CN109234318B - 一种提高红曲霉菌胞外色素的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种提高红曲胞外色素的方法，该方法是将红曲霉菌中编码麦角甾醇合成途径上甾醇还原酶ERG4/ERG24家族蛋白的基因敲除。本发明通过农杆菌介导转化技术敲除红曲霉菌中编码ERG4/ERG24基因。本发明从植物双元质粒pCAMBIA1300载体出发，通过根癌农杆菌EHA105介导将重组质粒转化至红曲霉菌中，显著提高了胞外色素生产水平，结果表明该重组菌株具有较好的传代稳定性。液态发酵结果显示，亲本菌株胞外红曲色素为4.92U/mL，本发明构建的重组菌株胞外红曲色素达6.52U/mL，胞外色素生产量提高32.52％，说明通过本发明的方法能够显著提高红曲胞外色素的产量。

Description

一种提高红曲霉菌胞外色素的方法

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种提高红曲霉菌胞外色素的方法。

背景技术

红曲霉菌，作为一种丝状真菌，属于真菌界、子囊菌门、子囊菌纲、散囊菌目、红曲科。红曲色素是由红曲霉菌次级代谢产生的一系列聚酮类化合物的天然色素，在中国、韩国和日本一直被作为食品添加剂广泛应用于饮料、酱、食用油、面包、糕点等领域，已有上千年的历史。同时，由于红曲色素还具有广泛的生物活性如调节血脂、降血压、防血管硬化、抗糖尿病、抑制肥胖、抗炎症、抗过敏、防过氧化、抗癌、抗细菌、抗真菌等，它在医生保健产品开发和医疗领域的应用也逐渐受到重视。

目前食品中所用的红曲色素一般为混合色素，主要分为红、橙、黄三大类。由于红曲霉固液态发酵产生的红曲色素主要是胞内色素，为醇溶性色素，由红曲霉在发酵过程中直接合成，占红曲霉产生的红曲色素总量的70％～80％。而胞外色素主要为水溶性色素，是红曲霉自身合成的色素与发酵液中氨基酸等物质结合形成的，占红曲霉产生的红曲色素总量的20～30％。胞内色素易溶于乙醇、丙酮等极性较大的溶剂，都是非水溶性的色素。采用乙醇、丙酮等极性比较大的溶剂对胞内色素进行浸提萃取，会造成浸提不彻底且浸提之后回收难度较大，工艺复杂且成本较高，因此在食品应用方面受到一定的限制。由此可见，提高红曲霉胞外色素的产量，将是红曲色素产业化必须解决的关键问题之一。

发明内容

本发明需要解决的技术问题是，提供一种提高红曲胞外色素的方法以解决现有技术中常规培养红曲霉产红曲胞外色素产量较低的技术问题。

为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：

一种提高红曲胞外色素的方法，该方法是红曲霉菌中编码麦角甾醇合成途径上甾醇还原酶ERG4/ERG24基因敲除，使该基因在红曲霉菌中不能正常表达；并利用植物双元质粒pCAMBIA1300载体，通过根癌农杆菌EHA105介导将重组质粒转化至红曲霉菌中，构建得到了红曲胞外色素高产菌株。

其中，所述的红曲霉菌为紫色红曲霉菌(Monascus purpureus)，所述编码ERG4/ERG24还原酶基因为Monascus_07017，其核苷酸序列如SEQ ID No：1所示。

其中，所述将紫色红曲霉菌中编码麦角甾醇还原酶ERG4/ERG24基因敲除，是利用农杆菌EHA105介导转化技术敲除紫色红曲霉菌中编码甾醇还原酶ERG4/ERG24基因。

其中，农杆菌EHA105介导转化技术敲除紫色红曲霉菌中编码甾醇还原酶 ERG4/ERG24基因，包括如下步骤：

作为优选，上述的通过农杆菌介导转化法基因敲除技术使编码ERG4/ERG24还原酶基因缺失，包括如下步骤：

(1)利用软件分析SEQ ID No：1所示的序列；

(2)以紫色红曲霉菌的cDNA为模板，以7017-up-osc-F(序列为SEQ ID No：2)、7017-up-osc-R(序列为SEQ ID No：3)为一对引物和7017-dn-osc-F(序列为SEQ ID No：4)、7017-dn-osc-R(序列为SEQ ID No：5)为一对引物分别进行PCR扩增得到 Monascus_07017基因的5’和3’同源臂片段；

(3)以质粒pXS(武汉大学刘天罡教授课题组赠送，SEQ ID No：12)为模板，以G418-osc-F(序列为SEQ ID No：6)、G418-osc-R(序列为SEQ ID No：7)为一对引物进行PCR扩增得到G418基因片段。

(4)采用Overlap PCR技术，以Monascus_07017基因的5’、3’同源臂片段以及 G418基因片段为模板，以7017-up-osc-F和7017-dn-osc-R为一对引物进行PCR扩增得到△7017目的片段。

(5)用EcoR I和SaI I双酶切双元表达载体pCAMBIA1300，利用一步克隆技术连接线性化的双元表达载体pCAMBIA1300与△7017目的片段，即得到双元质粒表达载体为pCAMBIA1300-△7017。

(6)根癌农杆菌EHA105介导双元质粒表达载体pCAMBIA1300-△7017，转化至紫色红曲霉菌中，筛选阳性克隆，即得到所述红曲胞外色素高产菌株。

作为优选，所述的紫色红曲霉菌株为紫色红曲霉Monascuspurpureus LQ-6(该菌株已在国家知识产权局指定的保藏单位保藏，保藏日期为2018年09月07日，保藏单位名称是中国典型保藏中心，保藏编号是CCTCC M 2018600)，保藏地址为：湖北省武汉市武昌区八一路299号，具体包括以下操作：先制备根癌农杆菌EHA105的感受态细胞，再通过液氮冻融法将所述双元质粒表达载体 pCAMBIA1300-△7017导入根癌农杆菌EHA105，随后将含有双元质粒表达载体 pCAMBIA1300-△7017的农杆菌转化至紫色红曲霉菌株中，在筛选阳性克隆，即得到所述红曲胞外色素高产菌株。

