CN103695454A

CN103695454A - 表达l-赖氨酸转运蛋白的重组质粒、工程菌及应用

Info

Publication number: CN103695454A
Application number: CN201310694012.4A
Authority: CN
Inventors: 高世军; 刘德玉; 唐春辉; 朱艳敏
Original assignee: SHANDONG SHOUGUANG JUNENG GROUP GOLDEN CORN CO Ltd
Current assignee: SHANDONG SHOUGUANG JUNENG GROUP GOLDEN CORN CO Ltd
Priority date: 2013-12-18
Filing date: 2013-12-18
Publication date: 2014-04-02

Abstract

本发明公开表达L-赖氨酸转运蛋白的重组质粒、工程菌及应用。该基因来自谷氨酸棒状杆菌ATCC13032，用PCR从谷氨酸棒状杆菌基因组DNA中扩增获得。L-赖氨酸转运蛋白基因的两端分别添加EcoRI和HindIII限制性酶切位点，和用相同的限制性内切酶进行酶切后的pKk223-3连接并转化，筛选，提质粒，电转化到谷氨酸棒状杆菌ATCC13032中，实现了在谷氨酸棒状杆菌中转运蛋白基因的倍增，表达产物L-赖氨酸转运蛋白分子量为25081.9Da。该重组L-赖氨酸转运蛋白或表达该重组转运蛋白的工程菌可以将L-赖氨酸由细胞内转运到细胞外，具有转运效率高，转运速度快，提高L-赖氨酸产率的优点。

Description

表达L-赖氨酸转运蛋白的重组质粒、工程菌及应用

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，尤其涉及表达L-赖氨酸转运蛋白的重组质粒、工程菌及应用。

背景技术

L-赖氨酸，属于天冬氨酸族氨基酸(L-aspartate family amino acids，AFAAS)，包括L-赖氨酸、蛋氨酸、苏氨酸和异亮氨酸4种氨基酸，均为必需氨基酸)，是人类和动物必需氨基酸，自身不能合成的氨基酸之一，必须从体外摄取。具有多种生理功能，广泛应用于食品、医药以及饲料添加剂等。L-赖氨酸是蛋白质组成中必不可少的一个组成部分。作为营养元素，对人体的成长和发展的作用是明显的。它还是产生肉碱的一个重要组分，而肉碱可以将部分不饱和脂肪酸转化为能量，进一步降低胆固醇水平。在人体中，L-赖氨酸的功能是多种的，可以组成胶原蛋白，胶原蛋白负责结缔组织，肌肉，骨骼，肌腱，软关节等的组成。在钙的吸收方面，L-赖氨酸的作用也是明显的。

合成方法主要有：提取法，以动物血粉为原料，再从蛋白质水解物中，用离子交换法或苦味酸沉淀法分离提取L-赖氨酸；化学合成法，以化学物质为原料合成L-赖氨酸。主要运用的工艺是DSM 法和东丽法，使用原料是己内酰胺和环己烯；酶合成法，以己内酰胺或二氢呋喃为起始原料，借助于有机合成与生物化学工程相结合的生产技术来生产L-赖氨酸；微生物发酵法，常以淀粉、甘蔗或甜菜制糖后的废糖蜜为原料，产生的L-赖氨酸都是L型，是目前工业上生产L-赖氨酸的最主要方法。

L-赖氨酸代谢工程育种主要体现在大肠杆菌和棒状杆菌（如谷氨酸棒杆菌、黄色短杆菌和乳糖发酵短杆菌等），而解析L-赖氨酸生物合成途径和关键酶基因序列是构建高产L-赖氨酸工程菌的前提和基础。

L-赖氨酸在细胞内部积累会对天冬氨酸激酶和二氢吡啶二羧酸合酶产生反馈抑制。天冬氨酸激酶（简称AK），可分为AK-Ⅰ，AK-Ⅱ，AK-Ⅲ，这三种酶为同工酶，都具有将L-天冬氨酸转化成L-天冬氨酸-β-磷酸的功效。其中AK-Ⅰ，AK-Ⅱ为复合酶，均带有高丝氨酸脱氢酶，高丝氨酸脱氢酶可将L-赖氨酸生物合成的前体物质天冬氨酸半醛转化成L-高丝氨酸，与L-赖氨酸抢夺资源。AK-Ⅲ是单功能酶，为lysC基因的产物，受到L-赖氨酸产物抑制，是L-赖氨酸生物合成系统中的第二限速酶。二氢吡啶二羧酸合酶（简称DDPS），也有翻译做二氢吡啶甲酸合酶，将天冬氨酸-β-半醛与丙酮酸脱水缩合生成二氢吡啶二羧酸，此酶负责L-赖氨酸合成系统中重要的调控位点，是L-赖氨酸生物合成的第一限速酶，受到L-赖氨酸反馈抑制与阻遏。

在发酵过程中，伴随着菌体的大量生长和菌体代谢的加快，L-赖氨酸也在细胞内不断地积累，加剧对天冬氨酸激酶和二氢吡啶二羧酸合酶的反馈抑制。对合成途径中从天冬氨酸到L-赖氨酸的代谢流进行了限制，也限制了L-赖氨酸的进一步发酵积累。

发明内容

本发明的目的在于，克服现有技术的不足，提供了表达L-赖氨酸转运蛋白的重组质粒、工程菌及应用。解决了现有技术存在的L-赖氨酸运送不足的问题。

表达L-赖氨酸转运蛋白的重组质粒pkk-E，其氨基酸序列为SEQ ID NO.3所示。

一种工程菌，该菌株AT-pkk-E-DE为谷氨酸棒杆菌Corynebacterium glutamicum，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.8183，保藏时间为2013年9月13日，由表达L-赖氨酸转运蛋白的重组质粒pkk-E转化谷氨酸棒杆菌获得。

