CN105368732B - 一株产木糖醇的工业酿酒酵母菌株及构建方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一株产木糖醇的工业酿酒酵母菌株及构建方法，所述酿酒酵母菌株的保藏号为：CGMCC11326，构建方法包括以下步骤：以pK‑XR‑Ct质粒为模板，δ‑pB‑F、δ‑pB‑R为引物，PCR扩增得到DNA片段A，以DNA片段A为模板，扩增得到DNA片段B；酿酒酵母融合菌株的G418最佳耐受浓度筛选；酿酒酵母融合菌株的转化；筛选单细胞转化子得到酿酒酵母菌株。通过本发明所述构建方法制备的酿酒酵母SEB6菌株木糖发酵生产木糖醇的性能优越，木糖醇的产率高；同时避免了现有酿酒酵母菌株表达时外源基因丢失、表达水平低的问题。

Description

一株产木糖醇的工业酿酒酵母菌株及构建方法

技术领域

本发明涉及微生物基因工程技术领域，具体地，涉及一株产木糖醇的工业酿酒酵母菌株及构建方法。

背景技术

农业废弃物如秸秆、皮壳、芯等粗纤维(多缩戊糖)含量丰富，但这些农业废弃物的处理方式多为废弃或焚烧，造成极大的资源浪费及环境污染。而木糖醇可由粗纤维(多缩戊糖) 水解制得。农业废弃物作为原料制备木糖醇,将农副产品变废为宝、保护环境、节约资源、是一条环保经济的有效途径。而木糖醇作为一种功能性甜味剂，糖尿病人的辅助治疗剂，具有减肥、调节肠道，改善肝功等功能，在食品工业应用广泛。

生产木糖醇的方法主要有化学加氢法和生物转化法。前者工艺过程对设备要求极高，副产物成分复杂、提纯难、成本高，且催化加氢过程所需的镍催化剂对环境污染严重，木糖醇的收益率较低。后者则是利用微生物体内的木糖还原酶，将木糖转化成木糖醇。该过程不需高温高压，反应条件温和，且工艺较简单可行，操作性可控性强。且后者可避免木糖的纯化，易于分离木糖醇，降低成本，减少污染，将逐渐成为替代化学加氢法生产的有效途径。因此，在我国发展生物转化法生产木糖醇有着广泛的资源保障及应用前景且能保护环境，使得废物资源化、无害化。

可生产木糖醇的微生物总体可分三类：细菌、丝状真菌以及酵母菌，酵母的产率明显高于其他。热带假丝酵母（Candida tropicalis）具有可天然利用木糖的能力，但是由于其可致病性等不安全因素存在，以及其他可天然利用木糖生产木糖醇的微生物在代谢过程具有局限性、以及安全性并未得到认证。且由于野生型酿酒酵母不能利用木糖作为碳源，发酵产生木糖醇，所以本研究旨在将热带假丝酵母的木糖还原酶基因整合到酿酒酵母基因组中，使其在体内高效表达木糖还原酶，从而将木糖转化为木糖醇。利用酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）生产木糖醇在食品行业已有上千年的发酵史，并得到GRAS（Generally Recognized As Safe） 认证，而且产木糖醇的效率接近于理论值100%。

微生物育种是以提高微生物菌株生产性能为目标，人为改造微生物菌株的遗传性能的过程。主要是通过增加或阻断代谢支路或者增强目标基因的表达来实现。酿酒酵母表达系统较复杂，能够使用的载体类别非常有限。传统的载体有附加体型载体（yeastepisomal plasmid，YEP）、整合型载体（yeast integration plasmid，YIP）和着丝点整合载体（yeast centromere plasmid，YCP）。YEP 型载体常常应用于酿酒酵母中异源蛋白的表达，但此载体数量会因酿酒酵母的有丝分裂而急剧下降导致外源基因丢失。整合型载体YIP 与 YCP，两者均将外源基因整合到染色体基因组上，能够克服遗传不稳定现象，但两者的拷贝数目少，表达水平很低，达不到工业生产要求。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一株产木糖醇的工业酿酒酵母菌株，该菌株不仅克服了现有酿酒酵母菌株表达时外源基因丢失、表达水平低的问题；而且木糖醇产率高。

此外，本发明还提供一种产木糖醇的工业酿酒酵母菌株的构建方法。

本发明解决上述问题所采用的技术方案是：一株产木糖醇的工业酿酒酵母菌株，所述酿酒酵母菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏名称为SEB6，其保藏号为：CGMCC11326。