作为优选，所述制备根癌农杆菌EHA105的感受态细胞，主要包括以下步骤：将根癌农杆菌EHA105接种于5～10mL含有50mg/L利福平的YEB液体培养基中，以温度 28℃、转速200rpm的条件培养约24～48h至对数生长期；取500μL活化的菌液接种于 20mL含有50mg/L利福平的YEB液体培养基中，以温度28℃、转速200rpm的条件培养至菌液OD₆₀₀＝0.5；将菌液冰浴30min后，在4℃条件下以5000rpm的转速离心5 min，弃上清，收集菌体；用50mmol/LCaCl₂洗涤菌体两次，再重悬于2mL 50mmol/L CaCl₂中。

作为优选，所述通过液氮冻融法将所述双元质粒表达载体pCAMBIA1300-△7017导入根癌农杆菌EHA105，包括以下步骤：取2ug所述双元质粒表达载体pCAMBIA1300- △7017加入到200μL的根癌农杆菌EHA105感受态细胞中，混匀后冰浴30min；液氮中速冻1min，后用37℃金属浴保温3min；加入800uL的YEB液体培养基，28℃培养 3h；室温下以5000rpm的转速离心5min，浓缩菌体；取200μL浓缩后的菌液涂布于含有50μg/mL利福平、50μg/mL卡那霉素的YEB选择性培养基平板上，28℃倒置培养 48h；挑选转化子于YEB液体培养基中培养，并用引物对克隆子进行筛选，得到阳性克隆子，即为含有双元质粒表达载体pCAMBIA1300-△7017的根癌农杆菌EHA105。

作为优选，所述含有双元表达载体pCAMBIA1300-△7017的根癌农杆菌EHA105 转化至紫色红曲霉菌M.purpureus LQ-6(CCTCC M 2018600)中，包括以下步骤：

(1)将红曲菌接种到PDA斜培养基，30℃培养7d，用无菌水从斜面上洗下红曲菌孢子，通过两层无菌擦镜纸过滤，调节孢子浓度；

(2)取含有双元质粒表达载体pCAMBIA1300-△7017的根癌农杆菌EHA105，接种于3mL含50μg/mL利福平，50μg/mL卡那霉素的YEB液体培养基中，28℃，220rpm 培养12～24h，取250μL的菌液于50mL MM培养基中，在相同条件下培养2d，测培养基中农杆菌的浓度，并用IM培养基稀释菌液至OD₆₀₀值为0.15。在相同条件下，培养6h，得农杆菌液备用。

(3)将以上所得的紫色红曲霉孢子液和含有双元质粒表达载体pCAMBIA1300-△7017的根癌农杆菌EHA105菌液，混合涂布于铺有玻璃纸的含200μmol/L乙酰丁香酮的Co-IM诱导培养基平板上，30℃共培养。

作为优选，所述筛选阳性克隆，包括以下步骤：

共培养4d后将玻璃纸揭起放入空的无菌培养皿中，然后倒入约含有50μg/mL G418和500μg/mL头孢霉素的PDA培养基，25℃培养，从第2天开始观察，将长出的菌落挑至含50μg/mL G418的PDA培养基上，30℃培养7d。如果在培养基上仍然能生长，即推定为转化子，并将之接种到PDB液体培养基中培养，按照SDS裂解法提取丝状真菌总DNA进行分子分析，以提取基因组为模板，用两对引物7017-T-F(序列为SEQ ID No：8)和7017-T-R(SEQ ID No：9)、G418-T-F(SEQ ID No：10)和7017-half-R(SEQ ID No：11)进行PCR验证，选取阳性菌株。

在以上技术方案中，所述植物双元质粒pCAMBIA1300、根癌农杆菌EHA105，均属于常规商品化生物材料，可自市面购得，紫色红曲霉M.purpureus LQ-6实验室自然筛选得到。

在以上技术方案中，所述YEB培养基的配方如下：5g/L牛肉膏，5g/L蛋白胨，5g/L蔗糖，4g/L七水硫酸镁，1g/L酵母粉，pH 7.4；若为固体培养基则另加2％的琼脂粉。

所述PDA培养基的配方如下：马铃薯(去皮)200g、葡萄糖20g、琼脂20g、蒸馏水1000mL，pH自然。

所述MM培养基的配方如下：2g/L葡萄糖，2.05g/L K₂HPO₄，1.45g/L KH₂PO₄， 0.5g/L(NH₄)₂SO₄，0.01g/L CaCl₂，使用前每毫升培养基加入0.1％FeSO₄1μL，50mg/mL 卡那霉素1μL。

所述IM培养基的配方如下：2g/L葡萄糖，2.05g/LK₂HPO₄，1.45g/L KH₂PO₄，0.5g/L(NH₄)₂SO₄，0.01g/L CaCl₂，5g/L甘油，使用前每毫升培养基加入0.2mmol/L AS 1μL， 100g/L MES 10μL，0.1％FeSO₄1μL。

所述Co-IM培养基的配方如下：1g/L葡萄糖，1.84g/L K₂HPO₄，1.45g/L KH₂PO₄，0.5g/L(NH₄)₂SO₄，0.01g/L CaCl₂，5g/L甘油，20g/L琼脂，使用前每毫升培养基加入0.2mmol/L AS 1μL，100g/L MES 10μL，0.1％FeSO₄1μL。