表达L-赖氨酸转运蛋白的重组质粒pkk-E在制备L-赖氨酸中的应用。

谷氨酸棒工程菌在制备L-赖氨酸中的应用。

利用PCR方法筛选克隆出谷氨酸棒状杆菌L-赖氨酸转运蛋白基因。

谷氨酸棒杆菌L-赖氨酸转运蛋白基因，该基因的DNA序列为SEQ ID NO.1，全长702bp，来自保藏菌株编号为1.1886（菌株别号为ATCC13032）的谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum），在中国普通微生物菌种保藏管理中心保藏，该基因是一个已经报道的DNA序列，从NCBI数据库获得，其碱基组成特征如下表1所示：

表1谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）ATCC13032

L-赖氨酸转运蛋白基因组成特征：

该基因编码的推导氨基酸序列为SEQ ID NO.2。

本发明提供一种上述谷氨酸棒杆菌L-赖氨酸转运蛋白基因的表达，获得表达产物——重组L-赖氨酸转运蛋白。具体的：该谷氨酸棒状杆菌L-赖氨酸转运蛋白基因借助通用的基因工程手段在谷氨酸棒状杆菌中过量表达；通过过量表达可以大规模的产生L-赖氨酸转运蛋白，该表达产物重组L-赖氨酸转运蛋白的分子量为25081.9Da。

本发明提供了一种谷氨酸棒杆菌，引入上述的谷氨酸棒状杆菌重组L-赖氨酸转运蛋白转化的。该菌株已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号为CGMCC No.8183，保藏时间为2013年9月13日，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。

本发明提供一种上述重组L-赖氨酸转运蛋白或表达该重组蛋白的谷氨酸棒杆菌在制备L-赖氨酸中的应用，具体的：利用所获得的重组L-赖氨酸转运蛋白或表达该重组蛋白的谷氨酸棒状杆菌能够高效率的把细胞内的L-赖氨酸转运到细胞外，降低细胞内L-赖氨酸的浓度，进一步减少对代谢流程的反馈抑制，此方法可用于L-赖氨酸的发酵制备。在发酵生产L-赖氨酸的过程中，合适的培养温度为28-38℃，合适的pH为6.5-7.5。

本发明的优点和有益效果：在研究谷氨酸棒状杆菌有关L-赖氨酸代谢流的过程中，一个有关L-赖氨酸转运的蛋白，可以将细胞内的L-赖氨酸转运到细胞外，降低细胞内L-赖氨酸的浓度，降低对L-赖氨酸合成途径中的反馈抑制作用。L-赖氨酸转运蛋白对L-赖氨酸的生物发酵制备有重要的价值和效果。通过分析谷氨酸棒状杆菌ATCC13032的转运蛋白基因序列，我们设计了针对于克隆L-赖氨酸的引物，优化PCR条件，用谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）ATCC13032的基因组DNA克隆得到了L-赖氨酸转运蛋白基因。

在该基因的两端加上EcoRI和HindIII限制性酶切位点序列，和经过相同的两种酶酶切后的质粒pkk223-3进行连接，转化到谷氨酸棒状杆菌中，获得了谷氨酸棒杆菌基因工程菌株。

本发明倍增了谷氨酸棒杆菌L-赖氨酸转运蛋白基因，加强了L-赖氨酸转运蛋白的表达，进一步加强L-赖氨酸从细胞内转运到细胞外的能力，能够使L-赖氨酸转运在发酵生产L-赖氨酸时，既可以利用谷氨酸棒状杆菌基因组表达的L-赖氨酸转运蛋白转运L-赖氨酸，也可以利用重组质粒上表达的L-赖氨酸转运蛋白进行L-赖氨酸的转运。在使用了重组的L-赖氨酸转运蛋白以后，发酵液中的L-赖氨酸含量明显提高了，而且不需要额外的能量，微量元素等。

具体实施方式

本发明涉及的菌株和培养基如下：

菌株：谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）ATCC13032为从中国普通微生物菌种保藏管理中心购得，保藏菌株编号为1.1886（菌株别号为ATCC13032）。

培养基：

（1）1000mL LB液体培养基：Tryptone 10g，Yeast Extract 5g，NaCl 10g，pH 7.0

（2）1000mL LB固体培养基：Tryptone 10g，Yeast Extract 5g，NaCl 10g，琼脂 20g，pH 7.0

（3）1000mL LBG液体培养基：Tryptone 10g，Yeast Extract 5g，NaCl 10g，葡萄糖5g，pH 7.0

（4）1000mL LBG 固体培养基：Tryptone 10g，Yeast Extract 5g，NaCl 10g，葡萄糖5g，琼脂 20g，pH 7.0

实施例1

谷氨酸棒杆菌L-赖氨酸转运蛋白基因的克隆

挑取保藏菌株编号为1.1886（菌株别号为ATCC13032）的谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）在LBG固体斜面培养基上划线接种，30℃，培养48小时，然后挑取单菌落，转接到含有25ml液体LBG培养基的250ml容积的锥形瓶中，置于30℃，100rpm的摇床中培养，直到菌体生长达到指数期中期，约生长24小时。然后从此液体LBG培养基中吸取菌液5ml，12000rpm离心一分钟，去掉上清液，使用上海生工生产的革兰氏阳性菌基因组提取试剂盒，按照说明提取基因组。在含0.5%琼脂糖的凝胶上进行电泳验证，提取基因组为单一的与基因组大小合适的条带，条带拖尾不严重，无RNA污染。

搜索NCBI的GenBank数据库中有关ATCC13032谷氨酸棒杆菌L-赖氨酸转运蛋白（由细胞内转运到细胞外）的基因序列，从基因序列的两端设计引物，原则上引物两端尽量不设计到此基因两端的其他的氨基酸序列，尽可能的只包含转运蛋白本身的氨基酸序列，设计了上游引物和下游引物：

上游引物：5’ - TTAGAATTCATGGAAATCTTCATTACAG-3’；

下游引物：5’ - TTAAAGCTTCTAACCCATCAACATCAG-3’ ;

