CN113957073B - 一种tkt基因启动子突变体及其在生产L-赖氨酸中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种tkt基因启动子突变体及其在生产L‑赖氨酸中的应用，其中突变体是发生在tkt基因启动子区域的CCAATTAACC序列，由TGAGTGAAAT序列所替代；并将突变体整合到穿梭质粒中构建成重组载体，然后将重组载体转化到赖氨酸生产菌种得到重组菌种，并进一步利用该重组菌株进行发酵生产赖氨酸。本发明含有tkt基因启动子突变体的重组菌株与现有菌株的相比，改造位点没有冲突，改造后的突变体可以增强葡萄糖‑6‑磷酸脱氢酶活性，可以进一步提高赖氨酸的产量，降低生产成本。
Description
技术领域
本发明属于微生物学和基因工程技术领域，特别是涉及一种tkt基因启动子突变体及其在生产L-赖氨酸中的应用。
背景技术
L-赖氨酸是人类和动物所必需的、自身不能合成的氨基酸之一，由于L-赖氨酸具有多种生理功能，如平衡氨基酸组成、调节体内代谢平衡、提高机体对谷类蛋白质的吸收及利用率和促进机体生长发育等，因而被广泛应用于饲料工业、医药工业及食品工业中，其中90％以上的赖氨酸产品用作饲料添加剂。
目前为止，工业上生产L-赖氨酸的方法主要有三种：蛋白水解法、化学合成法和微生物发酵法。其中微生物发酵法具有生产成本低、生产强度高、高特异性和对环境污染小等优点而成为当今工业生产L-赖氨酸应用最广泛的方法。国内外用于工业化生产L-赖氨酸的菌株多为谷氨酸棒杆菌(C.glutamicum)、黄色短杆菌(B.flavum)、乳酸发酵短杆菌(B.lactofermentus)和大肠杆菌(E.coli)的改造型菌株。在谷氨酸棒杆菌合成赖氨酸的途径中，合成1mol赖氨酸需要消耗4molNADPH，因此提高NADPH的量是提高L-赖氨酸积累量的重要手段之一。葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(Glucose-6-phosphate dehydrogenase，G6PDH)由基因zwf编码，它是磷酸戊糖途径的主要调节酶，催化6-磷酸葡萄糖脱氢，形成6-磷酸葡萄糖酸内酯，同时其还原当量产物以NADPH形式储存，以供生物合成及维持细胞内的还原状态，对维持细胞内NADPH和氧化还原反应的平衡起着重要作用。Ohnishi等都指出，通过定点突变，使zwf基因中的243位碱基由A突变成T可以有效解除ATP、磷酸烯醇式丙酮酸和果糖-1，6-二磷酸的抑制作用，增大NADPH的量，从而有效增加L-赖氨酸的量。
因此，通过基因突变来改变相应产物的表达量，从而影响到相关的代谢，达到提高目的产物的目标，是切实可行的方法。
发明内容
本发明所要解决的第一个技术问题是：提供一种tkt基因启动子突变体，通过在tkt基因的启动子区域引入点突变，改变tkt基因的启动子区域的构象结构，从而影响tkt基因的表达。
本发明所要解决的第二个技术问题是：提供一种tkt基因启动子突变体的构建方法。
本发明所要解决的第三个技术问题是：提供一种包含tkt基因启动子突变体的重组载体及重组菌株。
本发明所要解决的第四个技术问题是：提供一种包含tkt基因启动子突变体的重组菌株在生产L-赖氨酸中的应用。
为解决上述技术问题，本发明的技术方案是：
一种tkt基因启动子突变体，所述包含点突变的tkt基因启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，其启动子区域部分核苷酸序列由SEQ ID NO.1中的CCAATTAACC替换为TGAGTGAAAT。
如上所述的tkt基因启动子突变体的制备方法，包括以下步骤：
a.引物设计：根据NCBI公布的谷氨酸棒状杆菌ATCC13032的基因组序列(SEQ IDNO.1)，设计如下引物：
P1:CGCGGATCCGCGACAAGGAGGAGTTCAATAACC(BamH I)
P2:GATCTACGACTTAATTTCACTCATTCAAATTTGGCAAAGG
P3:CCTTTGCCAAATTTGAATGAGTGAAATTAAGTCGTAGATC
P4:ACGCGTCGACGGAAGCCTTACGAGTTGC(Sal I)；
b.PCR扩增：以谷氨酸棒状杆菌ATCC13032基因组(SEQ ID NO.1)为模板，分别以引物P1和P2、P3和P4进行PCR扩增，得到大小分别为859bp(SEQ ID NO.3)、1262bp(SEQ IDNO.4)的DNA片段；
其中PCR扩增条件为：
预变性：95℃，5min；变性：98℃，10s；复性：62℃，15s；延伸：72℃，1min30s；40循环；后延伸：72℃，10min；
c.纯化：将步骤b得到的产物分别通过琼脂糖凝胶电泳分离纯化；