上述提高红曲胞外色素的方法构建得到的红曲霉菌在本发明的保护范围之内。

本发明从基因工程技术领域提供了一种提高红曲胞外色素的方法，将红曲霉菌中编码麦角甾醇合成途径中ERG4/ERG24还原酶基因敲除，使该基因在红曲霉菌中不能正常表达，提高红曲霉菌胞膜的渗透性。该技术方案利用植物双元质粒pCAMBIA1300作为载体，通过根癌农杆菌EHA105介导，将重组质粒pCAMBIA1300-△7017转化至红曲霉菌中，构建得到了红曲胞外色素高产菌株。

本发明提供了一种简单、高效的提高红曲胞外色素的方法。在最佳发酵条件下(30℃，150rpm培养至第7天)，出发菌株M.purpureus LQ-6的胞外色素浓度、总色素浓度分别为4.92U/mL、43.24U/mL。本发明构建重组菌株红曲胞外色素浓度、总色素浓度分别为6.52U/mL、57.11U/mL，说明通过本发明的方法促进了红曲菌株中红曲色素的分泌，提高了胞外色素产量。

附图说明

图1为本发明所涉及的质粒pXS质粒图谱。

图2为本发明两引物对PCR验证转化子原理图。

图3为转化子PCR电泳图。

图4为工程菌和出发菌株胞外红曲色素液态发酵结果图。

具体实施方式

根据下述实施例，可以更好地理解本发明，但本发明的具体实施方式不限于此。为了避免过多不必要的细节，在以下实施例中对属于公知的结构或功能将不进行详细描述。

实施例1

1.紫色红曲霉菌Monascus_07017基因缺失突变株的双元质粒表达载体构建

(1)利用软件分析SEQ ID No：1所示的序列；

(2)以紫色红曲霉菌的cDNA为模板，以7017-up-osc-F(序列为SEQ ID No：2)、7017-up-osc-R(序列为SEQ ID No：3)为一对引物和7017-dn-osc-F(序列为SEQ ID No：4)、7017-dn-osc-R(序列为SEQ ID No：5)为一对引物分别进行PCR扩增得到 Monascus_07017基因的5’和3’同源臂片段，详见图2；

(3)以质粒pXS(武汉大学刘天罡教授课题组赠送，其质粒图谱详见图1)为模板，以G418-osc-F(序列为SEQ ID No：6)、G418-osc-R(序列为SEQ ID No：7)为一对引物进行PCR扩增得到G418基因片段。

(4)采用Overlap PCR技术，以Monascus_07017基因的5’、3’同源臂片段以及 G418基因片段为模板，以7017-up-osc-F和7017-dn-osc-R为一对引物进行PCR扩增得到△7017目的片段并测序，将测序正确的目的片段胶回收纯化，其电泳结果如图3所示，其中，泳道1：10000bp marker；泳道2：2000bp marker；泳道3：对照组；泳道5-7和 10：基因7017完全敲除；泳道9：假阳性克隆；泳道8和11：基因7017不完全敲除；泳道12：亲本菌株；泳道13-15：重组菌株。

(5)用EcoR I和SaI I双酶切双元表达载体pCAMBIA1300并回收，利用一步克隆连接酶将其与△7017目的片段连接，即得到双元质粒表达载体为pCAMBIA1300-△ 7017。

2.将构建成功的载体pCAMBIA1300-△7017，转化亲本紫色红曲霉M.purpureusLQ-6，获得基因工程菌株紫色红曲霉△7017。

2.1根癌农杆菌感受态细胞制备

①将根癌农杆菌EHA105接种于5～10mL含有50mg/L利福平的YEB液体培养基中，以温度28℃、转速200rpm的条件培养约24～48h至对数生长期。

②取500μL活化的菌液接种于20mL含有50mg/L利福平的YEB液体培养基中，以温度28℃、转速200rpm的条件培养至菌液OD₆₀₀＝0.5。

③将菌液冰浴30min后，在4℃条件下以5000rpm的转速离心5min，弃上清，收集菌体。

④用预冷的50mmol/L CaCl₂洗涤菌体两次，再重悬于预冷的2mL 50mmol/L CaCl₂中。

⑤按每管200μL分装，液氮速冻1min。

⑥此时的菌悬液可以直接转化，也可以储存于-80℃冰箱保存备用。

上述YEB培养基：5g/L牛肉膏，5g/L蛋白胨，5g/L蔗糖，4g/L七水硫酸镁，1g/L酵母粉，pH 7.4；若为固体培养基则另加2％的琼脂粉。

2.2液氮冻融法将双元质粒表达载体导入根癌农杆菌

①取2μg所述双元质粒表达载体pCAMBIA1300-△7017加入到200μL的根癌农杆菌EHA105感受态细胞中，混匀后冰浴30min。

②液氮中速冻1min，后用37℃金属浴保温3min。

③加入800μL的YEB液体培养基，28℃培养3h。

④室温下以5000rpm的转速离心5min，浓缩菌体。

⑤取200μL浓缩后的菌液涂布于含有50μg/mL利福平、50μg/mL卡那霉素的YEB 选择性培养基平板上，28℃倒置培养48h；

⑥挑选转化子于YEB液体培养基中培养，并用引物对克隆子进行筛选，得到阳性克隆子，即为含有双元质粒表达载体pCAMBIA1300-△7017的根癌农杆菌EHA105。