其中上游引物中的“GAATTC”是限制性核酸内切酶EcoRI的酶切位点，下游引物中的“AAGCTT”是限制性内切酶HindIII的酶切位点。

使用上游引物和下游引物，以谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）ATCC13032基因组DNA为模板，按照程序98℃，10秒；55℃，15秒；72℃，1分钟，30次循环PCR，进行克隆目标转运蛋白基因片段，获得大小合适，目标特异性强的结果。

使用确定的PCR反应体系为：Premix PrimeSTAR，25ul；模板基因组DNA，小于200ng；上游引物，0.2~0.3uM；下游引物，0.2~0.3uM；灭菌蒸馏水，将体系定容到50ul。

获得专一性强，大小合适的目标片段以后将片段切胶回收，然后送去华大基因测序，将测序结果与公布的已知序列比对，此次PCR结果无误，序列正确，是本次需要的L-赖氨酸转运蛋白基因。

实施例2

目的基因表达载体构建

在设计目标基因片段引物的时候在上下游引物的一端都设计了酶切位点，在与载体连接时，只需要将PCR获得的目标片段进行纯化后用EcoRI和HindIII进行双酶切，选择的载体质粒pkk223-3也用这两种限制性内切酶进行酶切，按照一般的载体与目标片段连接的方法进行片段连接，构建出新的表达载体。具体实施酶切方法，参照表2所述的限制性内切酶对目标基因和载体质粒分别进行双酶切。

表2限制性内切酶双酶切反应体系

注：反应温度为37℃，使用TAKARA公司出品的酶。

质粒与PCR获得的目标片段酶切3个小时。对酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，纯化，切胶回收，根据TAKARA公司购买的DL5000作为标准估测目标片段和载体片段的浓度，然后按照表3所示的反应体系和条件进行连接反应。

表3目标片段与载体连接体系

注：反应体系中使用的solution I来自于TAKARA公司出品的DNA Ligation Kit Ver.2.0。原则上载体DNA和插入目标DNA片段的摩尔数之比为0.03pmol：0.1~0.3pmol。连接温度为16℃，反应时间为4小时。

按照表2条件进行酶切，将PCR扩增后的产物纯化，将质粒pkk223-3提取回收后，用设计的酶进行双酶切，将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，并切胶回收，纯化片段，获得进一步纯化PCR目标片段和质粒酶切片段。然后按照表3条件连接片段与载体，连接4小时或过夜后，将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞。

按照热激转化的方法，将连接产物转化到使用CaCl₂法制备的保存在-80℃的大肠杆菌感受态细胞中，将转化后的大肠杆菌在37℃条件下培养1小时后，涂布到含有终浓度为50ug/ml的氨苄青霉素的LB固体平板上。温箱中37℃过夜培养约16小时后，挑取平板上长出来的单菌落，接种到含有终浓度为50ug/ml的氨苄青霉素的LB液体培养基中，生长16小时后，使用TAKARA公司的质粒提取试剂盒提取质粒，使用PCR和EcoRI、HindIII双酶切两种方法验证质粒。

结果表明，提取的连接转化质粒是对应的质粒pkk223-3和目标片段双酶切，并进行连接后的产物，成功构建了表达L-赖氨酸转运蛋白的重组质粒pkk-E。将转化后的质粒送去华大基因测序，然后与已知序列对比，结果正确，没有出现错配，丢失等的错误，其基因序列参见SEQ ID NO.3。

实施例3

获得含有谷氨酸转运蛋白表达质粒的谷氨酸棒杆菌基因工程菌

取构建好的表达L-赖氨酸转运蛋白的重组质粒pkk-E，电转化到谷氨酸棒杆菌中，按照如下条件筛选：将转化后的菌液接种到涂布有氨苄青霉素最终浓度为50ug/ml的LBG固体平板上，30~37℃，30~40小时培养，挑取单菌落，接种到氨苄青霉素终浓度为50ug/ml的液体LBG培养基中，30~37℃，30~40小时，120rpm培养。获得L-赖氨酸转运蛋白倍增的谷氨酸棒状杆菌基因工程菌（AT-pkk-E-DE）。

实施例4

谷氨酸棒杆菌基因工程菌发酵验证对产L-赖氨酸的影响

按照实施例3获得谷氨酸棒杆菌基因工程菌AT-pkk-E-DE，将基因工程菌AT-pkk-E-DE由种子培养到发酵培养获得L-赖氨酸。

种子培养基主要成分重量百分含量：

胰蛋白胨：1~10%

酵母提取物：1~10%

氯化钠：1~25%

葡萄糖：0.5~3%

培养温度：30~40℃

摇瓶种子培养，20~100ml体积的液体种子培养基在250ml锥形瓶中，100~220rpm摇床培养。种子培养基培养培养1~4天以后，接种到发酵培养基中摇瓶培养，接种量为10%~20%，即从种子培养基接到发酵培养基的那部分培养基体积是接种到发酵培养基中后发酵培养基整体体积的10%~20%。初始发酵摇瓶培养基OD控制在0.3~0.9之间。

发酵培养基主要成分重量百分含量：

淀粉水解糖：10~20%

尿素：0.3~10%

磷酸二氢钾：0.01~0.1%

硫酸镁：0.01~0.1%

硫酸锰：0.001~0.1%

甘蔗糖蜜：0.1~10%

发酵摇瓶培养生产L-赖氨酸，20~100ml体积的液体发酵培养基在250ml锥形瓶中，100~220rpm摇床培养。发酵培养基培养培养1~4天以后检测L-赖氨酸产量。

实施例5

检测基因工程菌生产L-赖氨酸能力

配置不同浓度的L-赖氨酸标准品，制作L-赖氨酸标准曲线，在475nm下测定发酵产物L-赖氨酸OD值，在实施例4中的培养基及培养条件下出发菌株ATCC13032产酸为1.12g/L，突变株AT-pkk-E-DE产酸为2.71g/L。L-赖氨酸转运蛋白倍增后的突变株AT-pkk-E-DE提高了L-赖氨酸的产酸能力。