d.PCR扩增：以步骤c纯化后的两片段为模板，以引物P1和P4进行重叠PCR扩增获得2079bp的DNA片段(SEQ ID NO.2)。
其中PCR扩增条件为：
预变性：95℃，5min；变性：98℃，10s；复性：62℃，15s；延伸：72℃，2min；40循环；后延伸：72℃，10min。
一种包含tkt基因启动子突变体的重组载体及重组菌株，将通过重叠PCR获得的DNA片段利用BamH I酶和Sal I酶进行双酶切，然后与同样双酶切的穿梭质粒连接得到重组载体；然后将重组载体转化到赖氨酸生产菌中得到重组菌株。
优选的，所述的重组载体是将经过琼脂糖凝胶电泳分离纯化后的重叠PCR获得的DNA片段进行酶切、纯化后，再用连接酶连接到穿梭质粒pk18mobsacB上，得到重组载体(名称pK18-m-tkt)。
优选的，所述的重组载体电转化到谷氨酸棒杆菌中得到重组菌株。
进一步的，所述的谷氨酸棒杆菌为菌株M7(保藏编号：CGMCC No.8184，保藏时间：2013年09月13日，保藏中心：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心)，得到的重组菌株为M7-01。
进一步的，所述的重组菌株通过以下方法进行筛选：
将获得的重组质粒pK18-m-tkt电转化入谷氨酸棒杆菌菌株M7中，对培养产生的单菌落通过引物P1和M13F进行鉴定，将扩增出2114bp的DNA片段(SEQ ID NO.5)的菌株定义为阳性菌株；将阳性菌株在含10％蔗糖的LB培养基上进行培养，将培养产生的单菌落分别在含有卡那霉素和不含卡那霉素的LBG培养基(在LB培养基中添加5g/L的葡萄糖)上进行培养。筛选在不含卡那霉素的培养基上生长，而在含卡那霉素的培养基上不生长的菌株进一步进行PCR鉴定，挑取菌株利用如下引物进行PCR扩增：
P5:GCACCTTGCGTTGAAGGCCCAG
P6:CTGCGAGGGAGCGGGTGTGAGCG
将PCR扩增出的1728bp的DNA片段(SEQ ID NO.6)，送北京invitrogen公司进行测序，通过序列比对，含有“TGAGTGAAAT”碱基序列的菌株即为重组菌株M7-01。
一种包含tkt基因启动子突变体的重组菌株在生产L-赖氨酸中的应用，将包含tkt基因启动子突变体的重组菌株进行发酵生产，得到L-赖氨酸。
由于采用了上述技术方案，本发明的有益效果是：
本发明通过对tkt基因的启动子区域引入突变，获得重组菌株，与现有菌株的相比，改造位点没有冲突，改造后的突变体可以增强葡萄糖-6-磷酸脱氢酶活性，用于谷氨酸棒状杆菌中赖氨酸的发酵生产，可以进一步提高赖氨酸的产量，降低生产成本。
具体实施方式
下面结合实施例，进一步阐述本发明。
本发明涉及的培养基如下：
(1)LB固体培养基：Tryptone(胰蛋白胨)10g/L，Yeast Extract(酵母膏)5g/L，NaCl 10g/L，琼脂20g/L，pH 7.0。
(2)LB液体培养基：Tryptone 10g/L，Yeast Extract 5g/L，NaCl 10g/L，pH 7.0。
(3)LBG液体培养基：Tryptone 10g/L，Yeast Extract 5g/L，NaCl 10g/L，葡萄糖5g/L，pH 7.0。
(4)LBG固体培养基：Tryptone 10g/L，Yeast Extract 5g/L，NaCl 10g/L，葡萄糖5g/L，琼脂20g/L，pH 7.0。
实施例一包含点突变的tkt基因启动子区的DNA片段的获得
a.引物设计：根据NCBI公布的谷氨酸棒状杆菌ATCC13032的基因组序列，设计引物用于在菌株M7中tkt基因的启动子区域引入突变，设计引物如下(由北京invitrogen公司合成)：
P1:CGCGGATCCGCGACAAGGAGGAGTTCAATAACC(BamH I)
P2:GATCTACGACTTAATTTCACTCATTCAAATTTGGCAAAGG
P3:CCTTTGCCAAATTTGAATGAGTGAAATTAAGTCGTAGATC
P4:ACGCGTCGACGGAAGCCTTACGAGTTGC(Sal I)；
其中P2引物末端划线部分序列与P3引物起始端划线部分序列为反向配对序列，P3引物中间划线部分序列为人工合成的“TGAGTGAAAT”序列，用于代替包含tkt基因的启动子区域的原序列(SEQ ID NO.1)中的“CCAATTAACC”；
b.PCR扩增：以谷氨酸棒状杆菌ATCC13032基因组为模板，分别以引物P1和P2、P3和P4进行PCR扩增，得到大小分别为859bp(SEQ ID NO.3)、1262bp(SEQ ID NO.4)的DNA片段；
PCR体系：PremixHS 25μL，模板DNA2μL，引物(20pM)各1μL，灭菌蒸馏时21μL，总体积50μL。
其中PCR扩增条件为：