2.3根癌农杆菌介导转化紫色红曲霉M.purpureus LQ-6

(1)菌体准备

紫色红曲霉M.purpureus LQ-6：将红曲菌接种到PDA斜培养基，30℃培养7d，用无

菌水从斜面上洗下红曲菌孢子，通过两层无菌擦镜纸过滤，调节孢子浓度。

根癌农杆菌：取含有双元质粒表达载体pCAMBIA1300-△7017的根癌农杆菌EHA105，接种于3mL含50μg/mL利福平，50μg/mL卡那霉素的YEB液体培养基中， 28℃，220rpm12～24h，取250μL的菌液于50mLMM培养基中，在相同条件下培养2d，测培养基中农杆菌的值，并用IM培养基稀释菌液至OD₆₀₀值为0.15。在相同条件下，培养6h得农杆菌液，备用。

(2)农杆菌与紫色红曲霉M.purpureus LQ-6共培养

将以上所得的紫色红曲霉孢子液和含有双元质粒表达载体pCAMBIA1300-△7017的根癌农杆菌EHA105菌液，混合涂布于铺有玻璃纸的含200μmol/L乙酰丁香酮的Co-IM 诱导培养基平板上，25℃共培养。

(3)转化子筛选验证

共培养4d后将玻璃纸揭起放入空的无菌培养皿中，然后倒入约含有50μg/mL G418和500μg/mL头孢霉素的PDA培养基，25℃培养，从第2天开始观察，将长出的菌落挑至含50μg/mL G418的PDA培养基上，30℃培养7d。如果在培养基上仍然能生长，即推定为转化子，并将之接种到PDB液体培养基中培养，按照SDS裂解法提取丝状真菌总DNA进行分子分析，用两对引物7017-T-F(序列为SEQ ID No：8)和7017-T-R(SEQ ID No：9)、G418-T-F(SEQ ID No：10)和7017-half-R(SEQ ID No：11)进行PCR 验证，选取阳性菌株。经红曲色素初步发酵，确定一株菌株即△7017，为本发明的工程菌株紫色红曲霉(Monascus purpureus)△7017。

上述PDA培养基：马铃薯(去皮)200g、葡萄糖20g、琼脂20g、蒸馏水1000ml，自然pH。

3.新构建的工程菌株紫色红曲霉△7017与亲本株M.purpureus LQ-6发酵产胞外红曲色素能力的对比。

3.1采用PDA固体培养基培养

将紫色红曲霉△7017与紫色红曲霉M.purpureus LQ-6，在PDA固体培养基培养7d后，用无菌水收集孢子悬液，并调至1×10⁵个/mL，接种量为10％。发酵条件为：30℃，150rpm发酵至第7天。

发酵培养基：葡萄糖80g/L，酵母粉2.5g/L，麦芽浸膏2.5g/L，蛋白胨2.5g/L，K₂HPO₄5g/L，CaCl₂0.1g/L，MgSO₄·7H₂O 0.5g/L，FeSO₄·7H₂O 0.01g/L，ZnSO₄·7H₂O 0.01g/L、MnSO₄·7H₂O 0.03g/L，pH＝5。

3.2红曲色素色价测定

胞外红曲色素(水溶)色价测定：将发酵液在离心管中定容至25mL，冷冻高速离心(10000rpm，10min)，上清液即为胞外色素。取一定量的滤液用水稀释适当倍数，以水为参照，用紫外分光光度计测定稀释液的吸光度值(红色素吸收主峰在505nm，黄色素吸收主峰在420nm，桔色素吸收主峰在470nm)，计算其总色价(红色素+黄色素+ 桔色素)。计算方法为：总色价＝稀释倍数×吸光度。

胞内红曲色素(醇溶)色价测定：发酵液离心后收集沉淀，用70％的乙醇在60℃下萃取2h，期间旋涡震荡数次。冷冻高速离心(10000rpm，20min)，上清液即为胞内色素。取一定量的滤液用70％乙醇稀释适当倍数，以70％乙醇为参照，用紫外分光光度计测定稀释液的吸光度值(红色素吸收主峰在505nm，黄色素吸收主峰在420nm，桔色素吸收主峰在470nm)，计算其总色价。计算方法同上。

总色价为胞外红曲色素(水溶)色价与胞内红曲色素(醇溶)色价之和。

紫色红曲霉△7017，在发酵第7天，胞外色价与总色价分别为6.52U/mL、57.11 U/mL。相比亲本紫色红曲霉M.purpureus LQ-6，胞外色价与总色价分别为4.92U/mL、 43.24U/mL，分别提高了32.52％和32.08％，结果如图4所示。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 中南林业科技大学

<120> 一种提高红曲霉菌胞外色素的方法

<160> 12

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 2010

<212> DNA

<213> Monascus_07017基因的核苷酸序列(Monascus purpureus)

<400> 1

aactcatcca cctcacttcc caacaatgac cgtaacacag aacccatcct gctaccgccg 60

tgccagctaa gaggggcaaa gagaatggat caaatactgt gtccaagttc actgatggcg 120

catcagatga gttcgagttt ggtggtccat tgggtgccgc gctgttgatg acaggctttc 180

ctctgctcac gtggtacatg tggattgggg ccacatacta tgatggcaag cttccattgc 240

ccgagtccgg ccagacctgg gctgactttg gccatcacct ctgtcacttg gtctacgagg 300

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gcgctgagtt gaatccccgc gttggcatct tggacttcaa gatgttctac gaggtcagga 720

tcccgtggtt tattttgttc ctcatcacct gctccgtggc tgctcgccaa tatgaaacat 780

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gttctctgtt ctgtatcttt tcttctactg gatgtgggat agtgccaacg gtcagaagaa 1140

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gtaagtttgt gattgctatt tgaggtgtaa agcgttgctg gcagttttga agtatattat 1620

ttaattgtgt ctcaacctca aaggtcctat cgcattgtta ttcctagcat gcatcgatgc 1680

tgattcaaat actttcctgt gtttgaaatg tttatatttg tttacttgtc aggattgttt 1740

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gttaagttct tcgtttgagg tcttcgtatc atgcgcggta gcattagcct agggttctgg 1980

ctatgctaca gtcttcgtgt gtgtgtgtgt 2010

<210> 2

<211> 40

<212> DNA

<213> 7017-up-osc-F(Monascus purpureus)

