genes encoding proteins with proton symporter activity of L-arabinose transport system suitable for the present invention include Corynebacterium glutamicum ATCC31831, Escherichia coli, Bacillus subtilis, Klebsiella oxytoca, and Salmonella typhim It is preferable to use an araE gene derived from a microorganism selected from the group consisting of lithium. Further, as a proton symporter gene of L-arabinose transport system, it hybridizes under stringent conditions with a DNA sequence represented by SEQ ID NO: 13 or a DNA sequence consisting of a base sequence complementary to the DNA sequence represented by SEQ ID NO: 13.
  • a DNA encoding a polypeptide having a sugar transporter function for example, a proton symporter function of an L-arabinose transport system. That is, in the present invention, the foreign gene encoding a protein having a sugar transporter function is composed of DNA consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 13 or a base sequence complementary to the base sequence represented by SEQ ID NO: 13. It is preferable to use DNA encoding a polypeptide that hybridizes with DNA under stringent conditions and has a sugar transporter function.
  • the DNA having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 13 is a gene derived from Corynebacterium glutamicum ATCC31831 and the like, and is the nucleotide sequence of the araE gene DNA.
  • Methods for regulating the appropriate expression level of the araE gene in D-xylose-utilizing strains are well known to those skilled in the art.
  • the type, combination, order of introduction, and the like of microorganisms derived from the D-xylose metabolism-related enzyme gene and the sugar transporter gene are not particularly limited.
  • stringent conditions mean that hybridization occurs when homology of 90% or more, preferably 95% or more, more preferably 97% or more, and even more preferably 98% or more exists between sequences. Means. Usually, the hybridization occurs at a temperature about 5 to 30 ° C., preferably about 10 to 25 ° C., more preferably about 15 to 20 ° C. lower than the melting temperature (Tm) of the complete hybrid.
  • Tm melting temperature
  • Stringent conditions are described in J. Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989), especially section 11.45 “Conditions for Hybridization of Oligonucleotide Probes”. The described conditions can be used.
  • the homology between the base sequences is calculated using the calculation software GENETYX (registered trademark) Ver. It is a value calculated using 8 (manufactured by Genetics).
  • a DNA that hybridizes with a certain DNA under stringent conditions for example, a DNA that hybridizes with a DNA having a base sequence complementary to the base sequence represented by SEQ ID NO: 13 under stringent conditions, It preferably has about 90% or more sequence homology with the base sequence of SEQ ID NO: 13, more preferably about 95% or more sequence homology, and particularly preferably about 98% or more sequence homology. .
  • the coryneform bacterium transformant of the present invention preferably uses D-glucose and D-xylose in parallel and simultaneously, and uses D-glucose, D-xylose and L-arabinose in parallel and simultaneously. More preferably.
  • the coryneform bacterium transformant of the present invention can be prepared, for example, by introducing the above sugar transporter gene into a coryneform bacterium having D-xylose utilization ability and transforming it.
  • Coryneform bacterial transformants that use D-glucose, D-xylose and L-arabinose in parallel and simultaneously include, for example, the above-mentioned D-xylose metabolism-related enzyme gene and sugar transporter gene, In addition, it can be prepared by introducing a gene related to L-arabinose metabolism.
  • genes related to L-arabinose metabolism include, for example, a gene encoding Escherichia coli L-arabinose isomerase, a gene encoding L-librokinase, and L-ribulose-5-phosphate-4-epimerase. Suitable genes are suitable. There are no particular limitations on the types, combinations, and order of introduction of microorganisms derived from the D-xylose metabolism-related enzyme gene, sugar transporter gene, and L-arabinose metabolism-related gene.
  • oligonucleotide primer set is prepared.
  • examples of such a primer set include those represented by the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 14 and 15.
  • a known PCR device such as a thermal cycler can be used. The PCR cycle may be performed according to a known technique.
  • DNA isolated from a microorganism having a sugar transporter gene can be used to synthesize DNA cDNA encoding AraE by PCR.
  • the gene obtained by the PCR method can be introduced into an appropriate cloning vector.
  • Cloning methods include commercially available PCR cloning systems such as pGEM-T easy vector system (Promega), TOPO TA-cloning system (Invitrogen), Mighty Cloning Kit (Takara), etc. You can also In addition, one example of the method will be described in detail in the Examples.
  • a DNA fragment containing this region is a high fragment using a synthetic primer appropriately designed based on the base sequence of DNA encoding known AraE as a template. It can also be obtained by a hybridization method.
  • a cloning vector containing the gene obtained by the PCR method is introduced into a microorganism such as Escherichia coli JM109 strain, and the strain is transformed.
  • the transformed strain is cultured in a medium containing an appropriate antibiotic (for example, ampicillin, chloramphenicol, etc.), and the cells are recovered from the culture.
  • Plasmid DNA is extracted from the collected cells.
  • Plasmid DNA can be extracted by a known technique, or can be easily extracted using a commercially available plasmid extraction kit. Examples of commercially available plasmid extraction kits include Qiaquick Plasmid Purification Kit (trade name: Qiaquick plasmid purification kit, manufactured by Qiagen).
  • the gene sequence encoding AraE can be confirmed.
  • the base sequence of DNA can be determined by a known method such as a dioxynucleotide enzyme method.
  • the base sequence can be determined using a capillary electrophoresis system using a multi-fluorescence technique for detection.
  • the base sequence can also be determined using a DNA sequencer such as ABI PRISM 3730xl DNA Analyzer (Applied Biosystems).
  • Said method can be performed based on the conventional method of genetic engineering experiment.
  • Introduction and expression methods of vector and the foreign gene of various microorganisms because they are described in many experimental books [e.g., Molecular Cloning: A Laboratory Manual ( 3 rd Edition) CSHL Press (2001), or Current protocols in molecular biology. Green Publishing and Wiley Interscience, New York (1987), etc.], vector selection, gene introduction and expression can be performed accordingly.
  • the araE gene is expressed on the plasmid or chromosome in the aforementioned coryneform bacterium having the ability to use D-xylose.
  • these genes are introduced under expressible regulatory sequences.
  • “under the control sequence” means that these genes can be transcribed and translated by joint work with a promoter, an inducer, an operator, a ribosome binding site, a transcription terminator, and the like.
  • any plasmid vector may be used as long as it contains a gene that controls the autonomous replication function in coryneform bacteria.
  • pAM330 derived from Brevbacterium lactofermentum 2256 (Japanese Patent Laid-Open No. 58-67699, Agric. Biol. Chem., Vol. 48, 2901-2903 (1984) and Nucleic Acids Symp Ser., Vol. 16, 265-267 (1985)], Corynebacterium glutamicum ⁇ ATCC13058-derived pHM1519 [Agric. Biol. Chem., Vol. 48, 2901-2903 (1984)] and pCRY30 [Appl. Environ. Microbiol., Vol.
  • the vector contains a multiple cloning site having various restriction enzyme sites therein or a single restriction enzyme site.
  • promoters can be suitably used.
  • Such a promoter can be obtained from many known sources including yeast, bacteria, and other cell sources, and can be any nucleotide sequence that has a function of initiating transcription of a target gene in coryneform bacteria. It may be.
  • an efficient, non-glucose-repressed promoter is preferable.
  • Preferable examples of such a promoter include, for example, the lac, trc, and tac promoters known as strong constitutive promoters in coryneform bacteria.
  • the promoter used in the present invention can be modified as necessary to change its regulatory mechanism.
  • the terminator under the control sequence arranged downstream of the target gene may be any nucleotide sequence as long as it has a function of terminating transcription of the gene in coryneform bacteria.
  • the construction of the plasmid vector used to create the coryneform bacterium transformant of the present invention is, for example, when using the araE gene of Corynebacterium ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ glutamicum ATCC31831, the gene whose base sequence has been confirmed, After ligation with a control sequence such as a terminator, it can be carried out by inserting it into an appropriate restriction enzyme site of any of the plasmid vectors exemplified above. Details are described in the examples.
  • an electric pulse method electropultation method
  • an electric pulse method particularly limited as long as it is a method capable of target gene transfer into CaCl 2 method coryneform bacterium Is not to be done.
  • Specific examples thereof include, for example, a known method [Agric. Biol. Chem., Vol. 54, 443-447 (1990)] or [Res. Microbiol., Vol. 144, 181-185 (1993). )] Can be used.
  • a drug resistance gene or the like is incorporated into a plasmid containing the target gene, and the target gene introduction treatment is performed on a plate medium containing the drug at an appropriate concentration.
  • the transformed coryneform bacterium can be selected. Specific examples of the method include those described in [Agric. Biol. Chem., Vol. 54, 443-447 (1990)] or [Res. Microbiol., Vol. 144, 181-185 (1993)]. The method etc. can be mentioned.
  • Corynebacterium glutamicum Ind-araE / pCRA811 (Accession number NITE BP-576) and Corynebacterium glutamicum (Corynebacterium glutamicum) X5-Ind-araE / Plac-araBAD (Accession number: NITE BP-577) (both of which are the National Institute for Product Evaluation Technology Patent Biological Depositary Center (2-5 Kazusa Kamashika, Kisarazu City, Chiba, Japan) -8 (Postal Code 292-0818)) (Department date: May 28, 2008) and Corynebacterium glutenum X5-Ind-araE- ⁇ ldh / pEthAra (Accession Number NITE BP-581 ) (National Institute of Technology and Evaluation, Patent Biological Deposit Center (2-5-8 Kazusa Kamashi, Kisarazu City, Chiba Prefecture, Japan) 292-0818)) to deposit pre-
  • the coryneform bacterium transformant created by the present invention increases the flow rate of the pentose phosphate pathway; increases resistance to ethanol, osmotic pressure or organic acids, and by-products (target production) to improve organic compound productivity. It may further comprise a genetic modification that produces one or more of the characteristics selected from the group consisting of reduced production (understood to mean carbon-containing molecules other than products). Such genetic modification can be specifically introduced by overexpression of a foreign gene and / or inactivation of an endogenous gene; classical mutagenesis; screening and / or selection of a target mutant. .
  • the thus produced coryneform bacterium transformant of the present invention uses D-xylose as a raw material (in the case of producing a polycarboxylic acid present in the TCA pathway, further using carbonate ion or the like as a raw material), monocarboxylic acid, dicarboxylic acid, Various organic compounds such as acids, ketocarboxylic acids, hydroxycarboxylic acids, amino acids, monoalcohols, polyols and vitamins can increase the rate of saccharide metabolism or suppress a decrease in the rate of saccharide metabolism over time, while at the same time providing a high production rate. It can be produced in the reaction solution with a high accumulated concentration.
  • the culture of the coryneform bacterium transformant can be performed using a normal nutrient medium containing a carbon source, a nitrogen source, an inorganic salt, and the like.
  • a carbon source for example, glucose or waste molasses or the like as a carbon source; for example, ammonia, ammonium sulfate, ammonium chloride, ammonium nitrate or urea can be used alone or in combination of two or more as a nitrogen source.
  • the inorganic salt for example, potassium monohydrogen phosphate, potassium dihydrogen phosphate, magnesium sulfate, or the like can be used.
  • nutrients such as peptone, meat extract, yeast extract, corn steep liquor, casamino acid; various vitamins such as biotin and thiamine can be appropriately added to the medium as necessary.
  • Cultivation can be performed at a temperature of about 15 to 45 ° C., preferably about 25 to 37 ° C. under aerobic conditions such as aeration stirring or shaking.
  • the pH of the medium during culture is in the range of about 5 to 10, preferably about 6.5 to 8.5, and pH adjustment during culture can be performed by adding an acid or an alkali.
  • the carbon source concentration of the medium at the start of the culture is preferably about 1 to 20% (W / V), more preferably about 2 to 5% (W / V).
  • the culture period is usually about 1 to 7 days.
  • the method for recovering and separating the cultured cells from the culture obtained as described above is not particularly limited, and known methods such as centrifugation and membrane separation can be used.
  • the collected cultured microbial cells may be treated, and the resulting microbial cell processed product may be used in the next step.
  • the cell-treated product may be any product obtained by applying some treatment to cultured cells, and examples thereof include immobilized cells obtained by immobilizing cells with acrylamide or carrageenan.
  • a step of generating an organic compound (also referred to as an organic compound generation step) is performed using the cultured microbial cells of the coryneform bacterium transformant collected and separated from the culture obtained as described above or the processed microbial cells. .
  • Organic Compound Generation Step an organic compound is generated using the coryneform bacterium transformant in a medium (reaction medium) containing D-xylose.
  • a method for producing an organic compound including such steps is also one aspect of the present invention.
  • the reaction medium contains D-xylose as a carbon source, but can also contain D-glucose in addition to D-xylose.
  • the D-xylose or D-glucose may be D-xylose or D-glucose itself, for example, an oligomer or polymer of a carbohydrate comprising D-xylose or D-glucose units such as lignocellulose, arabinan, cellulose, starch and the like. But you can.
  • an appropriate carbohydrate degrading enzyme xylanase, glucanase, amylase, etc.
  • xylanase glucanase, amylase, etc.
  • the coryneform bacterial transformant will be Enzymes may be produced.
  • the reaction medium may contain an organic carbon source other than D-xylose and D-glucose.
  • an organic carbon source include saccharides that can be used for biochemical reactions by the coryneform bacterium transformant of the present invention.
  • the saccharide include monosaccharides such as (D- or L-) arabinose, galactose, fructose, or mannose; disaccharides such as cellobiose, sucrose, lactose, maltose; polysaccharides such as dextrin or soluble starch Is mentioned.
  • monosaccharides such as C6 sugar and C5 sugar are preferable, and L-arabinose is particularly preferable.
  • the composition of the reaction medium used for the organic compound production reaction is a component necessary for maintaining the metabolic function of the coryneform bacterium transformant or the processed product thereof, that is, a carbon source such as various sugars; Nitrogen sources necessary for synthesis; salts such as phosphorus, potassium or sodium; and trace metal salts such as iron, manganese or calcium.
  • a carbon source such as various sugars
  • Nitrogen sources necessary for synthesis nitrogen sources necessary for synthesis
  • salts such as phosphorus, potassium or sodium
  • trace metal salts such as iron, manganese or calcium.
  • These addition amounts can be appropriately determined depending on the required reaction time, the type of the target organic compound product, the type of coryneform bacterium transformant used, and the like.
  • Carbon sources, nitrogen sources, inorganic salts, vitamins, and trace metal salts may be known ones, for example, those exemplified for the growth culture step.
  • the pH of the medium is preferably about 6-8.
  • the reaction between the coryneform bacterium transformant or a treated product thereof and a carbon source containing D-xylose is performed under temperature conditions where the coryneform bacterium transformant of the present invention or the treated product thereof can act. Is preferable, and can be appropriately selected depending on the type of coryneform bacterium transformant or a treated product thereof.
  • the temperature is usually about 25-35 ° C.
  • carbon dioxide or inorganic carbonates such as various carbonates or hydrogen carbonates may be added to the reaction medium in addition to organic carbon sources such as sugars. Depending on the target organic compound, it may be effective.
  • the concentration of the carbon source in the medium is not particularly limited, but is usually used at a concentration of about 0.1 to 30% by mass, preferably about 0.5 to 20% by mass.
  • the (D-xylose / D-glucose) mixing ratio (mass ratio) of saccharides in the carbon source is usually about 1/3 to 2/3 although it depends on the saccharide-derived biomass raw material species.
  • the mixing ratio of C6 sugars and C5 sugars is usually 1/4 to 3/4. Degree.
  • the reaction medium is preferably in a reduced state. That is, the coryneform bacterium transformant or the treated product thereof is preferably subjected to a reaction for producing a target organic compound in a reaction medium in a reduced state.
  • the organic compound generation method can be any of batch, fed-batch, and continuous methods.
  • the coryneform bacterium of the present invention when an organic compound is produced using a coryneform bacterium transformant in a reaction medium in a reduced state, that is, an organic compound is produced by a biochemical reaction in a reduced state, the coryneform bacterium of the present invention
  • the growth division of the transformant is completely suppressed, and a substantial complete suppression of secreted by-products accompanying the growth can be realized.
  • the coryneform bacterium transformant recovered from the culture growth step or the treated product thereof is used in the reaction medium, the environmental state during aerobic growth inside and outside the coryneform bacterium cell is the reaction medium. It is preferred to use methods and conditions that do not result.
  • the reaction medium is substantially free from a product that is generated during the growth culture process and is present outside and inside the cells. More specifically, secreted by-products generated during the growth culture process and released to the outside of the cells, and substances generated by the aerobic metabolic function in the cultured cells and remaining in the cells are substantially contained in the reaction medium. It is preferable that it is not present in Such a state is, for example, by performing a method such as centrifugation or membrane separation using a culture solution after growth and / or leaving the cultured cells in a reduced state for about 2 to 10 hours. It is realized by doing.
  • reaction medium in a reduced state, but the reaction medium may have any shape such as solid, semi-solid, or liquid.
  • the reduced state in the present invention is defined by the redox potential of the reaction system (reaction medium), and means that the redox potential of the reaction medium is a negative ( ⁇ ) value.
  • the redox potential of the reaction medium in the reduced state is preferably about -200 mV to -500 mV, more preferably about -250 mV to -500 mV.
  • the reduction state of the reaction medium can be estimated to some extent with a resazurin indicator (decolorization from blue to colorless in the reduction state) to some extent, but to be precise, use a redox potentiometer (eg ORP Electrodes, BROADLEY JAMES) Use to measure.
  • a resazurin indicator decolorization from blue to colorless in the reduction state
  • a redox potentiometer eg ORP Electrodes, BROADLEY JAMES
  • the oxidation-reduction potential of the reaction medium is maintained at about -200 mV to -500 mV for about 50% or more of the reaction time, more preferably about 70% or more, and further preferably about 90% or more. preferable.
  • the reduction state is realized by the method for preparing cultured cells after the culture, the method for preparing the reaction medium, the method for maintaining the reduction state during the reaction, or the like.
  • a known method may be used as a method for preparing the reaction medium in a reduced state.
  • a method for preparing an aqueous solution for a reaction medium is, for example, a method for preparing a culture solution for an anaerobic microorganism such as a sulfate-reducing microorganism (The ⁇ dissimilatory sulfate-reducing bacteria, In The Prokaryotes, A Handbook on Habitats, Isolation and Identification of Bacteria, Ed. By Starr, M. P. et. Al.
  • a method for preparing the reaction medium more specifically, a method of removing dissolved gas by subjecting the reaction medium to heat treatment or reduced pressure treatment, and the like can be mentioned. More specifically, by treating the reaction medium for about 1 to 60 minutes, preferably about 5 to 40 minutes under reduced pressure of about 10 mmHg or less, preferably about 5 mmHg or less, more preferably about 3 mmHg or less.
  • the dissolved gas, particularly dissolved oxygen can be removed, and a reaction medium under reducing conditions can be prepared.
  • An appropriate reducing agent for example, thioglycolic acid, ascorbic acid, cysteine hydrochloride, mercaptoacetic acid, thiolacetic acid, glutathione, sodium sulfide, etc.
  • an appropriate combination of these methods also provides a method for preparing an effective reduced reaction medium.
  • the organic compound produced in the reaction medium as described above is collected.
  • a known method used in a bioprocess can be used. Such known methods include salting out, recrystallization, organic solvent extraction, esterification distillation separation, chromatographic separation, or electrodialysis, etc. of the organic compound production liquid. Accordingly, the separation, purification and collection method can be appropriately determined.
  • Examples of organic compounds that can be produced by the method of the present invention include organic acids, alcohols, amino acids, and vitamins.
  • the organic acid include acetic acid, lactic acid, 3-hydroxypropionic acid, acrylic acid, succinic acid, fumaric acid, malic acid, oxaloacetic acid, citric acid, cisaconic acid, isocitric acid, itaconic acid, 2-oxoglutaric acid or shikimi An acid etc. are mentioned.
  • Examples of the alcohol include ethanol, butanol, 1,3-propanediol, glycerol, xylitol, sorbitol, or 1,4-butanediol.
  • amino acids examples include valine, leucine, alanine, aspartic acid, lysine, isoleucine or threonine.
  • the method of the present invention is suitable for producing one or more organic compounds selected from the group consisting of ethanol, lactic acid, succinic acid, xylitol, acetic acid and amino acids.
  • the present invention also provides a D-xylose-utilizing coryneform bacterium transformant having a markedly improved ability to convert D-xylose or a mixture of D-glucose and D-xylose into an organic compound by the reaction under the conditions described above. To do.
  • Plasmid pCRA811 construction method a) Escherichia coli Extraction of chromosomal DNA from JM109 Escherichia coli JM109 is dissolved in L medium (tryptone 10 g, yeast extract 5 g and NaCl 5 g in distilled water 1 L. ) was inoculated using a platinum loop, and cultured at 37 ° C. with shaking until the logarithmic growth phase, and the cells were collected. Using a DNA genome extraction kit (trade name: GenomicPrep Cells and Tissue DNA Isolation Kit, manufactured by Amersham), chromosomal DNA was recovered from the collected cells according to the instruction manual.
