CN113862166A - 一种产柚皮素的酿酒酵母菌 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种构建柚皮素生产菌的方法，包括以下步骤：构建表达芳香族氨基酸合成模块的质粒A，构建表达香豆酸和桂皮酸生成模块的质粒B，构建表达柚皮素合成模块的质粒C，将质粒A、质粒B、质粒C转化入酿酒酵母BY4742中，从转化子中筛选得到能通过发酵生产柚皮素的工程菌。

Description

一种产柚皮素的酿酒酵母菌
技术领域
本发明属于代谢工程领域，具体地说，涉及一种产柚皮素的酵母菌、尤其是酿酒酵母工程菌的构建方法。
背景技术
黄酮类化合物(flavonoids)泛指两个苯环通过三个碳原子相互连接而成的一系列化合物的总称，即具有C6-C3-C6结构的一类化合物的总称。柚皮素是柚皮甙的甙元，属二氢黄酮类化合物，具有抗菌、抗炎、清除自由基、抗氧化、止咳祛痰、降血脂、抗癌抗肿瘤、抗粥样动脉硬化等作用，可被广泛地应用于医药、食品等领域。柚皮素是重要的黄酮类化合物合成的平台化合物，众多的黄酮类化合物都是以柚皮素为前体，经过羟基化、甲基化、异戊烯基化、糖基化等修饰后合成。
目前，柚皮素主要通过从柚皮中提取制备。近年来，发酵法制备柚皮素受到了极大的关注，柚皮素主要由芳香族氨基酸苯丙氨酸和酪氨酸代谢而来。2014年，江南大学吴军军等报道了基因工程大肠杆菌发酵制备柚皮素，摇瓶发酵48h，可产柚皮素391mg/L(Fine-Tuning of the Fatty Acid Pathway by Synthetic Antisense RNA for Enhanced(2S)-Naringenin Production from l-Tyrosine in Escherichia coli.Applied andEnvironmental Microbiology,2014,80(23):7283-92)。2020年，魏文平等在解脂耶氏酵母中过表达木糖利用途径和柚皮素生成路径，摇瓶发酵可产柚皮素728mg/L(Wei W,Zhang P,Shang Y,et al.Metabolically engineering of Yarrowia lipolytica for thebiosynthesis of naringenin from a mixture of glucose and xylose.BioresourceTechnology,2020,314:123726.)2021年，吴梅等利用内生真菌Phomopsis liquidambaris的黄酮合成路径在酿酒酵母中进行了重构，构建菌种通过补料发酵产柚皮素和山奈酚分别为121.53mg/L和75.38mg/L(Wu M,Gong D C,Yang Q,et al.,Activation of Naringeninand Kaempferol through Pathway Refactoring in the Endophyte PhomopsisLiquidambaris.ACS Synthetic Biology,2021.)
发明内容
为了探索在公认安全微生物(GRAS)比如酿酒酵母、乳酸菌、枯草芽孢杆菌等微生物中通过发酵来生产柚皮素的可行性，我们尝试着在一些微生物宿主中增强或者导入外源芳香族氨基酸合成模块(用于提高苯丙氨酸和酪氨酸合成能力)、香豆酸和桂皮酸生成模块(用于建立苯丙氨酸代谢和酪氨酸双途径)和柚皮素合成模块(用于构建柚皮素合成途径)，并且/或者弱化分支代谢途径(例如敲除编码苯丙酮酸脱羧酶aro10的基因和/或编码丙酮酸脱羧酶PDC5的基因)，终于在宿主酿酒酵母BY4742中实现了本发明目的，构建出了一株产柚皮素工程菌。更有利的是，该工程菌的发酵液中无苯丙氨酸和酪氨酸积累。具体而言，本发明包括如下技术方案。
一种构建柚皮素生产菌的方法，其包括以下步骤：
A.构建表达芳香族氨基酸合成模块的质粒A，该质粒A用于中断酿酒酵母基因组中编码苯丙酮酸脱羧酶aro10的aro10基因，并且在酿酒酵母基因组中aro10基因位点整合编码DHAP合成酶aro4的aro4基因、编码分支酸变位酶aro7的aro7基因、编码五功能蛋白aro1的aro1基因、编码分支酸合酶aro2的aro2基因；芳香族氨基酸合成模块用于建立苯丙氨酸代谢和酪氨酸双途径；
B.构建表达香豆酸和桂皮酸生成模块的质粒B，该质粒B用于中断酿酒酵母基因组中编码丙酮酸脱羧酶PDC5的pdc5基因，并且在酿酒酵母基因组中pdc5基因位点整合编码预苯酸脱氢酶TYR1的tyr1基因、编码苯丙氨酸解氨酶PAL2的PAL2基因、编码酪氨酸解氨酶TAL的TAL基因；该香豆酸和桂皮酸生成模块用于建立苯丙氨酸代谢和酪氨酸双途径；
C.构建表达柚皮素合成模块的质粒C，该质粒C用于在酿酒酵母基因组中整合编码肉桂酸-4-羟化酶C4H的C4H基因、编码4-香豆酸-CoA连接酶4CL的4CL基因、编码查尔酮黄烷酮异构酶CHI的CHI基因、编码查尔酮合酶CHS的CHS基因；该柚皮素合成模块用于构建柚皮素合成途径，从而打通柚皮素从头合成的生物合成路线；
D.将步骤A中得到的质粒A、步骤B中得到的质粒B、步骤C中得到的质粒C分别地、或者两种以上同时地转化入酿酒酵母感受态细胞中，从转化子中筛选得到阳性克隆；
E.从阳性克隆中筛选出通过发酵生产柚皮素的工程菌。
可选地，步骤A中所述aro10基因和/或步骤B中所述pdc5基因的中断比如敲除可以通过基因编辑技术实施。
上述基因编辑技术可以采用CRISPR-Cas9系统、CRISPR-Cpf1系统、CRISPR-Cas相关的转座系统INTEGRATE系统或者CAST系统。
上述INTEGRATE系统是指Sam Sternberg研究组开发的基因编辑工具(Insertionof transposable elements by guide RNA-assisted targeting，引导RNA辅助靶向的转座元件插入)；CAST系统是指张锋研究组开发的基因编辑工具(CRISPR-associatedtransposase，CRISPR相关转座酶)。
优选地，上述步骤D中宿主酿酒酵母可以是酿酒酵母BY4742。
在一种优选的实施方式中，步骤A中所述DHAP合成酶(NCBI-Gene ID:852551，含K229L突变)、分支酸变位酶(NCBI Gene ID:856173，含G141S突变)、五功能蛋白(NCBI GeneID:851705)、分支酸合酶(NCBI Gene ID:852729)都是来源于酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)自身，它们的编码基因分别简写为SCaro4K229L、SCaro7G141S、SCaro1、SCaro2，所述芳香族氨基酸合成模块表示为Δaro10::SCaro4K229L-SCaro7G141S-SCaro1-SCaro2；并且/或者
步骤B中所述预苯酸脱氢酶TYR1来源于酿酒酵母自身(NCBI Gene ID:852464)，苯丙氨酸解氨酶来源于拟南芥(Arabidopsis thaliana)(NCBI Gene ID:824493)、酪氨酸解氨酶来源于约氏黄杆菌(Flavobacterium johnsoniaeu)(GenBank:KR095306.1)，它们的编码基因分别简写为SCtyr1、atPAL2、FjTAL，所述香豆酸和桂皮酸生成模块表示为Δpdc5::SCtyr1-atPAL2-FjTAL；并且/或者
步骤C中所述肉桂酸-4-羟化酶来源于拟南芥(NCBI Gene ID:817599)，4-香豆酸-CoA连接酶来源于拟南芥(NCBI Gene ID:841593，含I250L和I461V突变)，查尔酮黄烷酮异构酶来源于拟南芥(NCBI Gene ID:824678)，查尔酮合酶来源于矮牵牛(GenBank:KF765781.1)，它们的编码基因分别简写为atC4H、at4CLm、atCHI、PhCHS，所述柚皮素合成模块表示为atC4H-at4CLm-atCHI-PhCHS。
上述质粒A的骨架质粒是载体pUC或者pYES2，但不限于此，可以是任何适合于在酿酒酵母中表达的质粒；质粒B的骨架质粒是载体pUC或者pYES2，但不限于此，可以是任何适合于在酿酒酵母中表达的质粒；质粒C的骨架质粒是载体pUC或者pYES2，但不限于此，可以是任何适合于在酿酒酵母中表达的质粒。
上述质粒A的核苷酸序列优选为SEQ ID NO:1，在本文中称为pUC-aro4712。
上述质粒B的核苷酸序列优选为SEQ ID NO:2，在本文中称为pUC-TPT；
上述质粒C的核苷酸序列优选为SEQ ID NO:4，在本文中称为pYES2-C4CC。
在一种实施方式中，步骤D中质粒A、质粒B和质粒C对于酿酒酵母细胞的转化可以分步骤转化，例如先将质粒A转入酿酒酵母比如酿酒酵母BY4742感受态细胞中，得到菌株A，基因型为BY4742(Δaro10::aro4-aro7-aro1-aro2)；在采用基因编辑技术的情况下，基因型为BY4742(Δaro10::aro4-aro7-aro1-aro2/pHCas-Nour)。再将质粒B转入菌株A，得到菌株B，基因型为BY4742(Δaro10::aro4-aro7-aro1-aro2ΔPDC5::scTYR1-atPAL2-fjTAL)。然后将质粒C转入菌株B，得到菌株C，基因型为BY4742(Δaro10::aro4-aro7-aro1-aro2ΔPDC5::scTYR1-atPAL2–fjTAL/pYES2-CTCC)。
优选地，上述步骤E中筛选出的工程菌发酵时不产生苯丙氨酸和/或酪氨酸。
本发明的第二个方面在于提供一种柚皮素生产菌，其通过上述的方法构建得到。
本发明的第三个方面在于提供上述柚皮素生产菌在生产柚皮素中的应用。具体地，通过菌株的发酵来生产柚皮素。
本发明在公认的安全模式微生物酿酒酵母中构建出了完整的从葡萄糖至柚皮素的途径，得到的工程菌能够通过发酵直接生产出柚皮素，易于被广大食品和药品销售商和消费者所接受，以酿酒酵母BY4742为宿主构建的产柚皮素工程菌的发酵液中柚皮素含量高达850mg/L，并且检测不到苯丙氨酸和酪氨酸，值得进一步开发并探索工业化生产的可行性。
附图说明
图1是本发明构建的酿酒酵母中生物合成柚皮素的代谢路线图。
图2是本发明构建的整合质粒pUC-aro4712图谱，其核苷酸序列为SEQ ID NO:1，由南京金唯智生物技术有限公司合成。
图3是本发明构建的整合质粒pUC-TPT图谱，其核苷酸序列为SEQ ID NO:2，由南京金唯智生物技术有限公司合成。
图4是本发明构建的合成质粒pUC-C4CC图谱，其核苷酸序列为SEQ ID NO:3，由南京金唯智生物技术有限公司合成。
图5是本发明构建的穿梭质粒pYES2-C4CC图谱，其核苷酸序列为SEQ ID NO:4，由浙江华睿生物技术有限公司研发中心构建。
具体实施方式
本发明根据以酿酒酵母为出发菌株，运用代谢工程对其基因组进行改造，构建了柚皮素合成路线(如图1所示)，使得酿酒酵母可通过发酵将葡萄糖经过一系列生化反应合成柚皮素，并排出体外。
在上述的工程菌构建步骤A和B中，术语“中断(disruption)”，是某一个基因的功能丧失或者大幅度下调即基因敲减，包括该基因的敲除、突变或缺失，一般可以通过敲除、插入失活、移码突变、引入终止密码子提前翻译终止等常规的基因操作手段实现。
在步骤D中，质粒A、质粒B和质粒C可以分步骤地转化入宿主感受态细胞中，逐步完成基因组的改造；也可以两种质粒三种质粒一起转化入同一个感受态细胞中。
应理解，在构建本发明的基因工程菌的具体操作中，步骤A、步骤B和步骤C、以及质粒A、质粒B和质粒C的转化步骤的排序并非完全根据英文字母顺序由前到后地固定不变，它们可以交叉、颠倒地操作，只要每个步骤能实现各自的功能、完成宿主细胞基因型的定向改变即可。