<400> 2

cagctatgac catgattacg ggtcgacggt atcgataagc 40

<210> 3

<211> 40

<212> DNA

<213> 7017-up-osc-R(Monascus purpureus)

<400> 3

tatactagtg gatcccccgg gctgcagatc gtaaatggga 40

<210> 4

<211> 40

<212> DNA

<213> 7017-dn-osc-F(Monascus purpureus)

<400> 4

gttatgcggc cgccaccgcg gtggagctcg tgtgtgtgtg 40

<210> 5

<211> 40

<212> DNA

<213> 7017-dn-osc-R(Monascus purpureus)

<400> 5

tgctcaccat gtcgactcta tgctggcctt ttgctcacat 40

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> G418-osc-F(Monascus purpureus)

<400> 6

cccgggggat ccactagtat 20

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> G418-osc-R(Monascus purpureus)

<400> 7

cccgggggat ccactagtat 20

<210> 8

<211> 21

<212> DNA

<213> 7017-T-F(Monascus purpureus)

<400> 8

tgtcgggctc tcccatttac g 21

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 7017-T-R(Monascus purpureus)

<400> 9

gccgaagagg ctgtatcgag 20

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> G418-T-F(Monascus purpureus)

<400> 10

aactgccctt tcaactccga 20

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 7017-half-R(Monascus purpureus)

<400> 11

aggaacgggg atatggctaa 20

<210> 12

<211> 7472

<212> DNA

<213> 质粒pXS核苷酸序列(Monascus purpureus)