  • L medium tryptone 10 g, yeast extract 5 g and NaCl 5 g in distilled water 1 L.
  • the former is added with an EcoRI site and the latter with a SmaI site.
  • the template DNA the chromosomal DNA of Escherichia coli JM109 extracted in Example 1, (1), a) above was used.
  • PCR was performed under the following conditions using a “DNA thermal cycler” manufactured by Perkin Elmer Citas Co., Ltd. and using a DNA polymerase (trade name: Takara LA Taq HS DNA polymerase, manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd.) as a reaction reagent.
  • Reaction solution The above was mixed, and this 100 ⁇ L reaction solution was subjected to PCR.
  • PCR cycle Denaturation process: 94 ° C., 1 minute Annealing process: 55 ° C., 1 minute Extension process: 72 ° C., 2 minutes
  • One cycle was performed for 30 cycles.
  • electrophoresis was performed on a 1% (W / V) agarose gel using a part of the reaction solution generated above, DNA fragments of about 1.4 kb and about 1.6 kb containing the xylA gene and the xylB gene, respectively. was detected.
  • the amplification product of about 1.6 kb treated with the restriction enzymes EcoRI and SmaI described above and the vector pTrc99A (Pharmacia) treated with restriction enzymes with EcoRI and SmaI were mixed, and ligation kit (trade name: Mighty Cloning) was mixed therewith. Kit, manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd.) and then reacted according to the instruction manual.
  • Escherichia coli JM109 was transformed by the calcium chloride method [Journal of Molecular Biology., Vol.
  • a growing strain having a white color on this medium is subjected to liquid culture by a conventional method, and a plasmid into which a DNA fragment having a length of about 1.4 kb containing the xylA gene is inserted is extracted from the culture solution using a plasmid extraction kit (trade name: QIAprep Spin Extraction was performed using Miniprep Kit (manufactured by Qiagen).
  • the plasmid containing the xylA gene was named pCRA801.
  • the amplified product of about 1.6 kb treated with the restriction enzymes EcoRI and SmaI was ligated with the vector pTrc99A treated with the restriction enzymes EcoRI and SmaI in the same manner to construct a plasmid pCRA802 containing the xylB gene.
  • a DNA fragment containing the xylB gene linked to the trc promoter (Ptrc) was used, and PCR was performed under the same conditions as described above except that the primer set shown below was used.
  • Ptrc-xylB gene amplification primer set (Ptrc)
  • a amplification product of about 1.7 kb treated with the restriction enzymes FbaI and BamHI was also subjected to restriction enzyme treatment with FbaI and BamHI in the same manner as above except that chloramphenicol was used instead of ampicillin in the selection medium.
  • a plasmid pCRA811 (vector pCRA811) containing the Ptrc-xylB gene was constructed by ligation with pCRA810 (FIG. 1).
  • the chromosomal DNA of Corynebacterium glutamicum 31831 extracted in the above Example 1, (2), a) was used.
  • PCR was performed using “DNA Thermal Cycler” manufactured by Perkin Elmer Citas Co., Ltd., and using DNA polymerase (trade name: Takara LA Taq HS HS DNA Polymerase, manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd.) as a reaction reagent under the following conditions.
  • Reaction solution The above was mixed, and 50 ⁇ L of the reaction solution was subjected to PCR.
  • PCR cycle Denaturation process: 94 ° C., 1 minute Annealing process: 37 ° C., 1 minute Extension process: 72 ° C., 1 minute One cycle was performed for 30 cycles.
  • a plasmid in which a DNA fragment of about 390 bp in length containing the araA homologous region was inserted under the same conditions and method as in Example 1, (1), b) above was obtained.
  • the DNA sequence was determined by sequencing the plasmid thus prepared. The sequence thus obtained showed very high homology with the base sequence of araA reported in other bacteria.
  • the chromosomal DNA of Corynebacterium glutamicum ATCC31831 extracted in the above Example 1, (2), item a) was used.
  • PCR was performed using “DNA thermal cycler” manufactured by Perkin Elmer Citas Co., Ltd. under the following conditions using DNA polymerase (trade name: Pyrobest DNA polymerase, manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd.) as a reaction reagent.
  • Reaction solution The above was mixed, and this 100 ⁇ L reaction solution was subjected to PCR.
  • Escherichia coli JM109 was transformed by the calcium chloride method, and an L agar medium containing 50 ⁇ g / mL ampicillin [composition: containing 1.5% (W / V) agar] The same composition as that of the L medium was applied.
  • a growing strain on this medium is subjected to liquid culture by a conventional method, and a plasmid into which a DNA fragment having a length of about 1.7 kb containing the araE gene is inserted from the culture solution using a QIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen). Extracted.
  • the plasmid containing the araE gene was named pKK223-3-araE (FIG. 3).
  • the chromosomal DNA of Corynebacterium glutamicum R extracted by the same method as in Example 1, (2), a) above was used.
  • PCR was performed using Takara-LA-Taq-HS-DNA-polymerase, no DMSO in the reaction solution, and the PCR cycle was carried out under the following conditions (Examples 1, (2), b)) The same conditions were used.
  • Example 1 Using this ligation solution, the same as in Example 1, (1), b) above, except that kanamycin 50 ⁇ g / mL was used instead of chloramphenicol as an antibiotic in the transformant selection medium.
  • the plasmid containing the Indel11 region for araE gene introduction was named Ind11LKS2-4 (FIG. 3).
  • Plasmid pKK223-3-araE was treated with EcoRI, separated by agarose electrophoresis, and a DNA fragment containing about 2.0 kb gene excised from the gel was gel extraction kit (trade name: Minelute Gel Extraction Kit, manufactured by Qiagen) Was collected using The resulting DNA was blunt-ended using a blunt end treatment kit (trade name: DNA : Blunting Kit, manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd.), mixed with Ind11LKS2-4 treated with EcoRV and mixed with Mighty Cloning. After adding Kit (Takara Shuzo Co., Ltd.), the reaction was carried out according to the instruction manual.
  • Escherichia coli JM109 was transformed by the calcium chloride method, L agar medium containing 50 ⁇ g / mL kanamycin [composition: containing 1.5% (W / V) agar] Except for the above, the composition was the same as that of the L medium.
  • a growing strain on this medium is subjected to liquid culture by a conventional method, and a plasmid into which a DNA fragment having a length of about 1.7 kb containing the araE gene is inserted from the culture solution using a QIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen). Extracted.
  • the araE gene introduction plasmid was named Ind11-araE (FIG. 3).
  • the plasmid for introducing araE gene Ind11-araE is a plasmid that cannot replicate in Corynebacterium glutamicum R. Ind11-araE was prepared according to the method of electric pulse method [Agric. Biol. Chem., Vol. 54, 443-447 (1990) and Res. Microbiol., Vol. 144, 181-185 (1993)].
  • a agar medium containing 50 ⁇ g / mL kanamycin introduced into Corynebacterium glutamicum R [Composition: Same composition as the above liquid medium except that 1.5% (W / V) agar is included] It was applied to.
  • the strain obtained in the above medium was added to the BT agar medium shown in Table 2 containing 10% (W / V) of sucrose [composition: 1.5% (W / V) of agar was included. Except for the same composition as that of the BT liquid medium].
  • the plasmid Ind11-araE undergoes one-point homologous recombination with a homologous region on the chromosome, it results from kanamycin resistance by expression of the kanamycin resistance gene on Ind11-araE and by expression of the sacR-sacB gene of Bacillus subtilis.
  • sucrose lethality when two-point homologous recombination occurred, kanamycin sensitivity due to loss of the kanamycin resistance gene on Ind11-araE and growth in a sucrose-containing medium due to loss of the sacR-sacB gene Indicates.
  • the target araE gene chromosome-introduced strain exhibits kanamycin sensitivity and growth of sucrose-containing medium.
  • the strain that showed kanamycin sensitivity and growth of sucrose-containing medium was named Corynebacterium glutamicum Ind-araE.
  • Corynebacterium glutamicum R and Corynebacterium glutamicum Ind11-araE an A agar medium containing 5 ⁇ g / mL chloramphenicol [Composition: 1.5% agar (W / V) The same composition as in the liquid medium A except that it is contained), and transformants Corynebacterium glutamicum R / pCRA811 and Corynebacterium glutamicum Ind-araE / pCRA811 Got.
  • Corynebacterium glutamicum (Ind-araE / pCRA811) is an independent administrative agency of the National Institute of Technology and Evaluation, Patent Biological Deposit, 2-5-8 Kazusa Kamashi, Kisarazu, Chiba, Japan Deposited at the center (date of deposit: May 28, 2008, deposit number: NITE BP-576).
  • each of the two strains contains 5 ⁇ g / mL of chloramphenicol
  • one platinum ear was inoculated into 10 mL of the same component composition medium as the above liquid medium and aerobic at 33 ° C. for 13 hours at 200 rpm. After culturing, the cells were washed twice with the above-described BT medium, and inoculated to 100 mL of BT medium containing 25 mM D-xylose as a single carbon source so that OD610 was 0.2. The D-xylose concentration was analyzed by liquid chromatography after sampling a small amount of the culture medium, and the change in consumption over time was examined. The results are shown in FIGS. 4 (1) and (2).
  • FIG. 4 (1) is a graph showing changes in D-xylose consumption and growth over time by Corynebacterium glutamicum R / pCRA811 into which the araE gene has not been introduced.
  • FIG. 4 (2) is a diagram showing time-dependent changes in D-xylose consumption and proliferation by Corynebacterium glutamicum Ind-araE / pCRA811 in which the araE gene is introduced into the chromosome.
  • FIGS. 4 (1) and (2) under aerobic conditions, Corynebacterium glutamicum Ind-araE / pCRA811 (FIG.
  • Example 3 Sugar Consumption and Lactic Acid Production Reaction of Corynebacterium glutamicum R / pCRA811 and Corynebacterium glutamicum Ind-araE / pCRA811 using D-xylose as a single substrate (1) Corynebacterium glutamicum R / pCRA811 and Corynebacterium glutamicum (Corynebacterium glutamicum) prepared in Example 1 and (5) above, which are stored at ⁇ 80 ° C.
  • Ind-araE / pCRA811 is a Agar medium containing 5 ⁇ g / mL of chloramphenicol, which is a medium for plate culture [Composition: except that 1.5% (W / V) of agar is included The same component composition as that of the liquid medium A] was allowed to stand at 33 ° C. for 12 hours in a dark place.
  • Each of the two coryneform bacterial strains grown on the above plate was inoculated into a test tube containing 10 mL of chloramphenicol A liquid medium containing 5 ⁇ g / mL, and then plated at 33 ° C. for 12 hours.
  • the cells were cultured aerobically at 200 rpm.
  • Each of the two strains grown under the above conditions was transferred to a 1 L Erlenmeyer flask containing 500 mL of A liquid medium containing 5 ⁇ g / mL of chloramphenicol, which is an aerobic culture growth medium.
  • the aerobic culture was performed at 200 rpm for 13 hours.
  • the cells grown in this way were collected by centrifugation (4 ° C., 10 minutes, 5,000 ⁇ g) and subjected to the lactic acid production reaction under the following reducing conditions.
  • the pH in the reaction vessel was constantly maintained at 7.5 using a 2.5 N (normal) concentration NH 4 OH aqueous solution (2.5 N ammonia aqueous solution).
  • the D-xylose and lactic acid concentrations in the reaction vessel were analyzed by liquid chromatography by sequentially sampling a small amount of the medium, and the changes in consumption and production amount over time were examined.
  • FIG. 5 (1) is a diagram showing the time course of D-xylose consumption and lactic acid production by Corynebacterium glutamicum R / pCRA811 into which the araE gene has not been introduced.
  • FIG. 5 (2) is a graph showing time-dependent changes in D-xylose consumption and lactic acid production by Corynebacterium glutamicum Ind-araE / pCRA811 in which the araE gene is introduced into the chromosome.
  • black circles ( ⁇ ) indicate changes in the D-xylose concentration in the medium
  • white circles ( ⁇ ) indicate changes in the lactic acid concentration in the medium.
  • the D-xylose consumption rate and the lactic acid production rate are the consumption and production per unit time after 3 hours from the start of the reaction.
  • Corynebacterium glutamicum R / pCRA811 Figure 5 (1)
  • Corynebacterium glutamicum Ind-araE / pCRA811 Figure 5 (2)
  • D-xylose consumption rate and lactic acid production rate Corynebacterium glutamicum R / pCRA811, D-xylose consumption rate 15.1 mM / h and lactic acid production rate 18.5 mM / h
  • Corynebacterium glutamicum Ind-araE / pCRA811 The D-xylose consumption rate was 48.4 mM / h and the lactic acid production rate was 58.5 mM / h.
  • Example 4 Aerobic culture of Corynebacterium glutamicum R / pCRA811 and Corynebacterium glutamicum Ind-araE / pCRA811 using a medium containing D-glucose and D-xylose mixed sugar as a carbon source The reaction was carried out except that the carbon source in Example 2 was changed from D-xylose to a mixture of D-glucose and D-xylose (3.6 g / L and 3.6 g / L; abundance ratio 1: 1). Under the same conditions and method as in Example 2, aerobic culture growth and sugar consumption of Corynebacterium glutamicum R / pCRA811 and Corynebacterium glutamicum Ind-araE / pCRA811 were examined.
  • FIGS. 6 (1) and (2) The results are shown in FIGS. 6 (1) and (2).
  • FIG. 6 (1) is a graph showing changes in D-glucose and D-xylose consumption and growth over time by Corynebacterium glutamicum R / pCRA811 into which the araE gene has not been introduced.
  • FIG. 6 (2) is a graph showing changes in D-glucose and D-xylose consumption and growth over time by Corynebacterium glutamicum Ind-araE / pCRA811 in which the araE gene is introduced into the chromosome.
  • 6A and 6B an asterisk (*) indicates a change in OD610.
  • Black circles ( ⁇ ) indicate changes in D-glucose concentration in the medium.
  • Open circles ( ⁇ ) indicate changes in D-xylose concentration in the medium.
  • Corynebacterium glutamylum R / pCRA811 is observed to inhibit glucose in terms of D-xylose utilization in the presence of D-glucose and D-xylose, whereas corynebacteria Corynebacterium glutamicum Ind-araE / pCRA811 was able to use D-glucose and D-xylose in parallel and simultaneously.
  • Example 5 Sugar consumption and lactic acid under reducing conditions of Corynebacterium glutamicum R / pCRA811 and Corynebacterium glutamicum Ind-araE / pCRA811 using D-glucose and D-xylose mixed sugars as substrates
  • Production reaction Example 3 except that the reaction was carried out by replacing the substrate in Example 3 above from D-xylose with a mixture of D-glucose and D-xylose (40 g / L and 20 g / L; abundance ratio 2: 1). After aerobic culture growth under the same conditions and method as 3, reaction under reducing conditions was carried out.
  • FIGS. 7 (1) and (2) The results are shown in FIGS. 7 (1) and (2).
  • FIG. 7 (1) is a graph showing changes in D-glucose and D-xylose consumption and lactic acid production over time by Corynebacterium glutamicum R / pCRA811 into which the araE gene has not been introduced.
  • FIG. 7 (2) is a graph showing changes in D-glucose and D-xylose consumption and lactic acid production over time by Corynebacterium glutamicum Ind-araE / pCRA811 in which the araE gene is introduced into the chromosome.
  • black circles ( ⁇ ) indicate changes in the xylose concentration in the medium.
  • An asterisk (*) indicates a change in the D-glucose concentration in the medium.
  • Open circles ( ⁇ ) indicate changes in lactic acid concentration in the medium.
  • Corynebacterium glutamicum Ind-araE / pCRA811 was able to completely consume D-glucose and D-xylose within 8 hours, whereas Corynebacterium glutamicum (Corynebacterium glutamicum) ) With R / pCRA811, a significant amount of xylose remained in the same 8 hours.
  • the lactic acid production concentrations produced by Corynebacterium glutamicum R / pCRA811 and Corynebacterium glutamicum Ind-araE / pCRA811 after 8 hours are 339 mM and 431 mM, respectively, and the latter is about 1.3 times it was high.
  • Corynebacterium glutamicum R / pCRA811 under reduced conditions shows that glucose suppression is observed for D-xylose utilization in the presence of D-glucose and D-xylose, whereas Corynebacterium glutamicum R / pCRA811 Corynebacterium glutamicum Ind-araE / pCRA811 was able to use D-glucose and D-xylose in parallel and simultaneously.
  • araBAD gene amplification primer set The former has an EcoRI site and the latter has a SalI site added to the ends.
  • Escherichia coli JM109 chromosomal DNA extracted in Example 1, (1), a) above was used.
  • PCR was performed using “DNA thermal cycler” manufactured by Perkin Elmer Citas Co., Ltd. and using DNA polymerase (trade name: PrimeSTAR HS DNA polymerase, manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd.) as a reaction reagent under the following conditions.
  • PCR buffer 10 ⁇ L 2.5 mM dNTP mixture: 4 ⁇ L
  • Template DNA 1 ⁇ L (DNA content 200 ng or less)
  • primers 1 ⁇ L each (final concentration 0.2 ⁇ M)
  • PrimeSTAR HS DNA polymerase 0.5 ⁇ L Sterile distilled water: 33.5 ⁇ L
  • the above was mixed, and 50 ⁇ L of the reaction solution was subjected to PCR.
  • PCR cycle Denaturation process: 98 ° C., 10 seconds Annealing process: 55 ° C., 10 seconds Extension process: 72 ° C., 5 minutes One cycle was performed for 30 cycles.
  • Escherichia coli JM109 was transformed by the calcium chloride method [Journal of Molecular Biology., Vol. 53, 159 (1970)], and chloramphenicol 50 ⁇ g / mL, X-gal ( 5-Bromo-4-chloro-3-indoxyl-beta-D-galactopyranoside) 200 ⁇ g / mL and IPTG (isopropyl 1-thio-beta-d-galactoside) 100 ⁇ g / mL L agar medium [Composition: agar is 1. The composition was the same as that of the L medium except that 5% (W / V) was contained.
  • a growing strain having a white color on this medium is subjected to liquid culture by a conventional method, and a plasmid into which a DNA fragment having a length of about 4.5 kb containing the araBAD gene is inserted from the culture solution is extracted with a plasmid extraction kit (trade name: QIAprep Spin Extraction was performed using Miniprep Kit (manufactured by Qiagen).
  • the plasmid containing the araBAD gene was named Plac-araBAD (FIG. 8).
  • a asterisk indicates a primer for inverse PCR.
  • the base sequence indicated by b underline indicates a restriction enzyme site prepared for cloning.
  • Escherichia coli JM109 was transformed by the calcium chloride method, and an L agar medium containing 50 ⁇ g / mL kanamycin [composition: containing 1.5% (W / V) agar] The same composition as that of the L medium was applied.
  • the growing strain on this medium is subjected to liquid culture by a conventional method, and a plasmid inserted with a DNA fragment of about 3.3 kb in length containing the xylA-xylB gene from the culture is designated as QIAprep Spin Miniprep Kit (manufactured by Qiagen). Extracted using.
  • the araE gene introduction plasmid Ind11-araE prepared in Example 1 and (3) above was introduced into Corynebacterium glutenum X5 according to the same method as described above, and the strain obtained by introducing the araE gene introduction plasmid Ind11-araE into Corynebacterium It was named as Corynebacterium glutamicum X5-Ind-araE.
  • each is introduced into each of Corynebacterium glutamicum X5 and Corynebacterium glutamicum X5-Ind-araE, and an A agar medium containing 5 ⁇ g / mL of chloramphenicol [ Composition: Same composition as in the above liquid medium except that 1.5% (W / V) agar is contained], and transformed strains Corynebacterium glutamicum X5 / Plac-araBAD and Coryne Corynebacterium glutamicum X5-Ind-araE / Plac-araBAD was obtained.
  • Corynebacterium glutamicum (Corynebacterium glutamicum) X5-Ind-araE / Plac-araBAD is an independent administrative agency product evaluation technology base of 2-5-8 Kazusa Kamashi, Kisarazu City, Chiba Prefecture, Japan (zip code 292-0818) Organization Deposited at the Patent Organism Depositary (Trust Date: May 28, 2008, Deposit Number: NITE BP-577).
  • Example 7 Reduction conditions of Corynebacterium glutamicum X5 / Plac-araBAD and Corynebacterium glutamicum X5-Ind-araE / Plac-araBAD using D-glucose and D-xylose mixed sugar as substrates The following sugar consumption and lactic acid production reaction Under the same conditions and method as in Example 3 above, Corynebacterium glutamicum X5 / Plac-araBAD and Corynebacterium glutamicum X5-Ind-araE / Each Plac-araBAD was grown in aerobic culture.
