CN113564206B - 一种目的基因多拷贝整合到酿酒酵母染色体rDNA的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种目的基因多拷贝整合到酿酒酵母染色体rDNA的方法，是将待转化的酿酒酵母先在含有羟基脲的培养基上进行预培养，然后再通过常规转化方法将两端带有rDNA同源序列的DNA片段转入酿酒酵母，最后在筛选培养基上筛选转化子实现。本发明方法利用rDNA拷贝动态平衡的特点，建立了一次转化过程即在rDNA上整合了18个拷贝目的基因的方法。该方法以rDNA为整合靶点，操作便捷，无需额外引入除了重组DNA片段之外的其他DNA；并且，由于其所依赖的特殊机制，理论上可以和现有其他各种高拷贝重组方法联用，实现目的基因更高拷贝的整合，为基因编辑又提供了一种方法和有力的工具。

Description

一种目的基因多拷贝整合到酿酒酵母染色体rDNA的方法

技术领域

本发明涉及一种目的基因多拷贝整合到酿酒酵母染色体rDNA的方法。属于生物工程技术领域。

背景技术

酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)是广泛用于食品和工业生产的微生物，其具有鲁棒性强、代谢旺盛以及食品级安全等特性。通过代谢工程手段，将合适的基因引入酿酒酵母，可以获得相应的细胞工厂。目的基因的表达水平和其在细胞中的拷贝数成正相关，因此，需要开发在细胞中引入目的基因的多个拷贝的技术。

在酿酒酵母中实现高拷贝表达基因，最有力的工具是2μ质粒载体。但是维持质粒的存在需要特定培养条件，例如营养缺陷型或者带有抗生素的培养基。相对于依赖于质粒载体的多拷贝表达，在基因组的重复序列上多拷贝整合目的基因具有稳定性好，不需要特殊的营养缺陷型或者含抗生素培养基的特点。目前常用的多拷贝整合方法是以染色体中的重复序列为整合靶点，两个最常用的靶点是delta(δ)区和rDNA区(Choi and Kim,2018；Fang et al.,2017；Liu et al.,2013；Semkiv et al.,2016)。但是，即使在染色体上有很多拷贝的靶点DNA，一次转化能整合到染色体上的实际目的基因拷贝数也很低，提高筛选培养基中的抗生素浓度是一种方式，但是效果有限，利用抗G418能力减弱的KanXM4突变子作为筛选标记基因，能够在较温和的抗生素浓度下达到高浓度抗生素筛选的标准(Semkiv etal.,2016)。有工作利用CRISPR-Cas9技术在染色体上delta(δ)区(Shi et al.,2016)或者rDNA区(Wang et al.,2018)制造双链断裂位点，也提高了整合基因的拷贝数。这种方式在将目的基因引入前，需要在酵母中引入Cas9和gRNA。并且，由于rDNA的重要功能以及高度串联重复的特点，Cas9切割过度会直接导致细胞死亡，需要摸索合适的条件。

经检索，有关依据染色体上rDNA是多拷贝重复单元，并且rDNA拷贝数维持动态平衡的特点，先利用羟基脲(hydroxyurea)刺激细胞，使部分rDNA拷贝从染色体上丢失，之后将目的基因整合在剩余的rDNA拷贝上；当去除环境中的羟基脲后，rDNA区域按其拷贝数恢复机制出现不等姐妹染色单体重组；使整合在rDNA中的目的基因拷贝数随着rDNA拷贝数的增加而增加，实现将目的基因多拷贝整合到染色体rDNA的方法未见报道。

主要参考文献

Choi,H.J.,Kim,Y.H.,2018.Simultaneous and sequential integration byCre/loxP site-specific recombination in Saccharomyces cerevisiae.J MicrobiolBiotechnol.28,826-830.

Fang,C.,Wang,Q.,Selvaraj,J.N.,Zhou,Y.,Ma,L.,Zhang,G.,Ma,Y.,2017.Highcopy and stable expression of the xylanase XynHB in Saccharomyces cerevisiaeby rDNA-mediated integration.Sci Rep.7,8747.

Liu,L.,Liu,C.,Zou,S.,Yang,H.,Hong,J.,Ma,Y.,Zhang,M.,2013.Expressionof cellulase genes in Saccharomyces cerevisiae via delta-integration subjectto auxotrophic markers.Biotechnol Lett.35,1303-7.

Semkiv,M.V.,Dmytruk,K.V.,Sibirny,A.A.,2016.Development of a systemfor multicopy gene integration in Saccharomyces cerevisiae.J MicrobiolMethods.120,44-9.

Shi,S.,Liang,Y.,Zhang,M.M.,Ang,E.L.,Zhao,H.,2016.Ahighly efficientsingle-step,markerless strategy for multi-copy chromosomal integration oflarge biochemical pathways in Saccharomyces cerevisiae.Metab Eng.33,19-27.

Wang,L.,Deng,A.,Zhang,Y.,Liu,S.,Liang,Y.,Bai,H.,Cui,D.,Qiu,Q.,Shang,X.,Yang,Z.,He,X.,Wen,T.,2018.Efficient CRISPR-Cas9 mediated multiplex genomeediting in yeasts.Biotechnol Biofuels.11,277.

Wei,S.,Liu,Y.,Wu,M.,Ma,T.,Bai,X.,Hou,J.,Shen,Y.,Bao,X.,2018.Disruption of the transcription factors Thi2p and Nrm1p alleviates thepost-glucose effect on xylose utilization in Saccharomycescerevisiae.Biotechnol Biofuels.11,112.

Yang,X.,Liu,J.,Zhang,J.,Shen,Y.,Qi,Q.,Bao,X.,Hou,J.,2021.Quorumsensing-mediated protein degradation for dynamic metabolic pathway control inSaccharomyces cerevisiae.Metab Eng.64,85-94.

