CN108148876B

CN108148876B - 一种哈茨木霉菌基因敲除方法

Info

Publication number: CN108148876B
Application number: CN201810031220.9A
Authority: CN
Inventors: 沈其荣; 张建; 黄启为; 凌宁
Original assignee: Nanjing Agricultural University
Current assignee: Nanjing Agricultural University
Priority date: 2018-01-12
Filing date: 2018-01-12
Publication date: 2018-11-16
Anticipated expiration: 2038-01-12
Also published as: CN108148876A

Abstract

本发明涉及一种哈茨木霉菌基因敲除方法。一种哈茨木霉基因敲除方法，包括(1)构建敲除基因片段；(2)PEG‑CaCl₂原生质体转化；(3)菌落PCR筛选阳性突变子。本发明通过建立一套完整的哈茨木霉基因敲除方法，同源同组效率达到20％；同时结果菌落PCR技术，极大缩短获得阳性转化子的周期，高效敲除靶标基因。

Description

一种哈茨木霉菌基因敲除方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种哈茨木霉菌基因敲除方法。

技术背景

重木霉属真菌是一类重要土壤习居菌，属于真菌界、双核菌门、半知菌亚门、丝孢纲、丛梗孢目、从梗孢科，其菌丝生长及孢子萌发能够适应较广的温湿度和pH范围，且腐生性强、繁殖速度快，可迅速占据有利空间。目前，木霉属真菌已广泛用于多种植物真菌病害的防治，是一种较理想的生防真菌和植物促生菌(Plant Growth Promoting Fungus，PGPF)(Shoresh et al.2010)。近五年来，全球市场上的木霉制剂呈指数增长，正式注册登记的木霉制剂有38个(Woo et al.2014)。目前，约50％木霉制剂成分包含哈茨木霉菌(Trichoderma harzianum)。已登记的木霉制剂，主要用于土壤处理(与各种肥料混合施用)和种子处理(种子包衣)。由于土壤和作物种类的差异、土壤温度、湿度的变化以及土著微生物的存在显著影响着外源木霉的定殖，严重制约了功能木霉的进一步应用。通过遗传改造，获得稳定遗传的工程菌株，研究木霉拮抗病原真菌、促生和诱导植物抗性的机制，分析木霉秸秆固体发酵中关键基因，有利于木霉相关产品的规模化利用。

外源DNA进入真核细胞核后，以两种方式进入结合基因组中：基因打靶通过同源重组(Homologous recombination,HR)实现；随机插入或异位整合和基因过量表达通过非同源性末端接合(NHEJ)完成。在转化过程中，HR和NHEJ都比较活跃，但在在丝状真菌中，NHEJ效率比HR效率高出很多，直接导致基因敲除中脱靶，得到较多的假阳性。在敲除哈茨木霉基因中，同源重组效率约为2％(Montero Barrientos et al.,2011)，脱靶概率较高，目前国际上也鲜有哈茨木霉基因的敲除案例。本发明通过建立一套完整的哈茨木霉基因敲除方法，高效敲除靶标基因。

原生质体的制备与再生是PEG-CaCl₂转化方法的基础，真菌的原生质体制备通常采用酶法消化细胞壁获得，目前常用的细胞壁裂解酶有纤维素酶、蜗牛酶、裂解酶等。一般采用幼嫩菌丝、分生孢子和担孢子来获得原生质体(李娟等，2006)。影响原生质体制备和再生的因素很多，包括液体培养基的成分、菌丝体的培养温度、菌丝体的生长期、制备原生质体的溶菌温度和溶菌时间等。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的上述不足，提供一种哈茨木霉基因敲除方法，使同源同组效率达到20％；同时极大缩短获得阳性转化子的周期。

本发明的目的通过以下技术方案实现：

一种哈茨木霉基因敲除方法，包括(1)构建敲除基因片段；(2)PEG-CaCl₂原生质体转化；(3)菌落PCR筛选阳性突变子；

其中，构建敲除基因片段包括以下步骤：

以哈茨木霉基因组DNA为模板，分别PCR扩增目标基因约1200bpd的5’和3’端同源臂，以引物Hyg-F和Hyg-R扩增潮霉素抗性基因，Hyg-F与扩增5’同源臂的反向引物设置16bp的重叠区域；Hyg-R与扩增3’同源臂的正向引物设置16bp的重叠区域；BamH1酶切载体pUC19，利用一步法无缝克隆试剂盒进行体外重组并转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，用5’同源臂的上游引物5F和3’同源臂的下游引物3R扩增敲除片段验证阳性克隆；引物5F和3R进行PCR扩展大量制备敲除片段，纯化敲除片段使敲除片段浓度达到500ng/μL。

其中，所述的PEG-CaCl₂原生质体转化优选包括：制备哈茨木霉原生质体；将哈茨木霉原生质体悬浮液、纯化敲除片段、PEG溶液；用枪头混匀；加PEG溶液，轻轻混匀，常温下放置；加溶液B，轻轻混匀；将混合液涂布在覆盖层析纸的含1M蔗糖PDA平板上，层析纸预先剪成条形；28℃避光培养24h；将条形层析纸片转到含抗生素的PDA平板上，28℃，避光培养30-36h，待条形层析纸边缘长出菌落后，挑取菌落，转接至新鲜的抗生素平板上，培养2天；其中所述的溶液B配方为：1Msorbitol，50mM CaCl₂，10mM TrisHCl，pH 7.5；所述的PEG溶液配方为：25％PEG6000，50mM CaCl₂、10mM TrisHCl，pH 7.5。