  • Example 3 Thereafter, the substrate in Example 3 was changed from D-xylose to a mixture of D-glucose, D-xylose and L-arabinose (32 g / L, 16 g / L and 6.4 g / L, respectively; abundance ratio 5: 2.
  • the reaction was carried out under reducing conditions under the same conditions and method as in Example 3 except that the reaction was performed instead of 5: 1).
  • FIG. 9 (1) is a diagram showing the change over time in sugar consumption by Corynebacterium glutamicum X5 / Plac-araBAD into which the araE gene has not been introduced.
  • FIG. 9 (2) is a diagram showing the time-dependent change in sugar consumption by Corynebacterium glutamicum X5-Ind-araE / Plac-araBAD in which the araE gene is introduced into the chromosome.
  • black circles ( ⁇ ) indicate changes in the L-arabinose concentration in the medium.
  • Triangles ( ⁇ ) indicate changes in D-xylose concentration in the medium.
  • An asterisk (*) indicates a change in the D-glucose concentration in the medium.
  • Open circles ( ⁇ ) indicate changes in lactic acid concentration in the medium.
  • Corynebacterium glutamicum (X) -Ind-araE / Plac-araBAD (FIG. The consumption rate of D-xylose and L-arabinose in 2)) was significantly faster than that of Corynebacterium glutamicum X5 / Plac-araBAD (Fig. 9 (1)) without the araE gene introduced. .
  • Corynebacterium glutamicum X5-Ind-araE / Plac-araBAD completely consumes the three sugars D-glucose, D-xylose and L-arabinose in the medium within 9 hours.
  • Corynebacterium glutamicum X5 / Plac-araBAD showed D-xylose and L-arabinose remaining in the same 9 hours. After 9 hours, the concentrations of lactic acid produced by Corynebacterium glutamicum X5 / Plac-araBAD and Corynebacterium glutamicum X5-Ind-araE / Plac-araBAD were 342 mM and 374 mM, respectively. .
  • Corynebacterium glutamicum X5-Ind-araE / Plac-araBAD uses three sugars, D-glucose, D-xylose and L-arabinose, in parallel and simultaneously. Was possible.
  • Example 8 Production of succinic acid under reducing conditions using Corynebacterium glutamicum R / pCRA811 and Corynebacterium glutamicum Ind-araE / pCRA811 mixed sugars of D-glucose and D-xylose as substrates Reaction Corynebacterium glutamicum R / pCRA811 and Corynebacterium glutamicum Ind-araE / pCRA811 prepared in Example 1, (5) above are the same as in Example 5 above. Under the conditions and method, succinic acid production reaction was performed under reducing conditions after aerobic culture growth.
  • Escherichia coli JM109 was transformed by the calcium chloride method, and an L agar medium containing 50 ⁇ g / mL of chloramphenicol [Composition: 1.5% (W / V) agar was included. Except for the above, the same composition as that of the L medium was applied.
  • the grown strain on this medium is subjected to liquid culture by a conventional method, and a plasmid inserted with a DNA fragment of about 4.0 kb in length containing the adhB-pdc gene from the culture solution is designated as QIAprep Spin Miniprep Kit (manufactured by Qiagen). Extracted using.
  • the prepared plasmid was named pEthAra (FIG. 10).
  • Corynebacterium glutamicum X5-Ind-araE- ⁇ ldh was introduced into Corynebacterium glutamicum X5-Ind-araE- ⁇ ldh, and an A agar medium containing 5 ⁇ g / mL of chloramphenicol [Composition: 1.5% agar (W / V) Transformant Corynebacterium glutamicum X5-Ind-araE- ⁇ ldh / pEthAra was obtained by the same composition as that of the liquid medium A except that it was included.
  • Corynebacterium glutamicum (Corynebacterium glutamicum) X5-Ind-araE- ⁇ ldh / pEthAra is an independent administrative agency product evaluation technology base of 2-5-8 Kazusa Kamashi, Kisarazu City, Chiba Prefecture, Japan (zip code 292-0818) Organization Deposited at the Patent Biological Deposit Center (Accession date: June 4, 2008, Accession number: NITE BP-581).
  • Example 10 Sugar consumption and ethanol production reaction under reducing conditions of Corynebacterium glutamicum X5-Ind-araE- ⁇ ldh / pEthAra using D-glucose, D-xylose and L-arabinose mixed sugar as substrates Under the same conditions and method as in Example 3, Corynebacterium glutamicum X5-Ind-araE- ⁇ ldh / pEthAra was grown in aerobic culture, and then the substrate in Example 3 was converted from D-xylose to D-xylose.
  • Example 3 The same conditions as in Example 3 except that the mixture was replaced with a mixture of glucose, D-xylose and L-arabinose (32 g / L, 16 g / L and 6.4 g / L; abundance ratio 5: 2.5: 1). And the reaction was carried out under reducing conditions.
  • Corynebacterium glutamicum X5-Ind-araE- ⁇ ldh / pEthAra is a mixture of 3 of D-glucose, D-xylose and L-arabinose in the medium.
  • the seed sugar was consumed within 9 hours to produce ethanol.
  • the consumption rates of the three kinds of sugars were almost the same as those of Corynebacterium glutamicum X5-Ind-araE / Plac-araBAD in Example 7.
  • black circles ( ⁇ ) indicate changes in D-glucose concentration in the medium.
  • Triangles ( ⁇ ) indicate changes in D-xylose concentration in the medium.
  • Black squares ( ⁇ ) indicate changes in L-arabinose concentration in the medium.
  • White squares ( ⁇ ) indicate changes in ethanol concentration in the medium.
  • Corynebacterium glutamicum X5-Ind-araE- ⁇ ldh / pEthAra can use three types of sugars, D-glucose, D-xylose and L-arabinose, in parallel and simultaneously. It was possible.
  • the present invention can be suitably used for the production of organic compounds from cellulosic biomass resources.

Abstract

　シュガートランスポーター機能を有するタンパク質をコードする外来性遺伝子を、Ｄ－キシロース利用能を有するコリネ型細菌に導入したことを特徴とする、コリネ型細菌形質転換体。

Description

Ｄ－キシロース利用機能が向上したコリネ型細菌形質転換体
　本発明はＤ－キシロース利用技術に関する。さらに詳しくは、Ｄ－キシロース利用機能を向上するために特定の遺伝子操作が施されたコリネ型細菌形質転換体及びそれによる高効率的な有機化合物の製造技術に関する。
　セルロース系バイオマスは、生物的方法による各種の有機酸化合物、エタノール等の製造原料として有用である。セルロース系バイオマスは、コーンデンプン、砂糖などの糖質系バイオマスと異なり、安価に、農産廃棄物又は木質廃棄物として多種多様に入手可能であり、将来的にも、食糧資源確保の為の障害とはならない原料種であるからである。セルロース系バイオマスは、およそ、３５質量％～４５質量％のセルロース、３０質量％～４０質量％のヘミセルロース、１０質量％のリグニンそして１０質量％の他の成分から成っている。セルロースはグルコース（ヘキソース）のポリマーである。一方、ヘミセルロースでは、ペントースであるキシロース、アラビノース等が主要な構成成分である。
　コーンストーバー（Corn stover）、小麦わら（Wheat straw）、稲わら（Rice straw）、バガス（Baggasse）等のセルロース系バイオマスのヘミセルロース中ではＤ－キシロースがその大部分を占める。従って、セルロース系バイオマスの有効利用を図る上で、生物的方法による高効率的なＤ－キシロース利用技術の確立が不可欠となっている。
　セルロース系バイオマスの利用技術においては、まず、これらの原料をヘキソース、ペントース等の単糖類に糖化分解することが必要であるが、プロセス設計上、有機化合物産生培地にはこれら単糖類が共存することになる。通常、このような場合、ヘキソースによるペントースの所謂“グルコース抑制”が起こり、ヘキソース及びペントースを並行的かつ同時に利用できなくなり（プロセス設計及び運転制御が複雑となる要因）、ペントース成分を含むセルロース系バイオマスの効率的な工業化利用技術確立の妨げとなっている。この点に関しても改良が望まれている。
　ヘキソースであるグルコースを利用し、各種の有機化合物を発酵生産する多くの微生物はよく知られているところであるが、ペントースであるＤ－キシロースを利用し、エタノール等を産生することのできる微生物も幾つか知られている。
　特許文献１及び非特許文献１では、野生型ではＤ－キシロースを利用することができないサッカロミセス　セレビシアエ（Saccharomyces cerevisiae）に、ピキア スティピティス（Pichia stipitis）由来のキシロース レダクターゼ遺伝子及びキシリトール デヒドロゲナーゼ遺伝子、並びにサッカロミセス　セレビシアエ由来のキシルロキナーゼ遺伝子の３つの遺伝子をプラスミドにより導入するＤ－キシロース利用機能付与技術、及び得られる形質転換体サッカロミセス　セレビシアエによるＤ－キシロース利用技術が開示されている。しかし、この形質転換体サッカロミセス　セレビシアエはＤ－キシロースの利用速度が未だ不十分であり、且つ、Ｄ－グルコース及びＤ－キシロースの両糖の存在下では、Ｄ－キシロース利用に対してグルコース抑制（Ｄ－グルコース存在下では、Ｄ－キシロース利用能が非常に遅い）が観察されており、高効率なＤ－キシロース利用技術は未確立である。従って、これらの点に関する改良が望まれている。
　非特許文献２では、同じく、サッカロミセス　セレビシアエを用いる技術として、カビであるピロマイセス スピージーズ（Piromyces sp.）由来のキシロース　イソメラーゼ遺伝子を発現するのに加えて、サッカロミセス　セレビシアエ由来のキシルロキナーゼ遺伝子、リブロース ５－ホスフェート イソメラーゼ遺伝子、リブロース ５－ホスフェート エミペラーゼ遺伝子、トランスケトラーゼ遺伝子、及びトランスアルドラーゼ遺伝子を高発現する、アルドース レダクターゼ遺伝子が破壊された形質転換体サッカロミセス セレビシアエを作製し、さらに、この形質転換体を用いて嫌気キシロース制限ケモスタット（anaerobic, xylose-limited chimostat）と、続いて嫌気自動連続回分培養（anaerobic automated sequencing-batch reactor）とを行なうことにより、Ｄ－キシロース取り込み及び資化速度が向上した変異株を単離する技術、及びこの株を用いたＤ－キシロース利用技術が開示されている。この技術では、上記の特許文献１及び非特許文献１の技術と比較して、Ｄ－キシロース利用速度は改善されたが十分とはいえず、さらに未だにＤ－グルコース及びＤ－キシロースの両糖の存在下では、Ｄ－キシロース利用に対してグルコース抑制が観察されている。従って、これらの点に関する改良が望まれている。
　特許文献２では、野生型ではＤ－キシロースを利用することができないザイモモナス モビリス（Zymomonas mobilis）に、エシェリヒア　コリ （Escherichia coli）由来のキシロース イソメラーゼ遺伝子、キシルロキナーゼ遺伝子、トランスケトラーゼ遺伝子及びトランスアルドラーゼ遺伝子の４つの遺伝子をプラスミドにより導入し、発現することにより得られる形質転換体ザイモモナス　モビリスを用いるＤ－キシロース利用技術が開示されている。
　また、特許文献３では、同様に、ザイモモナス　モビリスに、エシェリヒア　コリ由来のキシロース　イソメラーゼ遺伝子、キシルロキナーゼ遺伝子、トランスケトラーゼ遺伝子及びトランスアルドラーゼ遺伝子の４つの遺伝子を染色体に導入し、発現することにより得られる、導入した遺伝子がより安定な形質転換体ザイモモナス　モビリスによるＤ－キシロース利用技術が開示されている。これらの公知技術においては、ヘキソースに対するペントースの同時利用性はある程度達成されてはいるものの、Ｄ－キシロースの消費速度（利用速度）はＤ－グルコースの消費速度に比し、不十分であり、実用的な意味でのヘキソース及びペントース同時利用性技術としては更なる改良が求められている。
　エシェリヒア　コリの野生株ではＤ－キシロース等のペントースも利用できるが、Ｄ－グルコース及びＤ－キシロースの両糖の存在下では、Ｄ－キシロース利用に対して上記のグルコース抑制がかかることが知られている。非特許文献３と非特許文献４では、グルコース取り込みに関わるｐｔｓＧ（glucose phosphotransferase system (PTS) transport）遺伝子を破壊することにより、Ｄ－グルコース及びＤ－キシロースの同時利用性を有する微生物が得られることが報告されている。しかしながら、エシェリヒア　コリはプロセス運転条件の変動により、溶菌作用が起こり易いことも指摘されており、プロセス運転上の問題点がある。また、エシェリヒア　コリを用いてエタノールを生産する場合、サッカロミセス　セレビシアエ及びザイモモナス　モビリスと比較して、エタノール耐性が低いことから、最終エタノール濃度が低いことが課題である（発酵液からのエタノール濃縮及び精製に多大のエネルギーを要する）。
　コリネバクテリウム　グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）及びその組換え株は、還元条件下の糖類からの有機酸等の有機化合物へのバイオ変換反応において、増殖することなく、有機化合物の生産が行えるので、糖類の有効利用上、有用な微生物である（特許文献４）。また、増殖の為の反応器容積を必要としないので、コンパクトな反応装置設計が可能である。本発明者等は、ザイモモナス モビリス由来のピルベート デカルボキシラーゼ遺伝子及びアルコール　デヒドロゲナーゼ遺伝子をコリネバクテリウム　グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）に導入し、導入遺伝子を発現させた形質転換体により、高効率にエタノールが生産される技術を開示している（非特許文献５）。
　さらに、増殖を伴い物質生産を行う、例えばサッカロミセス　セレビシアエ、ザイモモナス　モビリス、エシェリヒア　コリなどを用いた発酵法では、セルロース系バイオマス由来の原料糖類を得る為に必要な前処理工程において生成するフェノール類、フラン類、有機酸などの所謂“発酵阻害物質”（増殖阻害物質）による生産阻害を受けることが大きな課題となっている。コリネバクテリウム　グルタミカムを用いる技術は、増殖を伴わなずに有機酸等の有機化合物へのバイオ変換反応が可能であることから、所謂“発酵阻害物質”（増殖阻害物質）による生産阻害を受けない利点を有することが明らかになっている（非特許文献６）。
　しかしながら、コリネバクテリウム　グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）の野生株は様々な利点を有するバイオ変換反応を可能とする能力を有するものの、本来の特性として、Ｄ－キシロース等のペントースを利用することができない。発明者らは、この点に関して、コリネバクテリウム　グルタミカムに、エシェリヒア　コリ由来のキシロース　イソメラーゼ遺伝子及びキシルロキナーゼ遺伝子を導入し、発現させることで、Ｄ－キシロースの利用能を付与する技術を開示している（非特許文献７）。
　しかしながら、このＤ－キシロース利用能を有するコリネバクテリウム　グルタミカム組換え株においても、Ｄ－グルコース利用速度と比較して、Ｄ－キシロース利用速度は充分とは云えず、さらなるＤ－キシロース利用速度の向上が求められていた。
　一方、発明者らは、セルロース系バイオマス原料に含まれているペントースの一つであるＬ－アラビノースの効率的な利用能をコリネバクテリウム　グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）に付与する技術を提案している（特許文献５）。
　特許文献５の技術においては、具体的には、Ｌ－アラビノース利用能を有さないコリネバクテリウム　グルタミカムR (FERM P-18976)株に、エシェリヒア　コリ由来のアラビノースイソメラーゼ遺伝子、リブロキナーゼ遺伝子、及びリブロース－５－ホスフェート４－エピメラーゼ遺伝子を導入して発現させたコリネバクテリウム　グルタミカム形質転換体に、さらに、コリネバクテリウム　グルタミカムATCC31831由来のＬ－アラビノース輸送系のプロトンシンポーター遺伝子を導入する。これにより創製された新たな形質転換体は、Ｌ－アラビノース利用速度を大幅に向上出来ると共に、Ｄ－グルコース及びＬ－アラビノースの両糖の存在下での、Ｌ－アラビノース利用に対するグルコース抑制が完全に解除され、Ｄ－グルコース及びＬ－アラビノースを完全同時利用できるものである。
　しかしながら、上述したように、Ｄ－グルコース及びＤ－キシロースの両糖の存在下でのＤ－キシロース利用に対するグルコース抑制が完全に解除され、Ｄ－キシロース及びＤ－グルコースを並行的かつ同時に効率よく利用できるコリネバクテリウム形質転換体は、未だ開発されていない。
US patent 5,789,210 WO 0238740 US patent 7,354,755 PCT　公開公報　WO01/96573 A1 特願2007-222439（特開２００９－５０２３６号公報）
Applied and Environmental Microbiology、Vol.64，1852-1859　(1998). FEMS Yeast Research、Vol.5、925-934 (2005). Applied Microbilogy and Biotchnology、Vol.56、１20-125 (2001). Applied Microbilogy and Biotchnology、Vol.57、186-191 (2001). Journal of Molecular Microbiology and Biotechnology、Vol.8、243-254. (2004). Applied and Environmental Microbiology、Vol.73，2349-2353　(2007). Applied and Environmental Microbiology、Vol.72，3418-3428　(2006).