SEQUENCE LISTING

<110> 山东寿光巨能金玉米开发有限公司

<120> 表达L-赖氨酸转运蛋白的重组质粒、工程菌及应用

<130> 2013

<160> 2

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 702

<212> DNA

<213> 谷氨酸棒杆菌（Corynebacteriumglutamicum）

<400> 1

atggaaatct tcattacagg tctgcttttg ggggccagtc ttttactgtc catcggaccg 60

cagaatgtac tggtgattaa acaaggaatt aagcgcgaag gactcattgc ggttcttctc 120

gtgtgtttaa tttctgacgt ctttttgttc atcgccggca ccttgggcgt tgatcttttg 180

tccaatgccg cgccgatcgt gctcgatatt atgcgctggg gtggcatcgc ttacctgtta 240

tggtttgccg tcatggcagc gaaagacgcc atgacaaaca aggtggaagc gccacagatc 300

attgaagaaa cagaaccaac cgtgcccgat gacacgcctt tgggcggttc ggcggtggcc 360

actgacacgc gcaaccgggt gcgggtggag gtgagcgtcg ataagcagcg ggtttgggta 420

aagcccatgt tgatggcaat cgtgctgacc tggttgaacc cgaatgcgta tttggacgcg 480

tttgtgttta tcggcggcgt cggcgcgcaa tacggcgaca ccggacggtg gattttcgcc 540

gctggcgcgt tcgcggcaag cctgatctgg ttcccgctgg tgggtttcgg cgcagcagca 600

ttgtcacgcc cgctgtccag ccccaaggtg tggcgctgga tcaacgtcgt cgtggcagtt 660

gtgatgaccg cattggccat caaactgatg ttgatgggtt ag 702

<210> 2

<211> 233

<212> PRT

<213> 谷氨酸棒杆菌（Corynebacteriumglutamicum）

<400> 2

Met Glu Ile Phe Ile Thr Gly Leu Leu Leu Gly Ala Ser Leu Leu Leu

1 5 10 15

Ser Ile Gly Pro Gln Asn Val Leu Val Ile Lys Gln Gly Ile Lys Arg

20 25 30

Glu Gly Leu Ile Ala Val Leu Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Val Phe

35 40 45

Leu Phe Ile Ala Gly Thr Leu Gly Val Asp Leu Leu Ser Asn Ala Ala

50 55 60

Pro Ile Val Leu Asp Ile Met Arg Trp Gly Gly Ile Ala Tyr Leu Leu

65 70 75 80

Trp Phe Ala Val Met Ala Ala Lys Asp Ala Met Thr Asn Lys Val Glu

85 90 95

Ala Pro Gln Ile Ile Glu Glu Thr Glu Pro Thr Val Pro Asp Asp Thr

100 105 110

Pro Leu Gly Gly Ser Ala Val Ala Thr Asp Thr Arg Asn Arg Val Arg

115 120 125

Val Glu Val Ser Val Asp Lys Gln Arg Val Trp Val Lys Pro Met Leu

130 135 140

Met Ala Ile Val Leu Thr Trp Leu Asn Pro Asn Ala Tyr Leu Asp Ala

145 150 155 160

Phe Val Phe Ile Gly Gly Val Gly Ala Gln Tyr Gly Asp Thr Gly Arg

165 170 175

Trp Ile Phe Ala Ala Gly Ala Phe Ala Ala Ser Leu Ile Trp Phe Pro

180 185 190

Leu Val Gly Phe Gly Ala Ala Ala Leu Ser Arg Pro Leu Ser Ser Pro

195 200 205

Lys Val Trp Arg Trp Ile Asn Val Val Val Ala Val Val Met Thr Ala

210 215 220

Leu Ala Ile Lys Leu Met Leu Met Gly

225 230

<210> 3

<211> 5966

<212> DNA

<213> 谷氨酸棒杆菌（Corynebacteriumglutamicum）

<400> 3

atggaaatct tcattacagg tctgcttttg ggggccagtc ttttactgtc catcggaccg 60

cagaatgtac tggtgattaa acaaggaatt aagcgcgaag gactcattgc ggttcttctc 120

gtgtgtttaa tttctgacgt ctttttgttc atcgccggca ccttgggcgt tgatcttttg 180

tccaatgccg cgccgatcgt gctcgatatt atgcgctggg gtggcatcgc ttacctgtta 240

tggtttgccg tcatggcagc gaaagacgcc atgacaaaca aggtggaagc gccacagatc 300

attgaagaaa cagaaccaac cgtgcccgat gacacgcctt tgggcggttc ggcggtggcc 360

actgacacgc gcaaccgggt gcgggtggag gtgagcgtcg ataagcagcg ggtttgggta 420

aagcccatgt tgatggcaat cgtgctgacc tggttgaacc cgaatgcgta tttggacgcg 480

tttgtgttta tcggcggcgt cggcgcgcaa tacggcgaca ccggacggtg gattttcgcc 540

gctggcgcgt tcgcggcaag cctgatctgg ttcccgctgg tgggtttcgg cgcagcagca 600

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atgagagaag attttcagcc tgatacagat taaatcagaa cgcagaagcg gtctgataaa 780