所述的PEG-CaCl₂原生质体转化进一步优选包括：制备哈茨木霉原生质体；冰上放置15mL离心管，分别加200μL哈茨木霉原生质体悬浮液、10μL纯化敲除片段、50μL PEG溶液；用枪头混匀，冰上放置20min；加2mL PEG溶液，轻轻混匀，常温下放置5min；加2mL溶液B，轻轻混匀；将2mL混合液涂布在覆盖层析纸的含1M蔗糖PDA平板上，层析纸预先剪成条形；28℃避光培养24h；将条形层析纸片转到含抗生素的PDA平板上，28℃，避光培养36h，待条形层析纸边缘长出菌落后，挑取菌落，转接至新鲜的抗生素平板上，培养2天。

所述的制备原生质体的方法优选：接种哈慈木霉于PDA平板，28℃培养10天后，产生大量新鲜分生孢子；用10mL生理盐水洗涤菌丝表面，经玻璃绒过滤，去除菌丝体，得到孢子悬液；在玻璃纸覆盖的PDA平板上，取200μL孢子悬液涂布，28℃，避光培养16-20h直至孢子萌发；取玻璃纸，用溶解酶溶液洗涤玻璃纸，收集萌发的孢子；28℃，100rpm培养萌发的孢子悬液90min；预冷离心机和转子，准备装有玻璃绒的离心管；90min后，萌发的孢子悬液经装有玻璃绒的离心管过滤，除去菌丝，用溶液A冲洗，终悬液体积控制在20-30mL；4℃、2000rpm离心10min，去上清；加20mL溶液A，再次离心，去上清；加1mL溶液B，冰上得到原生质体；用血球板观察、计数，稀释原生质体至10⁸个/mL；所述的溶液A配方为：1.2M sorbitol，0.1M KH₂PO₄，pH 5.6；所述的溶液B配方为：1Msorbitol，50mM CaCl₂，10mM TrisHCl，pH7.5；所述的溶解酶溶液的配方为：0.15g溶解酶溶于20mL溶液A，0.2μm滤膜过滤除菌；所述的生理盐水为0.8-0.9％NaCl加0.05％Tween。

所述的菌落PCR筛选阳性突变子包括直接刮取少量哈次木霉菌丝体，裂解后离心，利用菌落PCR试剂盒共同筛选阳性突变转化子；其中一对引物以5’端同源臂设置正向引物，潮霉素基因序列设置反向引物，跨5’端同源序列扩增片段；另外一对引物以潮霉素基因序列设置正向引物，3’端下游序列设置反向引物，跨3’端同源序列扩增片段。。在获得阳性敲除突变子后，光照培养至产孢子，再通过单孢分离纯化突变子。

本发明技术方案的详细内容为：

哈茨木霉菌中高效基因敲除方法

1.试剂：

2.操作流程

2.1敲除片段构建(2天)

高保真酶(Phusion high-fidelity DNA polymerase，New England Biolabs，分别扩增目标基因5’和3’同源臂，引物Hyg-F和Hyg-R扩增潮霉素抗性基因，各引物设置16bp的重叠区域。BamH1酶切载体pUC19，1％琼脂糖凝胶电泳后切胶回收，利用体外重组酶技术(II One Step Cloning Kit.)，反应体系：4μL5×CE buffer，2μL Exnase^TMII，1μL线性载体(0.06pmol)，1μL PCR片段(0.03pmol)和10μL去离子水；37℃反应30分钟后冰浴。

将酶连反应产物与大肠杆菌DH5α感受态混合冰浴30min，42℃热激90s，迅速冰浴2min，转接600μL LB液体培养基中，于37℃，120rpm条件下复苏1-2h后涂布于Amp-X-Gal-IPTG平板中(LB固体培养基中加入100μL 24mg/mL IPTG、100μL 100mg/mL Amp，200μL20mg/mL X-Gal 200μL)，37℃培养14-16h后挑取白斑，用质粒提取试剂盒(Axygen)提取质粒，引物5F和3R扩增敲除片段验证阳性克隆；引物5F和3R扩展大量制备敲除片段，纯化后PCR片段浓度达到500ng/μL。

2.2木霉原生质体的制备(1天)

接种木霉于PDA平板，28℃培养10天后，产生大量新鲜分生孢子；用10mL生理盐水(0.8-0.9％NaCl,0.05％Tween)洗涤菌丝表面，经玻璃绒过滤，去除菌丝体，得到孢子悬液；

在玻璃纸覆盖的PDA平板上，取200μL孢子悬液涂布，28℃，避光培养16-20h。观察PDA平板上孢子是否萌发，如未萌发，延长培养时间；

配制溶解酶溶液：0.15g溶解酶(Lysing enzyme，Sigma:L1412)溶于20mL溶液A，0.2μm滤膜过滤除菌；

取玻璃纸，用溶解酶溶液洗涤玻璃纸，收集萌发的孢子；28℃，100rpm培养萌发的孢子悬液90min；

预冷离心机和转子，准备装有玻璃绒的离心管(打通离心管底部，加入一层玻璃绒)；

90min后，萌发的孢子悬液经装有玻璃绒的离心管过滤，除去菌丝，用溶液A冲洗，终悬液体积控制在20-30mL；4℃、2000rpm离心10min，去上清；

加20mL溶液A，再次离心，去上清；加1mL Solution B，冰上得到原生质体；用血球板观察、计数，稀释原生质体至10⁸个/mL。

2.3原生质体转化(3天)