　本発明は、セルロース系バイオマス資源の有効利用を図る上で必要なＤ－キシロースの利用機能が向上した組換え微生物、及び該微生物を用いる有機化合物の製造方法を提供することを目的とする。
　前記の課題を解決すべく、本発明者は研究を重ね、コリネ型細菌に特定の外来遺伝子、すなわちシュガートランスポーター機能を有するタンパク質をコードする外来性遺伝子を導入することにより、創製される形質転換体がＤ－キシロースから有機化合物を効率よく生産することを見出した。
　具体的には、上述したＤ－キシロースの利用能を付与したコリネバクテリウム　グルタミカムに、コリネバクテリウム　グルタミカム（Corynebacterium glutamicum） ATCC31831由来のＬ－アラビノース輸送系のプロトンシンポーター遺伝子を導入したところ、思いもかけず、基質特異性が発現することもなく、Ｄ－キシロース利用速度が大幅に向上すると共に、Ｄ－グルコース及びＤ－キシロースの両糖の存在下での、Ｄ－キシロース利用に対するグルコース抑制が完全に解除され、Ｄ－グルコース及びＤ－キシロースの並行的かつ同時利用が可能となることを見出した。
　なお、本明細書中、コリネ型細菌形質転換体が「Ｄ－キシロース及びＤ－グルコース（又はＤ－グルコース、Ｄ－キシロース及びＬ－アラビノース）を並行的かつ同時利用することができる」、又は「同時利用性（能）を有する」とは、Ｄ－キシロース及びＤ－グルコース（又はＤ－グルコース、Ｄ－キシロース及びＬ－アラビノース）の混合糖を炭素源とする培地中で該形質転換体を用いて有機化合物を生成させた場合に、該形質転換体がほぼ同等の消費速度でもって、これら炭素源を並行的にかつ同時に利用できることを意味する。
　本発明は、上記知見に基づき完成されたものであり、以下の微生物及び有機化合物の製造方法を提供する。本発明の組換え微生物は、優れたＤ－グルコース及びＤ－キシロースの同時利用性能を有しているので、セルロース系バイオマス原料からの有用な有機化合物の生産プロセス設計及び運転が容易な技術を提供することに繋がる技術となるものである。
（１）　シュガートランスポーター機能を有するタンパク質をコードする外来性遺伝子を、Ｄ－キシロース利用能を有するコリネ型細菌に導入したことを特徴とする、コリネ型細菌形質転換体。
（２）　シュガートランスポーター機能を有するタンパク質が、Ｌ－アラビノース輸送系のプロトンシンポーターである上記（１）記載のコリネ型細菌形質転換体。
（３）　シュガートランスポーター機能を有するタンパク質をコードする外来性遺伝子として、配列番号１３で示される塩基配列からなるＤＮＡ、又は配列番号１３で示される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつシュガートランスポーター機能を有するポリペプチドをコードするＤＮＡを用いる上記（１）又は（２）記載のコリネ型細菌形質転換体。
（４）　Ｄ－キシロース利用能を有するコリネ型細菌が、コリネバクテリウム　グルタミカム(Corynebacterium glutamicum) R (FERM P-18976)、セロビオース利用性組換え株もしくは変異株であるFERM P-18979、FERM P-18977及びFERM P-18978、コハク酸生産組換え株であるFERM P-19446及びFERM P-19477、並びにエタノール生産組換え株であるFERM P-17887、FERM P-17888、FERM P-19361及びFERM P-19362からなる群より選択されるいずれか１種の菌株のコリネ型細菌であって、かつＤ－キシロース利用能が付与されているものであることを特徴とする上記（１）～（３）のいずれか一項に記載のコリネ型細菌形質転換体。
（５）　シュガートランスポーター機能を有するタンパク質をコードする外来性遺伝子として、コリネバクテリウム　グルタミカム (Corynebacterium glutamicum) ATCC31831、エシェリヒア　コリ （Escherichia coli）、バチラス サブチリス（Bacillus subtilis）、バチラス　リチェニフォルミス（Bacillus licheniformis）、バチラス コアグランス（Bacillus coagulans）、ラクトバチルス サケイ（Lactobacillus sakei）、ペディオコッカス ペントサセウス（Pediococcus pentosaceus）、ラクトバチルス レウテリ（Lactobacillus reuteri）、オーシャノバチルス イヘエニス（Oceanobacillus iheyensis）、ラクトコッカス ラクティス（Lactococcus lactis）、ロイコノストック メセンテロイデス（Leuconostoc mesenteroides）、ラクトバチルス プランタリューム（Lactobacillus plantarum）、ラクトバチルス ファーメンタム（Lactobacillus fermentum）、ラクトバチルス ブレビス（Lactobacillus brevis）、ロイコノストック シテリューム（Leuconostoc citreum）、エンテロコッカス フェシウム（Enterococcus faecium）、クレブシエラ　オキシトカ（Klebsiella oxytoca）、及びサルモネラ　ティフィムリウム（Salmonella typhimurium）からなる群より選ばれる微生物由来のａｒａＥ遺伝子を用いる上記（１）又は（２）に記載のコリネ型細菌形質転換体。
（６）　Ｄ－グルコース及びＤ－キシロースを並行的かつ同時利用することができる上記（１）～（５）のいずれか一項に記載のコリネ型細菌形質転換体。
（７）　Ｄ－グルコース、Ｄ－キシロース及びＬ－アラビノースを並行的かつ同時利用することができる上記（６）記載のコリネ型細菌形質転換体。
（８）　コリネ型細菌形質転換体が、コリネバクテリウム　グルタミカム (Corynebacterium glutamicum) Ind-araE/pCRA811 (受託番号　ＮＩＴＥ　ＢＰ－５７６)である上記（１）記載のコリネ型細菌形質転換体。
（９）　コリネ型細菌形質転換体が、コリネバクテリウム　グルタミカム (Corynebacterium glutamicum) X5-Ind-araE/Plac-araBAD (受託番号　ＮＩＴＥ　ＢＰ－５７７)である上記（１）記載のコリネ型細菌形質転換体。
（１０）　コリネ型細菌形質転換体が、コリネバクテリウム グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）X5-Ind-araE-Δldh/pEthAra (受託番号　ＮＩＴＥ　ＢＰ－５８１)である上記（１）記載のコリネ型細菌形質転換体。
（１１）　Ｄ－キシロースを含有する培地中で上記（１）～（１０）のいずれか一項に記載のコリネ型細菌形質転換体を用いて有機化合物を生成させる工程と、同培地より有機化合物を回収する工程とを含む有機化合物の製造方法。
（１２）　有機化合物が、エタノール、乳酸、コハク酸、キシリトール、酢酸及びアミノ酸からなる群より選ばれる１種以上であることを特徴とする上記（１１）記載の有機化合物の製造方法。
　本発明により、Ｄ－キシロースの効率的な利用が可能となり、また、Ｄ－グルコースとＤ－キシロースとを並行的に同時に、かつ、同等の利用速度でもって利用できるので、セルロース系バイオマス資源の有用な有機化合物への有効利用を効率的な合理的プロセスにより実現することができる。
図１は、実施例１、（１）項において作製したベクターｐＣＲＡ８１１を示す模式図である。 図２は、コリネバクテリウム グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）ATCC31831におけるara gene mapを示す図である。 図３は、実施例１、（３）項において作製したベクターＩｎｄ１１－ａｒａＥの作製方法を示す図である。 図４は、コリネバクテリウム グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）R/pCRA811（図４（１））及びコリネバクテリウム グルタミカム（Corynebacterium glutamicum） Ind-araE/pCRA811（図４（２））それぞれによる、好気条件下、単一炭素源としてＤ－キシロースを含有するＢＴ培地における培養時の、Ｄ－キシロース消費及び増殖の経時変化を示す図である。 図５は、コリネバクテリウム グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）R/pCRA811（図５（１））及びコリネバクテリウム グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）Ind-araE/pCRA811（図５（２））それぞれによる、還元条件下、Ｄ－キシロース単一基質におけるＤ－キシロース消費及び乳酸生成の経時変化を示す図である。 図６は、コリネバクテリウム グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）R/pCRA811（図６（１））及びコリネバクテリウム グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）Ind-araE/pCRA811（図６（２））それぞれによる、好気条件下、炭素源としてＤ－グルコース及びＤ－キシロースを含有するＢＴ培地における培養時の、Ｄ－グルコース及びＤ－キシロース消費、並びに増殖の経時変化を示す図である。 図７は、コリネバクテリウム グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）R/pCRA811（図７（１））及びコリネバクテリウム グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）Ind-araE/pCRA811（図７（２））それぞれによる、還元条件下、Ｄ－グルコース及びＤ－キシロースの含有比率２対１の混合糖におけるＤ－グルコース及びＤ－キシロース消費、並びに乳酸生成の経時変化を示す図である。 図８は、　実施例６、（１）項において作製したベクターＰｌａｃ－ａｒａＢＡＤを示す模式図である。 図９（１）及び（２）は、コリネバクテリウム グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）X5/Plac-araBAD（図９（１））及びコリネバクテリウム グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）X5-Ind-araE/Plac-araBAD（図９（２））それぞれによる、還元条件下、Ｄ－グルコース、Ｄ－キシロース及びＬ－アラビノースの含有比率５：２．５：１の混合糖における糖消費、並びに乳酸生成の経時変化を示す図である。 図１０は、実施例９において作製したベクターpEthAraを示す模式図である。 図１１は、コリネバクテリウム グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）X5-Ind-araE-Δldh/pEthAraによるＤ－グルコース、Ｄ－キシロース及びＬ－アラビノースの含有比率５：２．５：１の混合糖における糖消費及びエタノール生成の経時変化を示す図である。
（Ｉ）Ｄ－キシロース利用機能が向上したコリネ型細菌形質転換体
　本発明のコリネ型細菌形質転換体は、シュガートランスポーター機能を有するタンパク質をコードする外来性遺伝子を、Ｄ－キシロース利用能を有するコリネ型細菌に導入したものである。
　Ｄ－キシロース利用能を有するコリネ型細菌に、シュガートランスポーター機能を有するタンパク質をコードする外来性遺伝子を導入することにより、該コリネ型細菌のＤ－キシロース利用能が顕著に向上する。このため、コリネ型細菌形質転換体はＤ－グルコース及びＤ－キシロースを並行的かつ同時利用することができるものとなる。
　本発明でシュガートランスポーター機能を有するタンパク質をコードする外来性遺伝子を導入する、Ｄ－キシロース利用能を有するコリネ型細菌は、Ｄ－キシロース利用能が付与されているコリネ型細菌であれば特に限定されるものではない。コリネ型細菌の野生株は、Ｄ－キシロース等のペントースを利用することができない。コリネ型細菌にＤ－キシロース利用能を付与する方法としては特に限定されず、例えば、該コリネ型細菌に他の生物種由来のＤ－キシロース代謝関連遺伝子を導入する方法が挙げられる。
　原核生物及び一部のカビにおけるＤ－キシロースからＤ－キシルロース－５－ホスフェートへの代謝は、具体的には、（ａ）Ｄ－キシロースからＤ－キシルロースへの反応を触媒するキシロース　イソメラーゼ（以下、酵素を「ＸｙｌＡ」、遺伝子を「ｘｙｌＡ」ともいう）、及び（ｂ）Ｄ－キシルロースからＤ－キシルロース－５－ホスフェートへの反応を触媒するキシルロキナーゼ（以下、酵素を「ＸｙｌＢ」、遺伝子を「ｘｙｌＢ」ともいう）の２つの酵素に触媒された２ステップの反応により行われる。本発明では該代謝系を用いることができる。これらの酵素をコードする上記（ａ）及び（ｂ）の遺伝子をコリネ型細菌に導入することによりコリネ型細菌にＤ－キシロース利用能が付与されるが、該遺伝子がコードしているポリペプチドがＤ－キシロース代謝機能を有する限り、（ａ）及び（ｂ）の遺伝子の由来微生物の種類、組み合わせ、及び導入の順番等は特に限定されない。
　例えば、発明者らは既に、コリネ型細菌に、Ｄ－キシロース代謝関連遺伝子として、エシェリヒア　コリ（Escherichia coli）由来のキシロース イソメラーゼ遺伝子（ｘｙｌＡ）、及びキシルロキナーゼ遺伝子（ｘｙｌＢ）を導入し、発現させることで、Ｄ－キシロースの利用能を付与する技術を開示している（Appl. Environ. Microbiol. Vol.72，3418-3428　(2006)）。本発明においては、このような技術により作製されるＤ－キシロース利用能が付与されたコリネ型細菌を用いることができる。また、例えばＤ－キシロース利用能を付与する方法としては、上記のエシェリヒア　コリ （Escherichia coli）以外の生物種由来遺伝子を導入した形質転換体であってもよい。
　上記（ａ）及び（ｂ）のＤ－キシロース代謝関連酵素をコードする遺伝子は、同じ遺伝子座上に存在していてもよく、又は、これら２つの遺伝子がそれぞれ別の遺伝子座上に存在していてもよい。２つの遺伝子が同じ遺伝子座上に存在している例としては、例えば、上記（ａ）及び（ｂ）の遺伝子が連結して形成されたオペロンなどが挙げられる。
　上記（ａ）及び（ｂ）の遺伝子は、通常、Ｄ－キシロースの代謝能を有する微生物に保有されている。本発明における（ａ）及び（ｂ）の遺伝子としては、エシェリヒア　コリ（Escherichia coli）、コリネバクテリウム　グルタミカム (Corynebacterium glutamicum) (ｘｙｌＢ遺伝子のみ保有)、バチラス　サブチリス（Bacillus subtilis）、サルモネラ　ティフィムリウム（Salmonella typhimurium）、バチラス　ハロデュランス（Bacillus halodurans）、シノリゾビューム メリロッティ（Sinorhizobium meliloti）、及びアグロバクテリュウム ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）からなる群より選ばれる同一又は異なる微生物由来のｘｙｌＡ遺伝子、及びｘｙｌＢ遺伝子を用いることが好ましい。
　中でも本発明では、エシェリヒア コリ（Escherichia coli）に由来するｘｙｌＡ遺伝子、及びｘｙｌＢ遺伝子の使用が最も好ましい。
　Ｄ－キシロース代謝関連酵素をコードする遺伝子は、上記（ａ）及び（ｂ）の遺伝子を含むＤＮＡ断片の塩基配列が既知であれば、その配列に従って合成したＤＮＡ断片を使用することができる。ＤＮＡ配列が不明の場合であっても、Ｄ－キシロース代謝関連酵素タンパク質間で保存されているアミノ酸配列をもとにハイブリダイゼーション法、ＰＣＲ法により断片を取得することが可能である。さらに他の既知のＤ－キシロース代謝関連遺伝子配列を基に設計したミックスプライマーを用い、ディジェネレートＰＣＲによって断片を取得することが可能である。
　Ｄ－キシロース代謝関連酵素をコードする遺伝子は、該遺伝子がコードしているポリペプチドのＤ－キシロース代謝活性が保持されている限り、塩基配列の一部が他の塩基に置換されていてもよく、削除されていてもよく、また新たに塩基が挿入されていてもよく、さらには塩基配列の一部が転位されていてもよい。これらのＤ－キシロース代謝関連酵素をコードする遺伝子の誘導体のいずれも本発明に用いることができる。上記の塩基配列の一部とは、例えばアミノ酸残基換算で１乃至数個（通常１～５個、好ましくは１～３個、さらに好ましくは１～２個）であってよい。
　Ｄ－キシロース代謝関連酵素をコードする遺伝子の塩基配列は、原核生物由来、すなわち原核生物中に天然に存在するＤ－キシロース代謝関連酵素と同じアミノ酸配列を持つＤ－キシロース代謝関連酵素をコードしていることが好ましい。真核生物由来のＤ－キシロース代謝関連酵素に比べ、原核生物由来のＤ－キシロース代謝関連酵素の発現は、細菌においてＤ－キシロース代謝関連酵素が活性形態で発現する可能性を高める。
　宿主となるコリネ型細菌としては、糖類の代謝変換機能を有しているものであればよく、特に限定されない。糖類の種類や目的有機化合物の種類によっては、コリネ型細菌が本来有していない糖類の取り込み、代謝経路又は目的有機化合物への変換経路等の新たな機能の導入を必要とする場合があるが、そのような場合には組換え技術や突然変異誘発処理等によりそれらの機能を付与すればよい。
　本発明で用いられるコリネ型細菌とは、バージーズ・マニュアル・デターミネイティブ・バクテリオロジー〔Bargeys Manual of Determinative Bacteriology、Vol. 8、599（1974）〕に定義されている一群の微生物であり、通常の好気的条件で増殖するものならば特に限定されるものではない。具体例を挙げれば、コリネバクテリウム属菌、ブレビバクテリウム属菌、アースロバクター属菌、マイコバクテリウム属菌又はマイクロコッカス属菌等が挙げられる。
　さらに具体的には、コリネバクテリウム属菌としては、コリネバクテリウム　グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）R（FERM P-18976）、ATCC13032、ATCC13058、ATCC13059、ATCC13060、ATCC13232、ATCC13286、ATCC13287、ATCC13655、ATCC13745、ATCC13746、ATCC13761、ATCC14020又はATCC31831等が挙げられる。
　ブレビバクテリウム属菌としては、ブレビバクテリウム　ラクトファーメンタム（Brevibacterium lactofermentum）ATCC13869、ブレビバクテリウム フラバム（Brevibacterium flavum）MJ-233（FERM BP-1497）もしくはMJ-233AB-41（FERM BP-1498）、又はブレビバクテリウム アンモニアゲネス（Brevibacterium ammoniagenes）ATCC6872等が挙げられる。
　アースロバクター属菌としては、アースロバクター　グロビフォルミス（Arthrobacter globiformis）ATCC8010、ATCC4336、ATCC21056、ATCC31250、ATCC31738又はATCC35698等が挙げられる。
　マイコバクテリウム属菌としては、マイコバクテリウム ボビス（Mycobacterium bovis）ATCC19210又はATCC27289等が挙げられる。
　マイクロコッカス属菌としては、マイクロコッカス　フロイデンライヒ（Micrococcus freudenreichii）NO. 239（FERM P-13221）、マイクロコッカス　ルテウス（Micrococcus leuteus）NO. 240（FERM P-13222）、マイクロコッカス ウレアエ（Micrococcus ureae）IAM1010又はマイクロコッカス　ロゼウス（Micrococcus roseus）IFO3764等が挙げられる。
　好ましくは、細胞の中へ能動的に又は受動的にＤ－キシロースを輸送できるコリネ型細菌であることである。また、形質転換されるコリネ型細菌は、正常に機能する解糖経路とペントースリン酸経路とを有していることが好ましい。さらには、ピルビン酸から目的とする発酵産物、例えばコハク酸、酢酸又は乳酸に変換するための酵素を含有することが好ましい。さらに用いるコリネ型細菌は、エタノール；乳酸、酢酸、ギ酸等のような有機酸；フルフラール、ヒドロキシメチルフルフラールのような糖分解産物に対して高い耐性を持っていることが好ましい。このような点から、本発明で用いられるコリネ型細菌としては、コリネバクテリウム　グルタミカムR（FERM P-18976、特願２００２－２５２１９０（特開２００４－０８９０２９号公報））又は、コリネバクテリウム　グルタミカムATCC31831等が好ましい。
　また、これらコリネ型細菌は自然界に存在する野生株の変異株（例えば、セロビオース利用性変異株：FERM P-18977、FERM P-18978）（特願２００２－２５２１９０（特開２００４－０８９０２９号公報））又は人為的な遺伝子組換え株等であってもよい。人為的な遺伝子組換え株としては、例えば、エタノール生産組換え株として、FERM P-17887（FERM BP-7621）、FERM P-17888（FERM BP-7622）（ＰＣＴ／ＪＰ０１／０４９３５（国際公開ＷＯ０１／０９６５７３））及びJ.Mol.Microbiol.Biotechnol.,Vol8,243-254(2004)記載株、すなわち日本国特許第４２９４３７３５号に記載のFERM P-19361及びFERM P-19362等；セロビオース利用組換え株として、FERM P-18979（特願２００２－２５２１９０（特開２００４－０８９０２９号公報））等；コハク酸生産組換え株として、FERM P-19446（すなわちFERM BP-10060）及びFERM P-19477（すなわちFERM BP-10061）（FERM P-19446及びFERM P-19477はそれぞれ、ＷＯ２００５／０１０１８２Ａ１に記載されているFERM BP-10060及びFERM BP-10061と同じ菌株である）等が挙げられる。J.Mol.Microbiol.Biotechnol.,Vol8,243-254(2004)記載株（日本国特許第４２９４３７３５号に記載のFERM P-19361及びFERM P-19362）は、ザイモモナス モビリス由来のピルベート デカルボキシラーゼ遺伝子及びアルコール　デヒドロゲナーゼ遺伝子をコリネバクテリウム　グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）に導入したコリネ型細菌形質転換体である。
　本発明においては、Ｄ－キシロース利用能を有するコリネ型細菌が、コリネバクテリウム　グルタミカム(Corynebacterium glutamicum) R (FERM P-18976)、セロビオース利用性組換え株もしくは変異株(FERM P-18979、FERM P-18977及びFERM P-18978)、コハク酸生産組換え株（FERM P-19446及びFERM P-19477）、並びにエタノール生産組換え株(FERM P-17887（FERM BP-7621）、FERM P-17888（FERM BP-7622）及びJ.Mol.Microbiol.Biotechnol.,Vol 8,243-254（2004）記載の株（すなわちFERM P-19361及びFERM P-19362）)からなる群より選択されるいずれか１種の菌株のコリネ型細菌であって、かつＤ－キシロース利用能が付与されているものであることが好ましい。
　本発明において特に好ましいコリネ型細菌は、Ｄ－キシロース利用能が付与されたコリネバクテリウム　グルタミカムR（FERM P-18976）である。
シュガートランスポーター機能を有するタンパク質をコードする外来性遺伝子