本发明中涉及保藏的微生物的保藏信息如下：保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号 中国科学院微生物研究所；保藏日期：2015年9月6日；保藏编号：CGMCC11326（保藏名称为SEB6）、CGMCC11321（保藏名称为SEB1）；分类命名：Saccharomyces cerevisiae。

一种产木糖醇的工业酿酒酵母菌株的构建方法，包括以下步骤：

（1）、设计扩增含有目的基因的引物：根据NCBI 数据库中已公布的δ 序列，设计合成两对引物：其中一对引物为δ-pB-F、δ-pB-R；另一对引物为δ-XR-XDH-F、δ-pB-R；

（2）、pK-XR-Ct质粒的制备；

（3）、目的基因的扩增：以pK-XR-Ct质粒为模板，δ-pB-F、δ-pB-R为引物，PCR扩增得到含有木糖还原酶基因xyl1以及G418抗性筛选基因KanMX的线性化DNA片段A，并纯化回收PCR扩增得到的DNA片段A，以线性化DNA片段A为模板，δ-XR-XDH-F、δ-pB-R为引物，扩增得到含有木糖还原酶基因xyl1的DNA片段B；所述DNA片段A为P_TEF1-KanMX-T_TEF1-P_GAPDH-CtXYL1-T_GAPDH，所述DNA片段B为P_GAPDH-CtXYL1-T_GAPDH；

（4）、构建出发菌株酿酒酵母融合菌株：以酿酒酵母IR-2和耐热酿酒酵母菌株SBE1为亲本，通过细胞融合方式得到酿酒酵母融合菌株RHZ-1；

（5）、酿酒酵母融合菌株的G418最佳耐受浓度筛选；

（6）、酿酒酵母融合菌株的转化：采用醋酸锂转化法将步骤（3）中的DNA片段A、DNA片段B按照摩尔比1:9转化到酿酒酵母融合菌株中，在含有G418最佳耐受浓度的2%YPD平板中筛选菌落形态完好且较大的阳性转化子；

（7）、筛选单细胞转化子：用四孢子显微操作仪挑取单细胞转化子于含有G418的YPD平板中，进一步筛选阳性克隆菌株。

本发明所述SEB1菌株，具有乙醇生产能力，保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC11321；其中，IR-2是从印度尼西亚发酵食品中分离得到的酿酒酵母，具有较好的絮凝性和乙醇发酵能力，IR-2来源记载在下述文献中： Hiroshi K, YoshioS, Toshio M, Harumi K, Yorikazu S. 1985. Continuous ethanol fermentation withcell recycling using flocculating yeast. J. Ferment. Technol. 63:159–165；该文献翻译后的名称为：使用絮凝性酵母进行带细胞循环的连续乙醇发酵；上述IR-2生物材料从日本产业技术综合研究所（National Institute of Advanced Industrial Scienceand Technology,AIST）获得。

酿酒酵母融合菌株的具体制备的方法：SEB1菌株和IR-2菌株在产孢子培养基（0.5%醋酸锂，2%琼脂）上生长3天，所得的子囊经酵母裂解酶处理得到孢子，经EMS处理2小时，超声分散后涂到YPD平板（2%葡萄糖，1%酵母粉，2%多聚蛋白胨，2%琼脂）培养，然后影印至最小营养平板（2%葡萄糖，0.67%无氨基酸酵母氮源，2%琼脂）上生长4天，检验在最小营养平板上不生长的菌落的营养缺陷型。从SEB1菌株得到异亮氨酸和缬氨酸缺陷型的菌株SIV-2，从IR-2得到赖氨酸缺陷型的菌株IL-1。SIV-2和IL-1经酵母裂解酶处理2小时后，得到的原生质体在30%的PEG6000中混匀处理15分钟，涂到再生平板（2%葡萄糖，0.5%酵母粉，1%多聚蛋白胨，4.5%氯化钾，2%琼脂）和选择平板（2%葡萄糖，0.67%无氨基酸酵母氮源，2%琼脂）上。在选择平板上生长的菌落视为融合子，融合子数量与再生原生质的数量比值为融合效率。共获得8株融合子（融合效率为1.1×10^-5），筛选获得利用25%糖蜜发酵产乙醇最快（1.3g/l/h)和乙醇浓度最高65 g/l的融合子RHZ-1，作为出发菌株（酿酒酵母融合菌株）用于工业酿酒酵母菌株的构建。