预变性：95℃，5min；变性：98℃，10s；复性：62℃，15s；延伸：72℃，1min30s；40循环；后延伸：72℃，10min；
c.纯化：将步骤b得到的产物分别通过琼脂糖凝胶电泳分离纯化；
d.PCR扩增：以步骤c纯化后的两个片段为模板，以引物P1和P4进行重叠PCR扩增获得2079bp的DNA片段(SEQ ID NO.2)。
PCR体系：PremixHS 25μL，模板DNA各2μL，引物(20pM)各1μL，灭菌蒸馏时19μL，总体积50μL。
其中重叠PCR扩增条件为：
预变性：95℃，5min；变性：98℃，10s；复性：62℃，15s；延伸：72℃，2min；40循环；后延伸：72℃，10min。
e.纯化：将步骤d得到的产物通过琼脂糖凝胶电泳进行分离纯化，该DNA片段两端分别包含BamH I和Sal I酶切位点。该DNA片段导致tkt基因启动子区的“CCAATTAACC”突变为“TGAGTGAAAT”。
实施例二包含点突变的tkt基因启动子区的重组载体pK18-m-tkt的构建
将实施例一中步骤e纯化得到的DNA片段与穿梭质粒pK18mobsacB进行双酶切(BamH I/Sal I)。
双酶切反应体系：质粒DNA/目标片段20ul，BamH I4 ul，Sal I 4ul，10*Tbuffer6ul，灭菌蒸馏水6ul。反应温度37℃，反应时间3小时或过夜。
将酶切后的产物分别通过琼脂糖凝胶电泳进行分离纯化。将纯化后的产物，利用TAKARA公司出品的DNA Ligation Kit Ver.2.0试剂盒进行连接，原则上载体DNA和插入目标DNA片段的摩尔数之比为0.03pmol：0.1～0.3pmol。连接温度为16℃，反应时间为4小时。
按照热激转化的方法，将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞(购自TAKARA公司)。将转化后的大肠杆菌在37℃条件下培养1小时后，涂布到含有终浓度为50ug/ml的卡那霉素的LB固体平板上。培养箱中37℃过夜培养约16小时后，接种到含有终浓度为50ug/ml的卡那霉素的LB液体培养基中，培养16小时后，使用OMEGA公司的质粒提取试剂盒提取重组质粒pK18-m-tkt，该质粒上含有卡那霉素抗性标记。将重组载体送北京invitrogen公司进行测序鉴定，将含有正确点突变的重组载体保存备用。
实施例三包含点突变的tkt基因启动子区的重组菌体的构建
将含有正确点突变的重组载体pK18-m-tkt通过电击转化到菌株M7中(经过测序确认该菌体染色体上保留有野生型的tkt基因启动子)，将转化后的菌液涂布到含卡那霉素最终浓度为50ug/ml的LBG固体培养基上，30℃培养24-30小时。对培养得到的单菌落分别通过引物P1和M13F进行鉴定，将扩增出2114bp的DNA片段(SEQ ID NO.5)的菌株定义为阳性菌株。
其中PCR扩增条件为：
预变性：95℃，5min；变性：98℃，10s；复性：62℃，15s；延伸：72℃，2min；40循环；后延伸：72℃，10min。
将阳性菌株在含10％蔗糖的LB固体培养基上进行培养，将培养产生的单菌落分别在含有卡那霉素和不含卡那霉素的LBG固体培养基上进行培养。筛选在不含卡那霉素的培养基上生长，而在含卡那霉素的培养基上不生长的菌株进一步进行PCR鉴定，单菌落利用如下引物进行PCR扩增：
P5:GCACCTTGCGTTGAAGGCCCAG
P6:CTGCGAGGGAGCGGGTGTGAGCG
其中PCR扩增条件为：
预变性：95℃，5min；变性：98℃，10s；复性：60℃，15s；延伸：72℃，2min；40循环；后延伸：72℃，10min。
将PCR扩增出的1728bp的DNA片段(SEQ ID NO.6)，送北京invitrogen公司进行测序，通过序列比对，含有“TGAGTGAAAT”碱基序列的菌株即为同源重组成功的菌株，被命名为M7-01。
实验例四L-赖氨酸的发酵生产
将构建的菌株M7-01和原始菌株M7进行小罐发酵试验。每个菌株重复3次，其中种子培养基配方如表1所示：
表1：种子培养基配方
| 名称 | 配方 |
| 蔗糖 | 20g/l |
| 硫酸镁 | 0.4g/l |
| 磷酸二氢钾 | 1.0g/l |
| 硫酸铵 | 20g/l |
| 硫酸亚铁 | 12mg/l |
| 硫酸锰 | 12mg/l |
| 生物素 | 50mg/l |
| 玉米浆 | 5ml/l |
| VB1 | 10mg/l |
| 烟酰胺 | 50mg/l |
| 消泡剂 | 0.1％ |
种子培养条件：37℃，pH6.9，初始转速200rpm，风量0.5vvm，罐压0.5mPa，溶氧校正100％，控溶氧20-25％，接种量5％。培养24h左右，OD生长至0.4左右(600nm，稀释26倍)时转接发酵罐。