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gtttgtcggt gaacgctctc ctgagtagga caaatccgcc gggagcggat ttgaacgttg 1020

cgaagcaacg gcccggaggg tggcgggcag gacgcccgcc ataaactgcc aggcatcaaa 1080

ttaagcagaa ggccatcctg acggatggcc tttttgcgtt tctacaaact cttttgttta 1140

tttttctaaa tacattcaaa tatgtatccg ctcatgagac aataaccctg ataaatgctt 1200

caataatatt gaaaaaggaa gagtatgagt attcaacatt tccgtgtcgc ccttattccc 1260

ttttttgcgg cattttgcct tcctgttttt gctcacccag aaacgctggt gaaagtaaaa 1320

gatgctgaag atcagttggg tgcacgagtg ggttacatcg aactggatct caacagcggt 1380

aagatccttg agagttttcg ccccgaagaa cgttttccaa tgatgagcac ttttaaagtt 1440

ctgctatgtg gcgcggtatt atcccgtgtt gacgccgggc aagagcaact cggtcgccgc 1500

atacactatt ctcagaatga cttggttgag tactcaccag tcacagaaaa gcatcttacg 1560

gatggcatga cagtaagaga attatgcagt gctgccataa ccatgagtga taacactgcg 1620

gccaacttac ttctgacaac gatcggagga ccgaaggagc taaccgcttt tttgcacaac 1680

atgggggatc atgtaactcg ccttgatcgt tgggaaccgg agctgaatga agccatacca 1740

aacgacgagc gtgacaccac gatgcctgta gcaatggcaa caacgttgcg caaactatta 1800

actggcgaac tacttactct agcttcccgg caacaattaa tagactggat ggaggcggat 1860

aaagttgcag gaccacttct gcgctcggcc cttccggctg gctggtttat tgctgataaa 1920

tctggagccg gtgagcgtgg gtctcgcggt atcattgcag cactggggcc agatggtaag 1980

ccctcccgta tcgtagttat ctacacgacg gggagtcagg caactatgga tgaacgaaat 2040

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tactcatata tactttagat tgatttaaaa cttcattttt aatttaaaag gatctaggtg 2160

aagatccttt ttgataatct catgaccaaa atcccttaac gtgagttttc gttccactga 2220

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gtccttctag tgtagccgta gttaggccac cacttcaaga actctgtagc accgcctaca 2460

tacctcgctc tgctaatcct gttaccagtg gctgctgcca gtggcgataa gtcgtgtctt 2520

accgggttgg actcaagacg atagttaccg gataaggcgc agcggtcggg ctgaacgggg 2580

ggttcgtgca cacagcccag cttggagcga acgacctaca ccgaactgag atacctacag 2640

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ctttatagtc ctgtcgggtt tcgccacctc tgacttgagc gtcgattttt gtgatgctcg 2820

tcaggggggc ggagcctatg gaaaaacgcc agcaacgcgg cctttttacg gttcctggcc 2880

ttttgctggc cttttgctca catgttcttt cctgcgttat cccctgattc tgtggataac 2940

cgtattaccg cctttgagtg agctgatacc gctcgccgca gccgaacgac cgagcgcagc 3000

gagtcagtga gcgaggaagc ggaagagcgc ctgatgcggt attttctcct tacgcatctg 3060

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ttaagccagt atacactccg ctatcgctac gtgactgggt catggctgcg ccccgacacc 3180