本发明所述pK-XR-Ct质粒的序列如SEQ ID NO.1所示；所述δ-pB-F引物序列如SEQID NO.2所示；所述δ-pB-R引物序列如SEQ ID NO.3所示；所述δ-XR-XDH-F引物序列如SEQID NO.4所示；所述δ 序列是一类长末端重复 DNA 序列，它们位于酿酒酵母染色体 DNA 的逆转录转座子Ty 上。在酿酒酵母染色体上，大约存在着 35 个 Ty相关联拷贝数和至少100 个 δ序列，利用 δ 序列同源重组方法，所述木糖还原酶基因xyl1、G418抗性筛选基因KanMX为生物学专业术语，木糖还原酶基因xyl1具体是指热带假丝酵母的木糖还原酶基因xyl1；KanMX基因为具有抗生素G418抗性的基因；将外源基因整合到酵母染色体组的效率比传统方法高许多，目的基因表达高效稳定，且操作更为简便，发酵性能优越；本发明的培养基配方如下：

(1) 、2 % YPD培养基（1%酵母浸出粉、2 %蛋白胨、2 %葡萄糖）, 121℃，灭菌15min，用于酵母发酵前的预培养。

(2)、 YPDX/G418培养基（1 %酵母浸出粉、2 %蛋白胨、5 % 木糖，2%葡萄糖）, 121℃灭菌15 min，冷却至60℃，加入100 μg/mLG418。用于木糖发酵。

固体培养基：

(1) 、LB/Amp培养基（1 %蛋白胨、0.5 %酵母浸出粉、1 % NaCl,

2%琼脂），121℃，冷却至60℃，加入100 μg/mL氨苄霉素。用于培养大肠杆菌。

(2) 、2 % YPD/G418固体培养基(1%酵母浸出粉、2 %蛋白胨、2 %葡萄糖、2 %琼脂），121℃，冷却至60℃，加入100 μg/mL G418。用于培养酵母，根据试验情况添加不同浓度G418筛选酵母转化子。

根据统计学意义，如果摩尔比小的xyl1和KanMX可以整合进入酵母细胞，那么摩尔比大的xyl1基因就可以确认整合进入基因组；由于酿酒酵母融合菌株为絮凝性酵母，由步骤（5）所筛选的单菌落中可能含有假阳性转化子；进而需要对步骤（5）中得到的阳性转化子进行进一步地筛选。

本发明是通过由假丝酵母来源的木糖还原酶基因xyl1在出发菌株（酿酒酵母融合菌株RHZ-1）中高效表达得到转化子，因而设计了DNA片段A作为筛选标记筛选转化子，又能确定xyl1已经被整合进入酵母基因组；导入KanMX基因，就可以使得酿酒酵母融合菌株含有G418抗性，但是，KanMX基因导入量的多少，对于出发菌株本身基因的表达或者生长状况可能会有恶劣的影响，为了避免这个问题，采取DNA片段A与DNA片段B摩尔比为1：9整合进入基因组。根据统计学意义，如果摩尔比较小的DNA片段A可以整合进入出发菌株，那么摩尔比大的DNA片段B整合进入出发菌株的统计学概率更大，可以认为导入DNA片段A必然导入DNA片段B；如果只导入DNA片段B，筛选工作只能由发酵进行，工作量大效果不明显，而且操作繁琐，如果只导入DNA片段A，xyl1基因的拷贝数以及酵母本身的基因表达不能得到保证；DNA片段A的比例不能太小，太小可能转化效率不高，也不能太高，太高对酵母本身可能会有影响，将DNA片段A、DNA片段B摩尔比设置为1:9，确保在不影响酵母本身的前提下尽可能提高转化率，因而本发明设计了DNA片段A、DNA片段B，再采用醋酸锂转化法将步骤（3）中的DNA片段A、DNA片段B按照摩尔比1:9转化到酿酒酵母融合菌株中，在含有G418最佳耐受浓度的2%YPD平板中筛选菌落形态完好且较大的阳性转化子，这样子得到的SEB6菌株可以利用木糖发酵高效生产木糖醇，而出发菌株酿酒酵母融合菌株则不能利用木糖生产木糖醇。