　本発明では、Ｄ－キシロース利用能を有するコリネ型細菌に、シュガートランスポーター機能を有するタンパク質をコードする外来性遺伝子（シュガートランスポーター遺伝子ともいう）を導入する。これにより、コリネ型細菌形質転換体のＤ－キシロース利用能をより向上させることができる。シュガートランスポーター機能を有するタンパク質としては、ヘキソース及びペントースを輸送する機能を有するタンパク質であればよいが、中でも、Ｌ－アラビノース輸送系のプロトンシンポーターが好ましい。
　本発明においては、シュガートランスポーター機能を有するタンパク質をコードする外来性遺伝子として、Ｌ－アラビノース輸送系のプロトンシンポーター機能を有するタンパク質をコードする遺伝子（Ｌ－アラビノース輸送系のプロトンシンポーター遺伝子ともいう）を用いることが好ましい。Ｌ－アラビノース輸送系のプロトンシンポーター遺伝子は既知であり、ａｒａＥと称されている。細菌では、以下に示す菌株等でａｒａＥ遺伝子配列や酵素特性が報告されている。バチラス　サブチリス（Bacillus subtilis）〔J. Bacteriol.、Vol. 179、7705?7711(1997)〕、クレブシエラ オキシトカ8017（Klebsiella oxytoca 8017）〔J. Bacteriol.、Vol. 177、5379-5380（1995）〕、エシェリヒア コリ〔J. Biol. Chem.、Vol. 263、8003-8010（1988）〕。
　本発明におけるシュガートランスポーター機能を有するタンパク質をコードする外来性遺伝子としては、コリネバクテリウム　グルタミカム (Corynebacterium glutamicum) ATCC31831、エシェリヒア　コリ （Escherichia coli）、バチラス サブチリス（Bacillus subtilis）、バチラス　リチェニフォルミス（Bacillus licheniformis）、バチラス コアグランス（Bacillus coagulans）、ラクトバチルス サケイ（Lactobacillus sakei）、ペディオコッカス ペントサセウス（Pediococcus pentosaceus）、ラクトバチルス レウテリ（Lactobacillus reuteri）、オーシャノバチルス イヘエニス（Oceanobacillus iheyensis）、ラクトコッカス ラクティス（Lactococcus lactis）、ロイコノストック メセンテロイデス（Leuconostoc mesenteroides）、ラクトバチルス プランタリューム（Lactobacillus plantarum）、ラクトバチルス ファーメンタム（Lactobacillus fermentum）、ラクトバチルス ブレビス（Lactobacillus brevis）、ロイコノストック シテリューム（Leuconostoc citreum）、エンテロコッカス フェシウム（Enterococcus faecium）、クレブシエラ　オキシトカ（Klebsiella oxytoca）、及びサルモネラ　ティフィムリウム（Salmonella typhimurium）からなる群より選ばれる微生物由来のａｒａＥ遺伝子を用いることができる。
　本発明に適したＬ－アラビノース輸送系のプロトンシンポーター活性を有するタンパク質をコードする外来性遺伝子としては、コリネバクテリウム　グルタミカム　ATCC31831、エシェリヒア　コリ、バチラス　サブチリス、クレブシエラ　オキシトカ（Klebsiella oxytoca）、及びサルモネラ　ティフィムリウムからなる群より選ばれる微生物由来のａｒａＥ遺伝子を用いることが好ましい。また、Ｌ－アラビノース輸送系のプロトンシンポーター遺伝子として、配列番号１３で示されるＤＮＡ配列、又は配列番号１３で示されるＤＮＡ配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡ配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつシュガートランスポーター機能（例えば、Ｌ－アラビノース輸送系のプロトンシンポーター機能）を有するポリペプチドをコードするＤＮＡを用いることが好ましい。すなわち本発明においては、シュガートランスポーター機能を有するタンパク質をコードする外来性遺伝子として、配列番号１３で示される塩基配列からなるＤＮＡ、又は配列番号１３で示される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつシュガートランスポーター機能を有するポリペプチドをコードするＤＮＡを用いることが好ましい。配列番号１３の塩基配列のＤＮＡは、コリネバクテリウム　グルタミカムATCC31831等由来の遺伝子であり、ａｒａＥ遺伝子のＤＮＡの塩基配列である。Ｄ－キシロース利用菌株におけるａｒａＥ遺伝子の適当な発現量の調節方法は、当業者には良く知られている。本発明においては、上記Ｄ－キシロース代謝関連酵素遺伝子、及びシュガートランスポーター遺伝子の由来微生物の種類、組み合わせ、及び導入の順番等は特に限定されない。
　ここで、ストリンジェントな条件とは、９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９７％以上、さらにより好ましくは９８％以上の相同性が配列間に存在するときにハイブリダイゼーションが起こることを意味する。通常、完全ハイブリッドの融解温度（Ｔｍ）より約５～３０℃、好ましくは約１０～２５℃、より好ましくは、約１５～２０℃低い温度でハイブリダイゼーションが起こる場合をいう。ストリンジェントな条件については、J.Sambrookら，Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989),特に11.45節”Conditions for Hybridization of Oligonucleotide Probes”に記載されており、ここに記載の条件を使用し得る。
　本発明において、塩基配列間の相同性は、計算ソフト　ＧＥＮＥＴＹＸ（登録商標）　Ｖｅｒ．８（ジェネティックス社製）を用いて計算した値である。
　なお、本発明において、あるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡ、例えば、配列番号１３で示される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡは、配列番号１３の塩基配列と約９０％以上の配列相同性を有することが好ましく、約９５％以上の配列相同性を有することがより好ましく、約９８％以上の配列相同性を有することが特に好ましい。
　本発明のコリネ型細菌形質転換体は、Ｄ－グルコース及びＤ－キシロースを並行的かつ同時利用するものであることが好ましく、Ｄ－グルコース、Ｄ－キシロース及びＬ－アラビノースを並行的かつ同時利用するものであることがより好ましい。
　本発明のコリネ型細菌形質転換体は、例えば、上記のシュガートランスポーター遺伝子を、Ｄ－キシロース利用能を有するコリネ型細菌に導入して形質転換することによって作製することができる。また、Ｄ－グルコース、Ｄ－キシロース及びＬ－アラビノースを並行的かつ同時利用するコリネ型細菌形質転換体は、例えば、コリネ型細菌に、上述したＤ－キシロース代謝関連酵素遺伝子及びシュガートランスポーター遺伝子、並びにＬ－アラビノース代謝関連遺伝子を導入することにより作製することができる。Ｌ－アラビノース代謝関連遺伝子としては、例えば、エシェリヒア コリ（Escherichia coli）のＬ－アラビノースイソメラーゼをコードする遺伝子、Ｌ－リブロキナーゼをコードする遺伝子及びＬ－リブロース－５－フォスフェイト－４－エピメラーゼをコードする遺伝子等が好適である。Ｄ－キシロース代謝関連酵素遺伝子、シュガートランスポーター遺伝子及びＬ－アラビノース代謝関連遺伝子の由来微生物の種類、組み合わせ、及び導入の順番等は特に限定されない。
ベクターの構築
　まず、上記のシュガートランスポーター遺伝子、例えば、Ｌ－アラビノース輸送系のプロトンシンポーターをコードするＤＮＡ（ａｒａＥ、タンパク質をＡｒａＥともいう）の配列をＰＣＲ (polymerase chain reaction) 法により増幅するためのオリゴヌクレオチドプライマーセットを作製する。このようなプライマーセットとしては、例えば配列番号１４、１５の塩基配列で示されるものなどが挙げられる。ＰＣＲ法は、公知のＰＣＲ装置、例えばサーマルサイクラーなどを利用することができる。ＰＣＲのサイクルは、公知の技術にしたがって行なわれてよく、例えば、変性、アニーリング、伸張を１サイクルとし、通常１０～１００サイクル、好ましくは、約２０～５０サイクルである。ＰＣＲの鋳型としては、シュガートランスポーター遺伝子を有する微生物から単離したＤＮＡを用いて、ＰＣＲ法によりＡｒａＥをコードするＤＮＡのｃＤＮＡを合成することができる。ＰＣＲ法によって得られた遺伝子は、適当なクローニングベクターに導入することができる。クローニング法としては、pGEM-T easy vector system（Promega社製）、TOPO TA-cloning system（Invitrogen社製）、Mighty Cloning Kit（Takara社製）などの商業的に入手可能なＰＣＲクローニングシステムなどを使用することもできる。また、方法の１つの例を実施例で詳記するが、該領域を含むＤＮＡ断片を、既知のＡｒａＥをコードするＤＮＡの塩基配列に基づいて適当に設計された合成プライマーを鋳型として用いたハイブリダイゼーション法により取得することもできる。
　次いで、ＰＣＲ法で得られた遺伝子を含むクローニングベクターを、微生物、例えばエシェリヒア　コリ　ＪＭ１０９菌株などに導入し、該菌株を形質転換する。この形質転換された菌株を適当な抗生物質（例えばアンピシリン、クロラムフェニコールなど）を含む培地で培養し、培養物から菌体を回収する。回収された菌体からプラスミドＤＮＡを抽出する。プラスミドＤＮＡの抽出は、公知の技術によって行なうことができ、また市販のプラスミド抽出キットを用いて簡便に抽出することもできる。市販のプラスミド抽出キットとしては、キアクイックプラスミド精製キット（商品名：Qiaquick plasmid purification kit、キアゲン社製）などが挙げられる。この抽出されたプラスミドＤＮＡの塩基配列を決定することにより、ＡｒａＥをコードする遺伝子配列を確認することができる。ＤＮＡの塩基配列は、公知の方法、例えばジオキシヌクレオチド酵素法などにより決定することができる。また、キャピラリー電気泳動システムを用いて、検出には多蛍光技術を使用して塩基配列を決定することもできる。また、ＤＮＡシーケンサー、例えばABI PRISM 3730xl DNA Analyzer（アプライドバイオシステム社製）などを使用して塩基配列を決定することもできる。
　上記の方法は、遺伝子工学実験の常法に基づいて行なうことができる。種々の微生物のベクターや外来遺伝子の導入及び発現法は、多くの実験書に記載されているので〔例えば、Molecular Cloning： A Laboratory Manual（3rd Edition）CSHL Press（2001）、又はCurrent protocols in molecular biology. Green Publishing and Wiley Interscience, New York（1987）等〕、それらに従ってベクターの選択、遺伝子の導入及び発現を行なうことができる。
　次に、ａｒａＥ遺伝子を、前述したＤ－キシロース利用能を有するコリネ型細菌において、プラスミド上又は染色体上で発現させる。例えば、プラスミドを用いて、これらの遺伝子は発現可能な制御配列下に導入される。ここで「制御配列下」とはこれらの遺伝子が、例えば、プロモーター、インデューサー、オペレーター、リボソーム結合部位及び転写ターミネーター等との共同作業により転写翻訳できることを意味する。このような目的で使用されるプラスミドベクターとしては、コリネ型細菌内で自律複製機能を司る遺伝子を含むものであれば良い。その具体例としては、例えば、ブレブバクテリウム　ラクトファーメンタム（Brevibacterium lactofermentum）2256由来のpAM330〔特開昭58-67699号公報、Agric. Biol. Chem.、Vol. 48、2901-2903（1984）及びNucleic Acids Symp Ser.、Vol. 16、265-267（1985）〕、コリネバクテリウム グルタミカム ATCC13058由来のpHM1519〔Agric. Biol. Chem.、Vol. 48、2901-2903（1984）〕及びpCRY30〔Appl. Environ. Microbiol.、 Vol. 57、759-764（1991）〕、コリネバクテリウム グルタミカム T250由来のpCG4〔特開昭57-183799号公報、J. Bacteriol.、Vol. 159、306-311（1984）〕、pAG1、pAG3、pAG14、pAG50（特開昭62-166890号公報）pEK0、pEC5、pEKEx1〔Gene、Vol. 102、93-98（1991）〕等、あるいはそれらから誘導されるプラスミドなどが使用可能である。また、ベクターは、種々の制限酵素部位をその内部にもつマルチクローニングサイトを含んでいる、又は単一の制限酵素部位を含んでいることが好ましい。
　本発明においては、広範囲の種類のプロモーターを好適に用いることができる。このようなプロモーターは、酵母、細菌及び他の細胞供給源を含む多くの公知の供給源から得ることができ、コリネ型細菌において目的遺伝子の転写を開始させる機能を有する塩基配列であればいかなるものであってもよい。本発明に使用されるプロモーターとしては、効率の良い、非グルコース抑制プロモーターが好ましい。そのようなプロモーターの好適な例としては、例えば、コリネ型細菌で強力な構成的なプロモーターとして既知である、ｌａｃ、ｔｒｃ、ｔａｃプロモーター等が挙げられる。本発明に使用されるプロモーターは、必要に応じて、修飾して、その調節機構を変更することができる。また、目的遺伝子の下流に配置される制御配列下のターミネーターについても、コリネ型細菌においてその遺伝子の転写を終了させる機能を有する塩基配列であれば、いかなるものであってもよい。
　本発明のコリネ型細菌形質転換体の創製に使用されるプラスミドベクターの構築は、例えば、コリネバクテリウム グルタミカム ATCC31831のａｒａＥ遺伝子を用いる場合では、塩基配列が確認された該遺伝子を、適当なプロモーター、ターミネーター等の制御配列と連結後、上記例示されているいずれかのプラスミドベクターの適当な制限酵素部位に挿入することにより、行うことができる。詳細は、実施例に記載している。
形質転換
　目的遺伝子を含むプラスミドベクターのコリネ型細菌への導入方法としては、電気パルス法（エレクトロポレーション法）、ＣａＣ１２法等コリネ型細菌への目的遺伝子導入が可能な方法であれば特に限定されるものではない。その具体例として、例えば電気パルス法としては、公知の方法〔Agric. Biol. Chem.、Vol. 54、443-447（1990）〕又は〔Res. Microbiol.、Vol. 144、181-185（1993）〕を用いることができる。
　本発明のコリネ型細菌形質転換体の取得方法としては、常法に従い、目的遺伝子を含むプラスミドに薬剤耐性遺伝子等を組み入れて、適切な濃度の当該薬剤を含むプレート培地上に目的遺伝子導入処理を行ったコリネ型細菌を塗布することにより形質転換されたコリネ型細菌を選抜することができる。その方法の具体例としては、例えば、〔Agric. Biol. Chem.、Vol. 54、443-447（1990）〕又は〔Res. Microbiol.、Vol. 144、181-185（1993）〕に記載の方法等を挙げることができる。
　上記の方法により創製されるコリネ型細菌の形質転換体の例としては、具体的には、コリネバクテリウム　グルタミカム (Corynebacterium glutamicum) Ind-araE/pCRA811（受託番号　ＮＩＴＥ　ＢＰ－５７６）及びコリネバクテリウム　グルタミカム (Corynebacterium glutamicum) X5-Ind-araE/Plac-araBAD（受託番号　ＮＩＴＥ　ＢＰ－５７７）（いずれも、独立行政法人製品評価技術基盤機構　特許生物寄託センター（日本国千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8（郵便番号292-0818））に寄託済み。受託日：２００８年５月２８日）、並びにコリネバクテリウム グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）X5-Ind-araE-Δldh/pEthAra （受託番号　ＮＩＴＥ　ＢＰ－５８１）（独立行政法人製品評価技術基盤機構　特許生物寄託センター（日本国千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8（郵便番号292-0818））に寄託済み。受託日：２００８年６月４日）などが挙げられる。これらのコリネ型細菌の形質転換体は、Ｄ－グルコース及びＤ－キシロースを並行的かつ同時利用するものであるため、後述するようにＤ－キシロース及びＤ－グルコース資源を含む培地で好適に用いることができる。
　本発明で創製したコリネ型細菌形質転換体は、有機化合物生産性を向上させるために、ペントースリン酸経路の流量の増加；エタノール、浸透圧又は有機酸に対する耐性の増加及び副生物（目的とする生成産物以外の炭素含有分子を意味すると理解される）生産の減少からなる群から選択される特徴の１又は２以上を生じる遺伝子修飾をさらに含むことができる。そのような遺伝子修飾は、具体的には、外来性遺伝子の過剰発現及び／又は内在性遺伝子の不活化；古典的突然変異誘起；スクリーニング及び／又は目的変異体の選別などにより導入することができる。
　かくして創製された本発明のコリネ型細菌形質転換体は、Ｄ－キシロースを原料として（TCA経路に存在するポリカルボン酸を製造する場合は、さらに炭酸イオン等も原料として）、モノカルボン酸、ジカルボン酸、ケトカルボン酸、ヒドロキシカルボン酸、アミノ酸、モノアルコール、ポリオール及びビタミン等の多様な有機化合物を、糖類の代謝速度を向上させる、又は糖類の代謝速度の経時低下を抑制すると同時に、高い生産速度と高い蓄積濃度でもって、反応液中に生成させることができるものである。
（ＩＩ）有機化合物の製造方法
増殖培養工程
　本発明のコリネ型細菌形質転換体を用いて有機化合物を製造する場合は、まず上述したコリネ型細菌形質転換体を好気条件下で増殖培養することが好ましい。
　コリネ型細菌形質転換体の培養は、炭素源、窒素源及び無機塩等を含む通常の栄養培地を用いて行うことができる。培養には、炭素源として、例えばグルコース又は廃糖蜜等；窒素源として、例えばアンモニア、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、硝酸アンモニウム又は尿素等をそれぞれ単独で又は２種以上を混合して用いることができる。また、無機塩として、例えば、リン酸一水素カリウム、リン酸ニ水素カリウム又は硫酸マグネシウム等を使用することができる。この他にも必要に応じて、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスティープリカー、カザミノ酸；ビオチン又はチアミン等の各種ビタミン等の栄養素を培地に適宜添加することもできる。
　培養は、通気撹拌又は振盪等の好気的条件下、約１５～４５℃、好ましくは約２５～３７℃の温度で行うことができる。培養時の培地のｐＨは５～１０付近、好ましくは６．５～８．５付近の範囲がよく、培養中のｐＨ調整は、酸又はアルカリを添加することにより行うことができる。培養開始時の培地の炭素源濃度は、好ましくは約１～２０％（Ｗ／Ｖ）、より好ましくは約２～５％（Ｗ／Ｖ）である。また、培養期間は通常１～７日間程度である。
　次いで、コリネ型細菌形質転換体の培養菌体を回収する。上記の如くして得られる培養物から培養菌体を回収分離する方法としては、特に限定されず、例えば遠心分離、膜分離等の公知の方法を用いることができる。
　回収された培養菌体に対して処理を加え、得られる菌体処理物を次工程に用いてもよい。前記菌体処理物としては、培養菌体に何らかの処理が加えられたものであればよく、例えば、菌体をアクリルアミド又はカラギーナン等で固定化した固定化菌体等が挙げられる。
　上記の如くして得られる培養物から回収分離されたコリネ型細菌形質転換体の培養菌体又はその菌体処理物を用いて、有機化合物を生成させる工程（有機化合物生成工程ともいう）を行う。
有機化合物生成工程
　有機化合物生成工程においては、Ｄ－キシロースを含有する培地（反応培地）中で、上記コリネ型細菌形質転換体を用いて有機化合物を生成させる。このような工程を含む有機化合物の製造方法も、本発明の１つである。
　反応培地には炭素源としてＤ－キシロースが含まれるが、Ｄ－キシロースに加えてＤ－グルコースも含むことができる。Ｄ－キシロース又はＤ－グルコースとしては、Ｄ－キシロース又はＤ－グルコースそのものでもよく、例えば、リグノセルロース、アラビナン、セルロース、デンプンなどのようなＤ－キシロース又はＤ－グルコース単位からなる炭水化物のオリゴマー又はポリマーでもよい。そのような炭水化物からＤ－キシロース又はＤ－グルコース単位を遊離させるために、適当な炭水化物分解酵素（キシラナーゼ、グルカナーゼ、アミラーゼなど）を、反応培地に加えてもよく、コリネ型細菌形質転換体に該酵素を生産させてもよい。
　反応培地は、Ｄ－キシロース及びＤ－グルコース以外の有機炭素源を含んでもよい。このような有機炭素源としては、本発明のコリネ型細菌形質転換体が生化学反応に利用できる糖類が挙げられる。
　具体的には、糖類としては、（Ｄ－又はＬ－）アラビノース、ガラクトース、フルクトース又はマンノースなどの単糖類；セロビオース、ショ糖、ラクトース、マルトースなどの二糖類；デキストリン又は可溶性澱粉などの多糖類などが挙げられる。特に、Ｃ６糖やＣ５糖などの単糖類が好ましく、中でも、Ｌ－アラビノースが好ましい。
　より好ましくは、有機化合物の生成反応に用いられる反応培地組成は、コリネ型細菌形質転換体又はその処理物がその代謝機能を維持するために必要な成分、即ち、各種糖類等の炭素源；蛋白質合成に必要な窒素源；リン、カリウム又はナトリウム等の塩類；さらに鉄、マンガン又はカルシウム等の微量金属塩を含む。これらの添加量は所要反応時間、目的有機化合物生産物の種類又は用いられるコリネ型細菌形質転換体の種類等により適宜定めることができる。用いるコリネ型細菌形質転換体によっては特定のビタミン類の添加が好ましい場合もある。炭素源、窒素源、無機塩類、ビタミン、微量金属塩は、公知のもの、例えば増殖培養工程につき例示したものでよい。
　培地のｐＨは、約６～８が好ましい。
　コリネ型細菌形質転換体又はその菌体処理物とＤ－キシロースを含む炭素源との反応は、本発明のコリネ型細菌形質転換体又はその菌体処理物が活動できる温度条件下で行なわれることが好ましく、コリネ型細菌形質転換体又はその菌体処理物の種類などにより適宜選択することができる。温度は、通常、約２５～３５℃である。また、後述する反応系の炭酸ガス封入法にも関連して、反応培地に二酸化炭素又は各種の炭酸塩もしくは炭酸水素塩等の無機炭酸塩を糖類などの有機炭素源に加えて注入することが目的有機化合物によっては有効な場合もある。培地中の炭素源濃度としては特に限定されないが、通常、約０．１～３０質量％、好ましくは約０．５～２０質量％の濃度で使用される。また、炭素源における糖類の（Ｄ－キシロース／Ｄ－グルコース）混合比率（質量比）に関しては、糖類由来バイオマス原料種にもよるが、通常その比率は１／３～２／３程度である。また、例えば、反応培地中の炭素源に各種のＣ６糖類やＣ５糖類を含む場合、Ｃ６糖及びＣ５糖の混合比率（Ｃ５糖／Ｃ６糖の質量比）は、通常１／４～３／４程度である。
　有機化合物生成工程においては、反応培地が還元状態下にあることが好ましい。すなわちコリネ型細菌形質転換体又はその菌体処理物は、還元状態下の反応培地で目的有機化合物の生成反応に供せられることが好ましい。有機化合物生成方式は、回分式、流加式、連続式いずれの生成方式も可能である。