冰上放置15mL离心管，分别加200μL原生质体悬浮液、10μL纯化PCR产物、50μLPEG；用枪头混匀，冰上放置20min；

加2mL PEG，轻轻混匀，常温下放置5min；加2mL溶液B，轻轻混匀；

将2mL混合液涂布在覆盖层析纸(Whatman)的含1M蔗糖PDA平板上，层析纸预先剪成条形；28℃避光培养24h；

将条形层析纸片转到含抗生素的PDA平板上，28℃，避光培养36h，待条形层析纸边缘长出菌落后，挑取菌落，转接至新鲜的抗生素平板上，培养2天。

2.4阳性突变子筛选和纯化(3天)

跨同源臂设置引物，如图所示，扩增P1和P2直接筛选阳性突变子；28℃光照培养阳性突变子至产孢(约3天)，稀释梯度法进行单孢分离，纯化突变子，获得稳定遗传敲除突变子。

本发明的有益效果：

本发明构建一套完整的哈次木霉基因敲除、转化体系，攻克了哈茨木霉敲除难题，跨同源臂设计引物，结合菌落PCR高效筛选敲除突变子，8天能够获得阳性转化子，极大缩短实验周期。为阐述哈茨木霉拮抗病原真菌、促进植物生长、诱导植物抗性和秸秆固体发酵机制奠定方法基础。

PEG-CaCl₂介导的真菌遗传转化以原生质体为感受态细胞，将受体细胞悬浮于含质粒DNA的溶液中，转化在一定浓度的PEG、CaCl₂和pH 8-9条件下进行。PEG是一种能够促进原生质体吸收外源DNA的化学诱导剂，在高pH情况下，PEG通过电荷间相互作用与外源DNA形成紧密的复合物，受体细胞通过内吞作用吸收这些复合物到细胞内，随后进入细胞核并整合到受体基因组中。利用菌落PCR试剂盒(Plant Direct PCR kit，Thermo Secientific)扩增跨同源臂的区域(图2，引物1和2)，筛选阳性克隆。再获得阳性敲除突变子后，光照培养至产孢子，再通过单孢分离纯化突变子，极大缩短筛选周期，简化操作流程。

基因打靶通过同源重组实现；随机插入或异位整合和基因过量表达通过非同源性末端接合完成。在转化过程中，HR和NHEJ都比较活跃，但在在丝状真菌中，NHEJ效率比HR效率高出很多，直接导致基因敲除中脱靶，得到较多的假阳性。在敲除哈茨木霉基因中，同源重组效率约为较低，脱靶概率较高，目前国际上也鲜有哈茨木霉基因的敲除案例。本发明通过建立一套完整的哈茨木霉基因敲除方法，同源同组效率达到20％；同时结果菌落PCR技术，极大缩短获得阳性转化子的周期，高效敲除靶标基因。

附图说明

图1.体外重组构建敲除载体示意图

图2.基因敲除和突变子筛选策略的示意图

注：hyg：潮霉素B抗性基因

图3.PCR筛选SQR-T037的hfb4缺失突变子(P1)

注：泳道1：1kb Marker，泳道2：SQR-T037野生型扩增P1；泳道3-17：突变子中扩增P1

图4.PCR筛选SQR-T037的hfb4缺失突变子(P2)

注：泳道1：1kb Marker，泳道2：SQR-T037野生型中扩增P2；泳道3-17：突变子中扩增P2

图5.图4.PCR筛选CBS 226.95的hfb10缺失突变子

注：泳道1：1kb Marker，泳道2：CBS 226.95中扩增P1；泳道3-7：转化子中扩增P1；泳道10：CBS 226.95野生型扩增P2；泳道11-15：转化子中扩增P2

图6.SQR-T037Δhfb4突变子与CBS 226.95Δhfb10突变子P验证

注：泳道1：DL 2000Marker；泳道2：CBS 226.95野生型扩增P3；泳道3：纯化后CBS226.95Δhfb10扩增P3；泳道6：SQR-T037野生型扩增P3；泳道7-10：纯化后SQR-T037Δhfb4扩增P3

生物材料保藏信息

SQR-T037，分类命名为哈茨木霉Trichoderma harzianum，保藏日期是2009年9月22日，保藏地址为北京市朝阳区大屯路中国科学院微生物研究所，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.3308。

具体实施方式

下面结合具体实施案例进一步阐述本发明。列举的实施案例仅用于举例说明本发明的实施方法，不用于限制本发明的使用范围。凡未注明具体实施条件的，均为按照本领域技术人员熟知的常规条件进行。

LB培养基：10g蛋白胨，5g酵母粉，10g NaCl溶于1000mL去离子水中，高温灭菌；

PDA培养基：39g Potato Dextrose Agar(Difco Laboratories,Detroit)溶于1000mL水中，12l℃高压蒸气灭菌20min；