发明内容

针对现有技术的不足，本发明要解决的问题是提供一种目的基因多拷贝整合到酿酒酵母染色体rDNA的方法。

本发明所述目的基因多拷贝整合到酿酒酵母染色体rDNA的方法，是将待转化的酿酒酵母先在含有羟基脲的培养基上进行预培养，然后再通过常规转化方法将两端带有rDNA同源序列的DNA片段转入酿酒酵母，最后在筛选培养基上筛选转化子实现；其特征在于：所述含有羟基脲的培养基是指在酵母常规培养基的基础上，添加终浓度为60mM-250mM的羟基脲；所述在含有羟基脲的培养基上预培养的方法是：将待转化的酿酒酵母活化后，转接到含羟基脲的培养基中培养，按每两天转接一次，每次都是转接到新鲜的含有羟基脲的培养基中，总共培养6-8天；所述两端带有rDNA同源序列的DNA片段含有筛选标记基因表达盒和目的基因表达盒，其组成及顺序为3’-rDNA同源序列1-筛选标记基因表达框-目的基因表达框-rDNA同源序列2-5’；其中rDNA同源序列1或rDNA同源序列2是5S rDNA或35S rDNA区域的同源序列，筛选标记基因表达框或目的基因表达框上下游顺序随意，目的基因表达框可以是一个或多个；其中筛选标记基因是抗生素抗性基因或是弥补营养缺陷型酵母的营养缺陷的基因；所述筛选培养基针对的是引入转化子并表达的筛选标记基因，是带有抗生素的培养基或是营养缺陷型培养基；或是在所述筛选培养基基础上再额外添60mM-250mM浓度的羟基脲。

上述目的基因多拷贝整合到酿酒酵母染色体rDNA的方法中：所述含有羟基脲的培养基优选是指在酵母常规培养基的基础上，添加终浓度为150mM-200mM的羟基脲。

上述目的基因多拷贝整合到酿酒酵母染色体rDNA的方法中：所述rDNA同源序列1或rDNA同源序列2优选是35SrDNA区域的同源序列；所述的抗生素抗性基因优选是G418抗性基因。

上述目的基因多拷贝整合到酿酒酵母染色体rDNA的方法中：所述两端带有rDNA同源序列的DNA片段优选是rDNA_up-GFP-KanMX-Ru-xylA-rDNA_down，其是利用SEQ ID NO:2所示核苷酸序列的引物rDNA-1-F和SEQ ID NO:5所示核苷酸序列的引物rDNA-2-R，以SEQ IDNO:1所示核苷酸序列的质粒pEASY-Blunt-GFP-kanMX-RuXI扩增获得。

上述目的基因多拷贝整合到酿酒酵母染色体rDNA的方法中：所述筛选培养基优选是带有抗生素和60mM-200mM羟基脲的培养基；或是营养缺陷型培养基加入终浓度150mM-200mM羟基脲。

其中，进一步优选的实施方式是：所述筛选培养基是带有200mg/L-20000mg/LG418，同时含有60mM-200mM羟基脲的培养基；再进一步优选的实施方式是：所述筛选培养基是带有10000mg/L-20000mg/L G418，同时含有60mM-90mM羟基脲的培养基。最优选的实施方式是：所述筛选培养基是带有20000mg/L G418，同时含有60mM羟基脲的YEPD培养基。

本发明公开的一种目的基因多拷贝整合到酿酒酵母染色体rDNA的方法，是依据染色体上rDNA是多拷贝重复单元，并且rDNA拷贝数维持动态平衡的特点，先利用羟基脲刺激细胞，使部分rDNA拷贝从染色体上丢失，之后将目的基因整合在剩余的rDNA拷贝上。当去除环境中的羟基脲后，rDNA区域按其拷贝数恢复机制出现不等姐妹染色单体重组。这一过程中，整合在rDNA中的目的基因拷贝数随着rDNA拷贝数的增加而增加。本发明首次利用rDNA拷贝动态平衡的特点，建立了一次转化过程即在rDNA上整合了18个拷贝目的基因的方法。该方法以rDNA为整合靶点，操作便捷，无需额外引入除了重组DNA片段之外的其他DNA；并且，由于其所依赖的特殊机制，理论上可以和现有其他各种高拷贝重组方法联用，实现目的基因更高拷贝的整合，为基因编辑又提供了一种方法和有力的工具。

附图说明

图1：一种将目的基因多拷贝整合到酿酒酵母染色体rDNA的方法操作流程示意图。

图2：质粒pEASY-Blunt-GFP-kanMX-RuXI结构。

图3：常规方法获得的转化子的相对荧光强度。

其中出发菌株直接用常规醋酸锂转化法转化，在含有20000mg/L G418的YEPD培养基上筛选转化子，获得的转化子中随机挑选九十六个测定它们的相对荧光强度。

图4：羟基脲处理降低菌株染色体上rDNA的拷贝数。

显示随着羟基脲处理时间的增加，菌株染色体上rDNA的拷贝数逐渐降低。

图5：羟基脲预处理后再用常规方法获得的转化子的相对荧光强度。

其中出发菌株先用羟基脲预处理八天，再用常规醋酸锂转化法转化预处理后的菌株，在含有20000mg/L G418的YEPD培养基上筛选转化子，在获得的转化子中随机挑选九十六个测定它们的相对荧光强度。

图6：羟基脲预处理后再用常规方法转化并在含羟基脲平板上筛选获得的转化子的相对荧光强度。

其中出发菌株先用羟基脲预处理八天，再用常规醋酸锂转化法转化预处理后的菌株，在含有20000mg/L G418以及60mM羟基脲的YEPD培养基上筛选转化子，在获得的转化子中随机挑选九十六个测定它们的相对荧光强度。

图7：不同方法获得的转化子整合外源基因的拷贝数。

具体实施方式

下面结合具体附图和实施例对本发明内容进行详细说明。如下所述例子仅是本发明的较佳实施方式而已，应该说明的是，下述说明仅仅是为了解释本发明，并非对本发明作任何形式上的限制，凡是依据本发明的技术实质对实施方式所做的任何简单修改，等同变化与修饰，均属于本发明技术方案的范围内。