在本文中，有时为了描述简便，会将酶比如苯丙酮酸脱羧酶(aro10)蛋白质名称与其编码基因(DNA)名称混用，本领域技术人员应能理解它们在不同描述场合表示不同的物质。例如，对于苯丙酮酸脱羧酶，用于描述苯丙酮酸脱羧酶功能或类别时，指的是aro10蛋白质；在作为一种基因描述时，指的是编码该酶的基因aro10，以此类推，这是本领域技术人员容易理解的。
在本文中，对于本发明，术语“柚皮素生产菌”、“基因工程菌”、“柚皮素工程菌”，表示相同的含义，可以互换使用，例如表示构建的酿酒酵母工程菌BY4742(Δaro10::aro4-aro7-aro1-aro2ΔPDC5::scTYR1-atPAL2–fjTAL/pYES2-CTCC)。
为了在酿酒酵母比如BY4742中最佳地表达外源的酶比如atC4H、PhCHS等，本发明对其表达基因进行了密码子优化。
密码子优化是可用于通过增加感兴趣基因的翻译效率使生物体中蛋白质表达最大化的一种技术。不同的生物体由于突变倾向和天然选择而通常示出对于编码相同氨基酸的一些密码子之一的特殊偏好性。例如，在选定的微生物如酿酒酵母中，优化密码子反映出其各自的基因组tRNA库的组成。因此，在生长快速的微生物中，氨基酸的低频率密码子可以用用于相同氨基酸的但高频率的密码子置换。因此，优化的DNA序列的表达在选定的微生物中得以改良。
经过密码子优化，设计了质粒pUC-aro4712、pUC-TPT、pUC-C4CC和pYES2-C4CC的核苷酸序列SEQ ID NOs:1-4，通过转化酿酒酵母BY4742，终于构建得到了产柚皮素、但几乎不产苯丙氨酸和酪氨酸的工程菌。有趣的是，当转入上述质粒pUC-aro4712、pUC-TPT、pUC-C4CC和pYES2-C4CC的宿主菌是另一个酿酒酵母亚种CCTCC M94055时，构建得到的转化子的发酵产物中不仅包含柚皮素，还包含苯丙氨酸和酪氨酸，可能与菌株内的酶系差异导致柚皮素代谢途径不同有关，具体原因有待于进一步研究。
以下结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。
实施例
本文中涉及到多种物质的添加量、含量及浓度，其中所述的百分含量，除特别说明外，皆指质量百分含量。
材料和方法
实施例中的基因合成、引物合成及测序皆委托南京金唯智生物技术有限公司完成。
本文中的分子生物学实验包括质粒构建、酶切、感受态细胞制备、转化等主要参照《分子克隆实验指南》(第三版)，J.萨姆布鲁克，D.W.拉塞尔(美)编著，黄培堂等译，科学出版社，北京，2002)进行。比如感受态细胞转化方法及感受态制备方法均参照《分子克隆实验指南》(第三版)第1章96页进行。必要时可以通过简单试验确定具体实验条件。
PCR扩增实验根据质粒或DNA模板供应商提供的反应条件或试剂盒说明书进行。必要时可以通过简单试验予以调整。
培养基：
LB培养基：5g/L酵母提取物，10g/L胰蛋白胨，10g/L氯化钠。(LB固体培养基另加20g/L琼脂粉。)
YPD20培养基：10g/L酵母提取物，20g/L胰蛋白胨，20g/L葡萄糖。(固体培养基另加20g/L琼脂粉。)
2×YPAD培养基：20g/L酵母提取物，40g/L胰蛋白胨，20g/L葡萄糖。
腺嘌呤：80mg/L。121℃灭菌20min。将葡萄糖制备400g/L母液，115℃15min灭菌，2.5mL分装备用。
YNB-URA培养基：YNB 6.7g；腺嘌呤0.3g；Dropout(不含尿嘧啶)1.26g。115℃，15min灭菌；固体培养基加入20g琼脂粉。
摇瓶发酵培养基(1L)：YNB 6.7g，Dropout(不含尿嘧啶)1.26g；40g葡萄糖，20gCaCO3。
20X电转母液：80g/L甘氨酸，2％吐温80。
以下实施例中，使用含氨苄霉素(amp)培养基时，所述抗生素在培养基中的终浓度为100μg/ml；使用诺尔丝菌素(Nour)和潮霉素(hyg)时终浓度为200μg/ml。
柚皮素的HPLC测定条件：
Figure BDA0003278882540000071
以下实施例中使用的引物序列信息如下表所示。
表1、引物序列
引物 序列(5’→3’)
pYES-gRNA-aro10-F cagtgaaagataaatgatcACATCAATGAAATTAATAAgttttagagctagaaatagc
gRNA-univer-R gatcatttatctttcactgcggagaagtttcgaacgccgaaacatg
pYES-gRNA-PDC5-F cagtgaaagataaatgatcGCTGATTTGATATTGTCTATgttttagagctagaaatagc
pYES2-XhoI-F Ccgctcgagatttaaatatttgcttatacaatcttc
pYES2-NotI-R ataagaatgcggccgcacgcgtgtacgcatgtaacattatac
pYES2-C4CC-V-F gccgcaaattaaagccttcgag
pYES2-C4CC-V-R CTCAACACCTTGTGTAAGAAGC
Aro10-V-F CAGTTTTCGGTGTTCCTGGTGAC
Aro10-V-R CTCTCATAATGATGGATAAATC
PDC5-V-F GAACGCTGCCTATGCTGCTGATG
PDC5-V-R CATCATAATATTCTTCCCTATC
表1中，名称中的“-F”代表正向；“-R”代表反向。
实施例中所使用的出发菌株酿酒酵母BY4742由上海工业生物技术研发中心惠赠；质粒pUC-aro4712、pUC-TPT、pUC-C4CC由浙江华睿生物技术有限公司设计，委托南京金唯智生物技术有限公司合成；质粒pYES2-C4CC由浙江华睿生物技术有限公司构建。任何单位和个人都可以获得这些质粒用于验证本发明，但未经允许不得用作其他用途，包括开发利用、新药申报、科学研究和教学。
实施例1：相关质粒构建
1.1构建用于CRISPR-Cas9系统的质粒pYES2-gRNA-aro10、pYES2-gRNA-PDC5：以pYES2-gRNA-MCS(addgene DI:107734，中国科学院分子植物科学卓越创新中心杨晟研究员惠赠)为模板，使用引物对pYES-gRNA-aro10-F/gRNA-univer-R进行PCR环扩，PCR扩增长度6kb。
PCR扩增体系为：KOD FX 1μl、2×KOD FX buffer 25μl、dNTP 3μl、模板质粒0.5μl、上下游引物各1μl(50μM)、ddH2O 18.5μl。
PCR扩增程序为：95℃5min；94℃30s，60℃30s，68℃6min，31个循环；68℃10min；16℃10min。
PCR产物用DpnI酶37℃消化2h，然后取3μl转化DH5α感受态细胞(上海唯地生物)，涂布amp平板，37℃培养箱中培养过夜，选取3个转化子抽质粒送测序，获得pYES2-gRNA-aro10测序阳性质粒，用于进行下步反应。
同样方法，使用引物对pYES-gRNA-PDC5-F/gRNA-univer-R进行pYES2-gRNA-PDC5质粒构建。
1.2构建整合质粒pUC-aro4712
设计整合质粒pUC-aro4712的结构，如图1所示，核苷酸序列为SEQ ID NO:1，委托南京金唯智生物技术有限公司合成。pUC-aro4712质粒用限制性内切酶NotI线性化，线性化片段直接过柱回收备用。pUC-aro4712质粒用于aro10基因(编码苯丙酮酸脱羧酶，NCBIGene ID:851987)敲除，同时在aro10位点整合aro4K229L基因(编码DHAP合成酶，NCBI GeneID:852551)、aro7G141S基因(编码分支酸变位酶，NCBI Gene ID:856173)、aro1基因(编码五功能蛋白，NCBI Gene ID:851705)、aro2基因(编码分支酸合酶，NCBI Gene ID：852729)。
1.3构建整合质粒pUC-TPT
设计整合质粒pUC-TPT的结构，如图2所示，核苷酸序列为SEQ ID NO:2，委托南京金唯智生物技术有限公司合成。pUC-TPT质粒用限制性内切酶NotI线性化，线性化片段直接过柱回收备用。pUC-TPT质粒用于丙酮酸脱羧酶(PDC5，NCBI Gene ID:850825)基因敲除，同时在此位点过表达酿酒酵母自身的预苯酸脱氢酶(TYR1，NCBI Gene ID:852464)、拟南芥来源苯丙氨酸解氨酶(atPAL2，NCBI Gene ID:824493)和来源于约氏黄杆菌(Flavobacteriumjohnsoniaeu)来源的酪氨酸解氨酶(fjTAL，GenBank:KR095306.1)。
1.4构建合成质粒pUC-C4CC
设计合成质粒pUC-C4CC的结构，如图3所示，核苷酸序列为SEQ ID NO:3，委托南京金唯智生物技术有限公司合成。质粒pUC-C4CC用于提供C4CC片段，用来构建穿梭质粒pYES2-C4CC。
1.5构建穿梭质粒pYES2-C4CC
质粒pUC-C4CC用NotI和XhoI酶切，回收9.8kb大小C4CC片段。以pYES2质粒为模板，使用引物对pYES2-XhoI-F/pYES2-NotI-R进行PCR扩增，得4.6kb大小片段，琼脂糖凝胶回收(Axygen DNA凝胶回收试剂盒AP-GX-50)，用NotI和XhoI酶切，直接过柱回收，得pYES2酶切片段。上述C4CC片段和pYES2酶切片段用T4连接酶连接，转化DH5α感受态细胞(上海唯地生物)。转化子用引物对pYES2-C4CC-V-F/pYES2-C4CC-V-R进行鉴定，阳性质粒可扩增出800bp片段，为穿梭质粒pYES2-C4CC。pYES2-C4CC主要用于过表达拟南芥来源的肉桂酸-4-羟化酶(atC4H，NCBI Gene ID:817599)、拟南芥来源的4-香豆酸-CoA连接酶(at4CL，NCBI GeneID:841593，I250L和I461V氨基酸突变)、拟南芥来源的查尔酮黄烷酮异构酶(atCHI，NCBIGene ID:824678)和矮牵牛来源的查尔酮合酶(CHS，GenBank:KF765781.1)，核苷酸序列是SEQ ID NO:4，其结构参见图4。
实施例2：基因工程菌构建
2.1感受态细胞制备
使用质粒pHCas-Nour(addgene ID:107733，中国科学院分子植物科学卓越创新中心杨晟研究员惠赠)转化酿酒酵母BY4742，阳性克隆BY4742/pHCas-Nour菌种YPD20平板(诺尔丝抗性，200μg/ml)划线；挑单克隆到YPD20(Nour，200μg/ml)试管过夜培养；按初始OD600＝0.1-0.2转接入50ml 2×YPAD摇瓶，30℃，240rpm培养至OD600为0.8-1.0，约4-5小时；20℃，3000g离心5min，收集菌体，用1/2体积无菌水重悬离心，3000g 5min。1/2体积无菌水再洗一次，离心收菌。用1ml无菌水重悬后转至1.5ml EP管，12000g，30秒收集菌体；用1ml无菌水重悬，每管100微升分装备用。
2.2质粒pUC-aro4712整合
取分装好的酵母菌，12000g离心30s，丢弃上清，按顺序依次加入以下成分：
PEG3350(50％(w/v))，240微升；
LiAc(1M)，36微升；
鱼精ssDNA(2mg/L，使用之前100℃放置5min后立马插入冰上)，50微升；
DNA(pYES2-gRNA-aro10和pUCaro4712线性化质粒)+H2O，34微升。
涡旋振荡混匀，42℃热激15min；12000g离心30s去上清，加入1ml YPD培养基重悬复苏1～2h，取适量复苏菌液涂抗性平板(Nour+hyg)，平板30℃培养，得转化子。