PDA蔗糖培养基：500mL水中，加19.5g PDA粉末，171.15g蔗糖，高温灭菌；

溶液A(200mL)：1.2M sorbitol，0.1M KH₂PO₄，pH 5.6；

溶液B(100mL)：1Msorbitol，50mM CaCl₂，10mM TrisHCl，pH 7.5；

PEG溶液(100mL)：25％PEG6000，50mM CaCl₂、10mM TrisHCl，pH 7.5。

实施例1哈茨木霉恐水性蛋白基因敲除

1.木霉菌株：木霉Trichoderma harzianum SQR-T037(CGMCC No.3308)和Trichoderma harzianum CBS 226.95(联合基因研究所Joint Genome Institute(JGI)，CBS 226.95)。

2.敲除载体构建及敲除片段的扩增(2天)

转录组学分别分析木霉SQR-T037和CBS 226.95拮抗病原真菌尖孢镰刀菌(Foc4)，SQR-T037中恐水性蛋白hfb4和CBS 226.95中hfb10的转录水平显著提高。通过基因敲除构建突变子，分析恐水性蛋白在木霉拮抗病原真菌的功能。

分别扩增目标基因(SQR-T037中hfb4(SEQ ID NO.1)和CBS 226.95中hfb10(SEQID NO.2))的5’和3’同源臂引物：

以SQR-T037基因组DNA为模板，引物hfb4_5F：gacggccagtgaattcttggagtagggatgggacga(SEQ ID NO.3)和hfb4_5R：tctcggatcctagaggttgggagatgctgttg(SEQ ID NO.4)扩增SQR-T037中基因hfb4的上游臂；引物hfb4_hygF：ccaacctctaggatccgagagctaccttacatc(SEQ ID NO.5)和hfb4_hygR：ttcaccatcactcgagggtactatggcttagatg(SEQ ID NO.6)从质粒pPcdna1-cel7b(SEQ ID NO.27)扩增潮霉素抗性基因；引物hfb4_3F：taccctcgag tgatggtgaatgagttgttgcac(SEQ ID NO.7)和引物hfb4_3R：tgattacgccaagctt ggttcatgggtcagggtggt(SEQ ID NO.8)扩增hfb4的下游臂，纯化后备用。BamH1酶切载体pUC19获得线性载体，1％琼脂糖凝胶电泳后切胶回收。利用体外重组酶技术(II One Step Cloning Kit(南京诺唯赞生物科技有限公司))，反应体系：4μL 5×CE buffer，2μL Exnase^TM II，1μL线性载体(0.06pmol)，1μL PCR片段(0.03pmol)和10μL去离子水；37℃反应30分钟后冰浴；将酶反应产物导入大肠杆菌DH5α感受态细胞中，蓝白斑筛选，挑取白斑接入含Amp的LB液体培养基中37℃，170rpm培养14-16h，用质粒提取试剂盒(Axygen)提取质粒，引物hfb4_5F和hfb4_3R扩增hfb4敲除片段，1％琼脂糖凝胶电泳验证阳性克隆；使用高保真酶(Phusion High-fidelity DNA polymerase，New England Biolabs)，以重组质粒为模板，引物hfb4_5F和hfb4_3R扩增制备敲除片段，纯化后PCR片段浓度达到500ng/μL。

构建敲除CBS 226.95的基因hfb10的片段，利用引物hfb10_5F：gacggccagtgaattcacgagaagcggataggatg(SEQ ID NO.9)和hfb10_5R：tctcggatccttcctccttcattgcctcc(SEQ ID NO.10)高保真酶(Phusion high-fidelity DNApolymerase，New England Biolabs)PCR扩增木霉CBS 226.95中基因hfb10的上游臂；以pPcdna1-cel7b为模板，引物hfb10_hygF：gaaggaggaaggatccgagagctaccttac(seq idno.11)和hfb10_hygr：atttagtcatctcgagggtactatggctta(seq id no.12)扩增潮霉素抗性基因；引物hfb10_3f：taccctcgagatgactaaatgccctcctc(seq id no.13)和引物hfb10_3r：tgattacgccaagcttttatcaccgtatccgcaa(SEQ ID NO.14)扩增CBS 226.95中基因hfb10的下游臂。酶切及转化同上。以构建的敲除hfb10目标基因的质粒为模板，hfb10_5F和hfb10_3R扩增hfb4敲除片段，纯化后PCR片段浓度达到500ng/μL。

3原生质体与突变子筛选

SQR-T037和CBS 226.95原生质体的制备流程同操作流程2.2，200μL 4742原生质体悬浮液、10μL纯化PCR产物、50μL PEG用枪头混匀，冰上放置20min；加2mL PEG，轻轻混匀，常温下放置5min；加2mL溶液B，轻轻混匀；将2mL混合液涂布在覆盖层析纸(Whatman)的含1M蔗糖PDA平板上，层析纸预先剪成条形；28℃避光培养24h；