实验证明，通过本发明所述构建方法得到的SEB6菌株的木糖醇产率高、性能优越。

进一步地，步骤（4）的筛选过程为：通过G418浓度梯度为0 μg/ml、25 μg/ml、50 μg/ml、75 μg/ml、100 μg/ml的2 %YPD平板，30℃静置培养，筛选确定出发菌株酿酒酵母融合菌株的G418最佳耐受浓度。

进一步地，步骤（3）中DNA片段A的PCR扩增程序为：将含有pK-XR-Ct质粒、引物δ-pB-F、δ-pB-R的反应体系在98.0 ℃变性10 s，63.7 ℃退火15 s，72 ℃延伸3 min 50 s，上述过程进行30个循环后，于4 ℃保存。

进一步地，含有pK-XR-Ct质粒、引物δ-pB-F、δ-pB-R的反应体系50μl中包括引物δ-pB-F、δ-pB-R 各0.5 μl和质粒pK-XR-Ct 3ng，其中引物δ-pB-F、δ-pB-R的浓度为10 μM。

进一步地，步骤（3）中DNA片段B的PCR扩增程序为：将含有DNA片段A、引物δ-XR-XDH-F、δ-pB-R的反应体系在98.0 ℃变性10 s，50 ℃退火15 s，72 ℃延伸2 min，上述过程循环10次后，98.0 ℃变性10 s，68 ℃退火延伸2 min 15 s，上述过程循环20次后，于4 ℃保存。

进一步地，含有DNA片段A、引物δ-XR-XDH-F、δ-pB-R的反应体系50 μl中包括的引物δ-XR-XDH-F、δ-pB-R 各0.5 μl和DNA片段A 3 ng，其中引物δ-XR-XDH-F、δ-pB-R的浓度为10 μM。

综上，本发明的有益效果是：

1、本发明通过以δ 序列为整合位点的DNA重组技术，可以迅速而快捷地得到多个克隆子。

2、通过本发明所述构建方法制备的酿酒酵母SEB6菌株木糖发酵生产木糖醇的性能优越，木糖醇的产率高；同时避免了现有酿酒酵母菌株表达时外源基因丢失、表达水平低的问题。

附图说明

图1是质粒pK-XR-Ct的图谱；

图2是SEB6菌株第一次试管发酵结果图；

图3是SEB6菌株第二次试管发酵结果图；

图4是SEB6菌株第三次试管发酵结果图；

图5是酿酒酵母融合菌株第一次试管发酵结果图；

图6是酿酒酵母融合菌株第二次试管发酵结果图；

图7是酿酒酵母融合菌株第三次试管发酵结果图。

具体实施方式

下面结合实施例及附图，对发明作进一步地的详细说明，但本发明的实施方式不限于此。

实施例：

一种产木糖醇的工业酿酒酵母菌株的构建方法，包括以下步骤： （1）、设计扩增含有目的基因的引物：根据NCBI 数据库中已公布的δ 序列，设计合成两对引物：其中一对引物为δ-pB-F（ SEQ ID NO.2）、δ-pB-R（SEQ ID NO.3）；另一对引物为δ-XR-XDH-F（ SEQ IDNO.4）、δ-pB-R（SEQ ID NO.3）；

（2）、pK-XR-Ct质粒的制备；

（3）、目的基因的扩增：以pK-XR-Ct质粒为模板，δ-pB-F、δ-pB-R为引物，扩增得到含有木糖还原酶基因xyl1以及G418抗性筛选基因KanMX的线性化DNA片段A，并纯化回收PCR扩增得到的片段A；基因xyl1的启动子为pGAPDH，终止子为tGAPDH；KanMX基因的启动子为pTEF1，终止子为tTEF1；PCR扩增反应体系（50 μl）组成如下：5×PrimeSTAR Buffer（Mg2+plus） 10 μl ；dNTP Mixture（各2.5 mM）4 μl；10 μM的引物δ-pB-F和δ-pB-R 各0.5 μl；PrimeSTAR HS DNA polymerase(5 U/μl) 0.5 μl；质粒pK-XR-Ct 3 ng；以灭菌双蒸水补加至50 μl。PCR扩增程序：98.0 ℃变性10 s，63.7 ℃退火15 s，72 ℃延伸3 min 50 s（片段总长度为3864bp），上述过程进行30个循环后，于4 ℃保存；