获得的转化子以Aro10-V-F/Aro10-V-R引物对进行菌落PCR鉴定，阳性转化子扩增获得1.24kb大小片段，野生型菌种无条带。阳性菌种在YPD试管连续传代3～5次，YPD平板(Nour抗性)划线，长出单克隆到YPD平板(hyg抗性)鉴定，潮霉素平板不能生长菌株即BY4742(Δaro10::aro4-aro7-aro1-aro2)/pHCas-Nour，进行下步构建。
2.3质粒pUC-TPT整合
pUC-TPT质粒用限制性内切酶NotI线性化，线性化片段直接过柱回收备用，将其整合入菌株BY4742(Δaro10::aro4-aro7-aro1-aro2)/pHCas-Nour中，使用引物对PDC5-V-F/PDC5-V-R进行菌落PCR鉴定，阳性转化子出现1.09kb条带，野生型菌种无条带。相同的方法获得BY4742(Δaro10::aro4-aro7-aro1-aro2ΔPDC5::scTYR1-atPAL2-fjTAL)菌株。
2.4穿梭质粒pYES2-C4CC转化
将pYES2-C4CC质粒电转入BY4742(Δaro10::aro4-aro7-aro1-aro2ΔPDC5::scTYR1-atPAL2-fjTAL)菌株中，转化子涂布YNB-URA3平板筛选，得到阳性克隆，其基因型为BY4742(Δaro10::aro4-aro7-aro1-aro2ΔPDC5::scTYR1-atPAL2-fjTAL)/pYES2-CTCC，命名为ZHR5601。
实施例3：工程菌发酵验证实验
将基因工程菌ZHR5601在YNB-URA3平板上培养，挑单克隆到YNB-URA3试管，30℃过夜培养，然后按照10v/v％接种量转接到摇瓶发酵培养基中，30℃230rpm振荡培养48h，取样进行HPLC检测，发酵液中柚皮素含量高达850mg/L，并且检测不到苯丙氨酸和酪氨酸。提示工程菌ZHR5601的柚皮素代谢途径构建成功，发酵结果甚至超过预期。
应理解，上述实施例仅用于举例说明目的，而不是对本发明的限制。本领域技术人员在阅读了本发明的构思之后，对其做出的各种改变或调整，均应落入本发明的保护范围内，这些等价形式同样属于权利要求书限定的范围。
序列表
<110> 浙江华睿生物技术有限公司
<120> 一种产柚皮素的酿酒酵母菌
<130> SHPI2110336
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 14129
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 1
gctcttccgc ttcctcgctc actgactcgc tgcgctcggt cgttcggctg cggcgagcgg 60
tatcagctca ctcaaaggcg gtaatacggt tatccacaga atcaggggat aacgcaggaa 120
agaacatgtg agcaaaaggc cagcaaaagg ccaggaaccg taaaaaggcc gcgttgctgg 180
cgtttttcca taggctccgc ccccctgacg agcatcacaa aaatcgacgc tcaagtcaga 240
ggtggcgaaa cccgacagga ctataaagat accaggcgtt tccccctgga agctccctcg 300
tgcgctctcc tgttccgacc ctgccgctta ccggatacct gtccgccttt ctcccttcgg 360
gaagcgtggc gctttctcat agctcacgct gtaggtatct cagttcggtg taggtcgttc 420
gctccaagct gggctgtgtg cacgaacccc ccgttcagcc cgaccgctgc gccttatccg 480
gtaactatcg tcttgagtcc aacccggtaa gacacgactt atcgccactg gcagcagcca 540
ctggtaacag gattagcaga gcgaggtatg taggcggtgc tacagagttc ttgaagtggt 600
ggcctaacta cggctacact agaagaacag tatttggtat ctgcgctctg ctgaagccag 660
ttaccttcgg aaaaagagtt ggtagctctt gatccggcaa acaaaccacc gctggtagcg 720
gtggtttttt tgtttgcaag cagcagatta cgcgcagaaa aaaaggatct caagaagatc 780
ctttgatctt ttctacgggg tctgacgctc agtggaacga aaactcacgt taagggattt 840
tggtcatgag attatcaaaa aggatcttca cctagatcct tttaaattaa aaatgaagtt 900
ttaaatcaat ctaaagtata tatgagtaaa cttggtctga cagttaccaa tgcttaatca 960
gtgaggcacc tatctcagcg atctgtctat ttcgttcatc catagttgcc tgactccccg 1020
tcgtgtagat aactacgata cgggagggct taccatctgg ccccagtgct gcaatgatac 1080
cgcgagaccc acgctcaccg gctccagatt tatcagcaat aaaccagcca gccggaaggg 1140
ccgagcgcag aagtggtcct gcaactttat ccgcctccat ccagtctatt aattgttgcc 1200
gggaagctag agtaagtagt tcgccagtta atagtttgcg caacgttgtt gccattgcta 1260
caggcatcgt ggtgtcacgc tcgtcgtttg gtatggcttc attcagctcc ggttcccaac 1320
gatcaaggcg agttacatga tcccccatgt tgtgcaaaaa agcggttagc tccttcggtc 1380
ctccgatcgt tgtcagaagt aagttggccg cagtgttatc actcatggtt atggcagcac 1440
tgcataattc tcttactgtc atgccatccg taagatgctt ttctgtgact ggtgagtact 1500
caaccaagtc attctgagaa tagtgtatgc ggcgaccgag ttgctcttgc ccggcgtcaa 1560
tacgggataa taccgcgcca catagcagaa ctttaaaagt gctcatcatt ggaaaacgtt 1620
cttcggggcg aaaactctca aggatcttac cgctgttgag atccagttcg atgtaaccca 1680
ctcgtgcacc caactgatct tcagcatctt ttactttcac cagcgtttct gggtgagcaa 1740
aaacaggaag gcaaaatgcc gcaaaaaagg gaataagggc gacacggaaa tgttgaatac 1800
tcatactctt cctttttcaa tattattgaa gcatttatca gggttattgt ctcatgagcg 1860
gatacatatt tgaatgtatt tagaaaaata aacaaatagg ggttccgcgc acatttcccc 1920
gaaaagtgcc acctgacgtc ctatacaagc gcattgacgt ttctaaactt tctttgcaat 1980
atgattcaaa tgtaactcaa tatacgaacg aaacaatgcg gttagaagat cctaccaatg 2040
gacaatcaag cattattaca caagttcact tacaaaagac gatgcctaaa tttttgaacc 2100
ctggtgatgt tgtcgtttgt gaaacaggct cttttcaatt ctctgttcgt gatttcgcgt 2160
ttccttcgca attaaaatat atatcgcaag gatttttcct ttccattggc atggcccttc 2220
ctgccgccct aggtgttgga attgccatgc aagaccactc aaacgctcac atcaatggtg 2280
gcggccgcgc gttcaagtaa ctttagtgat cggaacctac atcatttggt cccacagcta 2340
catgattcaa attttaaagg gccaaatcat aaagtatatc atgatatggt aaaagataga 2400
gtcgcttgct cggtagccta cttggaggat attgaaactg catgtgacca agtcgataat 2460
gttatccgcg atatttacaa gtattctaaa cctggttata tttttgttcc tgcagatttt 2520
gcggatatgt ctgttacatg tgataatttg gttaatgttc cacgtatatc tcaacaagat 2580
tgtatagtat acccttctga aaaccaattg tctgacataa tcaacaagcc cacacaccat 2640
agcttcaaaa tgtttctact ccttttttac tcttccagat tttctcggac tccgcgcatc 2700
gccgtaccac ttcaaaacac ccaagcacag catactaaat ttcccctctt tcttcctcta 2760
gggtgtcgtt aattacccgt actaaaggtt tggaaaagaa aaaagagacc gcctcgtttc 2820
tttttcttcg tcgaaaaagg caataaaaat ttttatcacg tttctttttc ttgaaaattt 2880
ttttttttga tttttttctc tttcgatgac ctcccattga tatttaagtt aataaacggt 2940
cttcaatttc tcaagtttca gtttcatttt tcttgttcta ttacaacttt ttttacttct 3000
tgctcattag aaagaaagca tagcaatcta atctaagttt taattacaaa atgagtgaat 3060
ctccaatgtt cgctgccaac ggcatgccaa aggtaaatca aggtgctgaa gaagatgtca 3120
gaattttagg ttacgaccca ttagcttctc cagctctcct tcaagtgcaa atcccagcca 3180
caccaacttc tttggaaact gccaagagag gtagaagaga agctatagat attattaccg 3240
gtaaagacga cagagttctt gtcattgtcg gtccttgttc catccatgat ctagaagccg 3300
ctcaagaata cgctttgaga ttaaagaaat tgtcagatga attaaaaggt gatttatcca 3360
tcattatgag agcatacttg gagaagccaa gaacaaccgt cggctggaaa ggtctaatta 3420