转化后，获得NJAU4742的转化子15株。引物hfb4_P1F：gaatcgtgttggtccgctaa(seqid no.15)和hfb4_p1r：gaacagaagccgcatcgtc(seq id no.16)扩增片段p1，引物hfb4_p2f：ctggcaaactgtgatggacg(seq id no.17)和hfb4_p2r：cattcggcagtggatggagt(seq idno.18)扩增p2，直接筛选阳性转化子。如图3和4所示，筛选出4株阳性转化子。稀释梯度法进行单孢分离，纯化突变子，获得稳定遗传敲除突变子。引物hfb4_p3f：atgaagttcctcactgttgccg(seq id no.19)和hfb4_p3r5：gcctgcaagatcgttagtatcaat(seqid no.20)扩增p3片段，验证成功获得4株hfb4缺失菌株(图6)，确定得到阳性转化子的效率为26.6％。

peg-cacl₂转化cbs 226.95获得5株转化子，培养2天后，引物hfb10_p1f：accctctccataccactttcg(seq id no.21)和hfb10_p1r：gcggtgagttcaggctttt(seq idno.22)扩增p1，引物hfb10_p2f：tgcaagacctgcctgaaac(seq id no.23)和hfb10_p2r：cactcctgatccaattgcca(seq id no.24)扩增p2，筛选阳性转化子。如图5所示，筛选出1株阳性转化子。稀释梯度法进行单孢分离，纯化突变子，获得稳定遗传敲除突变子。引物hfb10_p3f：gatgcccaggtggtcttact(seq id no.25)和hfb10_p3r5：ccggcctagatacaagagc(seq idno.26)扩增p3片段，验证成功敲除cbs 226.95菌株中目标基因hfb10(图6)，确定得到阳性转化子的效率为20％。

序列表

<110> 南京农业大学

<120> 一种哈茨木霉菌基因敲除方法

<160> 27

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 532

<212> DNA

<213> 哈茨木霉SQR-T037(Trichoderma harzianum SQR-T037)

<400> 1

ttaggcgcca gggacacctt ggcaaaggag gtcttggccg gcctgcaaga tcgttagtat 60

caataaagtg aagagaattt gtcttcgtaa aagtcactta caacggggag aacacagcaa 120

actgcctgct tgcctgtagt agcacagccg tttttgaaag cggagggact ttggacagag 180

gtagctatac ttttgtaagc atcaaagagt ttcaaattga aggcaaagca gtagacttac 240

gagtgctaca gtcgagtcca acaatgccaa gaacgagggt agagcagcat tgggggttgc 300

tatagaggcc cgcggggcat accgcgccgc cgctggtgtt gccgttgcca ttaccgttac 360

catgaccgtt gccgttacca ttgccattgc cattgccatt gccattgcca cctgcaggca 420

gggtatagct aggaggagga ggggcatagg taggaggagg aggagggggg tagttgcctg 480

gggcggcgag gacagcagtg aagaagacgg cggcaacagt gaggaacttc at 532

<210> 2

<211> 422

<212> DNA

<213> 哈茨木霉 CBS 226.95(Trichoderma harzianum CBS 226.95)

<400> 2

atgaagttct tcgccgtcgc cgctctcttc gtcgccagcg ccatggccag cccaatgggc 60

agcgaaggat gcccaggtgg tcttactaac accgttccgc tctgctgtgc caccaacgtc 120

ctcggcgtcg cgaccctcga ttgcagcacc cgtaagtctc tatccccacc ttgggaagtc 180

acggtgatga tttgtagcta acttgtatac ggcagccact gttccggtac ccaatgtcgg 240

catcttccag gcccactgtg cttccaaggg caaacagcct gtctgctgca ctgttcccgt 300

tgtaagtgta cctccagagc gagacgaagg gaaaaaaaaa atcccgttac agctgctaat 360

tgcgctcttg tatctaggcc ggcctgggcc tcctttgcca gaagcccact ggagcccagt 420

ag 422

<210> 4

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gacggccagt gaattcttgg agtagggatg ggacga 36

<210> 5

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

tctcggatcc tagaggttgg gagatgctgt tg 32

<210> 6

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ccaacctcta ggatccgaga gctaccttac atc 33

<210> 7

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

ttcaccatca ctcgagggta ctatggctta gatg 34

<210> 8

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

taccctcgag tgatggtgaa tgagttgttg cac 33

<210> 9

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

tgattacgcc aagcttggtt catgggtcag ggtggt 36

<210> 10

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

gacggccagt gaattcacga gaagcggata ggatg 35

<210> 11

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

tctcggatcc ttcctccttc attgcctcc 29

<210> 12

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

gaaggaggaa ggatccgaga gctaccttac 30

<210> 13

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

atttagtcat ctcgagggta ctatggctta 30

<210> 14

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

taccctcgag atgactaaat gccctcctc 29

<210> 15

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

tgattacgcc aagcttttat caccgtatcc gcaa 34

<210> 16

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

gaatcgtgtt ggtccgctaa 20

<210> 17

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

gaacagaagc cgcatcgtc 19

<210> 18

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

ctggcaaact gtgatggacg 20

<210> 19

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

cattcggcag tggatggagt 20

<210> 20

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

atgaagttcc tcactgttgc cg 22

<210> 21

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

gcctgcaaga tcgttagtat caat 24

<210> 22

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

accctctcca taccactttc g 21

<210> 23

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

gcggtgagtt caggctttt 19

<210> 24

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 24

tgcaagacct gcctgaaac 19

<210> 25

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 25

cactcctgat ccaattgcca 20

<210> 26

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 26

gatgcccagg tggtcttact 20

<210> 27

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 27

ccggcctaga tacaagagc 19

<210> 3

<211> 5964

<212> DNA

<213> 质粒ppcdna1-cel7b(ppcdna1-cel7b)