以上述线性DNA片段A为模板，δ-XR-XDH-F、δ-pB-R为引物，扩增得到以pGAPDH为启动子，tGAPDH为终止子的含有木糖还原酶基因xyl1的DNA片B；PCR扩增反应体系（50 μl）组成如下：5×PrimeSTAR Buffer（Mg2+ plus） 10 μl；dNTP Mixture（各2.5 mM）4 μl；10 μM的引物δ-XR-XDH-F和δ-pB-R 各0.5 μl； PrimeSTAR HS DNA polymerase(5 U/μl) 0.5 μl；DNA片段A约3 ng；以灭菌双蒸水补加至50 μl。PCR扩增程序：98.0 ℃变性10 s，50 ℃退火15 s，72 ℃延伸2 min，上述过程循环10次后，98.0 ℃变性10 s，68 ℃退火延伸2 min15 s，（片段总长度为1969bp），上述过程循环20次后，于4 ℃保存；

（4）、构建出发菌株酿酒酵母融合菌株：以酿酒酵母IR-2和耐热酿酒酵母菌株SBE1为亲本，通过细胞融合方式得到酿酒酵母融合菌株RHZ-1；

（5）、酿酒酵母融合菌株的G418最佳耐受浓度筛选：通过G418浓度梯度为0 μg/ml、25 μg/ml、50 μg/ml、75 μg/ml、100 μg/ml的2 %YPD平板，30℃静置培养，筛选确定出发菌株酿酒酵母融合菌株的G418最佳耐受浓度；

（6）、 酿酒酵母融合菌株的转化：采用醋酸锂转化法将步骤（3）中含有δ序列的两个同源片段即含有xyl1和KanMX的DNA片段A、含有xyl1的DNA片段B，按照摩尔比为1:9（即xyl1和KanMX片段3.4 μg，xyl1片段0.8 μg）的要求转化到酿酒酵母融合菌株中；在含有G418最佳耐受浓度的2%YPD平板中筛选菌落形态完好且较大的阳性转化子；

（7）、筛选单细胞转化子：用四孢子显微操作仪挑取单细胞转化子于含有G418的YPD平板中，进一步筛选阳性克隆菌株。

通过上述构建方法制备的产木糖醇的工业酿酒酵母菌株SEB6的保藏号为：CGMCC11326。

考察了菌株SEB6的木糖醇产率，具体测定步骤如下：

（1）、提取酿酒酵母阳性克隆转化子基因组：按照酵母基因组DNA提取试剂盒YeastDNAiso Kit（大连宝生物工程有限公司）中的操作步骤进行提取，通过琼脂糖凝胶电泳进行验证；

（2）、PCR验证xyl1基因是否整合进入转化子：PCR扩增反应体系（50 μl）组成如下：10×PCR Buffer（Mg2+ plus） 10 μl ；dNTP Mixture（各2.5 mM）4 μl；10 μM的引物XR-C-F和XR-C-R 各0.5 μl； TaKaRa Taq DNA聚合酶(5 U/μl) 0.5 μl；酵母基因组约40 ng；以灭菌双蒸水补加至50 μl；PCR扩增程序：94.0 ℃预变性5 min， 94.0 ℃变性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸28 s（片段总长度为275bp），上述过程进行30个循环后，于4 ℃保存；

（3）、重组菌株的发酵筛选：活化重组酿酒酵母菌株，将得到的阳性转化子菌株接种于2 % YPD平板，30 ℃恒温箱内培养1 d；预培养：将活化后的菌株接种于含10 ml 5 %YPD液体培养基的试管（规格20×200mm）中，30 ℃ 160 rpm过夜培养16 h；按照1%接种于含10 ml YPDX（含木糖4.5 %葡萄糖2 %）液体培养基的试管（规格20×200mm）中， 35 ℃，160rpm 恒温回转式摇床发酵培养；每隔0 h，24 h，48 h取样1 ml进行发酵参数的测定。

（4）、发酵参数的测定：利用紫外分光光度计测定发酵液在600 nm的吸光度值，记为OD600，通过OD600与酿酒酵母融合菌株干重的关系，计算出重组酵母干重来评价菌株生长情况；通过气象色谱仪GC（353B）（GL Science Inc.公司）测定乙醇含量，通过HPLC（SHIMADZU）液相色谱仪测定葡萄糖、木糖以及木糖醇的含量。