atgaccctga tgttaacaac actttcaaca tcaacaaggg tttgcaatcc gctagacaat 3480
tgtttgtcaa cttgacaaat atcggtttgc caattggttc tgaaatgctt gataccattt 3540
ctcctcaata cttggctgat ttggtctcct tcggtgccat tggtgccaga accaccgaat 3600
ctcaactgca cagagaattg gcctccggtt tgtctttccc agttggtttc aagaacggta 3660
ccgatggtac cttaaatgtt gctgtggatg cttgtcaagc cgctgctcat tctcaccatt 3720
tcatgggtgt tactttgcat ggtgttgctg ctatcaccac tactaagggt aacgaacact 3780
gcttcgttat tctaagaggt ggtaaaaagg gtaccaacta cgacgctaag tccgttgcag 3840
aagctaaggc tcaattgcct gccggttcca acggtctaat gattgactac tctcacggta 3900
actccaataa ggatttcaga aaccaaccaa aggtcaatga cgttgtttgt gagcaaatcg 3960
ctaacggtga aaacgccatt accggtgtca tgattgaatc aaacatcaac gaaggtaacc 4020
aaggcatccc agccgaaggt aaagccggct tgaaatatgg tgtttccatc actgatgctt 4080
gtataggttg ggaaactact gaagacgtct tgaggaaatt ggctgctgct gtcagacaaa 4140
gaagagaagt taacaagaaa tagcatgtaa ttagttatgt cacgcttaca ttcacgccct 4200
ccccccacat ccgctctaac cgaaaaggaa ggagttagac aacctgaagt ctaggtccct 4260
atttattttt ttatagttat gttagtatta agaacgttat ttatatttca aatttttctt 4320
ttttttctgt acagacgcgt gtacgcatgt aacattatac tgaaaacctt gcttgagaag 4380
gttttgggac gctcgaaggc tttacgcaca gatattataa catctgcata ataggcattt 4440
gcaagaatta ctcgtgagta aggaaagagt gaggaactat cgcatacctg catttaaaga 4500
tgccgatttg ggcgcgaatc ctttattttg gcttcaccct catactatta tcagggccag 4560
aaaaaggaag tgtttccctc cttcttgaat tgatgttacc ctcataaagc acgtggcctc 4620
ttatcgagaa agaaattacc gtcgctcgtg atttgtttgc aaaaagaaca aaactgaaaa 4680
aacccagaca cgctcgactt cctgtcttcc tattgattgc agcttccaat ttcgtcacac 4740
aacaaggtcc tagcgacggc tcacaggttt tgtaacaagc aatcgaaggt tctggaatgg 4800
cgggaaaggg tttagtacca catgctatga tgcccactgt gatctccaga gcaaagttcg 4860
ttcgatcgta ctgttactct ctctctttca aacagaattg tccgaatcgt gtgacaacaa 4920
cagcctgttc tcacacactc ttttcttcta accaaggggg tggtttagtt tagtagaacc 4980
tcgtgaaact tacatttaca tatatataaa cttgcataaa ttggtcaatg caagaaatac 5040
atatttggtc ttttctaatt cgtagttttt caagttctta gatgctttct ttttctcttt 5100
tttacagatc atcaaggaag taattatcta ctttttacaa caaatataaa acaatggatt 5160
tcacaaaacc agaaactgtt ttaaatctac aaaatattag agatgaatta gttagaatgg 5220
aggattcgat catcttcaaa tttattgaga ggtcgcattt cgccacatgt ccttcagttt 5280
atgaggcaaa ccatccaggt ttagaaattc cgaattttaa aggatctttc ttggattggg 5340
ctctttcaaa tcttgaaatt gcgcattctc gcatcagaag attcgaatca cctgatgaaa 5400
ctcccttctt tcctgacaag attcagaaat cattcttacc gagcattaac tacccacaaa 5460
ttttggcgcc ttatgcccca gaagttaatt acaatgataa aataaaaaaa gtttatattg 5520
aaaagattat accattaatt tcgaaaagag atggtgatga taagaataac ttctgttctg 5580
ttgccactag agatatagaa tgtttgcaaa gcttgagtag gagaatccac tttggcaagt 5640
ttgttgctga agccaagttc caatcggata tcccgctata cacaaagctg atcaaaagta 5700
aagatgtcga ggggataatg aagaatatca ccaattctgc cgttgaagaa aagattctag 5760
aaagattaac taagaaggct gaagtctatg gtgtggaccc taccaacgag tcaggtgaaa 5820
gaaggattac tccagaatat ttggtaaaaa tttataagga aattgttata cctatcacta 5880
aggaagttga ggtggaatac ttgctaagaa ggttggaaga gtaagcgaat ttcttatgat 5940
ttatgatttt tattattaaa taagttataa aaaaaataag tgtatacaaa ttttaaagtg 6000
actcttaggt tttaaaacga aaattcttat tcttgagtaa ctctttcctg taggtcaggt 6060
tgctttctca ggtatagcat gaggtcgctc ttattgacca cacctctacc ggcatgccga 6120
gcaaatgcct gcaaatcgct ccccatttca cccaattgta gatatgctaa ctccagcaat 6180
gagttgatga atctcggtgt gtattttatg tcctcagagg acaacacctg ttgtaatcgt 6240
tcttccacac ggatccacag cctagccttc agttgggctc tatcttcatc gtcttacaca 6300
gaatatataa catcgtaggt gtctgggtga acagtttatt cctggcatcc actaaatata 6360
atggagcccg ctttttaagc tggcatccag aaaaaaaaag aatcccagca ccaaaatatt 6420
gttttcttca ccaaccatca gttcataggt ccattctctt agcgcaacta cagagaacag 6480
gggcacaaac aggcaaaaaa cgggcacaac ctcaatggag tgatgcaacc tgcctggagt 6540
aaatgatgac acaaggcaat tgacccacgc atgtatctat ctcattttct tacaccttct 6600
attaccttct gctctctctg atttggaaaa agctgaaaaa aaaggttgaa accagttccc 6660
tgaaattatt cccctacttg actaataagt atataaagac ggtaggtatt gattgtaatt 6720
ctgtaaatct atttcttaaa cttcttaaat tctactttta tagttagtct tttttttagt 6780
tttaaaacac caagaactta gtttcgaata aacacacata aacaaacaaa atggtgcagt 6840
tagccaaagt cccaattcta ggaaatgata ttatccacgt tgggtataac attcatgacc 6900
atttggttga aaccataatt aaacattgtc cttcttcgac atacgttatt tgcaatgata 6960
cgaacttgag taaagttcca tactaccagc aattagtcct ggaattcaag gcttctttgc 7020
cagaaggctc tcgtttactt acttatgttg ttaaaccagg tgagacaagt aaaagtagag 7080
aaaccaaagc gcagctagaa gattatcttt tagtggaagg atgtactcgt gatacggtta 7140
tggtagcgat cggtggtggt gttattggtg acatgattgg gttcgttgca tctacattta 7200
tgagaggtgt tcgtgttgtc caagtaccaa catccttatt ggcaatggtc gattcctcca 7260
ttggtggtaa aactgctatt gacactcctc taggtaaaaa ctttattggt gcattttggc 7320
aaccaaaatt tgtccttgta gatattaaat ggctagaaac gttagccaag agagagttta 7380
tcaatgggat ggcagaagtt atcaagactg cttgtatttg gaacgctgac gaatttacta 7440
gattagaatc aaacgcttcg ttgttcttaa atgttgttaa tggggcaaaa aatgtcaagg 7500
ttaccaatca attgacaaac gagattgacg agatatcgaa tacagatatt gaagctatgt 7560
tggatcatac atataagtta gttcttgaga gtattaaggt caaagcggaa gttgtctctt 7620
cggatgaacg tgaatccagt ctaagaaacc ttttgaactt cggacattct attggtcatg 7680