下述实施例中，所使用的材料、菌株、质粒、试剂等，如无特殊说明，均从商业途径得到。本发明涉及的方法均为遗传工程和分子生物学领域使用的常规技术和方法。例如Methods in yeast genetics and genomics:a Cold Spring Harbor Laboratory coursemanual 2015 edition(Cold Spring Harbor,N.Y.:Cold Spring Harbor LaboratoryPress,2005)。

实施例1：转化用DNA片段rDNA_up-GFP-KanMX-Ru-xylA-rDNA_down的构建

本发明中，转化用DNA片段组成如图1中所示，包括：rDNA同源臂1、rDNA同源臂2、多个基因表达盒。

在本实施例中，转化用的DNA片段为rDNA_up-GFP-KanMX-Ru-xylA-rDNA_down，是图2所示质粒pEASY-Blunt-GFP-kanMX-RuXI(SEQ ID NO:1)标注了Fragment-F和Fragment-R之间的那一部分。其具体组成包括：35srDNA-1(对应图1中的rDNA同源臂1)，木糖异构酶基因表达盒TEF1p-Ru-xylA-ADH1t，G418抗性基因表达盒TEF1p-KanMX-TEF1t，荧光报告基因表达盒TEF1p-yEGFP-PGKt，以及35srDNA-2(对应图1中的rDNA同源臂2)。

其中，35s rDNA-1利用引物rDNA-1-F(SEQ ID NO:2)和rDNA-1-R(SEQ ID NO:3)，以酵母染色体为模板扩增获得。35srDNA-2利用引物rDNA-2-F(SEQ ID NO:4)和rDNA-2-R(SEQ ID NO:5)，也以酵母染色体为模板扩增获得。作为模板的酵母染色体用拟转化的菌株培养后，用任何市面销售的试剂盒提取即可。本实施例中使用的待转化的酿酒酵母MH001是在重组酵母菌株BSGX001(CEN.PK 113-5D derivative；XK,gre3::PPP,cox4Δ,AE,pJX7)(Wei et al.,2018)基础上，去除其中含有木糖异构酶基因的质粒pJX7而获得的。本实施例中的酵母染色体提取自MH001。

本实施例中的荧光报告基因表达盒TEF1p-yEGFP-PGKt利用引物GFP-TEF1-F(SEQID NO:6)和PGKt-R(SEQ ID NO:7)，以质粒pJFE1-TEF1-GFP(Yang et al.,2021)为模板扩增获得。其中，引物GFP-TEF1-F包含19bp和35s rDNA-1同源的序列，用于片段间的融合；引物PGKt-R包含20bp和表达盒TEF1p-KanMX-TEF1同源的序列，用于片段间的融合。G418抗性基因表达盒TEF1p-KanMX-TEF1t利用引物TEF1p-F(SEQ ID NO:8)和TEF1t-R(SEQ ID NO:9)，以质粒pUG6(Euroscarf,P30114)为模板扩增获得。木糖异构酶基因表达盒TEF1p-Ru-xylA-ADH1t利用引物ADH1t-F(SEQ ID NO:10)和引物XI-TEF1-R(SEQ ID NO:11)，以质粒pJX7(Wei et al.,2018)为模板扩增获得。其中，引物ADH1t-F包含19bp和表达盒TEF1p-KanMX-TEF1t下游同源的序列，用于片段间的融合；引物XI-TEF1-R包含20bp和rDNA同源臂2上游同源的序列，用于片段间的融合。

将上述35srDNA-1、表达盒TEF1p-yEGFP-PGKt、以及表达盒TEF1p-KanMX-TEF1t进行融合PCR，使用引物为rDNA-1-F(SEQ ID NO:2)和TEF1t-R(SEQ ID NO:9)，获得“融合片段1”；将上述表达盒TEF1p-Ru-xylA-ADH1t和35srDNA-2进行融合PCR，使用引物为ADH1t-F(SEQ ID NO:10)和rDNA-2-R(SEQ ID NO:5)，获得“融合片段2”；最后，再将“融合片段1”和“融合片段2”融合，使用引物为rDNA-1-F(SEQ ID NO:2)和rDNA-2-R(SEQ ID NO:5)，最终获得片段rDNA_up-GFP-KanMX-Ru-xylA-rDNA_down；由于转化需要大量的片段，本实施例中将融合好的片段构建在市售的pEASY-Blunt克隆载体上，方便以后直接获取转化所需的目的片段，连接方法见pEASY-Blunt克隆载体说明书。

实施例2：常规转化方法获得的转化子荧光强度

酿酒酵母培养使用的YPD培养基：20g/L蛋白胨，10g/L酵母粉；固体培养基添加20g/L琼脂粉；灭菌条件：115℃，30分钟。使用时，添加不同浓度的葡萄糖或木糖作为碳源分别制成YEPD或YEPX培养基。其中，YEPD培养基配方:20g/L蛋白胨，10g/L酵母粉，20g/L葡萄糖，若制固体培养基，加入20g/L琼脂粉。YEPX培养基配方：20g/L蛋白胨，10g/L酵母粉，10g/L木糖，若制固体培养基，加入20g/L琼脂粉。

本实施例中使用的待转化的酿酒酵母MH001是在重组酵母菌株BSGX001(CEN.PK113-5D derivative；XK,gre3::PPP,cox4Δ,AE,pJX7)(Wei et al.,2018)基础上，去除其中含有木糖异构酶基因的质粒pJX7而获得的。

酵母转化采用常规醋酸锂(LiAc)转化法。MH001在20mL YEPD培养基中培养12小时后转接至50mL新鲜的YEPD培养基，使其初始OD₆₀₀值约为0.25。继而在30℃振荡培养至OD₆₀₀在0.7-1.0范围区间。5000rpm，离心5分钟收集细胞，无菌水洗涤，再次收集后的细胞重悬于400μL 0.1M LiAc中混匀。取50μL，13000rpm离心15秒后去上清，然后加入240μL 50％的PEG3350，混匀后再加入36μL 1M LiAc,10μL 10mg/mL的单链鱼精DNA(提前100℃煮沸5min后迅速置于冰上保存，1小时内使用)，70μL无菌重蒸水溶解的DNA片段。