<400> 12

ctaaattgta agcgttaata ttttgttaaa attcgcgtta aatttttgtt aaatcagctc 60

attttttaac caataggccg aaatcggcaa aatcccttat aaatcaaaag aatagaccga 120

gatagggttg agtgttgttc cagtttggaa caagagtcca ctattaaaga acgtggactc 180

caacgtcaaa gggcgaaaaa ccgtctatca gggcgatggc ccactacgtg aaccatcacc 240

ctaatcaagt tttttggggt cgaggtgccg taaagcacta aatcggaacc ctaaagggag 300

cccccgattt agagcttgac ggggaaagcc ggcgaacgtg gcgagaaagg aagggaagaa 360

agcgaaagga gcgggcgcta gggcgctggc aagtgtagcg gtcacgctgc gcgtaaccac 420

cacacccgcc gcgcttaatg cgccgctaca gggcgcgtcc cattcgccat tcaggctgcg 480

caactgttgg gaagggcgat cggtgcgggc ctcttcgcta ttacgccagc tggcgaaagg 540

gggatgtgct gcaaggcgat taagttgggt aacgccaggg ttttcccagt cacgacgttg 600

taaaacgacg gccagtgagc gcgcgtaata cgactcacta tagggcgaat tgggtaccgg 660

gccccccctc gaggtcgacg gtatcgataa gcttgatatc gaattccacc cgccagtttt 720

cctccaagcg catctgctat attgatttga agactccatt tctaaccata acaatattta 780

tatgcaaaaa cttaattcgc agcacaatca gggccttgac tccttctatg cccaagaata 840

ttacagtcac tgcagcgaaa tctgcgtcgt acaagtgatt gagaggcacg aagcccagcc 900

cggactggag tagcaataac aggctgagat gcttcaactt gactctctat aagtgcctga 960

gcttcttccc tggtaaggct tggcccatga gaataacgag atatctggga tctagatcgt 1020

tgactattta cactgatgct gactaatatg ggctatccta aataggaagg agataaacag 1080

tgagagccac caacatctat agatctgtca tgggttcagc gccgatcaca tgcttcttac 1140

caacttccct tttttcttca gccagtgctt ttgtactttc tcttctccag cgattccttc 1200

gtatacataa gtgccaccca attgaacaaa gttgcgtcca acctcttaca tgatccagta 1260

tccacttggc aagtgattcc tcttcaaatt ctgaaagttt gagtccattt gcaaaaggaa 1320

ttttgcagtt gcagcatgat tgatatgggg attttcccat tttttaaatc agaaatggct 1380

aataagactc gaccctcgtg ctcagcgaga ttatttaaag gtccatcgcg aattggtggc 1440

attatggcgc gtcgaattgt atggaatcaa tatagtggac gttttttccg agtatggtat 1500

atccggcgac cactatgcac catgaataga tgcaacctta cacccttgtc agatgcaaga 1560

ttactctata taagctggca tgccgatgtg attcgcaacc actcatttga acttggctaa 1620

agatcggcaa acagtattct tgaagaaagg acgtgcgccg acacgcattc tggtccaagc 1680

tcgtacagca gggttgggga ccgtccgtac ttctacacgc tagcctacat ctcatcaacg 1740

cctgttgttg gaggcagaag ctaggcgctg aggtgcaagc tttcgggatt atttatcgga 1800

gtaacttcat ccttgcgaag taaatccttc aggatctgta cttccgcagc ccatatcatc 1860

tatgaagccc gtatagcgga agcacaagcg agcgggacgg ctggcgaata ccaacatctg 1920

agaatatccg acacaagcaa gaagagtggg gaggggcgcg aggtaactgt ccggaataat 1980

gttctgctgt ggattttcag ttcagcctca caggcaggtg cagtgggcac tccatcagac 2040

tcatatatag ttgctactat ccacgagatc agcaaacggt ctcgcatggc agtatatacc 2100

gtgtttgtgt gatataccta ccagtaccct atcattttca atacgatttc ccatcggtca 2160

gcttcaacgt gaccaaggac ggcagtttca attgcggcta taagttctgc agcccggggg 2220

atccactagt ataacttcgt atagcataca ttatacgaag ttattcgaca gaagatgata 2280

ttgaaggagc actttttggg cttggctgga gctagtggag gtcaacaatg aatgcctatt 2340

ttggtttagt cgtccaggcg gtgagcacaa aatttgtgtc gtttgacaag atggttcatt 2400

taggcaactg gtcagatcag ccccacttgt agcagtagcg gcggcgctcg aagtgtgact 2460

cttattagca gacaggaacg aggacattat tatcatctgc tgcttggtgc acgataactt 2520

ggtgcgtttg tcaagcaagg taagtgaacg acccggtcat accttcttaa gttcgccctt 2580

cctcccttta tttcagattc aatctgactt acctattcta cccaagcatc gataagcttc 2640

gattaggaag tagccaccat gggcaaggag aagacccacg tctcccgccc ccgtctcaac 2700

tccaacatgg acgctgacct ctacggttac aagtgggccc gcgacaacgt cggccagtcc 2760

ggtgctacca tctaccgtct ctacggcaag cccgacgccc ctgagctgtt cctcaagcac 2820

ggcaagggct ccgtcgctaa cgatgtcacc gacgagatgg tccgcctcaa ctggctcacc 2880

gagttcatgc ccctccctac catcaagcac ttcatccgta cccctgacga cgcttggctc 2940

ctcaccaccg ctatccctgg caagaccgcc ttccaggtcc tggaggagta ccccgactcc 3000

ggcgagaaca tcgtcgatgc cctcgctgtc ttcctccgcc gtctccactc catccccgtc 3060

tgcaactgcc ctttcaactc cgaccgtgtc ttccgtctcg ctcaggctca gtcccgcatg 3120

aacaacggtc tcgtcgatgc ctccgacttc gacgacgagc gtaacggctg gcctgtcgag 3180

caggtctgga aggagatgca caagctcctc cccttctccc ctgactccgt cgtcacccac 3240

ggcgacttct ccctcgacaa cctcatcttc gacgagggca agctcatcgg ctgcatcgat 3300

gtcggtcgcg tcggcatcgc tgaccgttac caggacctcg ccatcctctg gaactgcctc 3360

ggcgagttct ccccctccct ccagaagcgc ctcttccaga agtacggcat cgacaaccct 3420

gacatgaaca agctccagtt ccacctcatg ctcgacgagt tcttctaact cgagagtaga 3480

tgccgaccgg gatccactta acgttactga aatcatcaaa cagcttgacg aatctggata 3540

taagatcgtt ggtgtcgatg tcagctccgg agttgagaca aatggtgttc aggatctcga 3600

taagatacgt tcatttgtcc aagcagcaaa gagtgccttc tagtgattta atagctccat 3660

gtcaacaaga ataaaacgcg tttcgggttt acctcttcca gatacagctc atctgcaatg 3720

cattaatgca ttggacctcg caaccctagt acgcccttca ggctccggcg aagcagaaga 3780

atagcttagc agagtctatt ttcattttcg ggagacgaga tcaagcagat caacggtcgt 3840

caagagacct acgagactga ggaatccgct cttggctcca cgcgactata tatttgtctc 3900

taattgtact ttgacatgct cctcttcttt actctgatag cttgactatg aaaattccgt 3960

caccagcccc tgggttcgca aagataattg cactgtttct tccttgaact ctcaagccta 4020