　本発明において、還元状態下にある反応培地中でコリネ型細菌形質転換体を用いて有機化合物を生成させると、すなわち還元状態下の生化学反応により有機化合物を製造すると、本発明のコリネ型細菌形質転換体の増殖分裂が完全に抑制され、増殖に伴う分泌副生物の実質的な完全抑制を実現することができる。この観点からは、培養増殖工程から回収されたコリネ型細菌形質転換体又はその菌体処理物が反応培地に供せられるときには、コリネ型細菌細胞内外の好気増殖時の環境状態が反応培地にもたらされない方法や条件を用いることが好ましい。つまり、反応培地は、増殖培養過程で生成し、菌体内外に存在する生成物質を実質的に含有しないことが好ましい。より具体的には、増殖培養過程で生成し、菌体外に放出された分泌副生物、及び培養菌体内の好気的代謝機能により生成し菌体内に残存する物質が、反応培地に実質的に存在しない状態であることが好ましい。このような状態は、例えば、増殖培養後の培養液を用いて遠心分離、膜分離等の方法を行うことによって、及び／又は培養後の菌体を還元状態下で２時間ないし１０時間程度放置することで実現される。
　本工程においては、還元状態下の反応培地を用いることが好ましいが、反応培地は、固体状、半固体状又は液体状等いずれの形状を有していてもよい。
　本発明における還元状態とは、反応系（反応培地）の酸化還元電位で規定され、反応培地の酸化還元電位がマイナス（－）の値であることを意味する。還元状態下にある反応培地の酸化還元電位は、好ましくは約－２００ｍＶ～－５００ｍＶ程度、より好ましくは約－２５０ｍＶ～－５００ｍＶ程度である。
　反応培地の還元状態は簡便にはレサズリン指示薬（還元状態であれば、青色から無色への脱色）である程度推定できるが、正確には酸化還元電位差計（例えば、ORP Electrodes、BROADLEY JAMES社製）を用いて測定する。本発明においては、反応培地に菌体又はその処理物を添加した直後から有機化合物を採取するまで、還元状態を維持していることが好ましいが、少なくとも有機化合物を採取する時点で反応培地が還元状態であればよい。反応時間の約５０％以上、より好ましくは約７０％以上、さらに好ましくは約９０％以上の時間、反応培地が還元状態に保たれていることが好ましい。中でも、反応時間の約５０％以上、より好ましくは約７０％以上、さらに好ましくは約９０％以上の時間、反応培地の酸化還元電位が約－２００ｍＶ～－５００ｍＶ程度に保たれていることが特に好ましい。
　このような還元状態の実現は具体的には、前記の培養後の培養菌体調製方法、反応培地の調製方法、又は反応途中における還元状態の維持方法等によりなされる。還元状態下の反応培地の調製方法は、公知の方法を用いてよい。例えば、反応培地用水溶液の調製方法は、例えば硫酸還元微生物などの絶対嫌気性微生物用の培養液調製方法〔The dissimilatory sulfate-reducing bacteria, In The Prokaryotes, A Handbook on Habitats, Isolation and Identification of Bacteria, Ed. by Starr, M. P. et. al. Berlin, Springer Verlag、926-940（1981）や（農芸化学実験書　第三巻、京都大学農学部 農芸化学教室編、1990年第26刷、産業図書株式会社出版）〕などを使用することができ、所望する還元状態の水溶液を得ることができる。
　反応培地の調製方法として、より具体的には反応培地を加熱処理又は減圧処理することにより溶解ガスを除去する方法等が挙げられる。より具体的には、約１０ｍｍＨｇ以下、好ましくは約５ｍｍＨｇ以下、より好ましくは約３ｍｍＨｇ以下の減圧下で、約１～６０分程度、好ましくは約５～４０分程度、反応培地を処理することにより、溶解ガス、特に溶解酸素を除去し、還元条件下の反応培地を作製することができる。また、適当な還元剤（例えば、チオグリコール酸、アスコルビン酸、システィン塩酸塩、メルカプト酢酸、チオール酢酸、グルタチオン、硫化ソーダ等）を添加して還元状態の反応培地を調製することもできる。また、場合により、これらの方法を適宜組み合わせることも有効な還元状態の反応培地を調製する方法となる。
　反応途中における還元状態の維持方法としては、反応系外からの酸素の混入を可能な限り防止することが好ましく、反応系を窒素ガス等の不活性ガス、炭酸ガス等で封入する方法が通常用いられる。酸素混入をより効果的に防止する方法としては、反応途中においてコリネ型細菌形質転換体の菌体内の代謝機能を効率よく機能させるために、反応系のｐＨ維持調整液の添加や各種栄養素溶解液を適宜添加する必要が生じる場合もあるが、このような場合には添加する溶液から酸素を予め除去しておくことが有効である。
　最後に、上述のようにして反応培地で生成した有機化合物を採取する。その方法はバイオプロセスで用いられる公知の方法を用いることができる。そのような公知の方法として、有機化合物生成液の塩析法、再結晶法、有機溶媒抽出法、エステル化蒸留分離法、クロマトグラフィー分離法又は電気透析法等があり、生成有機化合物の特性に応じてその分離精製採取法は適宜定めることができる。
　本発明の方法により製造することができる有機化合物としては、有機酸、アルコール、アミノ酸又はビタミン類等が挙げられる。有機酸としては例えば、酢酸、乳酸、３－ヒドロキシプロピオン酸、アクリル酸、コハク酸、フマル酸、リンゴ酸、オキサロ酢酸、クエン酸、シスアコニット酸、イソクエン酸、イタコン酸、２－オキソグルタル酸又はシキミ酸などが挙げられる。アルコールとしては、例えば、エタノール、ブタノール、１，３－プロパンジオール、グリセロール、キシリトール、ソルビトール又は１，４－ブタンジオールなどが挙げられる。アミノ酸としては、例えば、バリン、ロイシン、アラニン、アスパラギン酸、リジン、イソロイシン又はスレオニンなどが挙げられる。本発明の方法は、エタノール、乳酸、コハク酸、キシリトール、酢酸及びアミノ酸からなる群より選ばれる１種以上の有機化合物の製造に好適である。
　本発明はまた、前記の条件下における反応によりＤ－キシロース、又はＤ－グルコースとＤ－キシロースとの混合物を有機化合物にする能力が著しく改善されたＤ－キシロース利用コリネ型細菌形質転換体を提供する。
　以下、本発明を実施例により詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
実施例１　コリネバクテリウム グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）R/pCRA811及びコリネバクテリウム グルタミカム（Corynebacterium glutamicum） Ind-araE/pCRA811の創製
（１）　プラスミドｐＣＲＡ８１１構築方法
ａ）　エシェリヒア コリ（Escherichia coli） ＪＭ１０９からの染色体ＤＮＡの抽出
　エシェリヒア コリ（Escherichia coli） ＪＭ１０９を、Ｌ培地（トリプトン　１０ｇ、イーストエキストラクト　５ｇ及びＮａＣｌ　５ｇを蒸留水１Ｌに溶解）に、白金耳を用いて植菌後、対数増殖期まで３７℃で振盪培養し、菌体を集めた。ＤＮＡゲノム抽出キット（商品名：GenomicPrep Cells and Tissue DNA Isolation Kit、アマシャム社製）を用いて、取扱説明書に従い、集めた菌体から染色体ＤＮＡを回収した。
ｂ）　エシェリヒア コリ（Escherichia coli）からのＤ－キシロースイソメラーゼ遺伝子（ｘｙｌＡ）及びＤ－キシルロキナーゼ遺伝子（ｘｙｌＢ）のクローニング
　エシェリヒア コリ（Escherichia coli）のキシロースイソメラーゼ遺伝子（以下、ｘｙｌＡと記す）（配列番号１）、及びキシルロキナーゼ遺伝子（以下、ｘｙｌＢと記す）（配列番号２）の２つの遺伝子を含むＤＮＡ断片を以下のＰＣＲ法により増幅した。
　ＰＣＲに際して、ｘｙｌＡ遺伝子及びｘｙｌＢ遺伝子をクローン化するべく、エシェリヒア コリ（Escherichia coli）の配列を基に、下記の一対のプライマーセットを、アプライド・バイオシステムズ（Applied Biosystems）社製「３９４　ＤＮＡ／ＲＮＡシンセサイザー（synthesizer）」を用いて合成し、使用した。
ｘｙｌＡ遺伝子増幅用プライマーセット
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000001
　尚、前者にはＥｃｏＲＩサイトが、後者にはＳｍａＩサイトがそれぞれ末端に付加されている。鋳型ＤＮＡには、上記の実施例１、（１）、ａ）項にて抽出したエシェリヒア コリ（Escherichia coli） ＪＭ１０９の染色体ＤＮＡを用いた。
　ＰＣＲは、パーキンエルマーシータス社製の「ＤＮＡサーマルサイクラー」を用い、反応試薬として、ＤＮＡポリメラーゼ（商品名：Takara LA Taq HS DNA polymerase、宝酒造株式会社製）を用いて下記の条件で行なった。
反応液：
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000002
　以上を混合し、この１００μＬの反応液をＰＣＲにかけた。
ＰＣＲサイクル：
　　　デナチュレーション過程：　９４℃、１分
　　　アニーリング過程：　５５℃、１分
　　　エクステンション過程：　７２℃、２分
　以上を１サイクルとし、３０サイクル行なった。
　上記で生成した反応液の一部を用いて１％（Ｗ／Ｖ）アガロースゲルにより電気泳動を行なったところ、それぞれｘｙｌＡ遺伝子及びｘｙｌＢ遺伝子を含む、約１．４ｋｂ及び約１．６ｋｂのＤＮＡ断片が検出できた。
　上述の制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＳｍａＩで処理した約１．６ｋｂの増幅産物と、ＥｃｏＲＩ及びＳｍａＩで制限酵素処理をしたベクターｐＴｒｃ９９Ａ（Pharmacia社製）とを混合し、これにライゲーションキット（商品名：Mighty Cloning Kit、宝酒造株式会社製）を添加後、取扱説明書に従い反応させた。このライゲーション溶液を用い、塩化カルシウム法〔Journal of Molecular Biology.、Vol. 53、159（1970）〕によりエシェリヒア コリ（Escherichia coli）ＪＭ１０９を形質転換し、アンピシリン５０μｇ／ｍＬ、Ｘ－ｇａｌ（5-Bromo-4-chloro-3-indoxyl-beta-D-galactopyranoside）２００μｇ／ｍＬ、ＩＰＴＧ（isopropyl 1-thio-beta-d-galactoside）１００μｇ／ｍＬを含むＬ寒天培地〔組成：寒天が１．５％（Ｗ／Ｖ）含まれていることを除けば上記Ｌ培地と同一成分組成〕に塗布した。この培地上で白色を呈する生育株を常法により液体培養し、培養液よりｘｙｌＡ遺伝子を含有する長さ約１．４ｋｂのＤＮＡ断片が挿入されたプラスミドを、プラスミド抽出キット（商品名：QIAprep Spin Miniprep Kit、キアゲン社製）を用いて抽出した。
　該ｘｙｌＡ遺伝子を含むプラスミドをｐＣＲＡ８０１と命名した。
　制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＳｍａＩで処理した約１．６ｋｂの増幅産物も同様の方法でＥｃｏＲＩ及びＳｍａＩで制限酵素処理をしたベクターｐＴｒｃ９９Ａと連結し、該ｘｙｌＢ遺伝子を含むプラスミドｐＣＲＡ８０２を構築した。
　構築したｐＣＲＡ８０１を鋳型としてｔｒｃプロモーター（Ｐｔｒｃ）に連結したｘｙｌＡ遺伝子を含むＤＮＡ断片を用いて、下記に示すプライマーセットを用いたこと以外は上記と同じ条件でＰＣＲを行なった。
Ｐｔｒｃ－ｘｙｌＡ遺伝子増幅用プライマーセット
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000003
　制限酵素Ｂｇｌ　ＩＩ及びＢａｍＨＩで処理した約１．６ｋｂの増幅産物も同様の方法でＢｇｌ　ＩＩ及びＢａｍＨＩで制限酵素処理をしたベクターコリネ型細菌－大腸菌シャトルベクターｐＣＲＢ１（特開２００６－１２４４４０）と連結し、該Ｐｔｒｃ－ｘｙｌＡ遺伝子を含むプラスミドｐＣＲＡ８１０を構築した。
　構築したｐＣＲＡ８０２を鋳型としてｔｒｃプロモーター（Ｐｔｒｃ）に連結したｘｙｌＢ遺伝子を含むＤＮＡ断片を用いて、下記に示すプライマーセットを用いたこと以外は上記と同じ条件でＰＣＲを行なった。
Ｐｔｒｃ－ｘｙｌＢ遺伝子増幅用プライマーセット
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000004
　制限酵素ＦｂａＩ及びＢａｍＨＩで処理した約１．７ｋｂの増幅産物も、選択培地にアンピシリンの代わりにクロラムフェニコールを使用する以外は、上記と同様の方法でＦｂａＩ及びＢａｍＨＩで制限酵素処理をしたベクターｐＣＲＡ８１０と連結し、該Ｐｔｒｃ－ｘｙｌＢ遺伝子を含むプラスミドｐＣＲＡ８１１（ベクターｐＣＲＡ８１１）を構築した（図１）。
（２）　コリネバクテリウム グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）ATCC31831からのａｒａオペロンの単離、及びａｒａＥの単離
ａ）　コリネバクテリウム グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）ATCC31831からの染色体ＤＮＡの抽出
　コリネバクテリウム グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）ATCC31831からの染色体ＤＮＡ抽出は、培地として表１に示すＡ液体培地を使用することと、培養温度が３０℃であること以外は、上記のエシェリヒア コリ（Escherichia coli）ＪＭ１０９と同様の条件で行なった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
ｂ）　コリネバクテリウム グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）ATCC31831からのＬ－アラビノース代謝関連遺伝子のクローニング
　Ｌ－アラビノースを単一炭素源として良好な増殖を示したコリネバクテリウム グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）ATCC31831よりＬ－アラビノース代謝に関与する遺伝子のクローニングを試みた。データベースのホモロジー検索の結果より、３種のＬ－アラビノース代謝酵素Ｌ－アラビノースイソメラーゼ、Ｌ－リブロキナーゼ、Ｌ－リブロース－５－フォスフェイト－４－エピメラーゼをコードする各遺伝子ａｒａＡ、ａｒａＢ、ａｒａＤの内、ａｒａＡが最も異種間での保存性が高かった。そこで、このａｒａＡにおける保存領域の配列から以下の一対のプライマーセットを、アプライド・バイオシステムズ社製「３９４　ＤＮＡ／ＲＮＡシンセサイザー」を用いて合成し、ＰＣＲに使用した。
ａｒａＡ相同領域増幅用プライマーセット
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000006
　鋳型ＤＮＡには、上記の実施例１、（２）、ａ）項にて抽出したコリネバクテリウム グルタミカム（Corynebacterium glutamicum） 31831の染色体ＤＮＡを用いた。ＰＣＲは、パーキンエルマーシータス社製の「ＤＮＡサーマルサイクラー」を用い、反応試薬として、ＤＮＡポリメラーゼ（商品名：Takara LA Taq HS DNA polymerase、宝酒造株式会社製）を用いて下記の条件で行なった。
反応液：
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000007
　以上を混合し、この５０μＬの反応液をＰＣＲにかけた。
ＰＣＲサイクル：
　　　デナチュレーション過程：　９４℃、１分
　　　アニーリング過程：　３７℃、１分
　　　エクステンション過程：　７２℃、１分
　以上を１サイクルとし、３０サイクル行なった。
　上記で生成した反応液を用いて１％（Ｗ／Ｖ）アガロースゲルにより電気泳動を行なったところ、ａｒａＡ相同領域を含む、約３９０ｂｐのＤＮＡ断片が検出できた。
　ＰＣＲ増幅産物は、pGEM-T easy vector system（Promega社製）を用いて取扱説明書に従い反応させた。
　このライゲーション溶液を用い、上記の実施例１、（１）、ｂ）項と同様の条件、方法にてａｒａＡ相同領域を含有する長さ約３９０ｂｐのＤＮＡ断片が挿入されたプラスミド取得した。このように作製されたプラスミドをシーケンスすることでＤＮＡ配列を決定した。こうして得た配列は、他の細菌で報告されているａｒａＡの塩基配列と非常に高い相同性を示した。
　決定した配列から作製したプローブと、上記の実施例１、（２）、ａ）項にて抽出したコリネバクテリウム グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）ATCC31831の染色体ＤＮＡを用いてサザンハイブリダイゼーションを行なった結果、制限酵素ＸｂａＩで処理した断片において約９．９ｋｂの位置にシングルのバンドが検出できた。サザンハイブリダイゼーションの結果を基にコロニーダイハイブリダイゼーションを行ない、ａｒａＡを含むＸｂａＩ断片と連結したプラスミドを作製した。このプラスミドをシーケンスすることでＤＮＡ配列を決定した。得られた配列を解析した結果、ａｒａＢ、ａｒａＤ、ａｒａＡの順に並ぶ約４．０ｋｂのＤＮＡ配列を確認できた。またａｒａＢの約２．５ｋｂ上流にはＬ－アラビノース輸送系のプロトンシンポーター遺伝子ａｒａＥ（配列番号１３）が存在していた（図２）。
ｃ）　コリネバクテリウム グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）ATCC31831からのＬ－アラビノース輸送系のプロトンシンポーター遺伝子（ａｒａＥ）のクローニング
　コリネバクテリウム　グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）ATCC31831のａｒａＥ遺伝子を含むＤＮＡ断片を以下のＰＣＲ法により増幅した。
　ＰＣＲに際しては、以下の一対のプライマーセットを、アプライド・バイオシステムズ社製「３９４　ＤＮＡ／ＲＮＡシンセサイザー」を用いて合成し、使用した。
ａｒａＥ遺伝子増幅用プライマーセット
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000008
尚、いずれのプライマーにもＥｃｏＲＩサイトが末端に付加されている。
　鋳型ＤＮＡには、上記の実施例１、（２）、ａ）項にて抽出したコリネバクテリウム グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）ATCC31831の染色体ＤＮＡを用いた。ＰＣＲは、パーキンエルマーシータス社製の「ＤＮＡサーマルサイクラー」を用い、反応試薬として、ＤＮＡポリメラーゼ（商品名：Pyrobest DNA polymerase、宝酒造株式会社製）を用いて下記の条件で行なった。
反応液：
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000009
　以上を混合し、この１００μＬの反応液をＰＣＲにかけた。
ＰＣＲサイクル：
　　　デナチュレーション過程：　９８℃、１０秒
　　　アニーリング過程：　５５℃、３０秒
　　　エクステンション過程：　７２℃、２分
　以上を１サイクルとし、３０サイクル行なった。
　上記で生成した反応液を用いて１％（Ｗ／Ｖ）アガロースゲルにより電気泳動を行なったところ、ａｒａＥ遺伝子を含む、約１．７ｋｂのＤＮＡ断片が検出できた。
　上述のＥｃｏＲＩ制限酵素で処理した増幅産物と、ＥｃｏＲＩで制限酵素処理をしたｐＫＫ２２３－３（ファルマシア社製）とを混合し、これにMighty Cloning Kit（宝酒造株式会社製）を添加した後、取扱説明書に従い反応させた。
　このライゲーション溶液を用い、塩化カルシウム法によりエシェリヒア コリ（Escherichia coli）ＪＭ１０９を形質転換し、アンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬ寒天培地〔組成：寒天が１．５％（Ｗ／Ｖ）含まれていることを除けば上記Ｌ培地と同一成分組成〕に塗布した。
　この培地上の生育株を常法により液体培養し、培養液よりａｒａＥ遺伝子を含有する長さ約１．７ｋｂのＤＮＡ断片が挿入されたプラスミドを、QIAprep Spin Miniprep Kit（キアゲン社製）を用いて抽出した。
　該ａｒａＥ遺伝子を含むプラスミドをｐＫＫ２２３－３－ａｒａＥ（図３）と命名した。
（３）　マーカーレス用ａｒａＥ導入用ベクターＩｎｄ－ａｒａＥの構築
　次に、ａｒａＥ遺伝子をコリネバクテリウム グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）Rにマーカーレスで染色体に導入するために必要なＤＮＡ領域を、コリネバクテリウム グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）Rの生育に必須でないと報告されている配列〔Appl. Environ. Microbiol.、Vol. 71、3369-3372（2005）〕（ＳＳＩ領域）を基に決定した。このＤＮＡ領域（Ｉｎｄｅｌ１１領域）を以下のＰＣＲ法により増幅した。
　ＰＣＲに際しては、以下の一対のプライマーセットを、アプライド・バイオシステムズ社製「３９４　ＤＮＡ／ＲＮＡシンセサイザー」を用いて合成し、使用した。
ａｒａＥ遺伝子導入用Ｉｎｄｅｌ１１領域増幅用プライマーセット
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000010
　尚、いずれのプライマーにもＸｂａＩサイトが末端に付加されている。
　鋳型ＤＮＡには、上記の実施例１、（２）、ａ）項と同様の方法で抽出したコリネバクテリウム グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）Rの染色体ＤＮＡを用いた。ＰＣＲは、Takara LA Taq HS DNA polymeraseを使用し、反応液にＤＭＳＯを使用しないことと、ＰＣＲサイクルを以下に示す条件で行なったこと以外は上記（実施例１、（２）、ｂ）項）と同様の条件で行なった。
ＰＣＲサイクル：
　　　デナチュレーション過程：　９４℃、３０秒
　　　アニーリング過程：　５５℃、３０秒
　　　エクステンション過程：　７２℃、３分
　以上を１サイクルとし、３０サイクル行なった。
　上記で生成した反応液を用いて１％（Ｗ／Ｖ）アガロースゲルにより電気泳動を行なったところ、Ｉｎｄｅｌ１１領域を含む、約２．０ｋｂのＤＮＡ断片が検出できた。
　上述の制限酵素ＸｂａＩで処理した増幅産物と、ＸｂａＩで制限酵素処理をしたマーカーレス遺伝子破壊用プラスミドｐＣＲＡ７２５〔J. Mol. Microbiol. Biotechnol.、 Vol. 8、243-254（2004）、（特開2006-124440）〕とを混合し、これにMighty Cloning Kit（宝酒造株式会社製）を添加した後、取扱説明書に従い反応させた。
　このライゲーション溶液を用い、形質転換体選定用培地の抗生物質としてクロラムフェニコールの代わりに、カナマイシン５０μｇ／ｍＬを使用したこと以外は、上記の実施例１、（１）、ｂ）と同様の条件及び方法にてＩｎｄｅｌ１１領域を含有する長さ約２．０ｋｂのＤＮＡ断片が挿入されたプラスミドを取得した。
　該ａｒａＥ遺伝子導入用Ｉｎｄｅｌ１１領域を含むプラスミドをＩｎｄ１１ＬＫＳ２－４（図３）と命名した。
　プラスミドｐＫＫ２２３－３－ａｒａＥをＥｃｏＲＩで処理後、アガロース電気泳動で分離し、ゲルから切り出した約２．０ｋｂの遺伝子を含むＤＮＡ断片をゲル抽出キット（商品名：Minelute Gel Extraction Kit、キアゲン社製）を用いて回収した。得られたＤＮＡを、平滑末端処理キット（商品名：DNA Blunting Kit、宝酒造株式会社製）を用いて平滑末端処理を行ない、ＥｃｏＲＶで制限酵素処理をしたＩｎｄ１１ＬＫＳ２－４を混合し、これにMighty Cloning Kit（宝酒造株式会社製）を添加した後、取扱説明書に従い反応させた。
　このライゲーション溶液を用い、塩化カルシウム法によりエシェリヒア コリ（Escherichia coli）ＪＭ１０９を形質転換、カナマイシン５０μｇ／ｍＬを含むＬ寒天培地〔組成：寒天が１．５％（Ｗ／Ｖ）含まれていることを除けば上記Ｌ培地と同一成分組成〕に塗布した。