本实施例中使用的DNA片段为rDNA_up-GFP-KanMX-Ru-xylA-rDNA_down，利用引物rDNA-1-F(SEQ ID NO:2)和rDNA-2-R(SEQ ID NO:5)，以质粒pEASY-Blunt-GFP-kanMX-RuXI(SEQ ID NO:1)扩增获得。使用量为2μg。上述混合液30℃保温30分钟，42℃热激25分钟，之后8000rpm，离心15秒，去上清。再加入500μL YEPD液体培养基，30℃培养2-3小时。之后，该含有转化子的培养液适量涂布在添加20000mg/L G418的YEPD的固体培养基平板中，30℃培养2-3天，待转化子长出。

随机挑取转化子至含有YEPX液体培养基的96孔板中，培养1天转接含有新鲜YEPX液体培养基的96孔板，使初始OD₆₀₀约等于0.1。用Multi-Detection Microplate Reader(Synergy HT,BioTek,USA)同时读取荧光值和OD₆₀₀(即细胞生物量)。相对荧光强度定义为荧光值除以OD₆₀₀值。结果显示(图3)，96个转化子的平均相对荧光强度为33217RFU，最高相对荧光强度为53370RFU。

实施例3：羟基脲预处理降低rDNA拷贝

菌株MH001在40mL YEPD培养基中活化培养12小时后，转接10％菌液到新鲜的含有150mM羟基脲的YEPD培养基中培养两天。此后，每两天转接一次，每次都是转接10％菌液到新鲜的含有150mM羟基脲的YEPD培养基中。

每次转接之后将剩余的细胞提取其染色体，并用荧光定量PCR法测定其rDNA拷贝数。结果显示，初始MH001细胞群体，rDNA拷贝数为144.7±28.6个拷贝/细胞。经过2、4、6和8天在含有羟基脲的培养基中的培养处理，拷贝分别降至132.9±18.5、101.4±16.7、83.5±2.4和81.0±8.3个拷贝/细胞(图4)。其中第八天的培养物中，分离出的细胞，命名为MH001-8d。

实施例4：羟基脲预处理后的菌株转化DNA获得的转化子的荧光强度

用实施例2中同样的DNA片段，采取实施例2中完全相同的方法转化菌株MH001-8d。转化子一部分涂布在添加20000mg/L G418的YEPD的固体培养基平板中(图1中的方案一)，另一部分涂布在添加20000mg/L G418和60mM羟基脲的YEPD的固体培养基平板中(图1中的方案二)，30℃培养2-3天，待转化子长出。

采取实施例2中的方案，测定转化子的荧光强度。

在方案一和方案二的平板上各随机挑取转化子至含有YEPX液体培养基的96孔板中，培养1天转接含有新鲜YEPX液体培养基的96孔板，使初始OD₆₀₀约等于0.1。用Multi-Detection Microplate Reader(Synergy HT,BioTek,USA)同时读取荧光值和OD₆₀₀(即细胞生物量)。相对荧光强度定义为荧光值除以OD₆₀₀值。

结果显示，方案一中随机挑选的96个转化子的平均相对荧光强度为32834RFU，最高相对荧光强度为54370RFU(图5)；方案二中随机挑选的96个转化子的平均相对荧光强度为35068RFU，最高相对荧光强度为71156RFU(图6)，虽然平均相对荧光强度提高不显著，但最高荧光强度均有所提高。

实施例5：各种方法获得的重组菌株中Ru-xylA拷贝数

选取实施例2中获得的转化子中荧光强度最高的5株，实施例4中方案一获得的转化子中荧光强度最高的5株，以及实施例4中方案二获得的转化子中荧光强度最高的5株，用荧光定量PCR方法检测Ru-xylA基因拷贝数。

结果显示(图7)，实施例2中获得的5株转化子Ru-xylA基因平均拷贝数为7.7，最高拷贝数为10.1；实施例4中方案一中获得的5株转化子Ru-xylA基因平均拷贝数为9.0，最高拷贝数为10.3；实施例4中方案二中获得的5株转化子Ru-xylA基因平均拷贝数为13.1,最高拷贝数为18.0。这一结果表明，羟基脲预处理菌株后再转化目的基因能够提高外源基因整合的拷贝数。其中，实施例4中方案二为更优方案。