发酵培养的培养基配方如表2所示：
表2：发酵培养基配方
| 名称 | 配方 |
| 葡萄糖 | 30g/l |
| 硫酸镁 | 1.5g/l |
| 磷酸二氢钾 | 1.2g/l |
| 硫酸铵 | 32g/l |
| 硫酸亚铁 | 24mg/l |
| 硫酸锰 | 24mg/l |
| 生物素 | 30mg/l |
| 玉米浆 | 24ml/l |
| VB1 | 10mg/l |
| 烟酰胺 | 30mg/l |
| 消泡剂 | 0.1％ |
发酵培养条件：37℃，pH6.9，初始转速200rpm，风量0.5vvm，罐压0.5mPa，溶氧校正100％，控溶氧15-20％，接种量5％，残糖控1g/l，流加75％浓糖、50％硫酸铵，用液氨调节PH，培养周期48h。
经过三次发酵，发酵结果见表3。
表3：赖氨酸发酵实验结果
结果分析：
如表3所示，对谷氨酸棒杆菌中的tkt启动子区域的碱基序列进行位点突变，得到的突变体与未突变菌株相比，能显著提高L-赖氨酸的产酸能力。
应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表
<110> 山东寿光巨能金玉米开发有限公司
寿光金远东变性淀粉有限公司
寿光金玉米生物科技有限公司
临清德能金玉米生物有限公司
<120> 一种tkt基因启动子突变体及其在生产L-赖氨酸中的应用
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 2060
<212> DNA
<213> 谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)
<400> 1
gcgacaagga ggagttcaat aaccctgggc ttcgttagcg caatataggc cttgatcgtg 60
tccaagggtt ctcctccaga acgttgcatt ttcaaatcac tcatatattt aagttgtgag 120
tccttattat ttaaatatcc ctgcggtgag tgtgcacctt gcgttgaagg cccagactct 180
gacagaagcg tcagagtgtt tactcaagac attttctaag acacacggca aattagtcgg 240
atgaagttaa ttaaaagttc ccgaatcaat ctttttaatg ttttcaaacc atttgaaggt 300
gtgctgaccc aggtggacgc caacctttaa aaagcttcag acttttattt ccacttcata 360
aaaactgcct gtgacgattc cgttaaagat tgtgccaaat cactgcgcaa aactcgcgcg 420
gaaccagacc ttgccatgct atcgcctatt cacactattt gagtaatcgg aaatagatgg 480
gtgtagacgc ttgattggcg gacggttcac agcggacgat ttcaggccct cgtagctcga 540
gagtttgaag gggtccgatt cgttccgttc gtgacgcttt gtgaggtttt ttgacgttgc 600
accgtattgc ttgccgaaca tttttctttt cctttcggtt tttcgagaat tttcacctac 660
aaaagcccac gtcacagctc ccagacttaa gattgatcac acctttgaca catttgaacc 720
acagttggtt ataaaatggg ttcaacatca ctatggttag aggtgttgac gggtcagatt 780
aagcaaagac tactttcggg gtagatcacc tttgccaaat ttgaaccaat taacctaagt 840
cgtagatctg atcatcggat ctaacgaaaa cgaaccaaaa ctttggtccc ggtttaaccc 900
aggaaggatt gaccaccttg acgctgtcac ctgaacttca ggcgctcact gtacgcaatt 960
acccctctga ttggtccgat gtggacacca aggctgtaga cactgttcgt gtcctcgctg 1020
cagacgctgt agaaaactgt ggctccggcc acccaggcac cgcaatgagc ctggctcccc 1080
ttgcatacac cttgtaccag cgggttatga acgtagatcc acaggacacc aactgggcag 1140