　この培地上の生育株を常法により液体培養し、培養液よりａｒａＥ遺伝子を含有する長さ約１．７ｋｂのＤＮＡ断片が挿入されたプラスミドを、QIAprep Spin Miniprep Kit（キアゲン社製）を用いて抽出した。
　該ａｒａＥ遺伝子導入用プラスミドをＩｎｄ１１－ａｒａＥ（図３）と命名した。
（４）　コリネバクテリウム グルタミカム（Corynebacterium glutamicum） Ｉｎｄ－ａｒａＥの作製
　ａｒａＥ遺伝子導入用プラスミドＩｎｄ１１－ａｒａＥは、コリネバクテリウム グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）R内で複製不可能なプラスミドである。Ｉｎｄ１１－ａｒａＥを、電気パルス法〔Agric. Biol. Chem.、Vol. 54、443-447（1990）及びRes. Microbiol.、Vol. 144、181-185（1993）〕の方法に従って、コリネバクテリウム グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）Rへ導入し、カナマイシン５０μｇ／ｍＬを含むＡ寒天培地〔組成：寒天が１．５％（Ｗ／Ｖ）含まれていることを除けば上記Ａ液体培地と同一成分組成〕に塗布した。
　さらに、上記の培地で得られた株を、スクロース１０％（Ｗ／Ｖ）を含有する表２に示すＢＴ寒天培地〔組成：寒天が１．５％（Ｗ／Ｖ）含まれていることを除けばＢＴ液体培地と同一成分組成〕に塗布した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000011
　プラスミドＩｎｄ１１－ａｒａＥが染色体上の相同領域と１点相同組換えを起こした場合、Ｉｎｄ１１－ａｒａＥ上のカナマイシン耐性遺伝子の発現によるカナマイシン耐性と、バチラス サブチリス（Bacillus subtilis）のｓａｃＲ－ｓａｃＢ遺伝子の発現によるスクロース致死性を示すのに対し、２点相同組換えを起こした場合は、Ｉｎｄ１１－ａｒａＥ上のカナマイシン耐性遺伝子の脱落によるカナマイシン感受性と、ｓａｃＲ－ｓａｃＢ遺伝子の脱落によるスクロース含有培地での生育性とを示す。従って、目的とするａｒａＥ遺伝子染色体導入株は、カナマイシン感受性及びスクロース含有培地生育性を示す。
　カナマイシン感受性及びスクロース含有培地生育性を示した株をコリネバクテリウム グルタミカム（Corynebacterium glutamicum） Ind-araEと命名した。
（５）　コリネバクテリウム グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）R/pCRA811とコリネバクテリウム グルタミカム（Corynebacterium glutamicum） Ind-araE/pCRA811の構築
　プラスミドｐＣＲＡ８１１を上記の実施例１、（４）項に示した電気パルス法に従って、コリネバクテリウム グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）Rとコリネバクテリウム グルタミカム（Corynebacterium glutamicum） Ind11-araEへ導入し、クロラムフェニコール５μｇ／ｍＬを含むＡ寒天培地〔組成：寒天が１．５％（Ｗ／Ｖ）含まれていることを除けば上記Ａ液体培地と同一成分組成〕により、形質転換株コリネバクテリウム グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）R/pCRA811とコリネバクテリウム グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）Ind-araE/pCRA811とを得た。尚、コリネバクテリウム グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）Ind-araE/pCRA811は、日本国千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8（郵便番号292-0818）の独立行政法人製品評価技術基盤機構　特許生物寄託センターに寄託した（受託日：２００８年５月２８日、受託番号：ＮＩＴＥ　ＢＰ－５７６）。
実施例２　Ｄ-キシロースを単一炭素源とした培地を用いたコリネバクテリウム グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）R/pCRA811とコリネバクテリウム グルタミカム（Corynebacterium glutamicum） Ind-araE/pCRA811の好気培養
　上記の実施例１、（５）項で作製したコリネバクテリウム グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）R/pCRA811とコリネバクテリウム グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）Ind-araE/pCRA811をそれぞれ用いて、Ｄ－キシロースを唯一の炭素源として含有するＢＴ液体培地におけるＤ－キシロースの減少と菌の増殖とを検討した。該２菌株をそれぞれ、クロラムフェニコール５μｇ／ｍＬを含むことを除けば上記Ａ液体培地と同一成分組成培地１０ｍＬに一白金耳植菌して３３℃、１３時間、２００ｒｐｍの条件で好気的に培養後、上記で示したＢＴ培地で２回洗浄し、単一炭素源として２５ｍＭ　Ｄ－キシロースを含有する１００ｍＬのＢＴ培地にＯＤ６１０が０．２になるように植菌した。Ｄ－キシロース濃度は、逐次培地の少量をサンプリングして液体クロマトグラフィーによる分析を行い、経時的な消費量の変動を調べた。結果を、図４（１）及び（２）に示す。図４（１）及び（２）において、白丸（○）は、ＯＤ６１０の変化を、黒丸（●）は、培地中のＤ－キシロース濃度の変化を、それぞれ示す。図４（１）は、ａｒａＥ遺伝子を導入していないコリネバクテリウム グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）R/pCRA811による、Ｄ－キシロース消費及び増殖の経時変化を示す図である。図４（２）は、ａｒａＥ遺伝子を染色体に導入したコリネバクテリウム グルタミカム（Corynebacterium glutamicum） Ind-araE/pCRA811による、Ｄ－キシロース消費及び増殖の経時変化を示す図である。結果、図４（１）及び（２）に示すように、好気条件下において、ａｒａＥ遺伝子を染色体に導入したコリネバクテリウム グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）Ind-araE/pCRA811（図４（２））のＤ－キシロース消費速度と増殖速度は、ａｒａＥ遺伝子を導入していないコリネバクテリウム グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）R/pCRA811（図４（１））と比較して、著しく速くなった。
実施例３　コリネバクテリウム グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）R/pCRA811及びコリネバクテリウム グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）Ind-araE/pCRA811のＤ－キシロースを単一基質とした還元条件下の糖消費及び乳酸生成反応
（1）好気培養増殖
　冷凍庫にて－８０℃で保存してある上記の実施例１、（５）項で作製したコリネバクテリウム グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）R/pCRA811とコリネバクテリウム グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）Ind-araE/pCRA811を、それぞれプレート培養用培地であるクロラムフェニコール５μｇ／ｍＬを含むＡ寒天培地〔組成：寒天が１．５％（Ｗ／Ｖ）含まれていることを除けば上記Ａ液体培地と同一成分組成〕に塗布し、３３℃、１２時間暗所に静置した。
　上記のプレートで生育した該２種のコリネ型細菌株をそれぞれ、１０ｍＬのクロラムフェニコール５μｇ／ｍＬを含むＡ液体培地が入った試験管に一白金耳植菌し、３３℃、１２時間、２００ｒｐｍの条件で好気的に培養した。
　上記の条件で生育した該２種の菌株をそれぞれ、好気培養増殖用培地であるクロラムフェニコール５μｇ／ｍＬを含むＡ液体培地５００ｍＬが入っている容量１Ｌの三角フラスコに移し、３３℃、１３時間、２００ｒｐｍの条件で好気的に培養した。このようにして培養増殖された菌体は、遠心分離（４℃、１０分、５，０００×ｇ）によって回収し、次の還元条件下の乳酸生成反応に供した。
（2）還元条件下の糖消費及び有機酸生成反応
　上記の実施例３、（１）項の好気培養増殖工程により回収された該２種の菌株それぞれの湿潤菌体　４ｇ（Dry cell換算約０．８ｇ）を、ＢＴ－Ｕ培地（組成：尿素が含まれていないことを除けば上記ＢＴ液体培地と同一成分組成）８０ｍＬに懸濁後、１００ｍＬ容のバイアルに入れ、Ｄ－キシロース１００ｍＭを利用炭素源として加え、炭酸水素ナトリウム１００ｍＭを添加後、密閉した状態で３３℃にてゆるく撹拌し、還元条件下の乳酸生成反応を行なった。
　この間、２．５Ｎ（規定）濃度のＮＨ４ＯＨ水溶液（２．５Ｎ　アンモニア水溶液）を使用して反応槽内のｐＨを７．５に常時維持した。
　反応槽内のＤ－キシロース及び乳酸濃度は、逐次培地少量をサンプリングして液体クロマトグラフィーによる分析を行い、経時的な消費量及び生成量の変動をそれぞれ調べた。
　その結果を図５（１）及び（２）に示す。図５（１）は、ａｒａＥ遺伝子を導入していないコリネバクテリウム グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）R/pCRA811による、Ｄ－キシロース消費及び乳酸生成の経時変化を示す図である。図５（２）は、ａｒａＥ遺伝子を染色体に導入したコリネバクテリウム グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）Ind-araE/pCRA811による、Ｄ－キシロース消費及び乳酸生成の経時変化を示す図である。図５（１）及び（２）において、黒丸（●）は、培地中のＤ－キシロース濃度の変化を、白丸（○）は、培地中の乳酸濃度の変化を、それぞれ示す。
　尚、Ｄ－キシロース消費速度及び乳酸生成速度は反応開始０時間から３時間後における単位時間当たりの消費量及び生成量である。コリネバクテリウム グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）R/pCRA811（図５（１））及びコリネバクテリウム グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）Ind-araE/pCRA811（図５（２））それぞれのＤ－キシロース消費速度及び乳酸生成速度は、コリネバクテリウム グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）R/pCRA811が、Ｄ－キシロース消費速度１５．１ｍＭ／ｈ及び乳酸生成速度１８．５ｍＭ／ｈ、コリネバクテリウム グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）Ind-araE/pCRA811が、Ｄ－キシロース消費速度４８．４ｍＭ／ｈ及び乳酸生成速度５８．５ｍＭ／ｈであった。
　この結果より、還元条件下においても、ａｒａＥ遺伝子を染色体に導入したコリネバクテリウム グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）Ind-araE/pCRA811のＤ－キシロース消費速度及び乳酸生成速度はいずれも、ａｒａＥ遺伝子を導入していないコリネバクテリウム グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）R/pCRA811と比較して、著しく速くなったことが分かった。
実施例４　Ｄ－グルコース及びＤ－キシロース混合糖を炭素源とした培地を用いたコリネバクテリウム グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）R/pCRA811とコリネバクテリウム グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）Ind-araE/pCRA811の好気培養
　上記の実施例２における炭素源をＤ－キシロースから、Ｄ－グルコース及びＤ－キシロースの混合物（３．６ｇ／Ｌ及び３．６ｇ／Ｌ；存在比率１：１）に代えて反応を行なう以外は、実施例２と同様の条件及び方法にて、コリネバクテリウム グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）R/pCRA811及びコリネバクテリウム グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）Ind-araE/pCRA811の好気培養増殖及び糖消費を調べた。
　結果を、図６（１）及び（２）に示す。図６（１）は、ａｒａＥ遺伝子を導入していないコリネバクテリウム グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）R/pCRA811による、Ｄ－グルコース及びＤ－キシロース消費、並びに増殖の経時変化を示す図である。図６（２）は、ａｒａＥ遺伝子を染色体に導入したコリネバクテリウム グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）Ind-araE/pCRA811による、Ｄ－グルコース及びＤ－キシロース消費、並びに増殖の経時変化を示す図である。なお、図６（１）及び（２）において、星印（＊）は、ＯＤ６１０の変化を示す。黒丸（●）は、培地中のＤ－グルコース濃度の変化を示す。白丸（○）は、培地中のＤ－キシロース濃度の変化を示す。
　この結果、図６（１）及び（２）に示すように、好気条件下において、ａｒａＥ遺伝子を染色体に導入したコリネバクテリウム グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）Ind-araE/pCRA811（図６（２））のＤ－キシロース消費速度は、ａｒａＥ遺伝子を導入していないコリネバクテリウム グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）R/pCRA811（図６（１））と比較して著しく速くなった。これにより、コリネバクテリウム グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）Ind-araE/pCRA811は、培地中のＤ－グルコース及びＤ－キシロースを３０時間以内に完全に消費することができたのに対して、コリネバクテリウム グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）R/pCRA811では、同じ３０時間でキシロースの残存が観察された。
　さらに、好気培養において、コリネバクテリウム グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）R/pCRA811は、Ｄ－グルコース及びＤ－キシロースの共存下では、Ｄ－キシロース利用に関してグルコース抑制が観察されるのに対して、コリネバクテリウム グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）Ind-araE/pCRA811は、Ｄ－グルコース及びＤ－キシロースを並行的かつ同時利用することが可能であった。
実施例５　コリネバクテリウム グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）R/pCRA811とコリネバクテリウム グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）Ind-araE/pCRA811のＤ－グルコース及びＤ－キシロース混合糖を基質とした還元条件下の糖消費及び乳酸生成反応
　上記の実施例３における基質をＤ－キシロースから、Ｄ－グルコース及びＤ－キシロースの混合物（４０ｇ／Ｌ及び２０ｇ／Ｌ；存在比率２：１）に代えて反応を行なう以外は、実施例３と同様の条件及び方法にて好気培養増殖後、還元条件下での反応を行なった。
　結果を、図７（１）及び（２）に示す。図７（１）は、ａｒａＥ遺伝子を導入していないコリネバクテリウム グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）R/pCRA811による、Ｄ－グルコース及びＤ－キシロース消費、並びに乳酸生成の経時変化を示す図である。図７（２）は、ａｒａＥ遺伝子を染色体に導入したコリネバクテリウム グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）Ind-araE/pCRA811による、Ｄ－グルコース及びＤ－キシロース消費、並びに乳酸生成の経時変化を示す図である。なお、図７（１）及び（２）において、黒丸（●）は、培地中のキシロース濃度の変化を示す。星印（＊）は、培地中のＤ－グルコース濃度の変化を示す。白丸（○）は、培地中の乳酸濃度の変化を示す。
　この結果、図７（１）及び（２）に示すように、還元条件下においても、ａｒａＥ遺伝子を染色体に導入したコリネバクテリウム グルタミカム（Corynebacterium glutamicum） Ind-araE/pCRA811（図７（２））のＤ－キシロース消費速度は、ａｒａＥ遺伝子を導入していないコリネバクテリウム グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）R/pCRA811（図７（１））と比較して著しく速くなった。これにより、コリネバクテリウム グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）Ind-araE/pCRA811は、Ｄ－グルコース及びＤ－キシロースを８時間以内に完全に消費することができたのに対して、コリネバクテリウム グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）R/pCRA811では、同じ８時間で著量のキシロースの残存が観察された。８時間後のコリネバクテリウム グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）R/pCRA811とコリネバクテリウム グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）Ind-araE/pCRA811の生成した乳酸生成濃度はそれぞれ、３３９ｍＭ及び４３１ｍＭと、後者が約１．３倍高かった。
　さらに、還元条件下において、コリネバクテリウム グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）R/pCRA811は、Ｄ－グルコース及びＤ－キシロースの共存下では、Ｄ－キシロース利用に関してグルコース抑制が観察されるのに対して、コリネバクテリウム グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）Ind-araE/pCRA811は、Ｄ－グルコース及びＤ－キシロースを並行的かつ同時利用することが可能であった。
実施例６　コリネバクテリウム グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）X5/Plac-araBAD及びコリネバクテリウム グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）X5-Ind-araE/Plac-araBADの構築
（１）　Ｐｌａｃ－ａｒａＢＡＤの構築方法
　エシェリヒア コリ（Escherichia coli）のＬ－アラビノースイソメラーゼ（以下ａｒａＡと記す）、Ｌ－リブロキナーゼ（ａｒａＢと記す）、Ｌ－リブロース－５－フォスフェイト－４－エピメラーゼ（ａｒａＤと記す）の３つの遺伝子はａｒａＢ、ａｒａＡ、ａｒａＤが順に連結したオペロン（ａｒａＢＡＤ）を形成している（配列番号１８）〔Gene、Vol. 47、231-244（1986）〕。ａｒａＢＡＤ遺伝子を含むＤＮＡ断片を以下のＰＣＲ法により増幅した。
　ＰＣＲに際して、ａｒａＢＡＤ遺伝子をクローン化するべく、エシェリヒア コリ（Escherichia coli）の配列を基に、下記の一対のプライマーセットを、アプライド・バイオシステムズ（Applied Biosystems）社製「３９４　ＤＮＡ／ＲＮＡシンセサイザー（synthesizer）」を用いて合成し、使用した。
ａｒａＢＡＤ遺伝子増幅用プライマーセット
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000012
尚、前者にはＥｃｏＲＩサイトが、後者にはＳａｌＩサイトがそれぞれ末端に付加されている。
　鋳型ＤＮＡには、上記の実施例１、（１）、ａ）項にて抽出したエシェリヒア コリ（Escherichia coli）ＪＭ１０９の染色体ＤＮＡを用いた。
　ＰＣＲは、パーキンエルマーシータス社製の「ＤＮＡサーマルサイクラー」を用い、反応試薬として、ＤＮＡポリメラーゼ（商品名：PrimeSTAR HS DNA polymerase、宝酒造株式会社製）を用いて下記の条件で行なった。
反応液：
　　　（５×）ＰＣＲ緩衝液：　１０μＬ
　　　２．５ｍＭ　ｄＮＴＰ混合液：　４μＬ
　　　鋳型ＤＮＡ：　１μＬ　（ＤＮＡ含有量２００ｎｇ以下）
　　　上記の２種のプライマー：　各々　１μＬ（最終濃度０．２μＭ）
　　　PrimeSTAR HS DNA polymerase：　０．５μＬ
　　　滅菌蒸留水：　３３．５μＬ
　以上を混合し、この５０μＬの反応液をＰＣＲにかけた。
　ＰＣＲサイクル：
　　　デナチュレーション過程：　９８℃、１０秒
　　　アニーリング過程：　５５℃、１０秒
　　　エクステンション過程：　７２℃、５分
　以上を１サイクルとし、３０サイクル行なった。
　上記で生成した反応液の一部を用いて１％（Ｗ／Ｖ）アガロースゲルにより電気泳動を行なったところ、ａｒａＢＡＤ遺伝子を含む、約４．５ｋｂのＤＮＡ断片が検出できた。
　上述の制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＳａｌ　Ｉで処理した増幅産物と、ＥｃｏＲＩ及びＳａｌ　Ｉで制限酵素処理をしたコリネ型細菌－大腸菌シャトルベクターｐＣＲＢ１（特開２００６－１２４４４０）とを混合し、これにライゲーションキット（商品名：Mighty Cloning Kit、宝酒造株式会社製）を添加後、取扱説明書に従い反応させた。
　このライゲーション溶液を用い、塩化カルシウム法〔Journal of Molecular Biology.、Vol. 53、159（1970）〕によりエシェリヒア コリ（Escherichia coli）ＪＭ１０９を形質転換し、クロラムフェニコール５０μｇ／ｍＬ、Ｘ－ｇａｌ（5-Bromo-4-chloro-3-indoxyl-beta-D-galactopyranoside）２００μｇ／ｍＬ及びＩＰＴＧ（isopropyl 1-thio-beta-d-galactoside）１００μｇ／ｍＬを含むＬ寒天培地〔組成：寒天が１．５％（Ｗ／Ｖ）含まれていることを除けば上記Ｌ培地と同一成分組成〕に塗布した。
　この培地上で白色を呈する生育株を常法により液体培養し、培養液よりａｒａＢＡＤ遺伝子を含有する長さ約４．５ｋｂのＤＮＡ断片が挿入されたプラスミドを、プラスミド抽出キット（商品名：QIAprep Spin Miniprep Kit、キアゲン社製）を用いて抽出した。
　該ａｒａＢＡＤ遺伝子を含むプラスミドをＰｌａｃ－ａｒａＢＡＤ（図８）と命名した。