cttatgaagc tatactaacc ccacaagcat tacatggtga atgtgtgtcc attggtatgg 7740
ttaaagaggc ggaattatcc cgttatttcg gtattctctc ccctacccaa gttgcacgtc 7800
tatccaagat tttggttgcc tacgggttgc ctgtttcgcc tgatgagaaa tggtttaaag 7860
agctaacctt acataagaaa acaccattgg atatcttatt gaagaaaatg agtattgaca 7920
agaaaaacga gggttccaaa aagaaggtgg tcattttaga aagtattggt aagtgctatg 7980
gtgactccgc tcaatttgtt agcgatgaag acctgagatt tattctaaca gatgaaaccc 8040
tcgtttaccc cttcaaggac atccctgctg atcaacagaa agttgttatc ccccctggtt 8100
ctaagtccat ctccaatcgt gctttaattc ttgctgccct cggtgaaggt caatgtaaaa 8160
tcaagaactt attacattct gatgatacta aacatatgtt aaccgctgtt catgaattga 8220
aaggtgctac gatatcatgg gaagataatg gtgagacggt agtggtggaa ggacatggtg 8280
gttccacatt gtcagcttgt gctgacccct tatatctagg taatgcaggt actgcatcta 8340
gatttttgac ttccttggct gccttggtca attctacttc aagccaaaag tatatcgttt 8400
taactggtaa cgcaagaatg caacaaagac caattgctcc tttggtcgat tctttgcgtg 8460
ctaatggtac taaaattgag tacttgaata atgaaggttc cctgccaatc aaagtttata 8520
ctgattcggt attcaaaggt ggtagaattg aattagctgc tacagtttct tctcagtacg 8580
tatcctctat cttgatgtgt gccccatacg ctgaagaacc tgtaactttg gctcttgttg 8640
gtggtaagcc aatctctaaa ttgtacgtcg atatgacaat aaaaatgatg gaaaaattcg 8700
gtatcaatgt tgaaacttct actacagaac cttacactta ttatattcca aagggacatt 8760
atattaaccc atcagaatac gtcattgaaa gtgatgcctc aagtgctaca tacccattgg 8820
ccttcgccgc aatgactggt actaccgtaa cggttccaaa cattggtttt gagtcgttac 8880
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ttgatatgga gccaatgact gatgcgttct taactgcatg tgttgttgcc gctatttcgc 9060
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agcaacagca taacaatcaa agtgttaaac aatttgttgt ggagaacggt tgggagaagt 9660
tccgtgagga agaaacaaga attttcaagg aagttattca aaattacggc gatgatggat 9720
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ccgcagaagc tgagttccaa gctctaagaa gatcgtttag taagtacatt gcaaccatta 10020
caggtgtcag agaaatagaa attccaagcg gaagatctgc ctttgtgtgt ttaacctttg 10080
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gtgtctctgt tccagggtcc aagcacaatg acccatttta ctttgaaaaa gaaacaaaca 13500
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gttcaccgag caaaattaaa aacgcaaaat gaattgtccc tatgaaatta ttaaaggacc 14100
acatcaccag acttatctct ggggggtcc 14129
<210> 2
<211> 10136
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 2
gctcttccgc ttcctcgctc actgactcgc tgcgctcggt cgttcggctg cggcgagcgg 60
tatcagctca ctcaaaggcg gtaatacggt tatccacaga atcaggggat aacgcaggaa 120
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cgtattatga ctgttccatt ctttacaaat aaagttgtcc aacagaatag agaagggtgg 960
gagtttgagg ctgctagcgt tgtggaggac gtgaagaaga atccagacag tgcgaccaaa 1020
ggtattgttt tgagaaaacg tctgcaattg atgatgtata acaatatgtt cagaataatg 1080
ttcgaccgtc gtttcgagag tgaagatgat cccttgtttc ttaggcttaa agcacttaat 1140
ggagaaagat cacgtttggc tcaaagcttt gagtataatt atggcgactt cattccaatc 1200
ctacgtcctt ttttaagagg atacttaaaa atctgccaag atgttaaaga tagaagaatt 1260
gcattattta aaaaatactt tgtagatgaa agaaaacaaa tagcatcttc taaacctact 1320
gggtccgaag gccttaagtg cgctatcgat cacattttag aggctgagca aaagggtgaa 1380
atcaacgagg ataatgtctt gtacattgtc gagaacatta atgttgcggc tattgaaact 1440
acattgtggt ctatagaatg gggtatagct gaactggtta atcatccaga gattcaatca 1500
aaattgagaa acgaattaga tactgtctta ggtcctggtg tccaagtaac tgagccagat 1560
ttgcacaagc tgccttattt gcaagcagta gtaaaagaaa ctctaagatt gagaatggcc 1620
atcccattac tggttccaca catgaaccta catgatgcaa agttggcagg ttatgacatt 1680
ccagctgaat caaaaatatt agttaatgct tggtggctag caaataatcc aaattcatgg 1740
aagaagcctg aagaatttcg tcccgaaagg ttctttgaag aagaatcaca cgtagaagcg 1800
aatggtaatg actttaggta tgtccccttt ggtgtgggtc gtagatcttg tcccggtatt 1860
attttggctt tacccatttt aggtattaca attggtcgta tggtacaaaa tttcgagtta 1920
ctgccacccc caggtcaatc taaagttgac acgtctgaaa aaggcggtca attttcacta 1980
catatactaa atcattcaat aattgtaatg aagccacgta attgttaaca tgtaattagt 2040
tatgtcacgc ttacattcac gccctccccc cacatccgct ctaaccgaaa aggaaggagt 2100
tagacaacct gaagtctagg tccctattta tttttttata gttatgttag tattaagaac 2160
gttatttata tttcaaattt ttcttttttt tctgtacaga cgcgtgtacg catgtaacat 2220
tatactgaaa accttgcttg agaaggtttt gggacgctcg aaggctttac gcacagatat 2280
tataacatct gcataatagg catttgcaag aattactcgt gagtaaggaa agagtgagga 2340
actatcgcat acctgcattt aaagatgccg atttgggcgc gaatccttta ttttggcttc 2400
accctcatac tattatcagg gccagaaaaa ggaagtgttt ccctccttct tgaattgatg 2460
ttaccctcat aaagcacgtg gcctcttatc gagaaagaaa ttaccgtcgc tcgtgatttg 2520
tttgcaaaaa gaacaaaact gaaaaaaccc agacacgctc gacttcctgt cttcctattg 2580
attgcagctt ccaatttcgt cacacaacaa ggtcctagcg acggctcaca ggttttgtaa 2640
caagcaatcg aaggttctgg aatggcggga aagggtttag taccacatgc tatgatgccc 2700
actgtgatct ccagagcaaa gttcgttcga tcgtactgtt actctctctc tttcaaacag 2760
aattgtccga atcgtgtgac aacaacagcc tgttctcaca cactcttttc ttctaaccaa 2820
gggggtggtt tagtttagta gaacctcgtg aaacttacat ttacatatat ataaacttgc 2880
ataaattggt caatgcaaga aatacatatt tggtcttttc taattcgtag tttttcaagt 2940
tcttagatgc tttctttttc tcttttttac agatcatcaa ggaagtaatt atctactttt 3000
tacaacaaat ataaaacaat ggcgccacaa gaacaagcag tttctcaggt gatggagaaa 3060