gccgtgaccg cttcgttctt tcttgtggcc actcctcttt gacccagtac atccagcttt 1200
acttgggtgg attcggcctt gagatggatg acctgaaggc tctgcgcacc tgggattcct 1260
tgaccccagg acaccctgag taccgccaca ccaagggcgt tgagatcacc actggccctc 1320
ttggccaggg tcttgcatct gcagttggta tggccatggc tgctcgtcgt gagcgtggcc 1380
tattcgaccc aaccgctgct gagggcgaat ccccattcga ccaccacatc tacgtcattg 1440
cttctgatgg tgacctgcag gaaggtgtca cctctgaggc atcctccatc gctggcaccc 1500
agcagctggg caacctcatc gtgttctggg atgacaaccg catctccatc gaagacaaca 1560
ctgagatcgc tttcaacgag gacgttgttg ctcgttacaa ggcttacggc tggcagacca 1620
ttgaggttga ggctggcgag gacgttgcag caatcgaagc tgcagtggct gaggctaaga 1680
aggacaccaa gcgacctacc ttcatccgcg ttcgcaccat catcggcttc ccagctccaa 1740
ctatgatgaa caccggtgct gtgcacggtg ctgctcttgg cgcagctgag gttgcagcaa 1800
ccaagactga gcttggattc gatcctgagg ctcacttcgc gatcgacgat gaggttatcg 1860
ctcacacccg ctccctcgca gagcgcgctg cacagaagaa ggctgcatgg caggtcaagt 1920
tcgatgagtg ggcagctgcc aaccctgaga acaaggctct gttcgatcgc ctgaactccc 1980
gtgagcttcc agcgggctac gctgacgagc tcccaacatg ggatgcagat gagaagggcg 2040
tcgcaactcg taaggcttcc 2060
<210> 2
<211> 2079
<212> DNA
<213> Corynebacterium glutamicum
<400> 2
cgcggatccg cgacaaggag gagttcaata accctgggct tcgttagcgc aatataggcc 60
ttgatcgtgt ccaagggttc tcctccagaa cgttgcattt tcaaatcact catatattta 120
agttgtgagt ccttattatt taaatatccc tgcggtgagt gtgcaccttg cgttgaaggc 180
ccagactctg acagaagcgt cagagtgttt actcaagaca ttttctaaga cacacggcaa 240
attagtcgga tgaagttaat taaaagttcc cgaatcaatc tttttaatgt tttcaaacca 300
tttgaaggtg tgctgaccca ggtggacgcc aacctttaaa aagcttcaga cttttatttc 360
cacttcataa aaactgcctg tgacgattcc gttaaagatt gtgccaaatc actgcgcaaa 420
actcgcgcgg aaccagacct tgccatgcta tcgcctattc acactatttg agtaatcgga 480
aatagatggg tgtagacgct tgattggcgg acggttcaca gcggacgatt tcaggccctc 540
gtagctcgag agtttgaagg ggtccgattc gttccgttcg tgacgctttg tgaggttttt 600
tgacgttgca ccgtattgct tgccgaacat ttttcttttc ctttcggttt ttcgagaatt 660
ttcacctaca aaagcccacg tcacagctcc cagacttaag attgatcaca cctttgacac 720
atttgaacca cagttggtta taaaatgggt tcaacatcac tatggttaga ggtgttgacg 780
