CN110079544B - 一种提高发酵液中红曲色素色价的方法 - Google Patents

Abstract

一种提高发酵液中红曲色素色价的方法，是通过红曲霉菌自带的同源重组系统，利用根癌农杆菌介导（ATMT）转化T‑DNA技术完成红曲霉菌中编码C‑24(28)甾醇还原酶的ERG4基因敲除，得到红曲色素高产菌株。本发明能够显著性提高发酵液中红曲色素的生产水平，液态发酵（10d）结果显示，出发菌株胞外色价和总色价分别为14.57 U/mL、106.54 U/mL，本发明构建的重组菌株胞外色价和总色价分别为21.55U/mL、112.78U/mL，胞外色价和总色价分别提高了47.90%、5.86%。

Description

一种提高发酵液中红曲色素色价的方法

技术领域

本发明涉及一种提高发酵液中红曲色素色价的方法，具体地说，是涉及一种通过基因工程技术提高发酵液中红曲色素色价的方法。

背景技术

红曲色素作为一种天然食用色素在我国及东南亚等国家已有上千年的应用历史，在化学合成色素被证实具有不同程度的毒副作用后，红曲色素以其“天然、营养、多功能”的优点，在食品工业中具有很大的潜力。同时，由于红曲色素还具有调节血脂、降血压、防血管硬化、抗防过氧化等广泛的生物活性，因此，它在保健产品开发和医疗领域的应用也逐渐受到重视。

红曲色素的生产方法主要有固态发酵和液态发酵两种。虽然固态发酵过程简单、投资小，但是固态发酵存在生产周期长、工艺条件难以精确控制、劳动密度大等缺点。因此，液态发酵法成为生产红曲色素工业化的主流，其中提高发酵产量，也就是提高色素色价成为当前的主要任务。液态发酵生产的红曲色素具有杂质少、周期短、产品质量稳定等优点，但此方法产生的色价不高，而产品售价较高，制约了其应用范围。

目前，提高发酵液中红曲色素色价的方法目前主要从菌种筛选、菌种诱变、培养条件优化等方面进行。

CN 109234318 A公开了一种提高红曲胞外色素的方法，该方法是将红曲霉菌中编码麦角甾醇合成途径上甾醇还原酶的ERG4/ERG24家族的基因敲除。其记载的液态发酵结果显示，亲本菌株胞外红曲色素为4.92U/mL，通过该方法构建的重组菌株胞外红曲色素达6.52U/mL，胞外色素生产量提高32.52％，该方法能够提高红曲胞外色素的产量，但其红曲色素的色价仍然无法满足行业需求。

CN 109337932 A公开了一种提高红曲色素产量的方法，该方法是从植物双元质粒pCambia0380载体出发，改造并构建了一种适合丝状真菌基因敲除的双元质粒载体pHph0380。在此基础上，从红色红曲霉CICC41233中克隆得到糖转运蛋白gltp1基因上下游同源臂片段，与质粒载体pHph0380连接后，通过根癌农杆菌EHA105介导将其转化至亲本红色红曲霉中，构建得到了重组菌株。该重组菌株发酵36h，红色红曲霉GLTP24醇溶色价为0.29U，相比亲本红色红曲霉CICC41233，醇溶色价为0 .09U，提高了2倍。该重组菌株发酵144h，醇溶色价为49 .46U。相比亲本红色红曲霉CICC41233，醇溶色价为28 .42U，提高了74％，但其红曲色素的色价仍欠理想。

以上所述现有技术受限于红曲霉菌自身的代谢特性，红曲色素累积很难再进一步提高，色价不高，无法满足行业需求。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是，克服现有技术存在的上述缺陷，提供一种工艺较简单，能够有效促进红曲色素产量满足行业需求的提高发酵液中红曲色素色价的方法。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案如下：一种提高发酵液中红曲色素色价的方法，利用基因敲除技术使红曲霉菌中编码C-24(28)-甾醇还原酶的ERG4基因缺失，得到重组菌株，利用所述重组菌株发酵产红曲霉素。

进一步，所述红曲霉菌为紫色红曲霉菌M. purpureus；所述编码甾醇还原酶的ERG4基因为monascus_08018，其核苷酸序列如SEQ ID No:1所示。

进一步，所述基因敲除技术是利用同源重组技术，通过根癌农杆菌EHA105（湖南大学生物学院于峰教授课题组赠送，属于常规商品化的生物材料）介导转化T-DNA技术使得紫色红曲霉菌中编码甾醇还原酶的ERG4基因monascus_08018缺失，具体包括以下步骤：