（5）、计算木糖醇收率：根据消耗的木糖以及产生的木糖醇的量，计算木糖醇的产率；筛选出收率最接近于理论值1.0的菌株作为最优菌株。

按照上述木糖醇产率测定步骤对SEB6菌株进行三次试管发酵；并且并且与酿酒酵母融合菌株（RHZ-1菌株）进行对比；实验结果分别如表1、表2所示：

表1

表2

根据表1、表2的结果可知：酿酒酵母（SEB6菌株）木糖发酵生产木糖醇的性能优越，收率可达0.9以上甚至可以达到理论值1.0，比出发菌株（酿酒酵母融合菌株）的收率提高约6倍，木糖醇产量提高约36.6倍，木糖醇产率提高约109倍。

如上所述，可较好的实现本发明。

SEQUENCE LISTING

<110> 四川大学

<120> 一株产木糖醇的工业酿酒酵母菌株及构建方法

<130> 2015

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 6792

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

ctaaattgta agcgttaata ttttgttaaa attcgcgtta aatttttgtt aaatcagctc 60

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gcgaccagca ttcacatacg attgacgcat gatattactt tctgcgcact taacttcgca 3120

tctgggcaga tgatgtcgag gcgaaaaaaa atataaatca cgctaacatt tgattaaaat 3180

agaacaacta caatataaaa aaactataca aatgacaagt tcttgaaaac aagaatcttt 3240

ttgttgtcag tactgattag aaaaactcat cgagcatcaa atgaaactgc aatttattca 3300

tatcaggatt atcaatacca tatttttgaa aaagccgttt ctgtaatgaa ggagaaaact 3360

caccgaggca gttccatagg atggcaagat cctggtatcg gtctgcgatt ccgactcgtc 3420

caacatcaat acaacctatt aatttcccct cgtcaaaaat aaggttatca agtgagaaat 3480

caccatgagt gacgactgaa tccggtgaga atggcaaaag cttatgcatt tctttccaga 3540

cttgttcgac aggccagcca ttacgctcgt catcaaaatc actcgcatca accaaaccgt 3600

tattcattcg tgattgcgcc tgagcgagac gaaatacgcg atcgctgtta aaaggacaat 3660

tacaaacagg aatcgaatgt aaccggcgca ggaacactgc cagcgcatca acaatatttt 3720

cacctgaatc aggatattct tctaatacct ggaatgctgt tttgccgggg atcgcagtgg 3780

tgagtaacca tgcatcatca ggagtacgga taaaatgctt gatggtcgga agaggcataa 3840

attccgtcag ccagtttagt ctgaccatct catctgtaac atcattggca acgctacctt 3900

tgccatgttt cagaaacaac tctggcgcat cgggcttccc atacaatcga tagattgtcg 3960

cacctgattg cccgacatta tcgcgagccc atttataccc atataaatca gcatccatgt 4020

tggaatttaa tcgcggcctc gaagcgtgag tcttttcctt acccatggtt gtttatgttc 4080

ggatgtgatg tgagaactgt atcctagcaa gattttaaaa ggaagtatat gaaagaagaa 4140

cctcagtggc aaatcctaac cttttatatt tctctacagg ggcgcggcgt ggggacaatt 4200

caacgcgtct gtgaggggag cgtttccctg ctcgcaggtc tgcagcgagg agccgtaatt 4260

tttgcttcgc gccgtgcggc catcaaaatg tatggatgca aatgattata catggggatg 4320

tatgggctaa atgtacgggc gacagtcaca tcatgcccct gagctgctca cgtcaagact 4380

gtcaaggagg gtattctggg cctccatgtc gctggccggg tgacccggtg gggacgaggc 4440

aagcttggta tctctagacc taataacttc gtatagcata cattatacga agttatatta 4500

agggttgtcg acctgcagcg tacgaagctt cagctggcgg gatgagtagc agcacgttcc 4560

ttatatgtag ctttcgacat gggcccgtac ccagcttttg ttccctttag tgagggttaa 4620

ttgcgcgctt ggcgtaatca tggtcatagc tgtttcctgt gtgaaattgt tatccgctca 4680

caattccaca caacatacga gccggaagca taaagtgtaa agcctggggt gcctaatgag 4740

tgagctaact cacattaatt gcgttgcgct cactgcccgc tttccagtcg ggaaacctgt 4800

cgtgccagct gcattaatga atcggccaac gcgcggggag aggcggtttg cgtattgggc 4860

gctcttccgc ttcctcgctc actgactcgc tgcgctcggt cgttcggctg cggcgagcgg 4920