序列表

<110>山东大学

<120>一种目的基因多拷贝整合到酿酒酵母染色体rDNA的方法

<141>2021-07-27

<160>11

<210>1

<211>11265

<212> DNA

<213>人工序列

<221> 质粒pEASY-Blunt-GFP-kanMX-RuXI

<400> 1

agcgcccaat acgcaaaccg cctctccccg cgcgttggcc gattcattaa tgcagctggc 60

acgacaggtt tcccgactgg aaagcgggca gtgagcgcaa cgcaattaat gtgagttagc 120

tcactcatta ggcaccccag gctttacact ttatgcttcc ggctcgtatg ttgtgtggaa 180

ttgtgagcgg ataacaattt cacacaggaa acagctatga ccatgattac gccaccggaa 240

cctctaatca ttcgctttac ctcataaaac tgatacgagc ttctgctatc ctgagggaaa 300

cttcggcagg aaccagctac tagatggttc gattagtctt tcgcccctat acccaaattc 360

gacgatcgat ttgcacgtca gaaccgctac gagcctccac cagagtttcc tctggcttca 420

ccctattcag gcatagttca ccatctttcg ggtcccaaca gctatgctct tactcaaatc 480

catccgaaga catcaggatc ggtcgattgt gcacctcttg cgaggcccca acctacgttc 540

actttcatta cgcgtatggg ttttacaccc aaacactcgc atagacgtta gactccttgg 600

tccgtgtttc aagacgggcg gcatataacc attatgccag catccttgac ttacgtcgca 660

gtcctcagtc ccagctggca gtattcccac aggctataat acttaccgag gcaagctaca 720

ttcctatgga tttatcctgc caccaaaact gatgctggcc cagtgaaatg cgagattccc 780

ctacccacaa ggagcagagg gcacaaaaca ccatgtctga tcaaatgccc ttccctttca 840

acaatttcac gtactttttc actctctttt caaagttctt ttcatctttc catcactgta 900

cttgttcgct atcggtctct cgccaatatt tagctttaga tggaatttac cacccactta 960

gagctgcatt cccaaacaac tcgactcttc gaaggcactt tacaaagaac cgcactcctc 1020

gccacacggg attctcaccc tctatgacgt cctgttccaa ggaacataga caaggaacgg 1080

ccccaaagtt gccctctcca aattacaact cgggcaccga aggtaccaga tttcaaattt 1140

gagcttttgc cgcttcactc gccgttacta aggcaatccc ggttggtttc ttttcctccg 1200

cttattgata tgcttaagtt cagcgggtac tcctacctga tttgaggtca aactttaaga 1260

acattgttcg cctagacgct ctcttcttat cgataacgtt ccaatacgct cagtataaaa 1320

aaagattagc cgcagttggt aaaacctaaa acgaccgtac ttgccacaca ccatagcttc 1380

aaaatgtttc tactcctttt ttactcttcc agattttctc ggactccgcg catcgccgta 1440

ccacttcaaa acacccaagc acagcatact aaatttcccc tctttcttcc tctagggtgt 1500

cgttaattac ccgtactaaa ggtttggaaa agaaaaaaga gaccgcctcg tttctttttc 1560

ttcgtcgaaa aaggcaataa aaatttttat cacgtttctt tttcttgaaa attttttttt 1620

ttgatttttt tctctttcga tgacctccca ttgatattta agttaataaa cggtcttcaa 1680

tttctcaagt ttcagtttca tttttcttgt tctattacaa ctttttttac ttcttgctca 1740

ttagaaagaa agcatagcaa tctaatctaa gttttaatta caaaggatcc tatgtctaaa 1800

ggtgaagaat tattcactgg tgttgtccca attttggttg aattagatgg tgatgttaat 1860

ggtcacaaat tttctgtctc cggtgaaggt gaaggtgatg ctacttacgg taaattgacc 1920

ttaaaattta tttgtactac tggtaaattg ccagttccat ggccaacctt agtcactact 1980

ttcggttatg gtgttcaatg ttttgctaga tacccagatc atatgaaaca acatgacttt 2040

ttcaagtctg ccatgccaga aggttatgtt caagaaagaa ctattttttt caaagatgac 2100

ggtaactaca agaccagagc tgaagtcaag tttgaaggtg ataccttagt taatagaatc 2160

gaattaaaag gtattgattt taaagaagat ggtaacattt taggtcacaa attggaatac 2220

aactataact ctcacaatgt ttacatcatg gctgacaaac aaaagaatgg tatcaaagtt 2280

aacttcaaaa ttagacacaa cattgaagat ggttctgttc aattagctga ccattatcaa 2340

caaaatactc caattggtga tggtccagtc ttgttaccag acaaccatta cttatccact 2400

caatctgcct tatccaaaga tccaaacgaa aagagagacc acatggtctt gttagaattt 2460

gttactgctg ctggtattac ccatggtatg gatgaattgt acaaataaag tcgacctgca 2520

ggattgaatt gaattgaaat cgatagatca atttttttct tttctctttc cccatccttt 2580

acgctaaaat aatagtttat tttatttttt gaatattttt tatttatata cgtatatata 2640

gactattatt tatcttttaa tgattattaa gatttttatt aaaaaaaaat tcgctcctct 2700

tttaatgcct ttatgcagtt tttttttccc attcgatatt tctatgttcg ggttcagcgt 2760

attttaagtt taataactcg aaaattctgc gttgaagctt cgtacgctgc aggtcgacaa 2820

cccttaatat aacttcgtat aatgtatgct atacgaagtt attaggtcta gagatctgtt 2880

tagcttgcct cgtccccgcc gggtcacccg gccagcgaca tggaggccca gaataccctc 2940

cttgacagtc ttgacgtgcg cagctcaggg gcatgatgtg actgtcgccc gtacatttag 3000

cccatacatc cccatgtata atcatttgca tccatacatt ttgatggccg cacggcgcga 3060

agcaaaaatt acggctcctc gctgcagacc tgcgagcagg gaaacgctcc cctcacagac 3120