cagagcaaca acaacaacag tgacgtcatt ttccgatcaa agttaccgga tatttacatc 3120
ccgaaccacc tatctctcca cgactacatc ttccaaaaca tctccgaatt cgccactaag 3180
ccttgcctaa tcaacggacc aaccggccac gtgtacactt actccgacgt ccacgtcatc 3240
tcccgccaaa tcgccgccaa ttttcacaaa ctcggcgtta accaaaacga cgtcgtcatg 3300
ctcctcctcc caaactgtcc cgaattcgtc ctctctttcc tcgccgcctc cttccgcggc 3360
gcaaccgcca ccgccgcaaa ccctttcttc actccggcgg agatagctaa acaagccaaa 3420
gcctccaaca ccaaactcat aatcaccgaa gctcgttacg tcgacaaaat caaaccactt 3480
caaaacgacg acggagtagt catcgtctgc atcgacgaca acgaatccgt gccaatccct 3540
gaaggctgcc tccgcttcac cgagttgact cagtcgacaa ccgaggcatc agaagtcatc 3600
gactcggtgg agatttcacc ggacgacgtg gtggcactac cttactcctc tggcacgacg 3660
ggattaccaa aaggagtgat gctgactcac aagggactag tcacgagcgt tgctcagcaa 3720
gtcgacggcg agaacccgaa tctttatttc cacagcgatg acgtcctact ctgtgttttg 3780
cccatgtttc atatctacgc tttgaactcg atcatgttgt gtggtcttag agttggtgcg 3840
gcgattctga taatgccgaa gtttgagatc aatctgctat tggagctgat ccagaggtgt 3900
aaagtgacgg tggctccgat ggttccgccg attgtgttgg ccattgcgaa gtcttcggag 3960
acggagaagt atgatttgag ctcgataaga gtggtgaaat ctggtgctgc tcctcttggt 4020
aaagaacttg aagatgccgt taatgccaag tttcctaatg ccaaactcgg tcagggatac 4080
ggaatgacgg aagcaggtcc agtgctagca atgtcgttag gttttgcaaa ggaacctttt 4140
ccggttaagt caggagcttg tggtactgtt gtaagaaatg ctgagatgaa aatagttgat 4200
ccagacaccg gagattctct ttcgaggaat caacccggtg agatttgtat tcgtggtcac 4260
cagatcatga aaggttacct caacaatccg gcagctacag cagagaccat tgataaagac 4320
ggttggcttc atactggaga tattggattg atcgatgacg atgacgagct tttcatcgtt 4380
gatcgattga aagaacttgt caagtataaa ggttttcagg tagctccggc tgagctagag 4440
gctttgctca tcggtcatcc tgacattact gatgttgctg ttgtagcaat gaaagaagaa 4500
gcagctggtg aagttcctgt tgcatttgtg gtgaaatcga aggattcgga gttatcagaa 4560
gatgatgtga agcaattcgt gtcgaaacag gttgtgtttt acaagagaat caacaaagtg 4620
ttcttcactg aatccattcc taaagctcca tcagggaaga tattgaggaa agatctgagg 4680
gcaaaactag caaatggatt gtaagcgaat ttcttatgat ttatgatttt tattattaaa 4740
taagttataa aaaaaataag tgtatacaaa ttttaaagtg actcttaggt tttaaaacga 4800
aaattcttat tcttgagtaa ctctttcctg taggtcaggt tgctttctca ggtatagcat 4860
gaggtcgctc ttattgacca cacctctacc ggcatgccga gcaaatgcct gcaaatcgct 4920
ccccatttca cccaattgta gatatgctaa ctccagcaat gagttgatga atctcggtgt 4980
gtattttatg tcctcagagg acaacacctg ttgtaatcgt tcttccacac ggatccacag 5040
cctagccttc agttgggctc tatcttcatc gtcttacaca gaatatataa catcgtaggt 5100
gtctgggtga acagtttatt cctggcatcc actaaatata atggagcccg ctttttaagc 5160
tggcatccag aaaaaaaaag aatcccagca ccaaaatatt gttttcttca ccaaccatca 5220
gttcataggt ccattctctt agcgcaacta cagagaacag gggcacaaac aggcaaaaaa 5280
cgggcacaac ctcaatggag tgatgcaacc tgcctggagt aaatgatgac acaaggcaat 5340
tgacccacgc atgtatctat ctcattttct tacaccttct attaccttct gctctctctg 5400
atttggaaaa agctgaaaaa aaaggttgaa accagttccc tgaaattatt cccctacttg 5460
actaataagt atataaagac ggtaggtatt gattgtaatt ctgtaaatct atttcttaaa 5520
cttcttaaat tctactttta tagttagtct tttttttagt tttaaaacac caagaactta 5580
gtttcgaata aacacacata aacaaacaaa atggcgccac aagaacaagc agtttctcag 5640
gtgatggaga aacagagcaa caacaacaac agtgacgtca ttttccgatc aaagttaccg 5700
gatatttaca tcccgaacca cctatctctc cacgactaca tcttccaaaa catctccgaa 5760
ttcgccacta agccttgcct aatcaacgga ccaaccggcc acgtgtacac ttactccgac 5820
gtccacgtca tctcccgcca aatcgccgcc aattttcaca aactcggcgt taaccaaaac 5880
gacgtcgtca tgctcctcct cccaaactgt cccgaattcg tcctctcttt cctcgccgcc 5940
tccttccgcg gcgcaaccgc caccgccgca aaccctttct tcactccggc ggagatagct 6000
aaacaagcca aagcctccaa caccaaactc ataatcaccg aagctcgtta cgtcgacaaa 6060
atcaaaccac ttcaaaacga cgacggagta gtcatcgtct gcatcgacga caacgaatcc 6120
gtgccaatcc ctgaaggctg cctccgcttc accgagttga ctcagtcgac aaccgaggca 6180
tcagaagtca tcgactcggt ggagatttca ccggacgacg tggtggcact accttactcc 6240
tctggcacga cgggattacc aaaaggagtg atgctgactc acaagggact agtcacgagc 6300
gttgctcagc aagtcgacgg cgagaacccg aatctttatt tccacagcga tgacgtcata 6360
ctctgtgttt tgcccatgtt tcatatctac gctttgaact cgatcatgtt gtgtggtctt 6420
agagttggtg cggcgattct gataatgccg aagtttgaga tcaatctgct attggagctg 6480
atccagaggt gtaaagtgac ggtggctccg atggttccgc cgattgtgtt ggccattgcg 6540
aagtcttcgg agacggagaa gtatgatttg agctcgataa gagtggtgaa atctggtgct 6600
gctcctcttg gtaaagaact tgaagatgcc gttaatgcca agtttcctaa tgccaaactc 6660
ggtcagggat acggaatgac ggaagcaggt ccagtgctag caatgtcgtt aggttttgca 6720
aaggaacctt ttccggttaa gtcaggagct tgtggtactg ttgtaagaaa tgctgagatg 6780
aaaatagttg atccagacac cggagattct ctttcgagga atcaacccgg tgagatttgt 6840
attcgtggtc accagatcat gaaaggttac ctcaacaatc cggcagctac agcagagacc 6900
attgataaag acggttggct tcatactgga gatattggat tgatcgatga cgatgacgag 6960
cttttcatcg ttgatcgatt gaaagaactt atcaagtata aaggttttca ggtagctccg 7020
gctgagctag aggctttgct catcggtcat cctgacatta ctgatgttgc tgttgtcgca 7080
atgaaagaag aagcagctgg tgaagttcct gttgcatttg tggtgaaatc gaaggattcg 7140
gagttatcag aagatgatgt gaagcaattc gtgtcgaaac aggttgtgtt ttacaagaga 7200
atcaacaaag tgttcttcac tgaatccatt cctaaagctc catcagggaa gatattgagg 7260
aaagatctga gggcaaaact agcaaatgga ttgtaaattt aactccttaa gttactttaa 7320