ggtcagatta agcaaagact actttcgggg tagatcacct ttgccaaatt tgaatgagtg 840
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gtttaaccca ggaaggattg accaccttga cgctgtcacc tgaacttcag gcgctcactg 960
tacgcaatta cccctctgat tggtccgatg tggacaccaa ggctgtagac actgttcgtg 1020
tcctcgctgc agacgctgta gaaaactgtg gctccggcca cccaggcacc gcaatgagcc 1080
tggctcccct tgcatacacc ttgtaccagc gggttatgaa cgtagatcca caggacacca 1140
actgggcagg ccgtgaccgc ttcgttcttt cttgtggcca ctcctctttg acccagtaca 1200
tccagcttta cttgggtgga ttcggccttg agatggatga cctgaaggct ctgcgcacct 1260
gggattcctt gaccccagga caccctgagt accgccacac caagggcgtt gagatcacca 1320
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agcgtggcct attcgaccca accgctgctg agggcgaatc cccattcgac caccacatct 1440
acgtcattgc ttctgatggt gacctgcagg aaggtgtcac ctctgaggca tcctccatcg 1500
ctggcaccca gcagctgggc aacctcatcg tgttctggga tgacaaccgc atctccatcg 1560
aagacaacac tgagatcgct ttcaacgagg acgttgttgc tcgttacaag gcttacggct 1620
ggcagaccat tgaggttgag gctggcgagg acgttgcagc aatcgaagct gcagtggctg 1680
aggctaagaa ggacaccaag cgacctacct tcatccgcgt tcgcaccatc atcggcttcc 1740
cagctccaac tatgatgaac accggtgctg tgcacggtgc tgctcttggc gcagctgagg 1800
ttgcagcaac caagactgag cttggattcg atcctgaggc tcacttcgcg atcgacgatg 1860
aggttatcgc tcacacccgc tccctcgcag agcgcgctgc acagaagaag gctgcatggc 1920
aggtcaagtt cgatgagtgg gcagctgcca accctgagaa caaggctctg ttcgatcgcc 1980
tgaactcccg tgagcttcca gcgggctacg ctgacgagct cccaacatgg gatgcagatg 2040
agaagggcgt cgcaactcgt aaggcttccg tcgacgcgt 2079
<210> 3
<211> 859
<212> DNA
<213> Corynebacterium glutamicum
<400> 3
cgcggatccg cgacaaggag gagttcaata accctgggct tcgttagcgc aatataggcc 60
ttgatcgtgt ccaagggttc tcctccagaa cgttgcattt tcaaatcact catatattta 120
agttgtgagt ccttattatt taaatatccc tgcggtgagt gtgcaccttg cgttgaaggc 180
ccagactctg acagaagcgt cagagtgttt actcaagaca ttttctaaga cacacggcaa 240
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tttgaaggtg tgctgaccca ggtggacgcc aacctttaaa aagcttcaga cttttatttc 360
cacttcataa aaactgcctg tgacgattcc gttaaagatt gtgccaaatc actgcgcaaa 420