gcgttgaatt gtccccacgc cgcgcccctg tagagaaata taaaaggtta ggatttgcca 3180

ctgaggttct tctttcatat acttcctttt aaaatcttgc taggatacag ttctcacatc 3240

acatccgaac ataaacaacc atgggtaagg aaaagactca cgtttcgagg ccgcgattaa 3300

attccaacat ggatgctgat ttatatgggt ataaatgggc tcgcgataat gtcgggcaat 3360

caggtgcgac aatctatcga ttgtatggga agcccgatgc gccagagttg tttctgaaac 3420

atggcaaagg tagcgttgcc aatgatgtta cagatgagat ggtcagacta aactggctga 3480

cggaatttat gcctcttccg accatcaagc attttatccg tactcctgat gatgcatggt 3540

tactcaccac tgcgatcccc ggcaaaacag cattccaggt attagaagaa tatcctgatt 3600

caggtgaaaa tattgttgat gcgctggcag tgttcctgcg ccggttgcat tcgattcctg 3660

tttgtaattg tccttttaac agcgatcgcg tatttcgtct cgctcaggcg caatcacgaa 3720

tgaataacgg tttggttgat gcgagtgatt ttgatgacga gcgtaatggc tggcctgttg 3780

aacaagtctg gaaagaaatg cataagcttt tgccattctc accggattca gtcgtcactc 3840

atggtgattt ctcacttgat aaccttattt ttgacgaggg gaaattaata ggttgtattg 3900

atgttggacg agtcggaatc gcagaccgat accaggatct tgccatccta tggaactgcc 3960

tcggtgagtt ttctccttca ttacagaaac ggctttttca aaaatatggt attgataatc 4020

ctgatatgaa taaattgcag tttcatttga tgctcgatga gtttttctaa tcagtactga 4080

caataaaaag attcttgttt tcaagaactt gtcatttgta tagttttttt atattgtagt 4140

tgttctattt taatcaaatg ttagcgtgat ttatattttt tttcgcctcg acatcatctg 4200

cccagatgcg aagttaagtg cgcagaaagt aatatcatgc gtcaatcgta tgtgaatgct 4260

ggtcgctata ctgctgtcga ttcgatacta acgccgccat ccagtgtcga aaacgagctc 4320

tcgagaaccc ttaatataac ttcgtataat gtatgctata cgaagttatt aggtgatatc 4380

agatccagag cgacctcatg ctatacctga gaaagcaacc tgacctacag gaaagagtta 4440

ctcaagaata agaattttcg ttttaaaacc taagagtcac tttaaaattt gtatacactt 4500

atttttttta taacttattt aataataaaa atcataaatc ataagaaatt cgcttattta 4560

gaagtgtcaa caacgtatct accaacgatt tgaccctttt ccatcttttc gtaaatttct 4620

ggcaaggtag acaagccgac aaccttgatt ggagacttga ccaaacctct ggcgaagaat 4680

tgttaattaa gagctggtta tttgcagtgg agggcgacga ttgtctcgta cttctcctgc 4740

ttgccagagg tctgcttcgg ctcttcaacc ttcttaccat actcgtaaac ctgctcgaag 4800

gtcagcttgc catcctcgaa gtccttaccg ataccgctgt cgaagcttgc gtagcgagcc 4860

ttcttcattg cgggcagttc agagttctca agaatatcgg ctgcattcat cagggcgcgg 4920

gccatggcat ccataccgct gatatgagcg atgaagagat cctcgaggtc ggtagaatta 4980

cgacggatct tggcgtcgaa attggtaccg ccattgccca gaccaccgtt gcggatgatc 5040

tccagcatag cctgtgtcag ctcaaagttg tcgatgggga actggtcggt atcccagccg 5100

ttctgggcat caccgcggtt agcgtcgata gaacccagca taccagcgtc aacagcacaa 5160

gccagttcgt gctcgaaggt gtgaccagcc aatgtagcgt ggttcacctc gatgttcacc 5220

ttgaagtcct tatccagacc atgtgccttc aggaagccaa tcacggtctc tgtgtccaca 5280

tcatactggt gctttgaagg ctccatcggc ttcggctcaa tcaggaacgt acccttgaat 5340

cccttagcgc gagcatagtc acgagccata cccagcatcg tagccatgtg ctccttctca 5400

cgcttctggt cggtgttcaa caggctcatg tagccctcac gaccacccca gaacacatag 5460

ttggtaccac caagcttgat ggtagcgtcg atagagttct tgatctgaac aatcgcacga 5520

gcaaccacat cgaaatcggg gttggtagaa gcgccattgg cataacgctt gttgccgaat 5580

acgtttgcgg taccccagag cagcttgata ttggggaact gcttcatctt ctcctgagcg 5640

tagtcggtga tggccttcat gcgctcctcg tactcagcga tggtgggagc ctcctcaacg 5700

aggtctacat cgtggaagca gaagtactcg atacccagct tatccatgat ctcgaaacca 5760

gcgtccatct tatcctttgc acgctgtacg gggcattcag ccttgtccca ctcatagctg 5820

cgagtttgac caccgaactg gtctgcagaa gcgcctccca gtgtgtgcca ccaggccatt 5880

gcgaacttca gccagtcctt catcttcttt cccatcacga ctttctcggg ctcgtaataa 5940

tggaaagcca ttacattttt actatccttt ccctcgaaag gaattttacc agtaaacgga 6000

aaatattctt ttgccatgga tcctttgtaa ttaaaactta gattagattg ctatgctttc 6060

tttctaatga gcaagaagta aaaaaagttg taatagaaca agaaaaatga aactgaaact 6120

tgagaaattg aagaccgttt attaacttaa atatcaatgg gaggtcatcg aaagagaaaa 6180

aaatcaaaaa aaaaaatttt caagaaaaag aaacgtgata aaaattttta ttgccttttt 6240

cgacgaagaa aaagaaacga ggcggtctct tttttctttt ccaaaccttt agtacgggta 6300

attaacgaca ccctagagga agaaagaggg gaaatttagt atgctgtgct tgggtgtttt 6360

gaagtggtac ggcgatgcgc ggagtccgag aaaatctgga agagtaaaaa aggagtagaa 6420