（1）利用软件分析编码甾醇还原酶的ERG4基因monascus_08018的核苷酸序列；

（2）以紫色红曲霉菌M. purpureus LQ-6的cDNA 为模板，以8018-up-osc-F和8018-up-osc-R为第一对引物，以8018-dn-osc-F和8018-dn-osc-R为第二对引物，将两对引物分别进行PCR扩增得到monascus_08018基因的5＇端和3＇端同源臂片段；所述8018-up-osc-F的序列为SEQ ID No:2；所述8018-up-osc-R的序列为SEQ ID No:3；所述8018-dn-osc-F的序列为SEQ ID No:4；所述8018-dn-osc-R的序列为SEQ ID No:5；

（3）以质粒pXS为模板，以G418-F和G418-R为一对引物进行PCR扩增得到G418基因片段；所述G418-F的序列为SEQ ID No:6；所述G418-R的序列为SEQ ID No:7；

（4）采用Overlap PCR技术，以monascus_08018基因的5＇端和3＇端同源臂片段以及G418基因片段为模板，以8018-up-osc-F和8018-dn-osc-R为一对引物进行PCR扩增得到△8018目的片段；

（5）用EcoR I和Sal I双酶切双元表达载体pCAMBIA1300，胶回收线性化载体，利用一步克隆技术连接线性化双元载体pCAMBIA1300与△8018目的片段，即得到基因敲除载体pCAMBIA1300-△8018；所述质粒pCAMBIA1300-△8018序列为SEQ ID No:12；

（6）根癌农杆菌EHA105介导基因敲除载体pCAMBIA1300-△8018，转化至紫色红曲霉菌中，筛选阳性克隆，即得到所述的液态发酵中红曲色素高产菌株。

进一步，步骤（2）中所述紫色红曲霉M. purpureus LQ-6于2018年09月07日在中国典型保藏中心保藏，保藏编号是CCTCC M 2018600。

进一步，步骤（6）中所述根癌农杆菌EHA105介导基因敲除载体pCAMBIA1300-△8018是通过液氮冻融法将所述基因敲除载体pCAMBIA1300-△8018导入根癌农杆菌EHA105，具体步骤如下：取2 μg所述基因敲除载体pCAMBIA1300-△8018加入到200μL的根癌农杆菌EHA105感受态细胞中，混匀后冰浴30 min；液氮中速冻1min，后用37℃金属浴保温3 min；加入800 μL的YEB液体培养基，28℃培养3h；室温下以5000 rpm的转速离心5min，浓缩菌体；取200 μL浓缩后的菌液涂布于含有50 mg/L 利福平、50 mg/L卡那霉素的YEB选择性培养基平板上，28℃倒置培养48 h；挑选转化子于YEB液体培养基中培养，并用引物对克隆子进行筛选，得到阳性克隆子，即为含有基因敲除载体pCAMBIA1300-△8018的根癌农杆菌EHA105。

进一步，步骤（6）中所述含有基因敲除载体pCAMBIA1300-△8018的根癌农杆菌EHA105转化至紫色红曲霉菌中的步骤如下：将红曲菌接种到PDA斜培养基，30℃培养7d，用无菌水从斜面上洗下红曲菌孢子，通过两层无菌擦镜纸过滤，调节孢子浓度；取含有基因敲除载体pCAMBIA1300-△8018的根癌农杆菌EHA105，接种于3mL含50μg/mL 利福平，50μg/mL卡那霉素的YEB液体培养基中，28℃，220rpm培养12～24h，取250μL的菌液于50mLMM培养基中，在相同条件下培养2d，测培养基中农杆菌的值，并用IM培养基稀释菌液至OD₆₀₀值为0.15；再在相同条件下培养6h得农杆菌液备用；将所得的紫色红曲霉孢子液和含有基因敲除载体pCAMBIA1300-△8018的根癌农杆菌EHA105菌液，混合涂布于铺有玻璃纸的含200 μmol/L乙酰丁香酮的Co-IM诱导培养基平板上，25℃共培养。

进一步，步骤（6）中所述筛选阳性克隆的具体步骤如下：将共培养4d后将玻璃纸揭起放入空的无菌培养皿中，然后倒入约含有50 μg/mL G418和500 μg/mL头孢霉素的PDA培养基，25℃培养，从第2天开始观察，将长出的菌落挑至含50 μg/mL G418的PDA培养基上，30℃培养7d；如果在培养基上仍然能生长，即推定为转化子，并将之接种到PDB液体培养基中培养，按照SDS裂解法提取丝状真菌总DNA进行分子分析，以提取基因组为模板，用两对引物8018-T-F和8018-T-R、G418-T-F和8018-half-R进行PCR验证，选取阳性菌株；所述8018-T-F的序列为SEQ ID No:8；所述8018-T-R的序列为SEQ ID No:9；所述G418-T-F的序列为SEQID No:10；所述8018-half-R的序列为SEQ ID No:11。