tgatttagtt tttattatta ataattcatg ctcatgacat ctcatataca cgtttataaa 7380
acttaaatag attgaaaatg tattaaagat tcctcaggga ttcgattttt ttggaagttt 7440
ttgttttttt ttccttgaga tgctgtagta tttgggaaca attatacaat cgaaagatat 7500
atgcttacat tcgaccgttt tagccgtgat catccaactg gcaccgctgg cttgaacaac 7560
aataccagcc ttccaacttc tgtaaataac ggcggtacgc cagtgccacc agtaccgtta 7620
cctttcggta tacctccttt ccccatgttt ccaatgccct tcatgcctcc aacggctact 7680
atcacaaatc ctcatcaagc tgacgcaagc cctaagaaat gaataacaat actgacagta 7740
ctaaataatt gcctacttgg cttcacatac gttgcatacg tcgatataga taataatgat 7800
aatgacagca ggattatcgt aatacgtaat agttgaaaat ctcaaaaatg tgtgggtcat 7860
tacgtaaata atgataggaa tgggattctt ctatttttcc tttttccatt ctagcagccg 7920
tcgggaaaac gtggcatcct ctctttcggg ctcaattgga gtcacgctgc cgtgagcatc 7980
ctctctttcc atatctaaca actgagcacg taaccaatgg aaaagcatga gcttagcgtt 8040
gctccaaaaa agtattggat ggttaatacc atttgtctgt tctcttctga ctttgactcc 8100
tcaaaaaaaa aaaatctaca atcaacagat cgcttcaatt acgccctcac aaaaactttt 8160
ttccttcttc ttcgcccacg ttaaatttta tccctcatgt tgtctaacgg atttctgcac 8220
ttgatttatt ataaaaagac aaagacataa tacttctcta tcaatttcag ttattgttct 8280
tccttgcgtt attcttctgt tcttcttttt cttttgtcat atataaccat aaccaagtaa 8340
tacatattca aaatggttac ggtggaagaa taccgcaaag ctcaacgcgc tgaaggcccg 8400
gcgacggtga tggcgattgg cacggcaacc ccgacgaact gtgttgatca gagcacctat 8460
ccggactatt actttcgtat caccaactct gaacataaaa cggatctgaa agaaaaattc 8520
aaacgtatgt gcgaaaaaag catgatcaaa aaacgctata tgcacctgac cgaagaaatt 8580
ctgaaagaaa atccgagcat gtgtgaatac atggcaccgt ctctggatgc tcgccaggac 8640
attgtggttg tcgaagtgcc gaaactgggt aaagaagcgg cccagaaagc gatcaaagaa 8700
tggggccaac cgaaatcaaa aattacccat ctggtctttt gcaccacgtc gggtgtggat 8760
atgccgggtt gtgactatca actgacgaaa ctgctgggtc tgcgtccgag cgtgaaacgc 8820
ctgatgatgt accagcaagg ctgcttcgca ggcggtaccg ttctgcgtct ggcgaaagat 8880
ctggccgaaa acaataaagg tgcgcgtgtt ctggtggtgt gtagtgaaat caccgctgtt 8940
acgtttcgtg gtccgaacga tacgcacctg gactccctgg ttggccaggc cctgttcggt 9000
gatggtgcag gtgccattat cattggtagc gacccgattc cgggcgttga acgtccgctg 9060
tttgaactgg tcagcgcagc tcaaaccctg ctgccggata gccacggcgc aattgacggt 9120
cacctgcgtg aagtcggtct gacgttccat ctgctgaaag atgtgccggg cctgatctca 9180
aaaaacattg aaaaaagcct ggaagaagcg tttcgcccgc tgagtatctc cgattggaac 9240
agcctgttct ggattgcaca tccgggcggc ccggcaatcc tggaccaggt cgaaattaaa 9300
ctgggtctga aaccggaaaa actgaaagcg acccgtaatg ttctgtcaaa ctacggcaat 9360
atgagctctg cctgcgtcct gtttattctg gatgaaatgc gcaaagcatc ggctaaagaa 9420
ggtctgggca ccacgggtga aggcctggaa tggggcgtgc tgttcggctt tggtccgggt 9480
ctgacggtgg aaacggtggt tctgcatagt gtggctacct aatgcgtttg aagtgagacg 9540
ctccatcatc tctcttaatt tttcatgact gacgtttttt cttcatttta attatcatag 9600
tatttgtttg aaaaaaaaaa aaaaaaattt cccttatcaa tgatatcctt acgattatat 9660
aaattcctta cctaaaccta ttatttgtgt acatatatca gagtattatt acatatataa 9720
cctttttctc taaaacagga aaaaaaaaag aaaacgataa catgctctgc catcctttgt 9780
tcaccgagca aaattaaaaa cgcaaaatga attgtcccta tgaaattatt aaaggaccac 9840
atcaccagac ttatctctgg ggggtccctc gagatttaaa tatttgctta tacaatcttc 9900
ctgtttttgg ggcttttctg attatcaacc ggggtggagc ttcccattgc gaataccgct 9960
tccacaaaca ttgctcaaaa gtatctcttt gctatatatc tctgtgctat atccctatat 10020
aacctaccca tccacctttc gctccttgaa cttgcatcta aactcgacct ctacattttt 10080
tatgtttatc tctagtatta ctctttagac aaaaaaattg tagtaagaac tattcataga 10140
gtgaatcgaa aacaatacga aaatgtaaac atttcctata cgtagtatat agagacaaaa 10200
tagaagaaac cgttcataat tttctgacca atgaagaatc atcaacgcta tcactttctg 10260
ttcacaaagt atgcgcaatc cacatcggta tagaatataa tcggggatgc ctttatcttg 10320
aaaaaatgca cccgcagctt cgctagtaat cagtaaacgc gggaagtgga gtcaggcttt 10380
ttttatggaa gagaaaatag acaccaaagt agccttcttc taaccttaac ggacctacag 10440
tgcaaaaagt tatcaagaga ctgcattata gagcgcacaa aggagaaaaa aagtaatcta 10500
agatgctttg ttagaaaaat agcgctctcg ggatgcattt ttgtagaaca aaaaagaagt 10560
atagattctt tgttggtaaa atagcgctct cgcgttgcat ttctgttctg taaaaatgca 10620
gctcagattc tttgtttgaa aaattagcgc tctcgtcgcg ttgcattttt gttttacaaa 10680
aatgaagcac agattcttcg ttggtaaaat agcgctttcg cgttgcattt ctgttctgta 10740
aaaatgcagc tcagattctt tgtttgaaaa attagcgctc tcgcgttgca tttttgttct 10800
acaaaatgaa gcacagatgc ttcgttaaca aagatatgct attgaagtgc aagatggaaa 10860
cgcagaaaat gaaccgggga tgcgacgtgc aagattacct atgcaataga tgcaatagtt 10920
tctccaggaa ccgaaataca tacattgtct tccgtaaagc gctagactat atattattat 10980
acaggttcaa atatactatc tgtttcaggg aaaactccca ggttcggatg ttcaaaattc 11040
aatgatgggt aacaagtacg atcgtaaatc tgtaaaacag tttgtcggat attaggctgt 11100
atctcctcaa agcgtattcg aatatcattg agaagctgca gcgtcacatc ggataataat 11160
gatggcagcc attgtagaag tgccttttgc atttctagtc tctttctcgg tctagctagt 11220
tttactacat cgcgaagata gaatcttaga tcacactgcc tttgctgagc tggatcaata 11280
gagtaacaaa agagtggtaa ggcctcgtta aaggacaagg acctgagcgg aagtgtatcg 11340
tacagtagac ggagtatcta gtatagtcta tagtccgtgg aattaattct catctttgac 11400
agcttatcat cgataagcta gcttttcaat tcaattcatc attttttttt tattcttttt 11460
tttgatttcg gtttctttga aatttttttg attcggtaat ctccgaacag aaggaagaac 11520
gaaggaagga gcacagactt agattggtat atatacgcat atgtagtgtt gaagaaacat 11580