acattttgaa gctatggtgt gtggtggcct atgcattata cctcaagcac gcagagaaac 6480

ctctctttgg aaaaaaaaca tccaatgaaa aggccagcaa tttcaagtta actccaaaga 6540

gtatcactca ctaccaaaca gaatgtttga gaaggaaatg acgctcaaac aggcatgccc 6600

cctggaatac caaggggcgc aatgtgcgtt caaagattcg atgattcacg gaattctgca 6660

attcacatta cgtatcgcat ttcgctgcgt tcttcatcga tgcgagaacc aagagatccg 6720

ttgttgaaag tttttaatat tttaaaattt ccagttacga aaattcttgt ttttgacaaa 6780

aatttaatga atagataaaa ttgtttgtgt ttgttacctc tgggccccga ttgctcgaat 6840

gcccaaagaa aaagttgcaa agatatgaaa actccacagt gtgttgtatt gaaacggttt 6900

taattgtcct ataacaaaag cacagaaatc tctcaccgtt tggaatagca agaaagaaac 6960

ttacaagcct agcaagaccg cgcacttaag cgcaggcccg gctggactct ccatctcttg 7020

tcttcttgcc cagtaaaagc tctcatgctc ttgccaaaac aaaaaaatcc attttcaaaa 7080

ttattaaatt tctttaatga tccttccgca ggttcaccta cggaaacctt gttacgactt 7140

ttagttcctc taaatgacca agtttgtcca aattctccgc tctgagatgg agttgccccc 7200

ttctctaagc agatcctgag gcctcactaa gccattcaat cggtactagc gacgggcggt 7260

gtgtacaaag ggcagggacg taatcaacgc aagctgatga cttgcgctta ctaggaattc 7320

ctcgttgaag agcaataatt acaatgctct atccccagca cgacggagtt tcacaagatt 7380

accaagacct ctcggccaag gttagactcg ctggctccgt cagtgtagcg cgcgtgcggc 7440

ccagaacgtc taagggcatc acagacctgt tattgcctca aacttccatc ggcttgaaac 7500

cgatagtccc tctaagaagt ggataaccag caaatgctag caccactatt tagtaggtta 7560

aggtctcgtt cgtttggtac cgagctcgga tccactagta acggccgcca gtgtgctgga 7620

attgccctta agggcaattc tgcagatatc catcacactg gcggccgctc gagcatgcat 7680

ctagagggcc caattcgccc tatagtgagt cgtattacaa ttcactggcc gtcgttttac 7740

aacgtcgtga ctgggaaaac cctggcgtta cccaacttaa tcgccttgca gcacatcccc 7800

ctttcgccag ctggcgtaat agcgaagagg cccgcaccga tcgcccttcc caacagttgc 7860

gcagcctgaa tggcgaatgg acgcgccctg tagcggcgca ttaagcgcgg cgggtgtggt 7920

ggttacgcgc agcgtgaccg ctacacttgc cagcgcccta gcgcccgctc ctttcgcttt 7980

cttcccttcc tttctcgcca cgttcgccgg ctttccccgt caagctctaa atcgggggct 8040

ccctttaggg ttccgattta gtgctttacg gcacctcgac cccaaaaaac ttgattaggg 8100

tgatggttca cgtagtgggc catcgccctg atagacggtt tttcgccctt tgacgttgga 8160

gtccacgttc tttaatagtg gactcttgtt ccaaactgga acaacactca accctatctc 8220

ggtctattct tttgatttat aagggatttt gccgatttcg gcctattggt taaaaaatga 8280

gctgatttaa caaaaattta acgcgaattt taacaaaatt cagggcgcaa gggctgctaa 8340

aggaagcgga acacgtagaa agccagtccg cagaaacggt gctgaccccg gatgaatgtc 8400

agctactggg ctatctggac aagggaaaac gcaagcgcaa agagaaagca ggtagcttgc 8460

agtgggctta catggcgata gctagactgg gcggttttat ggacagcaag cgaaccggaa 8520

ttgccagctg gggcgccctc tggtaaggtt gggaagccct gcaaagtaaa ctggatggct 8580

ttcttgccgc caaggatctg atggcgcagg ggatcaagat ctgatcaaga gacaggatga 8640

ggatcgtttc gcatgattga acaagatgga ttgcacgcag gttctccggc cgcttgggtg 8700

gagaggctat tcggctatga ctgggcacaa cagacaatcg gctgctctga tgccgccgtg 8760

ttccggctgt cagcgcaggg gcgcccggtt ctttttgtca agaccgacct gtccggtgcc 8820

ctgaatgaac tgcaggacga ggcagcgcgg ctatcgtggc tggccacgac gggcgttcct 8880

tgcgcagctg tgctcgacgt tgtcactgaa gcgggaaggg actggctgct attgggcgaa 8940

gtgccggggc aggatctcct gtcatcccac cttgctcctg ccgagaaagt atccatcatg 9000

gctgatgcaa tgcggcggct gcatacgctt gatccggcta cctgcccatt cgaccaccaa 9060

gcgaaacatc gcatcgagcg agcacgtact cggatggaag ccggtcttgt cgatcaggat 9120

gatctggacg aagagcatca ggggctcgcg ccagccgaac tgttcgccag gctcaaggcg 9180

cgcatgcccg acggcgagga tctcgtcgtg acccatggcg atgcctgctt gccgaatatc 9240

atggtggaaa atggccgctt ttctggattc atcgactgtg gccggctggg tgtggcggac 9300

cgctatcagg acatagcgtt ggctacccgt gatattgctg aagagcttgg cggcgaatgg 9360

gctgaccgct tcctcgtgct ttacggtatc gccgctcccg attcgcagcg catcgccttc 9420

tatcgccttc ttgacgagtt cttctgaatt gaaaaaggaa gagtatgagt attcaacatt 9480

tccgtgtcgc ccttattccc ttttttgcgg cattttgcct tcctgttttt gctcacccag 9540

aaacgctggt gaaagtaaaa gatgctgaag atcagttggg tgcacgagtg ggttacatcg 9600

aactggatct caacagcggt aagatccttg agagttttcg ccccgaagaa cgttttccaa 9660