caggacacac attcatcgta ggtataaacc tcgaaaatca ttcctactaa gatgggtata 4080

caatagtaac catggttgcc tagtgaatgc tccgtaacac ccaatacgcc ggccgaaact 4140

tttttacaac tctcctatga gtcgtttacc cagaatgcac aggtacactt gtttagaggt 4200

aatccttctt tctagaataa cttcgtatag catacattat acgaagttat gcggccgcca 4260

ccgcggtgga gctccaaact ggtctcttcc ccaagccctg gtattcagtg ccagcacaaa 4320

ggaggagctg aatagggccc ttgcatcttt tgagaaaggc agcacggatt tcccatctgt 4380

ccagcttccg gatccgaagc ccgtcatcct atgctttgga gggcaagttt ccacctatgt 4440

tggtttggat caagaggtct ataacagcac tgcgattttg agacattact tagatcagtg 4500

cgatgccatg tgcctttcgc taggcctgca aagtatctac ccggctattt tccaacggtc 4560

cccaatcgag gatattgttc agcttcaaac agcgctgttt gcgatgcagt attcctgcgc 4620

caaggcatgg atagatagcg gactgaaggt tgcctcggtc gtcgggcaca gctttggtga 4680

gttgatagct ctatgtgtct ccaatgctgt atcgttgaag gatgctgtca agatgatttc 4740

cggtcgagcc cgccttatta aggagcgctg gggcgctgac aaggggtcca tgatcgctgt 4800

cgaggcggac ctttccgatg tggaagcttt gttggccaag gtgaaatcac agatgggatc 4860

tgaaacggga cttgcaatcg cctgctataa tgcatcaaaa agcttcacat tggctgggcc 4920

cacgaaagac gtggaccatg ccgagaactt gctgaaaaat gacccagact tctcaggaat 4980

aagatataaa agactgaacg tcaccaacgc cttccattcg gttctcgttg acgcgttgat 5040

tgatgaccta gagagtctgg gacaaggtat caggttcaag gagccgacga ttaagcttga 5100

aagagcaaca gagcaagagt ccaccagcac attaaatgcc aattatgtgg ccacccacat 5160

gagaaagcca gttttctttg cccaggcagt caagaggttg tcagacaaat tccctgttgc 5220

catttggtta gaggccggat cgaactccac catcacggcc atggcaagcc gggctctggg 5280

tacatcaaac tcctctttcc aggccgtcaa cattactagc gagggtgcat tccggttcct 5340

ctgcgacacg accgtgaaac tctggaagga aggccagaaa gtcagcttct gggctcatca 5400

ccgcctgcag acacctatgt atactccagt cctattaccc ccgtatcaat tcgagaagtc 5460

gaggcactgg atggatctga aggtaccccc gaagcccgaa gcttctgtgc aggtggcaga 5520

gcagacagca attatcgagg caccgaaggg cctgacgact ttcgttggtt atcaagacgc 5580

atcccagcgc tctgtgaggt tcagagtaaa tgtcacgaca gaaaagttta accgtctcct 5640

gtccggccat atcatggcaa atgacatgtg agcaaaaggc cagcaaaagg ccaggaaccg 5700

taaaaaggcc gcgttgctgg cgtttttcca taggctccgc ccccctgacg agcatcacaa 5760

aaatcgacgc tcaagtcaga ggtggcgaaa cccgacagga ctataaagat accaggcgtt 5820

tccccctgga agctccctcg tgcgctctcc tgttccgacc ctgccgctta ccggatacct 5880

gtccgccttt ctcccttcgg gaagcgtggc gctttctcat agctcacgct gtaggtatct 5940

cagttcggtg taggtcgttc gctccaagct gggctgtgtg cacgaacccc ccgttcagcc 6000

cgaccgctgc gccttatccg gtaactatcg tcttgagtcc aacccggtaa gacacgactt 6060

atcgccactg gcagcagcca ctggtaacag gattagcaga gcgaggtatg taggcggtgc 6120

tacagagttc ttgaagtggt ggcctaacta cggctacact agaaggacag tatttggtat 6180

ctgcgctctg ctgaagccag ttaccttcgg aaaaagagtt ggtagctctt gatccggcaa 6240

acaaaccacc gctggtagcg gtggtttttt tgtttgcaag cagcagatta cgcgcagaaa 6300

aaaaggatct caagaagatc ctttgatctt ttctacgggg tctgacgctc agtggaacga 6360

aaactcacgt taagggattt tggtcatgag attatcaaaa aggatcttca cctagatcct 6420

tttaaattaa aaatgaagtt ttaaatcaat ctaaagtata tatgagtaaa cttggtctga 6480

cagttaccaa tgcttaatca gtgaggcacc tatctcagcg atctgtctat ttcgttcatc 6540

catagttgcc tgactccccg tcgtgtagat aactacgata cgggagggct taccatctgg 6600

ccccagtgct gcaatgatac cgcgagaccc acgctcaccg gctccagatt tatcagcaat 6660

aaaccagcca gccggaaggg ccgagcgcag aagtggtcct gcaactttat ccgcctccat 6720

ccagtctatt aattgttgcc gggaagctag agtaagtagt tcgccagtta atagtttgcg 6780

caacgttgtt gccattgcta caggcatcgt ggtgtcacgc tcgtcgtttg gtatggcttc 6840

attcagctcc ggttcccaac gatcaaggcg agttacatga tcccccatgt tgtgcaaaaa 6900

agcggttagc tccttcggtc ctccgatcgt tgtcagaagt aagttggccg cagtgttatc 6960

actcatggtt atggcagcac tgcataattc tcttactgtc atgccatccg taagatgctt 7020

ttctgtgact ggtgagtact caaccaagtc attctgagaa tagtgtatgc ggcgaccgag 7080

ttgctcttgc ccggcgtcaa tacgggataa taccgcgcca catagcagaa ctttaaaagt 7140

gctcatcatt ggaaaacgtt cttcggggcg aaaactctca aggatcttac cgctgttgag 7200

atccagttcg atgtaaccca ctcgtgcacc caactgatct tcagcatctt ttactttcac 7260

cagcgtttct gggtgagcaa aaacaggaag gcaaaatgcc gcaaaaaagg gaataagggc 7320

gacacggaaa tgttgaatac tcatactctt cctttttcaa tattattgaa gcatttatca 7380

gggttattgt ctcatgagcg gatacatatt tgaatgtatt tagaaaaata aacaaatagg 7440

ggttccgcgc acatttcccc gaaaagtgcc ac 7472

Claims (9)

1.一种提高红曲胞外色素的方法，其特征在于：该方法将红曲霉菌中编码麦角甾醇合成途径上还原酶ERG4/ERG24基因失活，使该基因在红曲霉菌中缺失而不能正常表达；所述的红曲霉菌为紫色红曲霉菌，所述编码麦角甾醇还原酶ERG4/ERG24基因为Monascus_07017，所述Monascus_07017核苷酸序列如SEQ ID No：1所示。

2.根据权利要求1所述的提高红曲胞外色素的方法，其特征在于：将紫色红曲霉菌中编码麦角甾醇还原酶ERG4/ERG24基因敲除，是利用农杆菌EHA105介导转化技术敲除紫色红曲霉菌中编码麦角甾醇还原酶ERG4/ERG24基因。

3.根据权利要求2所述的提高红曲胞外色素的方法，其特征在于：通过农杆菌介导转化法基因敲除技术使编码还原酶ERG4/ERG24基因缺失，包括如下步骤：

1)利用软件分析SEQ ID No：1所示的序列；

2)以紫色红曲霉菌的cDNA为模板，以7017-up-osc-F和7017-up-osc-R为第一对引物以及7017-dn-osc-F和7017-dn-osc-R为第二对引物分别进行PCR扩增得到Monascus_07017基因的5’和3’同源臂片段；所述7017-up-osc-F的序列为SEQ ID No：2；所述7017-up-osc-R的序列为SEQ ID No：3；所述7017-dn-osc-F的序列为SEQ ID No：4；所述7017-dn-osc-R的序列为SEQ ID No：5；