<400> 3

tcgcgcgttt cggtgatgac ggtgaaaacc tctgacacat gcagctcccg gagacggtca 60

cagcttgtct gtaagcggat gccgggagca gacaagcccg tcagggcgcg tcagcgggtg 120

ttggcgggtg tcggggctgg cttaactatg cggcatcaga gcagattgta ctgagagtgc 180

accatatgcg gtgtgaaata ccgcacagat gcgtaaggag aaaataccgc atcaggcgcc 240

attcgccatt caggctgcgc aactgttggg aagggcgatc ggtgcgggcc tcttcgctat 300

tacgccagct ggcgaaaggg ggatgtgctg caaggcgatt aagttgggta acgccagggt 360

tttcccagtc acgacgttgt aaaacgacgg ccagtgaatt cgagctcggt acccggggat 420

ccgagagcta ccttacatca atatggccag cacctcttcg gcgatacata ctcgccaccc 480

cagccggggc gattgtgtgt actaggtagg ctcgtactat accagcagga gaggtgctgc 540

ttggcaatcg tgctcagctg ttaggttgta cttgtatggt acttgtaagg tggtcatgca 600

gttgctaagg tacctaggga gggattcaac gagccctgct tccaatgtcc atctggatag 660

gatggcggct ggcggggccg aagctgggaa ctcgccaaca gtcatatgta atagctcaag 720

ttgatgatac cgttttgcca ggattaggat gcgagaagca gcatgaatgt cgctcatccg 780

atgccgcatc accgttgtgt cagaaacgac caagctaagc aactaaggta ccttaccgtc 840

cactatctca ggtaaccagg tactaccagc taccctacct gccgtgccta cctgctttag 900

tattaatctt tccacctccc tcctcaatct tcttttccct cctctcctct tttttttttc 960

ttcctcctct tcttctccat aaccattcct aacaacatcg acattctctc ctaatcacca 1020

gcctcgcaaa tcctcaggtt agtattacta ctactacaat catcaccacg atgctccgcc 1080

cgacgatgcg gcttctgttc gcctgcccct cctctcactc gtgcccttga cgagctaccc 1140

cgccagactc tcctgcgtca ccaatttttt tccctattta cccctcctcc ctctctccct 1200

ctcgtttctt cctaacaaac aaccaccacc aaaatctctt tggaagctca cgactcacgc 1260

aagctcaatt cgcagataca aatctagaat gaaaaagcct gaactcaccg cgacgtctgt 1320

cgagaagttt ctgatcgaaa agttcgacag cgtctccgac ctgatgcagc tctcggaggg 1380

cgaagaatct cgtgctttca gcttcgatgt aggagggcgt ggatatgtcc tgcgggtaaa 1440

tagctgcgcc gatggtttct acaaagatcg ttatgtttat cggcactttg catcggccgc 1500

gctcccgatt ccggaagtgc ttgacattgg ggaattcagc gagagcctga cctattgcat 1560

ctcccgccgt gcacagggtg tcacgttgca agacctgcct gaaaccgaac tgcccgctgt 1620

tctgcagccg gtcgcggagg ccatggatgc gatcgctgcg gccgatctta gccagacgag 1680

cgggttcggc ccattcggac cgcaaggaat cggtcaatac actacatggc gtgatttcat 1740

atgcgcgatt gctgatcccc atgtgtatca ctggcaaact gtgatggacg acaccgtcag 1800

tgcgtccgtc gcgcaggctc tcgatgagct gatgctttgg gccgaggact gccccgaagt 1860

ccggcacctc gtgcacgcgg atttcggctc caacaatgtc ctgacggaca atggccgcat 1920

aacagcggtc attgactgga gcgaggcgat gttcggggat tcccaatacg aggtcgccaa 1980

catcttcttc tggaggccgt ggttggcttg tatggagcag cagacgcgct acttcgagcg 2040

gaggcatccg gagcttgcag gatcgccgcg gctccgggcg tatatgctcc gcattggtct 2100

tgaccaactc tatcagagct tggttgacgg caatttcgat gatgcagctt gggcgcaggg 2160

tcgatgcgac gcaatcgtcc gatccggagc cgggactgtc gggcgtacac aaatcgcccg 2220

cagaagcgcg gccgtctgga ccgatggctg tgtagaagta ctcgccgata gtggaaaccg 2280

acgccccagc actcgtccga gggcaaagga ataatgcatg tgctgtgttc ctcagaatgg 2340

gccccagaag ggcgtcgagc attgtctatg aatgcaaaca aaaatagtaa ataaatagta 2400

attctggcca tgacgaatag agccaatctg ctccacttga ctatccttgt gactgtatcg 2460

tatgtcgaac ccttgactgc ccattcaaac aattgtaaag gaatatgagc tacaagttat 2520

gtctcacgtt tgcgtgcgag cccgtttgta cgttattttg agaaagcgtt gccatcacat 2580

gctcacagtc acttggctta cgatcatgtt tgcgatcttt cggtaagaat acacagagta 2640

acgattatac atccatcgct ttctatgatt aggtactcag acaacacatg ggaaacaaga 2700

taaccatcgc atgcaaggtc gattccaatc atgatctgga ctggggtatt ccatctaagc 2760

catagtaccc tcgagcagac aatgatggta gcagcgcatg gaagaacccg gttgttcgga 2820

atgtccttgt gctaacagtg gcatgatttt acgttgcggc tcatctcgcc ttggcaccgg 2880

acctcagcaa atcttgtcac aacagcaatc tcaaacagcc tcatggttcc cagattccct 2940

gattcagaac tctagagcgg cagatgtcaa acgattctga cctagtacct tgagcatccc 3000