cgccaacacc cgctgacgcg ccctgacggg cttgtctgct cccggcatcc gcttacagac 3240

aagctgtgac cgtctccggg agctgcatgt gtcagaggtt ttcaccgtca tcaccgaaac 3300

gcgcgaggca gctgcggtaa agctcatcag cgtggtcgtg aagcgattca cagatgtctg 3360

cctgttcatc cgcgtccagc tcgttgagtt tctccagaag cgttaatgtc tggcttctga 3420

taaagcgggc catgttaagg gcggtttttt cctgtttggt cacttgatgc ctccgtgtaa 3480

gggggaattt ctgttcatgg gggtaatgat accgatgaaa cgagagagga tgctcacgat 3540

acgggttact gatgatgaac atgcccggtt actggaacgt tgtgagggta aacaactggc 3600

ggtatggatg cggcgggacc agagaaaaat cactcagggt caatgccagc gcttcgttaa 3660

tacagatgta ggtgttccac agggtagcca gcagcatcct gcgatgcaga tccggaacat 3720

aatggtgcag ggcgctgact tccgcgtttc cagactttac gaaacacgga aaccgaagac 3780

cattcatgtt gttgctcagg tcgcagacgt tttgcagcag cagtcgcttc acgttcgctc 3840

gcgtatcggt gattcattct gctaaccagt aaggcaaccc cgccagccta gccgggtcct 3900

caacgacagg agcacgatca tgcgcacccg tggccaggac ccaacgctgc ccgagatgcg 3960

ccgcgtgcgg ctgctggaga tggcggacgc gatggatatg ttctgccaag ggttggtttg 4020

cgcattcaca gttctccgca agaattgatt ggctccaatt cttggagtgg tgaatccgtt 4080

agcgaggtgc cgccggcttc cattcaggtc gaggtggccc ggctccatgc accgcgacgc 4140

aacgcgggga ggcagacaag gtatagggcg gcgcctacaa tccatgccaa cccgttccat 4200

gtgctcgccg aggcggcata aatcgccgtg acgatcagcg gtccagtgat cgaagttagg 4260

ctggtaagag ccgcgagcga tccttgaagc tgtccctgat ggtcgtcatc tacctgcctg 4320

gacagcatgg cctgcaacgc gggcatcccg atgccgccgg aagcgagaag aatcataatg 4380

gggaaggcca tccagcctcg cgtcgcgaac gccagcaaga cgtagcccag cgcgtcggcc 4440

gccatgccgg cgataatggc ctgcttctcg ccgaaacgtt tggtggcggg accagtgacg 4500

aaggcttgag cgagggcgtg caagattccg aataccgcaa gcgacaggcc gatcatcgtc 4560

gcgctccagc gaaagcggtc ctcgccgaaa atgacccaga gcgctgccgg cacctgtcct 4620

acgagttgca tgataaagaa gacagtcata agtgcggcga cgatagtcat gccccgcgcc 4680

caccggaagg agctgactgg gttgaaggct ctcaagggca tcggtcgacg ctctccctta 4740

tgcgactcct gcattaggaa gcagcccagt agtaggttga ggccgttgag caccgccgcc 4800

gcaaggaatg gtgcatgcaa ggagatggcg cccaacagtc ccccggccac ggggcctgcc 4860

accataccca cgccgaaaca agcgctcatg agcccgaagt ggcgagcccg atcttcccca 4920

tcggtgatgt cggcgatata ggcgccagca accgcacctg tggcgccggt gatgccggcc 4980

acgatgcgtc cggcgtagag gatccggagc ttatcgactg cacggtgcac caatgcttct 5040

ggcgtcaggc agccatcgga agctgtggta tggctgtgca ggtcgtaaat cactgcataa 5100

ttcgtgtcgc tcaaggcgca ctcccgttct ggataatgtt ttttgcgccg acatcataac 5160

ggttctggca aatattctga aatgagctgt tgacaattaa tcatcggctc gtataatgtg 5220

tggaattgtg agcggataac aatttcacac aggaaacaga attcatggaa atcttcatta 5280

caggtctgct tttgggggcc agtcttttac tgtccatcgg accgcagaat gtactggtga 5340

ttaaacaagg aattaagcgc gaaggactca ttgcggttct tctcgtgtgt ttaatttctg 5400

acgtcttttt gttcatcgcc ggcaccttgg gcgttgatct tttgtccaat gccgcgccga 5460

tcgtgctcga tattatgcgc tggggtggca tcgcttacct gttatggttt gccgtcatgg 5520

cagcgaaaga cgccatgaca aacaaggtgg aagcgccaca gatcattgaa gaaacagaac 5580

caaccgtgcc cgatgacacg cctttgggcg gttcggcggt ggccactgac acgcgcaacc 5640

gggtgcgggt ggaggtgagc gtcgataagc agcgggtttg ggtaaagccc atgttgatgg 5700

caatcgtgct gacctggttg aacccgaatg cgtatttgga cgcgtttgtg tttatcggcg 5760

gcgtcggcgc gcaatacggc gacaccggac ggtggatttt cgccgctggc gcgttcgcgg 5820

caagcctgat ctggttcccg ctggtgggtt tcggcgcagc agcattgtca cgcccgctgt 5880

ccagccccaa ggtgtggcgc tggatcaacg tcgtcgtggc agttgtgatg accgcattgg 5940

ccatcaaact gatgttgatg ggttag 5966。

SEQUENCE LISTING

<110> 山东寿光巨能金玉米开发有限公司

<120> 表达L-赖氨酸转运蛋白的重组质粒、工程菌及应用

<130> 2013

<160> 2

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 702

<212> DNA

<213> 谷氨酸棒杆菌（Corynebacteriumglutamicum）

<400> 1

atggaaatct tcattacagg tctgcttttg ggggccagtc ttttactgtc catcggaccg 60

cagaatgtac tggtgattaa acaaggaatt aagcgcgaag gactcattgc ggttcttctc 120

gtgtgtttaa tttctgacgt ctttttgttc atcgccggca ccttgggcgt tgatcttttg 180

tccaatgccg cgccgatcgt gctcgatatt atgcgctggg gtggcatcgc ttacctgtta 240

tggtttgccg tcatggcagc gaaagacgcc atgacaaaca aggtggaagc gccacagatc 300

attgaagaaa cagaaccaac cgtgcccgat gacacgcctt tgggcggttc ggcggtggcc 360

actgacacgc gcaaccgggt gcgggtggag gtgagcgtcg ataagcagcg ggtttgggta 420

aagcccatgt tgatggcaat cgtgctgacc tggttgaacc cgaatgcgta tttggacgcg 480

tttgtgttta tcggcggcgt cggcgcgcaa tacggcgaca ccggacggtg gattttcgcc 540

gctggcgcgt tcgcggcaag cctgatctgg ttcccgctgg tgggtttcgg cgcagcagca 600

ttgtcacgcc cgctgtccag ccccaaggtg tggcgctgga tcaacgtcgt cgtggcagtt 660

gtgatgaccg cattggccat caaactgatg ttgatgggtt ag 702

<210> 2

<211> 233

<212> PRT

<213> 谷氨酸棒杆菌（Corynebacteriumglutamicum）

<400> 2

Met Glu Ile Phe Ile Thr Gly Leu Leu Leu Gly Ala Ser Leu Leu Leu

1 5 10 15

Ser Ile Gly Pro Gln Asn Val Leu Val Ile Lys Gln Gly Ile Lys Arg

20 25 30

Glu Gly Leu Ile Ala Val Leu Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Val Phe