gaaattgccc agtattctta acccaactgc acagaacaaa aacctgcagg aaacgaagat 11640
aaatcatgtc gaaagctaca tataaggaac gtgctgctac tcatcctagt cctgttgctg 11700
ccaagctatt taatatcatg cacgaaaagc aaacaaactt gtgtgcttca ttggatgttc 11760
gtaccaccaa ggaattactg gagttagttg aagcattagg tcccaaaatt tgtttactaa 11820
aaacacatgt ggatatcttg actgattttt ccatggaggg cacagttaag ccgctaaagg 11880
cattatccgc caagtacaat tttttactct tcgaagacag aaaatttgct gacattggta 11940
atacagtcaa attgcagtac tctgcgggtg tatacagaat agcagaatgg gcagacatta 12000
cgaatgcaca cggtgtggtg ggcccaggta ttgttagcgg tttgaagcag gcggcagaag 12060
aagtaacaaa ggaacctaga ggccttttga tgttagcaga attgtcatgc aagggctccc 12120
tatctactgg agaatatact aagggtactg ttgacattgc gaagagcgac aaagattttg 12180
ttatcggctt tattgctcaa agagacatgg gtggaagaga tgaaggttac gattggttga 12240
ttatgacacc cggtgtgggt ttagatgaca agggagacgc attgggtcaa cagtatagaa 12300
ccgtggatga tgtggtctct acaggatctg acattattat tgttggaaga ggactatttg 12360
caaagggaag ggatgctaag gtagagggtg aacgttacag aaaagcaggc tgggaagcat 12420
atttgagaag atgcggccag caaaactaaa aaactgtatt ataagtaaat gcatgtatac 12480
taaactcaca aattagagct tcaatttaat tatatcagtt attacccatt gaaaaaggaa 12540
gagtatgagt attcaacatt tccgtgtcgc ccttattccc ttttttgcgg cattttgcct 12600
tcctgttttt gctcacccag aaacgctggt gaaagtaaaa gatgctgaag atcagttggg 12660
tgcacgagtg ggttacatcg aactggatct caacagcggt aagatccttg agagttttcg 12720
ccccgaagaa cgttttccaa tgatgagcac ttttaaagtt ctgctatgtg atacactatt 12780
atcccgtatt gacgccgggc aagagcaact cggtcgccgc atacactatt ctcagaatga 12840
cttggttgag tactcaccag tcacagaaaa gcatcttacg gatggcatga cagtaagaga 12900
attatgcagt gctgccataa ccatgagtga taacactgcg gccaacttac ttctgacaac 12960
gatcggagga ccgaaggagc taaccgcttt tttgcacaac atgggggatc atgtaactcg 13020
ccttgatcgt tgggaaccgg agctgaatga agccatacca aacgacgaga gtgacaccac 13080
gatgcctgta gcaatgccaa caacgttgcg caaactatta actggcgaac tacttactct 13140
agcttcccgg caacaattaa tagactgaat ggaggcggat aaagttgcag gaccacttct 13200
gcgctcggcc cttccggctg gctggtttat tgctgataaa tctggagccg gtgagcgtgg 13260
gtctcgcggt atcattgcag cactggggcc agatggtaag cgctcccgta tcgtagttat 13320
ctacacgacg gggagtcagg caactatgga tgaacgaaat agacagatcg ctgagatagg 13380
tgcctcactg attaagcatt ggtaactgtc agaccaagtt tactcatata tactttagat 13440
tgatttaaaa cttcattttt aatttaaaag gatctaggtg aagatccttt ttgataatct 13500
catgaccaaa atcccttaac gtgagttttc gttccactga gcgtcagacc ccgtagaaaa 13560
gatcaaagga tcttcttgag atcctttttt tctgcgcgta atctgctgct tgcaaacaaa 13620
aaaaccaccg ctaccagcgg tggtttgttt gccggatcaa gagctaccaa ctctttttcc 13680
gaaggtaact ggcttcagca gagcgcagat accaaatact gtccttctag tgtagccgta 13740
gttaggccac cacttcaaga actctgtagc accgcctaca tacctcgctc tgctaatcct 13800
gttaccagtg gctgctgcca gtggcgataa gtcgtgtctt accgggttgg actcaagacg 13860
atagttaccg gataaggcgc agcggtcggg ctgaacgggg ggttcgtgca cacagcccag 13920
cttggagcga acgacctaca ccgaactgag atacctacag cgtgagctat gagaaagcgc 13980
cacgcttccc gaagggagaa aggcggacag gtatccggta agcggcaggg tcggaacagg 14040
agagcgcacg agggagcttc cagggggaaa cgcctggtat ctttatagtc ctgtcgggtt 14100
tcgccacctc tgacttgagc gtcgattttt gtgatgctcg tcaggggggc ggagcctatg 14160
gaaaaacgcc agcaacgcgg cctttttacg gttcctgggc ttttgctggc cttttgctca 14220
catgttcttt cctgcgttat cccctgattc tgtggataac cgtattaccg cctttgagtg 14280
agctgatacc gctcgccgca gccgaacgac cgagcgcagc gagtcagtga gcgaggaagc 14340
ggaagagcgc ccaatacgca aaccgcctct ccccgcgcgt tggccgattc attaatgcag 14400

Claims (10)

1.一种构建柚皮素生产菌的方法，其特征在于，包括以下步骤：
A.构建表达芳香族氨基酸合成模块的质粒A，该质粒A用于中断酿酒酵母基因组中编码苯丙酮酸脱羧酶aro10的aro10基因，并且在酿酒酵母基因组中aro10基因位点整合编码DHAP合成酶aro4的aro4基因、编码分支酸变位酶aro7的aro7基因、编码五功能蛋白aro1的aro1基因、编码分支酸合酶aro2的aro2基因；
B.构建表达香豆酸和桂皮酸生成模块的质粒B，该质粒B用于中断酿酒酵母基因组中编码丙酮酸脱羧酶PDC5的pdc5基因，并且在酿酒酵母基因组中pdc5基因位点整合编码预苯酸脱氢酶TYR1的tyr1基因、编码苯丙氨酸解氨酶PAL2的PAL2基因、编码酪氨酸解氨酶TAL的TAL基因；
C.构建表达柚皮素合成模块的质粒C，该质粒C用于在酿酒酵母基因组中整合编码肉桂酸-4-羟化酶C4H的C4H基因、编码4-香豆酸-CoA连接酶4CL的4CL基因、编码查尔酮黄烷酮异构酶CHI的CHI基因、编码查尔酮合酶CHS的CHS基因；
D.将步骤A中得到的质粒A、步骤B中得到的质粒B、步骤C中得到的质粒C转化入酿酒酵母中，从转化子中筛选得到阳性克隆；
E.从阳性克隆中筛选出产柚皮素的工程菌。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤A中所述aro10基因和/或步骤B中所述pdc5基因的中断通过基因编辑技术实施。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤D中宿主酿酒酵母是酿酒酵母BY4742。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤A中所述DHAP合成酶(NCBI-Gene ID:852551，含K229L突变)、分支酸变位酶(NCBI Gene ID:856173，含G141S突变)、五功能蛋白(NCBI Gene ID:851705)、分支酸合酶(NCBI Gene ID:852729)都是来源于酿酒酵母自身；并且/或者
步骤B中所述预苯酸脱氢酶TYR1来源于酿酒酵母自身(NCBI Gene ID:852464)，苯丙氨酸解氨酶来源于拟南芥(NCBI Gene ID:824493)、酪氨酸解氨酶来源于约氏黄杆菌(GenBank:KR095306.1)；并且/或者
步骤C中所述肉桂酸-4-羟化酶来源于拟南芥(NCBI Gene ID:817599)，4-香豆酸-CoA连接酶来源于拟南芥(NCBI Gene ID:841593，含I250L和I461V突变)，查尔酮黄烷酮异构酶来源于拟南芥(NCBI Gene ID:824678)，查尔酮合酶来源于矮牵牛(GenBank:KF765781.1)。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，质粒A的骨架质粒是载体pUC或者pYES2，质粒B的骨架质粒是载体pUC或者pYES2，质粒C的骨架质粒是载体pUC或者pYES2。
6.如权利要求4所述的方法，其特征在于，质粒A的核苷酸序列为SEQ ID NO:1；质粒B的核苷酸序列为SEQ ID NO:2；质粒C的核苷酸序列为SEQ ID NO:4。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤E中筛选出的工程菌发酵时不产生苯丙氨酸和/或酪氨酸。
8.一种柚皮素生产菌，其特征在于，通过如权利要求1-7中任一项所述的方法构建得到。
9.如权利要求8所述的柚皮素生产菌在生产柚皮素中的应用。
10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，通过菌株的发酵来生产柚皮素。
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