actcgcgcgg aaccagacct tgccatgcta tcgcctattc acactatttg agtaatcgga 480
aatagatggg tgtagacgct tgattggcgg acggttcaca gcggacgatt tcaggccctc 540
gtagctcgag agtttgaagg ggtccgattc gttccgttcg tgacgctttg tgaggttttt 600
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ggtcagatta agcaaagact actttcgggg tagatcacct ttgccaaatt tgaatgagtg 840
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<211> 1262
<212> DNA
<213> Corynebacterium glutamicum
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gt 1262
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<212> DNA
<213> Corynebacterium glutamicum
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Claims (7)
1.一种tkt基因启动子突变体，其特征在于，所述tkt基因启动子突变体基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，其启动子区域部分核苷酸序列由SEQ ID NO.1中的CCAATTAACC替换为TGAGTGAAAT。
2.如权利要求1所述的tkt基因启动子突变体的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
a.引物设计：根据NCBI公布的如SEQ ID NO.1所示的谷氨酸棒状杆菌ATCC13032的基因组序列，设计如下引物：
P1: CGCGGATCCGCGACAAGGAGGAGTTCAATAACC
P2: GATCTACGACTTAATTTCACTCATTCAAATTTGGCAAAGG
P3:CCTTTGCCAAATTTGAATGAGTGAAATTAAGTCGTAGATC
P4: ACGCGTCGACGGAAGCCTTACGAGTTGC
b.PCR扩增：以ATCC13032基因组为模板，分别以引物P1和P2、P3和P4进行PCR扩增，得到大小分别为如SEQ ID NO.3所示859bp、如SEQ ID NO.4所示1262bp的DNA片段；
c.纯化：将步骤b得到的产物分别通过琼脂糖凝胶电泳分离纯化；
d.连接并酶切：以步骤c纯化后的两片段为模板，以引物P1和P4进行PCR扩增获得如SEQID NO.2所示的2079bp的DNA片段，得到tkt基因启动子突变体。
3.如权利要求2所述的tkt基因启动子突变体的制备方法，其特征在于：所述步骤b中PCR扩增条件为：
预变性：95℃，5min；变性：98℃，10s；复性：62℃，15s；延伸：72℃，1min30s；40循环；后延伸：72℃， 10min；
步骤d中PCR扩增条件为：
预变性：95℃，5min；变性：98℃，10s；复性：62℃，15s；延伸：72℃，2min；40循环；后延伸：72℃， 10min。
4.一种包含tkt基因启动子突变体的重组载体，其特征在于：将权利要求1所述的tkt基因启动子突变体利用BamH I酶和Sal I酶进行酶切，然后连接到穿梭质粒上得到重组载体。
5.如权利要求4所述的包含tkt基因启动子突变体的重组载体，其特征在于：所述重组载体是将经过琼脂糖凝胶电泳分离纯化后的tkt基因启动子突变体进行酶切、纯化后，再用连接酶连接到穿梭质粒pk18mobsacB上，得到重组载体。
6.一种包含tkt基因启动子突变体的重组菌株，其特征在于：将包含权利要求1所述的tkt基因启动子突变体的重组载体转化到赖氨酸生产菌中得到重组菌株。
7.一种包含tkt基因启动子突变体的重组菌株在生产L-赖氨酸中的应用，其特征在于：将包含权利要求1所述的tkt基因启动子突变体的重组菌株进行发酵生产，得到L-赖氨酸。
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Legal Events
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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