35 40 45

Leu Phe Ile Ala Gly Thr Leu Gly Val Asp Leu Leu Ser Asn Ala Ala

50 55 60

Pro Ile Val Leu Asp Ile Met Arg Trp Gly Gly Ile Ala Tyr Leu Leu

65 70 75 80

Trp Phe Ala Val Met Ala Ala Lys Asp Ala Met Thr Asn Lys Val Glu

85 90 95

Ala Pro Gln Ile Ile Glu Glu Thr Glu Pro Thr Val Pro Asp Asp Thr

100 105 110

Pro Leu Gly Gly Ser Ala Val Ala Thr Asp Thr Arg Asn Arg Val Arg

115 120 125

Val Glu Val Ser Val Asp Lys Gln Arg Val Trp Val Lys Pro Met Leu

130 135 140

Met Ala Ile Val Leu Thr Trp Leu Asn Pro Asn Ala Tyr Leu Asp Ala

145 150 155 160

Phe Val Phe Ile Gly Gly Val Gly Ala Gln Tyr Gly Asp Thr Gly Arg

165 170 175

Trp Ile Phe Ala Ala Gly Ala Phe Ala Ala Ser Leu Ile Trp Phe Pro

180 185 190

Leu Val Gly Phe Gly Ala Ala Ala Leu Ser Arg Pro Leu Ser Ser Pro

195 200 205

Lys Val Trp Arg Trp Ile Asn Val Val Val Ala Val Val Met Thr Ala

210 215 220

Leu Ala Ile Lys Leu Met Leu Met Gly

225 230

<210> 3

<211> 5966

<212> DNA

<213> 谷氨酸棒杆菌（Corynebacteriumglutamicum）

<400> 3

atggaaatct tcattacagg tctgcttttg ggggccagtc ttttactgtc catcggaccg 60

cagaatgtac tggtgattaa acaaggaatt aagcgcgaag gactcattgc ggttcttctc 120

gtgtgtttaa tttctgacgt ctttttgttc atcgccggca ccttgggcgt tgatcttttg 180

tccaatgccg cgccgatcgt gctcgatatt atgcgctggg gtggcatcgc ttacctgtta 240

tggtttgccg tcatggcagc gaaagacgcc atgacaaaca aggtggaagc gccacagatc 300

attgaagaaa cagaaccaac cgtgcccgat gacacgcctt tgggcggttc ggcggtggcc 360

actgacacgc gcaaccgggt gcgggtggag gtgagcgtcg ataagcagcg ggtttgggta 420

aagcccatgt tgatggcaat cgtgctgacc tggttgaacc cgaatgcgta tttggacgcg 480

tttgtgttta tcggcggcgt cggcgcgcaa tacggcgaca ccggacggtg gattttcgcc 540

gctggcgcgt tcgcggcaag cctgatctgg ttcccgctgg tgggtttcgg cgcagcagca 600

ttgtcacgcc cgctgtccag ccccaaggtg tggcgctgga tcaacgtcgt cgtggcagtt 660

gtgatgaccg cattggccat caaactgatg ttgatgggtt agaagcttct gttttggcgg 720

atgagagaag attttcagcc tgatacagat taaatcagaa cgcagaagcg gtctgataaa 780

acagaatttg cctggcggca gtagcgcggt ggtcccacct gaccccatgc cgaactcaga 840

agtgaaacgc cgtagcgccg atggtagtgt ggggtctccc catgcgagag tagggaactg 900

ccaggcatca aataaaacga aaggctcagt cgaaagactg ggcctttcgt tttatctgtt 960

gtttgtcggt gaacgctctc ctgagtagga caaatccgcc gggagcggat ttgaacgttg 1020

cgaagcaacg gcccggaggg tggcgggcag gacgcccgcc ataaactgcc aggcatcaaa 1080

ttaagcagaa ggccatcctg acggatggcc tttttgcgtt tctacaaact cttttgttta 1140

tttttctaaa tacattcaaa tatgtatccg ctcatgagac aataaccctg ataaatgctt 1200

caataatatt gaaaaaggaa gagtatgagt attcaacatt tccgtgtcgc ccttattccc 1260

ttttttgcgg cattttgcct tcctgttttt gctcacccag aaacgctggt gaaagtaaaa 1320

gatgctgaag atcagttggg tgcacgagtg ggttacatcg aactggatct caacagcggt 1380

aagatccttg agagttttcg ccccgaagaa cgttttccaa tgatgagcac ttttaaagtt 1440

ctgctatgtg gcgcggtatt atcccgtgtt gacgccgggc aagagcaact cggtcgccgc 1500

atacactatt ctcagaatga cttggttgag tactcaccag tcacagaaaa gcatcttacg 1560

gatggcatga cagtaagaga attatgcagt gctgccataa ccatgagtga taacactgcg 1620

gccaacttac ttctgacaac gatcggagga ccgaaggagc taaccgcttt tttgcacaac 1680

atgggggatc atgtaactcg ccttgatcgt tgggaaccgg agctgaatga agccatacca 1740

aacgacgagc gtgacaccac gatgcctgta gcaatggcaa caacgttgcg caaactatta 1800

actggcgaac tacttactct agcttcccgg caacaattaa tagactggat ggaggcggat 1860

aaagttgcag gaccacttct gcgctcggcc cttccggctg gctggtttat tgctgataaa 1920

tctggagccg gtgagcgtgg gtctcgcggt atcattgcag cactggggcc agatggtaag 1980

ccctcccgta tcgtagttat ctacacgacg gggagtcagg caactatgga tgaacgaaat 2040

agacagatcg ctgagatagg tgcctcactg attaagcatt ggtaactgtc agaccaagtt 2100

tactcatata tactttagat tgatttaaaa cttcattttt aatttaaaag gatctaggtg 2160

aagatccttt ttgataatct catgaccaaa atcccttaac gtgagttttc gttccactga 2220

gcgtcagacc ccgtagaaaa gatcaaagga tcttcttgag atcctttttt tctgcgcgta 2280

atctgctgct tgcaaacaaa aaaaccaccg ctaccagcgg tggtttgttt gccggatcaa 2340

gagctaccaa ctctttttcc gaaggtaact ggcttcagca gagcgcagat accaaatact 2400

gtccttctag tgtagccgta gttaggccac cacttcaaga actctgtagc accgcctaca 2460

tacctcgctc tgctaatcct gttaccagtg gctgctgcca gtggcgataa gtcgtgtctt 2520

accgggttgg actcaagacg atagttaccg gataaggcgc agcggtcggg ctgaacgggg 2580

ggttcgtgca cacagcccag cttggagcga acgacctaca ccgaactgag atacctacag 2640

cgtgagctat gagaaagcgc cacgcttccc gaagggagaa aggcggacag gtatccggta 2700