3)以质粒pXS为模板，以G418-osc-F和G418-osc-R为一对引物进行PCR扩增得到G418基因片段；所述G418-osc-F的序列为SEQ ID No：6；所述G418-osc-R的序列为SEQ ID No：7；所述质粒pXS的序列为SEQ ID No：12；

4)采用Overlap PCR技术，以Monascus_07017基因的5’、3’同源臂片段以及G418基因片段为模板，以7017-up-osc-F和7017-dn-osc-R为一对引物进行PCR扩增得到△7017目的片段；

5)用EcoR I和SaII双酶切双元表达载体pCAMBIA1300，利用一步克隆技术连接线性化双元载体pCAMBIA1300与△7017目的片段，即得到双元敲除质粒pCAMBIA1300-△7017；

6)根癌农杆菌EHA105介导双元敲除质粒pCAMBIA1300-△7017，转化至紫色红曲霉菌中，筛选阳性克隆，即得到红曲胞外色素高产菌株。

4.根据权利要求3所述的提高红曲胞外色素的方法，其特征在于：所述步骤6)具体包括以下操作：先制备根癌农杆菌EHA105的感受态细胞，再通过液氮冻融法将所述双元质粒表达载体pCAMBIA1300-△7017导入根癌农杆菌EHA105，随后将含有双元质粒表达载体pCAMBIA1300-△7017的农杆菌转化至紫色红曲霉菌株中，再筛选阳性克隆，即得到所述红曲胞外色素高产菌株。

5.根据权利要求4所述的提高红曲胞外色素的方法，其特征在于：所述制备根癌农杆菌EHA105的感受态细胞的具体制备方法是：将根癌农杆菌EHA105接种于5～10mL含有50mg/L利福平的YEB液体培养基中，以温度28℃、转速200rpm的条件培养24～48h至对数生长期；取500μL活化的菌液接种于20mL含有50mg/L利福平的YEB液体培养基中，以温度28℃、转速200rpm的条件培养至菌液OD₆₀₀＝0.5；将菌液冰浴30min后，在4℃条件下以5000rpm的转速离心5min，弃上清，收集菌体；用50mmol/L CaCl₂洗涤菌体两次，再重悬于2mL 50mmol/LCaCl₂中，得到根癌农杆菌EHA105感受态细胞。

6.根据权利要求4所述的提高红曲胞外色素的方法，其特征在于：所述通过液氮冻融法将所述双元质粒表达载体pCAMBIA1300-△7017导入根癌农杆菌EHA105的具体实现方式是：取2μg所述双元质粒表达载体pCAMBIA1300-△7017加入到200μL的根癌农杆菌EHA105感受态细胞中，混匀后冰浴30min；液氮中速冻1min，后用37℃金属浴保温3min；加入800μL的YEB液体培养基，28℃培养3h；室温下以5000rpm的转速离心5min，浓缩菌体；取200μL浓缩后的菌液涂布于含有50mg/L利福平、50mg/L卡那霉素的YEB选择性培养基平板上，28℃倒置培养48h；挑选转化子于YEB液体培养基中培养，并用引物对克隆子进行筛选，得到阳性克隆子，即为含有双元质粒表达载体pCAMBIA1300-△7017的根癌农杆菌EHA105。

7.根据权利要求4所述的提高红曲胞外色素的方法，其特征在于：含有双元表达载体pCAMBIA1300-△7017的根癌农杆菌EHA105转化至紫色红曲霉菌中的具体实现方式是：

将红曲菌接种到PDA斜培养基，30℃培养7d，用无菌水从斜面上洗下红曲菌孢子，通过两层无菌擦镜纸过滤，调节孢子浓度；取含有双元质粒表达载体pCAMBIA1300-△7017的根癌农杆菌EHA105，接种于3mL含50μg/mL利福平，50μg/mL卡那霉素的YEB液体培养基中，28℃，220rpm12～24h，取250μL的菌液于50mLMM培养基中，在相同条件下培养2d，测培养基中农杆菌的值，并用IM培养基稀释菌液至OD₆₀₀值为0.15；再在相同条件下培养6h得农杆菌液备用；将以上所得的紫色红曲霉孢子液和含有双元质粒表达载体pCAMBIA1300-△7017的根癌农杆菌EHA105菌液，混合涂布于铺有玻璃纸的含200μmol/L乙酰丁香酮的Co-IM诱导培养基平板上，25℃共培养。

8.根据权利要求7所述的提高红曲胞外色素的方法，其特征在于：所述筛选阳性克隆的具体实现方式是：

共培养4d后将玻璃纸揭起放入空的无菌培养皿中，然后倒入含有50μg/mL G418和500μg/mL头孢霉素的PDA培养基，25℃培养，从第2天开始观察，将长出的菌落挑至含50μg/mLG418的PDA培养基上，30℃培养7d；如果在培养基上仍然能生长，即推定为转化子，并将之接种到PDB液体培养基中培养，按照SDS裂解法提取丝状真菌总DNA进行分子分析，以提取基因组为模板，用两对引物7017-T-F和7017-T-R、G418-T-F和7017-half-R进行PCR验证，选取阳性菌株；所述7017-T-F的序列为SEQ ID No：8；所述7017-T-R的序列为SEQ ID No：9；所述G418-T-F的序列为SEQ ID No：10；所述7017-half-R的序列为SEQ ID No：11。

9.一种基于如权利要求8所述的提高红曲胞外色素的方法构建得到的高产红曲胞外色素的重组菌株。

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