tttcggatcc ggcccatgtt ctgcctgccc ttctgagcac agcaaacagc ccaaaaggcg 3060

ccggccgatt cctttcccgg gatgctccgg agtggcacca cctcccaaaa caagcaacct 3120

tgaacccccc ccccaaatca actgaagcgc tcttcgccta accagcataa gcccccccca 3180

ggatcgttag gccaagtggt agggccagcc aattagcgag cggccatttg gaggtcatgg 3240

gcgcagaatg tcctgacagt ggtatgatat tgactgcccg gtgtgtgtgg catctggcca 3300

taatcgcagg ctgaggcgag gaagtctcgt gaggatgtcc cgactttgac atcatgaggg 3360

agtgagaaac tgaagagaag gaaagcttcg aaggttcgat aagggatgat ttgcatggcg 3420

ggcgacagga tgcgatggct cgttgggata cataatgctt gggttggaag cgattccagg 3480

tcgtcttttt ttggttcatc atcacagcat caacaagcaa cgatacaagc aatccactga 3540

ggattacctc tcaactcaac cactttccaa accatctcaa ctccctaaga ttctttcagt 3600

gtattatcac taggattttt cccaagccgg cttcaaaaca cacagataaa ccaccaactc 3660

tacaaccaaa gactttttga tcaatccaac aacttctctc atcgatgtcg acctgcaggc 3720

atgcaagctt ggcgtaatca tggtcatagc tgtttcctgt gtgaaattgt tatccgctca 3780

caattccaca caacatacga gccggaagca taaagtgtaa agcctggggt gcctaatgag 3840

tgagctaact cacattaatt gcgttgcgct cactgcccgc tttccagtcg ggaaacctgt 3900

cgtgccagct gcattaatga atcggccaac gcgcggggag aggcggtttg cgtattgggc 3960

gctcttccgc ttcctcgctc actgactcgc tgcgctcggt cgttcggctg cggcgagcgg 4020

tatcagctca ctcaaaggcg gtaatacggt tatccacaga atcaggggat aacgcaggaa 4080

agaacatgtg agcaaaaggc cagcaaaagg ccaggaaccg taaaaaggcc gcgttgctgg 4140

cgtttttcca taggctccgc ccccctgacg agcatcacaa aaatcgacgc tcaagtcaga 4200

ggtggcgaaa cccgacagga ctataaagat accaggcgtt tccccctgga agctccctcg 4260

tgcgctctcc tgttccgacc ctgccgctta ccggatacct gtccgccttt ctcccttcgg 4320

gaagcgtggc gctttctcat agctcacgct gtaggtatct cagttcggtg taggtcgttc 4380

gctccaagct gggctgtgtg cacgaacccc ccgttcagcc cgaccgctgc gccttatccg 4440

gtaactatcg tcttgagtcc aacccggtaa gacacgactt atcgccactg gcagcagcca 4500

ctggtaacag gattagcaga gcgaggtatg taggcggtgc tacagagttc ttgaagtggt 4560

ggcctaacta cggctacact agaaggacag tatttggtat ctgcgctctg ctgaagccag 4620

ttaccttcgg aaaaagagtt ggtagctctt gatccggcaa acaaaccacc gctggtagcg 4680

gtggtttttt tgtttgcaag cagcagatta cgcgcagaaa aaaaggatct caagaagatc 4740

ctttgatctt ttctacgggg tctgacgctc agtggaacga aaactcacgt taagggattt 4800

tggtcatgag attatcaaaa aggatcttca cctagatcct tttaaattaa aaatgaagtt 4860

ttaaatcaat ctaaagtata tatgagtaaa cttggtctga cagttaccaa tgcttaatca 4920

gtgaggcacc tatctcagcg atctgtctat ttcgttcatc catagttgcc tgactccccg 4980

tcgtgtagat aactacgata cgggagggct taccatctgg ccccagtgct gcaatgatac 5040

cgcgagaccc acgctcaccg gctccagatt tatcagcaat aaaccagcca gccggaaggg 5100

ccgagcgcag aagtggtcct gcaactttat ccgcctccat ccagtctatt aattgttgcc 5160

gggaagctag agtaagtagt tcgccagtta atagtttgcg caacgttgtt gccattgcta 5220

caggcatcgt ggtgtcacgc tcgtcgtttg gtatggcttc attcagctcc ggttcccaac 5280

gatcaaggcg agttacatga tcccccatgt tgtgcaaaaa agcggttagc tccttcggtc 5340

ctccgatcgt tgtcagaagt aagttggccg cagtgttatc actcatggtt atggcagcac 5400

tgcataattc tcttactgtc atgccatccg taagatgctt ttctgtgact ggtgagtact 5460

caaccaagtc attctgagaa tagtgtatgc ggcgaccgag ttgctcttgc ccggcgtcaa 5520

tacgggataa taccgcgcca catagcagaa ctttaaaagt gctcatcatt ggaaaacgtt 5580

cttcggggcg aaaactctca aggatcttac cgctgttgag atccagttcg atgtaaccca 5640

ctcgtgcacc caactgatct tcagcatctt ttactttcac cagcgtttct gggtgagcaa 5700

aaacaggaag gcaaaatgcc gcaaaaaagg gaataagggc gacacggaaa tgttgaatac 5760

tcatactctt cctttttcaa tattattgaa gcatttatca gggttattgt ctcatgagcg 5820

gatacatatt tgaatgtatt tagaaaaata aacaaatagg ggttccgcgc acatttcccc 5880

gaaaagtgcc acctgacgtc taagaaacca ttattatcat gacattaacc tataaaaata 5940

ggcgtatcac gaggcccttt cgtc 5964

Claims

1.一种哈茨木霉基因敲除方法，其特征在于包括:（1）构建敲除基因片段:

以木霉基因组DNA为模板，分别PCR扩增目标基因约1200 bp的5’和3’端同源臂，以引物Hyg-F和Hyg-R扩增潮霉素抗性基因，Hyg-F与扩增5’同源臂的反向引物设置16 bp的重叠区域；Hyg-R与扩增3’同源臂的正向引物设置16 bp的重叠区域；BamHI 酶切载体pUC19，利用一步法无缝克隆试剂盒对5’端同源臂、潮霉素抗性基因、3’端同源臂和pUC19线性载体进行体外重组并转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，用5’同源臂的上游引物5F和3’同源臂的下游引物3R扩增敲除片段验证阳性克隆；引物5F和3R进行PCR扩增大量制备敲除片段，纯化敲除片段使敲除片段浓度达到500 ng/μL；

（2）PEG-CaCl₂原生质体转化:PEG-CaCl₂原生质体转化包括：制备哈茨木霉原生质体；将哈茨木霉原生质体悬浮液、纯化敲除片段、PEG溶液；用枪头混匀；加PEG溶液，轻轻混匀，常温下放置；加溶液B，轻轻混匀；将混合液涂布在覆盖层析纸的含1 M蔗糖PDA平板上，层析纸预先剪成条形；28℃避光培养24 h；将条形层析纸片转到含抗生素的PDA平板上，28℃，避光培养30-36 h，待条形层析纸边缘长出菌落后，挑取菌落，转接至新鲜的抗生素平板上，培养2天；其中所述的溶液B配方为：1 Msorbitol，50 mM CaCl₂，10 mM TrisHCl，pH 7.5；所述的PEG溶液配方为：25% PEG6000，50 mM CaCl₂、10 mM TrisHCl，pH 7.5；

（3）菌落PCR筛选阳性突变子: 直接刮取少量哈次木霉菌丝体，裂解后离心，利用菌落PCR试剂盒共同筛选阳性突变转化子；其中使用的引物1以5’端同源臂的上游序列设置正向引物，潮霉素基因序列设置反向引物，跨5’端同源序列扩增片段；引物2以潮霉素基因序列设置正向引物，3’端下游序列设置反向引物，跨3’端同源序列扩增片段。

2.根据权利要求1所述的哈茨木霉基因敲除方法，其特征在于所述的PEG-CaCl₂原生质体转化包括：制备哈茨木霉原生质体；冰上放置15 mL离心管，分别加200 μL哈茨木霉原生质体悬浮液、10 μL纯化敲除片段、50 μL PEG溶液；用枪头混匀，冰上放置20 min；加2 mLPEG溶液，轻轻混匀，常温下放置5 min；加2 mL溶液B，轻轻混匀；将2 mL混合液涂布在覆盖层析纸的含1 M蔗糖PDA平板上，层析纸预先剪成条形；28℃避光培养24 h；将条形层析纸片转到含抗生素的PDA平板上，28℃，避光培养36 h，待条形层析纸边缘长出菌落后，挑取菌落，转接至新鲜的抗生素平板上，培养2天。

3.根据权利要求1或2所述的哈茨木霉基因敲除方法，其特征在于所述的制备原生质体的方法为：接种哈茨木霉于PDA平板，28℃培养10天后，产生大量新鲜分生孢子；用10 mL 生理盐水洗涤菌丝表面，经玻璃绒过滤，去除菌丝体，得到孢子悬液；在玻璃纸覆盖的PDA平板上，取200 μL孢子悬液涂布，28℃，避光培养16-20 h直至孢子萌发；取玻璃纸，用溶解酶溶液洗涤玻璃纸，收集萌发的孢子；28℃，100 rpm培养萌发的孢子悬液90 min；预冷离心机和转子，准备装有玻璃绒的离心管；90 min后，萌发的孢子悬液经装有玻璃绒的离心管过滤，除去菌丝，用溶液A冲洗，终悬液体积控制在20-30 mL；4℃、2000 rpm离心10 min，去上清；加20 mL溶液A，再次离心，去上清；加1 mL 溶液 B，冰上得到原生质体；用血球板观察、计数，稀释原生质体至10⁸个/mL；所述的溶液A配方为：1.2 M sorbitol，0.1 M KH₂PO₄，pH5.6；所述的溶液B配方为：1 Msorbitol，50 mM CaCl₂，10 mM TrisHCl，pH 7.5；所述的溶解酶溶液的配方为：0.15 g溶解酶溶于20 mL 溶液A，0.2 μm滤膜过滤除菌；所述的生理盐水为0.8-0.9 % NaCl加 0.05% Tween。

4.根据权利要求1所述的哈茨木霉基因敲除方法，其特征在于在获得阳性敲除突变子后，光照培养至产孢子，再通过单孢分离纯化突变子。