agcggcaggg tcggaacagg agagcgcacg agggagcttc cagggggaaa cgcctggtat 2760

ctttatagtc ctgtcgggtt tcgccacctc tgacttgagc gtcgattttt gtgatgctcg 2820

tcaggggggc ggagcctatg gaaaaacgcc agcaacgcgg cctttttacg gttcctggcc 2880

ttttgctggc cttttgctca catgttcttt cctgcgttat cccctgattc tgtggataac 2940

cgtattaccg cctttgagtg agctgatacc gctcgccgca gccgaacgac cgagcgcagc 3000

gagtcagtga gcgaggaagc ggaagagcgc ctgatgcggt attttctcct tacgcatctg 3060

tgcggtattt cacaccgcat atggtgcact ctcagtacaa tctgctctga tgccgcatag 3120

ttaagccagt atacactccg ctatcgctac gtgactgggt catggctgcg ccccgacacc 3180

cgccaacacc cgctgacgcg ccctgacggg cttgtctgct cccggcatcc gcttacagac 3240

aagctgtgac cgtctccggg agctgcatgt gtcagaggtt ttcaccgtca tcaccgaaac 3300

gcgcgaggca gctgcggtaa agctcatcag cgtggtcgtg aagcgattca cagatgtctg 3360

cctgttcatc cgcgtccagc tcgttgagtt tctccagaag cgttaatgtc tggcttctga 3420

taaagcgggc catgttaagg gcggtttttt cctgtttggt cacttgatgc ctccgtgtaa 3480

gggggaattt ctgttcatgg gggtaatgat accgatgaaa cgagagagga tgctcacgat 3540

acgggttact gatgatgaac atgcccggtt actggaacgt tgtgagggta aacaactggc 3600

ggtatggatg cggcgggacc agagaaaaat cactcagggt caatgccagc gcttcgttaa 3660

tacagatgta ggtgttccac agggtagcca gcagcatcct gcgatgcaga tccggaacat 3720

aatggtgcag ggcgctgact tccgcgtttc cagactttac gaaacacgga aaccgaagac 3780

cattcatgtt gttgctcagg tcgcagacgt tttgcagcag cagtcgcttc acgttcgctc 3840

gcgtatcggt gattcattct gctaaccagt aaggcaaccc cgccagccta gccgggtcct 3900

caacgacagg agcacgatca tgcgcacccg tggccaggac ccaacgctgc ccgagatgcg 3960

ccgcgtgcgg ctgctggaga tggcggacgc gatggatatg ttctgccaag ggttggtttg 4020

cgcattcaca gttctccgca agaattgatt ggctccaatt cttggagtgg tgaatccgtt 4080

agcgaggtgc cgccggcttc cattcaggtc gaggtggccc ggctccatgc accgcgacgc 4140

aacgcgggga ggcagacaag gtatagggcg gcgcctacaa tccatgccaa cccgttccat 4200

gtgctcgccg aggcggcata aatcgccgtg acgatcagcg gtccagtgat cgaagttagg 4260

ctggtaagag ccgcgagcga tccttgaagc tgtccctgat ggtcgtcatc tacctgcctg 4320

gacagcatgg cctgcaacgc gggcatcccg atgccgccgg aagcgagaag aatcataatg 4380

gggaaggcca tccagcctcg cgtcgcgaac gccagcaaga cgtagcccag cgcgtcggcc 4440

gccatgccgg cgataatggc ctgcttctcg ccgaaacgtt tggtggcggg accagtgacg 4500

aaggcttgag cgagggcgtg caagattccg aataccgcaa gcgacaggcc gatcatcgtc 4560

gcgctccagc gaaagcggtc ctcgccgaaa atgacccaga gcgctgccgg cacctgtcct 4620

acgagttgca tgataaagaa gacagtcata agtgcggcga cgatagtcat gccccgcgcc 4680

caccggaagg agctgactgg gttgaaggct ctcaagggca tcggtcgacg ctctccctta 4740

tgcgactcct gcattaggaa gcagcccagt agtaggttga ggccgttgag caccgccgcc 4800

gcaaggaatg gtgcatgcaa ggagatggcg cccaacagtc ccccggccac ggggcctgcc 4860

accataccca cgccgaaaca agcgctcatg agcccgaagt ggcgagcccg atcttcccca 4920

tcggtgatgt cggcgatata ggcgccagca accgcacctg tggcgccggt gatgccggcc 4980

acgatgcgtc cggcgtagag gatccggagc ttatcgactg cacggtgcac caatgcttct 5040

ggcgtcaggc agccatcgga agctgtggta tggctgtgca ggtcgtaaat cactgcataa 5100

ttcgtgtcgc tcaaggcgca ctcccgttct ggataatgtt ttttgcgccg acatcataac 5160

ggttctggca aatattctga aatgagctgt tgacaattaa tcatcggctc gtataatgtg 5220

tggaattgtg agcggataac aatttcacac aggaaacaga attcatggaa atcttcatta 5280

caggtctgct tttgggggcc agtcttttac tgtccatcgg accgcagaat gtactggtga 5340

ttaaacaagg aattaagcgc gaaggactca ttgcggttct tctcgtgtgt ttaatttctg 5400

acgtcttttt gttcatcgcc ggcaccttgg gcgttgatct tttgtccaat gccgcgccga 5460

tcgtgctcga tattatgcgc tggggtggca tcgcttacct gttatggttt gccgtcatgg 5520

cagcgaaaga cgccatgaca aacaaggtgg aagcgccaca gatcattgaa gaaacagaac 5580

caaccgtgcc cgatgacacg cctttgggcg gttcggcggt ggccactgac acgcgcaacc 5640

gggtgcgggt ggaggtgagc gtcgataagc agcgggtttg ggtaaagccc atgttgatgg 5700

caatcgtgct gacctggttg aacccgaatg cgtatttgga cgcgtttgtg tttatcggcg 5760

gcgtcggcgc gcaatacggc gacaccggac ggtggatttt cgccgctggc gcgttcgcgg 5820

caagcctgat ctggttcccg ctggtgggtt tcggcgcagc agcattgtca cgcccgctgt 5880

ccagccccaa ggtgtggcgc tggatcaacg tcgtcgtggc agttgtgatg accgcattgg 5940

ccatcaaact gatgttgatg ggttag 5966

Claims

1.表达L-赖氨酸转运蛋白的重组质粒pkk-E，其氨基酸序列为SEQ ID NO.3所示。

2.一种工程菌，该菌株AT-pkk-E-DE为谷氨酸棒杆菌Corynebacterium glutamicum，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.8183，保藏时间为2013年9月13日，由表达L-赖氨酸转运蛋白的重组质粒pkk-E转化谷氨酸棒杆菌获得。

3.权利要求1所述的表达L-赖氨酸转运蛋白的重组质粒pkk-E在制备L-赖氨酸中的应用。

4.权利要求2所述的谷氨酸棒工程菌在制备L-赖氨酸中的应用。