tatcagctca ctcaaaggcg gtaatacggt tatccacaga atcaggggat aacgcaggaa 4980

agaacatgtg agcaaaaggc cagcaaaagg ccaggaaccg taaaaaggcc gcgttgctgg 5040

cgtttttcca taggctccgc ccccctgacg agcatcacaa aaatcgacgc tcaagtcaga 5100

ggtggcgaaa cccgacagga ctataaagat accaggcgtt tccccctgga agctccctcg 5160

tgcgctctcc tgttccgacc ctgccgctta ccggatacct gtccgccttt ctcccttcgg 5220

gaagcgtggc gctttctcat agctcacgct gtaggtatct cagttcggtg taggtcgttc 5280

gctccaagct gggctgtgtg cacgaacccc ccgttcagcc cgaccgctgc gccttatccg 5340

gtaactatcg tcttgagtcc aacccggtaa gacacgactt atcgccactg gcagcagcca 5400

ctggtaacag gattagcaga gcgaggtatg taggcggtgc tacagagttc ttgaagtggt 5460

ggcctaacta cggctacact agaaggacag tatttggtat ctgcgctctg ctgaagccag 5520

ttaccttcgg aaaaagagtt ggtagctctt gatccggcaa acaaaccacc gctggtagcg 5580

gtggtttttt tgtttgcaag cagcagatta cgcgcagaaa aaaaggatct caagaagatc 5640

ctttgatctt ttctacgggg tctgacgctc agtggaacga aaactcacgt taagggattt 5700

tggtcatgag attatcaaaa aggatcttca cctagatcct tttaaattaa aaatgaagtt 5760

ttaaatcaat ctaaagtata tatgagtaaa cttggtctga cagttaccaa tgcttaatca 5820

gtgaggcacc tatctcagcg atctgtctat ttcgttcatc catagttgcc tgactccccg 5880

tcgtgtagat aactacgata cgggagggct taccatctgg ccccagtgct gcaatgatac 5940

cgcgagaccc acgctcaccg gctccagatt tatcagcaat aaaccagcca gccggaaggg 6000

ccgagcgcag aagtggtcct gcaactttat ccgcctccat ccagtctatt aattgttgcc 6060

gggaagctag agtaagtagt tcgccagtta atagtttgcg caacgttgtt gccattgcta 6120

caggcatcgt ggtgtcacgc tcgtcgtttg gtatggcttc attcagctcc ggttcccaac 6180

gatcaaggcg agttacatga tcccccatgt tgtgcaaaaa agcggttagc tccttcggtc 6240

ctccgatcgt tgtcagaagt aagttggccg cagtgttatc actcatggtt atggcagcac 6300

tgcataattc tcttactgtc atgccatccg taagatgctt ttctgtgact ggtgagtact 6360

caaccaagtc attctgagaa tagtgtatgc ggcgaccgag ttgctcttgc ccggcgtcaa 6420

tacgggataa taccgcgcca catagcagaa ctttaaaagt gctcatcatt ggaaaacgtt 6480

cttcggggcg aaaactctca aggatcttac cgctgttgag atccagttcg atgtaaccca 6540

ctcgtgcacc caactgatct tcagcatctt ttactttcac cagcgtttct gggtgagcaa 6600

aaacaggaag gcaaaatgcc gcaaaaaagg gaataagggc gacacggaaa tgttgaatac 6660

tcatactctt cctttttcaa tattattgaa gcatttatca gggttattgt ctcatgagcg 6720

gatacatatt tgaatgtatt tagaaaaata aacaaatagg ggttccgcgc acatttcccc 6780

gaaaagtgcc ac 6792

<210> 2

<211> 55

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

tgttggaata gaaatcaact atcatctact aactactcat cccgccagct gaagc 55

<210> 3

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

gtttatattc attgatccta ttacattatc aatcaatgaa tcgaaaatgt c 51

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<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

tgttggaata gaaatcaact atcatctact aactaacaac aagaagttta atgacgc 57

Claims (1)

1.一株产木糖醇的工业酿酒酵母菌株，其特征在于，所述酿酒酵母菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏名称为SEB6，其保藏号为：CGMCCNO.11326。