tgatgagcac ttttaaagtt ctgctatgtg gcgcggtatt atcccgtatt gacgccgggc 9720

aagagcaact cggtcgccgc atacactatt ctcagaatga cttggttgag tactcaccag 9780

tcacagaaaa gcatcttacg gatggcatga cagtaagaga attatgcagt gctgccataa 9840

ccatgagtga taacactgcg gccaacttac ttctgacaac gatcggagga ccgaaggagc 9900

taaccgcttt tttgcacaac atgggggatc atgtaactcg ccttgatcgt tgggaaccgg 9960

agctgaatga agccatacca aacgacgagc gtgacaccac gatgcctgta gcaatggcaa 10020

caacgttgcg caaactatta actggcgaac tacttactct agcttcccgg caacaattaa 10080

tagactggat ggaggcggat aaagttgcag gaccacttct gcgctcggcc cttccggctg 10140

gctggtttat tgctgataaa tctggagccg gtgagcgtgg gtctcgcggt atcattgcag 10200

cactggggcc agatggtaag ccctcccgta tcgtagttat ctacacgacg gggagtcagg 10260

caactatgga tgaacgaaat agacagatcg ctgagatagg tgcctcactg attaagcatt 10320

ggtaactgtc agaccaagtt tactcatata tactttagat tgatttaaaa cttcattttt 10380

aatttaaaag gatctaggtg aagatccttt ttgataatct catgaccaaa atcccttaac 10440

gtgagttttc gttccactga gcgtcagacc ccgtagaaaa gatcaaagga tcttcttgag 10500

atcctttttt tctgcgcgta atctgctgct tgcaaacaaa aaaaccaccg ctaccagcgg 10560

tggtttgttt gccggatcaa gagctaccaa ctctttttcc gaaggtaact ggcttcagca 10620

gagcgcagat accaaatact gttcttctag tgtagccgta gttaggccac cacttcaaga 10680

actctgtagc accgcctaca tacctcgctc tgctaatcct gttaccagtg gctgctgcca 10740

gtggcgataa gtcgtgtctt accgggttgg actcaagacg atagttaccg gataaggcgc 10800

agcggtcggg ctgaacgggg ggttcgtgca cacagcccag cttggagcga acgacctaca 10860

ccgaactgag atacctacag cgtgagctat gagaaagcgc cacgcttccc gaagggagaa 10920

aggcggacag gtatccggta agcggcaggg tcggaacagg agagcgcacg agggagcttc 10980

cagggggaaa cgcctggtat ctttatagtc ctgtcgggtt tcgccacctc tgacttgagc 11040

gtcgattttt gtgatgctcg tcaggggggc ggagcctatg gaaaaacgcc agcaacgcgg 11100

cctttttacg gttcctggcc ttttgctggc cttttgctca catgttcttt cctgcgttat 11160

cccctgattc tgtggataac cgtattaccg cctttgagtg agctgatacc gctcgccgca 11220

gccgaacgac cgagcgcagc gagtcagtga gcgaggaagc ggaag 11265

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213>人工序列

<221> 引物rDNA-1-F

<400> 2

ccggaacctc taatcattcg 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213>人工序列

<221> 引物rDNA-1-R

<400> 3

gcaagtacgg tcgttttagg 20

<210> 4

<211> 35

<212> DNA

<213>人工序列

<221> 引物rDNA-2-F

<400> 4

gtgtgtggtg gcctatgcat tatacctcaa gcacg 35

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213>人工序列

<221> 引物rDNA-2-R

<400> 5

aacgaacgag accttaacct 20

<210> 6

<211> 41

<212> DNA

<213>人工序列

<221>引物GFP-TEF1-F

<400> 6

ctaaaacgac cgtacttgcc acacaccata gcttcaaaat g 41

<210> 7

<211> 46

<212> DNA

<213>人工序列

<221>引物PGK1t-R

<400> 7

cctgcagcgt acgaagcttc aacgcagaat tttcgagtta ttaaac 46

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213>人工序列

<221>引物TEF1p-F

<400> 8

gaagcttcgt acgctgcagg 20

<210>9

<211> 20

<212> DNA

<213>人工序列

<221>引物TEF1t-R

<400> 9

tggatctgat atcacctaat 20

<210>10

<211> 39

<212> DNA

<213>人工序列

<221>引物ADH1t-F

<400> 10

ttaggtgata tcagatccag agcgacctca tgctatacc 39

<210>11

<211> 43

<212> DNA

<213>人工序列

<221>引物XI-TEF1-R

<400> 11

gaggtataat gcataggcca ccacacacca tagcttcaaa atg 43

Claims (3)

1.一种目的基因多拷贝整合到酿酒酵母染色体rDNA的方法，是将待转化的酿酒酵母先在含有羟基脲的培养基上进行预培养，然后再通过常规转化方法将两端带有rDNA同源序列的DNA片段转入酿酒酵母，最后在筛选培养基上筛选转化子实现；其特征在于：所述含有羟基脲的培养基是指在酵母常规培养基的基础上，添加终浓度为150mM的羟基脲；所述在含有羟基脲的培养基上预培养的方法是：将待转化的酿酒酵母活化后，转接到含羟基脲的培养基中培养，按每两天转接一次，每次都是转接到新鲜的含有羟基脲的培养基中，总共培养6-8天；所述两端带有rDNA同源序列的DNA片段含有筛选标记基因表达盒和目的基因表达盒，其组成及顺序为3’-rDNA同源序列1-筛选标记基因表达框-目的基因表达框-rDNA同源序列2-5’；其中rDNA同源序列1或rDNA同源序列2是5S rDNA或35S rDNA区域的同源序列，筛选标记基因表达框或目的基因表达框上下游顺序随意，目的基因表达框可以是一个或多个；其中筛选标记基因是抗生素抗性基因G418；所述筛选培养基针对的是引入转化子并表达的筛选标记基因，是带有20000mg/L G418，同时含有60mM羟基脲的YEPD培养基。

2.根据权利要求1所述目的基因多拷贝整合到酿酒酵母染色体rDNA的方法，其特征在于：所述rDNA同源序列1或rDNA同源序列2是35S rDNA区域的同源序列。

3.根据权利要求1所述目的基因多拷贝整合到酿酒酵母染色体rDNA的方法，其特征在于：所述两端带有rDNA同源序列的DNA片段是rDNA_up-GFP-KanMX-Ru-xylA-rDNA_down，其是利用SEQ ID NO:2所示核苷酸序列的引物rDNA-1-F和SEQ ID NO:5所示核苷酸序列的引物rDNA-2-R，以SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的质粒pEASY-Blunt-GFP-kanMX-RuXI扩增获得。