（２）　コリネバクテリウム グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）X5及びコリネバクテリウム グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）X5-Ind-araEの構築方法
ａ）　コリネバクテリウム グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）RからのＳＳＩ領域のクローニング
　コリネバクテリウム グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）RのＳＳＩ領域にＤ－キシロース代謝関連遺伝子ｘｙｌＡ及びｘｙｌＢ遺伝子の導入を行なうため、これらのＤＮＡ領域を、表３に示したプライマー及びコリネバクテリウム グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）Rの染色体ＤＮＡを用いたＰＣＲ反応により増幅させた。ＰＣＲは、Takara LA Taq HS DNA polymeraseを使用し、上記の実施例１、（３）項と同条件で行なった
　上記で生成した反応液を用いて１％（Ｗ／Ｖ）アガロースゲルにより電気泳動を行なったところ、約２．０から３．０ｋｂのＤＮＡ断片が検出できた。
　表３に示した制限酵素で処理した増幅産物と、同じ制限酵素で処理をしたマーカーレス遺伝子破壊用プラスミドｐＣＲＡ７２５〔J. Mol. Microbiol. Biotechnol.、Vol. 8、243-254（2004）、（特開2006-124440）〕とを混合し、これにMighty Cloning Kit（宝酒造株式会社製）を添加した後、取扱説明書に従い反応させた。
　このライゲーション溶液を用い、形質転換体選定用培地の抗生物質としてクロラムフェニコールの代わりに、カナマイシン５０μｇ／ｍＬを使用すること以外は、上記の実施例６、（１）項と同様の条件及び方法にて各ＳＳＩ領域を含有する長さ約２．０から３．０ｋｂのＤＮＡ断片が挿入されたプラスミドを取得した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000013
　表１中、ａ アスタリスクは、インバースＰＣＲのためのプライマーを示している。
　表１において、ｂ アンダーラインで示した塩基配列は、クローニング用に作製した制限酵素サイトを示している。
ｂ）　マーカーレス用ｘｙｌＡ－ｘｙｌＢ遺伝子導入用ベクターの構築
　上記の実施例１、（１）項で作製したプラスミドｐＣＲＡ８１１をＸｂａＩ及びＸｈｏＩで処理後、アガロース電気泳動で分離し、ゲルから切り出した約３．３ｋｂのｘｙｌＡ－ｘｙｌＢ遺伝子を含むＤＮＡ断片をゲル抽出キット（商品名：Minelute Gel Extraction Kit、キアゲン社製）を用いて回収した。得られたＤＮＡを、ＸｂａＩ及びＸｈｏＩで制限酵素処理をした上記実施例６、（２）、ａ）項で作製したプラスミドと混合し、これにMighty Cloning Kit（宝酒造株式会社製）を添加した後、取扱説明書に従い反応させた。
　このライゲーション溶液を用い、塩化カルシウム法によりエシェリヒア コリ（Escherichia coli）ＪＭ１０９を形質転換し、カナマイシン５０μｇ／ｍＬを含むＬ寒天培地〔組成：寒天が１．５％（Ｗ／Ｖ）含まれていることを除けば上記Ｌ培地と同一成分組成〕に塗布した。
　この培地上の生育株を常法により液体培養し、培養液よりｘｙｌＡ－ｘｙｌＢ遺伝子を含有する長さ約３．３ｋｂのＤＮＡ断片が挿入されたプラスミドを、QIAprep Spin Miniprep Kit（キアゲン社製）を用いて抽出した。
ｃ）　コリネバクテリウム グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）X5及びコリネバクテリウム グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）X5- Ind-araE株の作製
　上記の実施例６、（２）、ｂ）項で作製したｘｙｌＡ－ｘｙｌＢ遺伝子導入用プラスミドを上記の実施例１、（３）の方法に従って、コリネバクテリウム グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）RのＳＳＩ領域にＸｙｌ３、７、８、４、１、１１、６の順番に導入した。最終的に得られた菌株をコリネバクテリウム　グルタミカム（Corynebacterium glutamicum） X5と命名した。
　さらに、上記の実施例１、（３）項で作製したａｒａＥ遺伝子導入用プラスミドＩｎｄ１１－ａｒａＥを上記と同様の方法に従って、コリネバクテリウム グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）X5へ導入し得られた菌株をコリネバクテリウム グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）X5-Ind-araEと命名した。
（３）　コリネバクテリウム グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）X5/Plac-araBAD及びコリネバクテリウム グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）X5-Ind-araE/Plac-araBADの構築
　プラスミＰｌａｃ－ａｒａＢＡＤを上記の実施例１、（４）項に示した電気パルス法に従って、コリネバクテリウム グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）X5及びコリネバクテリウム グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）X5-Ind-araEそれぞれへ導入し、クロラムフェニコール５μｇ／ｍＬを含むＡ寒天培地〔組成：寒天が１．５％（Ｗ／Ｖ）含まれていることを除けば上記Ａ液体培地と同一成分組成〕により、形質転換株コリネバクテリウム グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）X5/Plac-araBAD及びコリネバクテリウム グルタミカム（Corynebacterium glutamicum） X5-Ind-araE/Plac-araBADを得た。尚、コリネバクテリウム グルタミカム（Corynebacterium glutamicum） X5-Ind-araE/Plac-araBADは、日本国千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8（郵便番号292-0818）の独立行政法人製品評価技術基盤機構　特許生物寄託センターに寄託した（受託日：２００８年５月２８日、受託番号：ＮＩＴＥ　ＢＰ－５７７）。
実施例７　コリネバクテリウム グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）X5/Plac-araBAD及びコリネバクテリウム グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）X5-Ind-araE/Plac-araBADのＤ－グルコース及びＤ－キシロース混合糖を基質とした還元条件下の糖消費及び乳酸生成反応
　上記の実施例３と同様の条件及び方法にて、コリネバクテリウム グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）X5/Plac-araBAD及びコリネバクテリウム グルタミカム（Corynebacterium glutamicum） X5-Ind-araE/Plac-araBADそれぞれを好気培養増殖させた。その後、上記の実施例３における基質をＤ－キシロースから、Ｄ－グルコース、Ｄ－キシロース及びＬ－アラビノースの混合物（それぞれ３２ｇ／Ｌ、１６ｇ／Ｌ及び６．４ｇ／Ｌ；存在比率５：２．５：１）に代えて行なう以外は、上記の実施例３と同様の条件及び方法にて、還元条件下での反応を行なった。
　結果を図９（１）及び（２）に示す。図９（１）は、ａｒａＥ遺伝子を導入していないコリネバクテリウム グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）X5/Plac-araBADによる糖消費の経時変化を示す図である。図９（２）は、ａｒａＥ遺伝子を染色体に導入したコリネバクテリウム グルタミカム（Corynebacterium glutamicum） X5-Ind-araE/Plac-araBADによる糖消費の経時変化を示す図である。図９（１）及び（２）において、黒丸（●）は、培地中のＬ－アラビノース濃度の変化を示す。三角（▲）は、培地中のＤ－キシロース濃度の変化を示す。星印（＊）は、培地中のＤ－グルコース濃度の変化を示す。白丸（○）は、培地中の乳酸濃度の変化を示す。
　この結果、図９（１）及び（２）に示すように、還元条件下において、ａｒａＥ遺伝子を染色体に導入したコリネバクテリウム グルタミカム（Corynebacterium glutamicum） X5-Ind-araE/Plac-araBAD（図９（２））のＤ－キシロース及びＬ－アラビノース消費速度は、ａｒａＥ遺伝子を導入していないコリネバクテリウム グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）X5/Plac-araBAD（図９（１））と比較して著しく速くなった。これにより、コリネバクテリウム グルタミカム（Corynebacterium glutamicum） X5-Ind-araE/Plac-araBADは、培地中のＤ－グルコース、Ｄ－キシロース及びＬ－アラビノースの３種の糖を９時間以内に完全に消費することができたのに対して、コリネバクテリウム グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）X5/Plac-araBADは、同じ９時間でＤ－キシロース及びＬ－アラビノースの残存が観察された。９時間後のコリネバクテリウム グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）X5/Plac-araBAD及びコリネバクテリウム グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）X5-Ind-araE/Plac-araBADの生成した乳酸の濃度は、それぞれ３４２ｍＭ及び３７４ｍＭであった。
　さらに、還元条件下において、コリネバクテリウム グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）X5-Ind-araE/Plac-araBADは、Ｄ－グルコース、Ｄ－キシロース及びＬ－アラビノースの３種の糖を並行的かつ同時利用することが可能であった。
実施例８　コリネバクテリウム グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）R/pCRA811及びコリネバクテリウム グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）Ind-araE/pCRA811のＤ－グルコース及びＤ－キシロースの混合糖を基質とした還元条件下のコハク酸生成反応
　上記の実施例１、（５）項で作製したコリネバクテリウム グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）R/pCRA811及びコリネバクテリウム グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）Ind-araE/pCRA811それぞれを、上記の実施例５と同様の条件及び方法にて、好気培養増殖後、還元条件下、コハク酸生成反応を行った。
　その結果、コリネバクテリウム グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）R/pCRA811及びコリネバクテリウム グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）Ind-araE/pCRA811の反応開始３時間後のコハク酸生成速度は、それぞれ１４．２ｍＭ／ｈ及び１６．９ｍＭ／ｈであった。
実施例９　コリネバクテリウム グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）X5-Ind11-araE-Δldh/pEthAraの構築
（１）　プラスミドｐＥｔｈＡｒａ構築方法
　エタノール生産に必要なザイモモナス モビリス（Zymomonas mobilis）のアルデヒドデヒドロゲナーゼ（以下ａｄｈＢと記す）及びピルベートデカルボキシラーゼ（ｐｄｃと記す）の２つの遺伝子〔Journal Mol Microbiol Biotechnol、Vol. 8、4（2004）〕を含むプラスミドｐＣＲＡ７２３〔J. Mol. Microbiol. Biotechnol.、 Vol. 8、243-254（2004）、（特開２００６－１２４４４０）〕を制限酵素ＢａｍＨＩ及びＢｇｌ　ＩＩで処理後、アガロース電気泳動で分離した。ゲルから切り出した約４．０ｋｂのａｄｈＢ－ｐｄｃ遺伝子を含むＤＮＡ断片をゲル抽出キット（商品名：Minelute Gel Extraction Kit、キアゲン社製）を用いて回収した。得られたＤＮＡを、平滑末端処理キット（商品名：DNA Blunting Kit、宝酒造株式会社製）を用いて平滑末端処理を行ない、Ｓａｌ　Ｉで制限酵素処理後、同じく平滑末端処理をした上記の実施例６、（１）項で作製したプラスミドＰｌａｃ－ａｒａＢＡＤを混合し、これにMighty Cloning Kit（宝酒造株式会社製）を添加した後、取扱説明書に従い反応させた。
　このライゲーション溶液を用い、塩化カルシウム法によりエシェリヒア コリ（Escherichia coli）ＪＭ１０９を形質転換し、クロラムフェニコール５０μｇ／ｍＬを含むＬ寒天培地〔組成：寒天が１．５％（Ｗ／Ｖ）含まれていることを除けば上記Ｌ培地と同一成分組成〕に塗布した。
　この培地上の生育株を常法により液体培養し、培養液よりａｄｈＢ－ｐｄｃ遺伝子を含有する長さ約４．０ｋｂのＤＮＡ断片が挿入されたプラスミドを、QIAprep Spin Miniprep Kit（キアゲン社製）を用いて抽出した。作製したプラスミドをｐＥｔｈＡｒａと命名した（図１０）。
（２）　コリネバクテリウム グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）X5-Ind-araE-Δldhの作製
　乳酸デヒドロゲナーゼ（ｌｄｈ）遺伝子をマーカーレス破壊するために、マーカーレスｌｄｈ遺伝子破壊用プラスミドｐＣＲＡ７２８〔J. Mol. Microbiol. Biotechnol.、Vol. 8、243-254（2004）〕を上記の実施例１、（３）の方法に従って、コリネバクテリウム グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）X5-Ind11-araEに導入した。最終的に得られた菌株をコリネバクテリウム グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）X5-Ind-araE-Δldhと命名した。
（３）　コリネバクテリウム グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）X5-Ind-araE-Δldh/pEthAraの構築
　上記の実施例９、（１）項で作製したプラスミドｐＥｔｈＡｒａを、上記の実施例１、（４）項に示した電気パルス法に従って、コリネバクテリウム グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）X5-Ind-araE-Δldhへ導入し、クロラムフェニコール５μｇ／ｍＬを含むＡ寒天培地〔組成：寒天が１．５％（Ｗ／Ｖ）含まれていることを除けば上記Ａ液体培地と同一成分組成〕により、形質転換株コリネバクテリウム グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）X5-Ind-araE-Δldh/pEthAraを得た。尚、コリネバクテリウム グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）X5-Ind-araE-Δldh/pEthAraは、日本国千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8（郵便番号292-0818）の独立行政法人製品評価技術基盤機構　特許生物寄託センターに寄託した（受託日：２００８年６月４日、受託番号：ＮＩＴＥ　ＢＰ－５８１）。
実施例１０　コリネバクテリウム グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）X5-Ind-araE-Δldh/pEthAraのＤ－グルコース、Ｄ－キシロース及びＬ－アラビノース混合糖を基質とした還元条件下の糖消費及びエタノール生成反応
　上記の実施例３と同様の条件及び方法にて、コリネバクテリウム グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）X5-Ind-araE-Δldh/pEthAraを好気培養増殖後、上記の実施例３における基質をＤ－キシロースからＤ－グルコース、Ｄ－キシロース及びＬ－アラビノースの混合物（３２ｇ／Ｌ、１６ｇ／Ｌ及び６．４ｇ／Ｌ；存在比率５：２．５：１）に代えて行なう以外は、実施例３と同様の条件及び方法にて還元条件下での反応を行なった。
　この結果、図１１に示すように、還元条件下において、コリネバクテリウム グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）X5-Ind-araE-Δldh/pEthAraは、培地中のＤ－グルコース、Ｄ－キシロース及びＬ－アラビノースの３種の糖を９時間以内に消費し、エタノールを生成した。この際の、３種の糖の消費速度は、実施例７におけるコリネバクテリウム グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）X5-Ind-araE/Plac-araBADとほぼ同等であった。図１１において、黒丸（●）は、培地中のＤ－グルコース濃度の変化を示す。三角（▲）は、培地中のＤ－キシロース濃度の変化を示す。黒い四角（■）は、培地中のＬ－アラビノース濃度の変化を示す。白い四角（◇）は、培地中のエタノール濃度の変化を示す。
　さらに、還元条件下においてコリネバクテリウム グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）X5-Ind-araE-Δldh/pEthAraは、Ｄ－グルコース、Ｄ－キシロース及びＬ－アラビノースの３種の糖を並行的かつ同時利用することが可能であった。
　本発明は、セルロース系バイオマス資源からの有機化合物の製造に好適に利用することができる。

Claims (12)

  1. 　シュガートランスポーター機能を有するタンパク質をコードする外来性遺伝子を、Ｄ－キシロース利用能を有するコリネ型細菌に導入したことを特徴とする、コリネ型細菌形質転換体。
  2. 　シュガートランスポーター機能を有するタンパク質が、Ｌ－アラビノース輸送系のプロトンシンポーターである請求項１記載のコリネ型細菌形質転換体。
  3. 　シュガートランスポーター機能を有するタンパク質をコードする外来性遺伝子として、配列番号１３で示される塩基配列からなるＤＮＡ、又は配列番号１３で示される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつシュガートランスポーター機能を有するポリペプチドをコードするＤＮＡを用いる請求項１又は２記載のコリネ型細菌形質転換体。
  4. 　Ｄ－キシロース利用能を有するコリネ型細菌が、コリネバクテリウム　グルタミカム(Corynebacterium glutamicum) R (FERM P-18976)、セロビオース利用性組換え株もしくは変異株であるFERM P-18979、FERM P-18977及びFERM P-18978、コハク酸生産組換え株であるFERM P-19446及びFERM P-19477、並びにエタノール生産組換え株であるFERM P-17887、FERM P-17888、FERM P-19361及びFERM P-19362からなる群より選択されるいずれか１種の菌株のコリネ型細菌であって、かつＤ－キシロース利用能が付与されているものであることを特徴とする請求項１～３のいずれか一項に記載のコリネ型細菌形質転換体。
  5. 　シュガートランスポーター機能を有するタンパク質をコードする外来性遺伝子として、コリネバクテリウム　グルタミカム (Corynebacterium glutamicum) ATCC31831、エシェリヒア　コリ （Escherichia coli）、バチラス サブチリス（Bacillus subtilis）、バチラス　リチェニフォルミス（Bacillus licheniformis）、バチラス コアグランス（Bacillus coagulans）、ラクトバチルス サケイ（Lactobacillus sakei）、ペディオコッカス ペントサセウス（Pediococcus pentosaceus）、ラクトバチルス レウテリ（Lactobacillus reuteri）、オーシャノバチルス イヘエニス（Oceanobacillus iheyensis）、ラクトコッカス ラクティス（Lactococcus lactis）、ロイコノストック メセンテロイデス（Leuconostoc mesenteroides）、ラクトバチルス プランタリューム（Lactobacillus plantarum）、ラクトバチルス ファーメンタム（Lactobacillus fermentum）、ラクトバチルス ブレビス（Lactobacillus brevis）、ロイコノストック シテリューム（Leuconostoc citreum）、エンテロコッカス フェシウム（Enterococcus faecium）、クレブシエラ　オキシトカ（Klebsiella oxytoca）、及びサルモネラ　ティフィムリウム（Salmonella typhimurium）からなる群より選ばれる微生物由来のａｒａＥ遺伝子を用いる請求項１又は２に記載のコリネ型細菌形質転換体。
  6. 　Ｄ－グルコース及びＤ－キシロースを並行的かつ同時利用することができる請求項１～５のいずれか一項に記載のコリネ型細菌形質転換体。
  7. 　Ｄ－グルコース、Ｄ－キシロース及びＬ－アラビノースを並行的かつ同時利用することができる請求項６記載のコリネ型細菌形質転換体。
  8. 　コリネ型細菌形質転換体が、コリネバクテリウム　グルタミカム (Corynebacterium glutamicum) Ind-araE/pCRA811 (受託番号　ＮＩＴＥ　ＢＰ－５７６)である請求項１記載のコリネ型細菌形質転換体。
  9. 　コリネ型細菌形質転換体が、コリネバクテリウム　グルタミカム (Corynebacterium glutamicum) X5-Ind-araE/Plac-araBAD (受託番号　ＮＩＴＥ　ＢＰ－５７７)である請求項１記載のコリネ型細菌形質転換体。
  10. 　コリネ型細菌形質転換体が、コリネバクテリウム グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）X5-Ind-araE-Δldh/pEthAra (受託番号　ＮＩＴＥ　ＢＰ－５８１)である請求項１記載のコリネ型細菌形質転換体。
  11. 　Ｄ－キシロースを含有する培地中で請求項１～１０のいずれか一項に記載のコリネ型細菌形質転換体を用いて有機化合物を生成させる工程と、同培地より有機化合物を回収する工程とを含む有機化合物の製造方法。
  12. 　有機化合物が、エタノール、乳酸、コハク酸、キシリトール、酢酸及びアミノ酸からなる群より選ばれる１種以上であることを特徴とする請求項１１記載の有機化合物の製造方法。
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