进一步，所述根癌农杆菌EHA105感受态细胞的制备方法如下：将根癌农杆菌EHA105接种于5～10 mL含有50 mg/L利福平的YEB液体培养基中，以温度28℃、转速200 rpm的条件培养约24～48 h至对数生长期；取500 μL活化的菌液接种于20 mL含有50 mg/L利福平的YEB液体培养基中，以温度28℃、转速200rpm的条件培养至菌液OD₆₀₀=0.5；将菌液冰浴30 min后，在4℃条件下以5000 rpm的转速离心5 min，弃上清，收集菌体；用50 mmol/LCaCl₂洗涤菌体两次，再重悬于2 mL 50 mmol/L CaCl₂中，得到根癌农杆菌EHA105感受态细胞。

在以上技术方案中，所述植物双元质粒pCAMBIA1300、根癌农杆菌EHA105，均属于常规商品化生物材料，可自市面购得，紫色红曲霉M .purpureus LQ-6于2018年09月07日在中国典型保藏中心（地址：武汉；简称“CCTCC”）保藏，保藏编号是CCTCC M 2018600。

在以上技术方案中，所述YEB培养基的配方如下：5g/L牛肉膏，5g/L蛋白胨，5g/L蔗糖，4g/L七水硫酸镁，1g/L酵母粉，pH 7.4；若为固体培养基则另加2%的琼脂粉。

所述PDA培养基的配方如下：马铃薯(去皮) 200g、葡萄糖20g、琼脂20g、蒸馏水1000mL，pH自然。

所述MM培养基的配方如下：2g/L葡萄糖，2.05g/L K₂HPO₄，1 .45g/L KH₂PO₄，0.5g/L(NH₄)₂SO₄，0.01g/L CaCl₂，pH7.0，使用前每毫升培养基加入0.1% FeSO₄1μL，50mg/mL 卡那霉素1μL。

所述IM培养基的配方如下：2g/L葡萄糖，1.84g/L K₂HPO₄，1.45g/L KH₂PO₄，0.5g/L(NH₄)₂SO₄，0.01g/L CaCl₂，5g/L甘油，pH4.9，使用前每毫升培养基加入0.2mmol/L AS 1μL，100g/L MES 10μL，0.1%FeSO₄ 1μL。

所述Co-IM培养基的配方如下：1g/L葡萄糖，1.84g/LK₂HPO₄，1.45g/L KH₂PO₄，0.5g/L (NH₄)₂SO₄，0.01g/L CaCl₂，5g/L甘油，pH4.9，使用前每毫升培养基加入0.2mmol/LAS 1μL，100g/L MES 10μL，0.1%FeSO₄ 1μL。

本发明之提高发酵液中红曲色素色价的方法中所构建得到的红曲霉素高产菌株也在本发明的保护范围之内。

本发明是从基因工程技术领域提供了一种提高发酵液中红曲色素色价的方法，将红曲霉菌中编码C-24(28)-甾醇还原酶的ERG4还原酶基因敲除，有利于提高红曲霉菌胞膜的通透性，利用植物双元质粒pCAMBIA1300作为载体，通过根癌农杆菌EHA105介导T-DNA转化技术，敲除靶标的命中率和稳定性较好，将基因敲除载体pCAMBIA1300-△8018转化至红曲霉菌中，转化效率较高，所构建得到了液态发酵中红曲色素高产菌株具有良好的传代稳定性。

本发明有益效果：提供了一种简单、高效的提高发酵液中红曲色素色价的方法，在最佳发酵条件下（30℃，150 rpm培养至色素生产稳定期即第10天），出发菌株M. purpureus LQ-6的胞外色素色价、总色素色价分别为14.57U/mL、106.54U/mL。本发明构建重组菌株红曲胞外色素色价、总色素色价分别为21.55U/mL、112.78U/mL，胞外色价和总色价分别提高了47.90%、5.86%，说明通过本发明的方法能够显著性提高发酵液中红曲色素的生产水平。

生物材料保藏情况说明

紫色红曲霉LQ-6，拉丁学名为Monascus. purpureus LQ-6，于2018年09月07日在中国典型保藏中心（地址：武汉；简称“CCTCC”）保藏，保藏编号是CCTCC M 2018600。

附图说明

图1为本发明所涉及的重组质粒pCAMBIA1300-△8018的质粒图谱；

图2为转化子PCR电泳图（泳道1：10 000 bp marker；泳道2：2 000bp marker；泳道3：阴性对照；泳道4：亲本菌株；泳道6-8和12：基因8018完全敲除；泳道10、11：假阳性克隆；泳道5和9：基因8018不完全敲除；泳道13：亲本菌株；泳道14：-21：转化子）；

图3为出发菌株和重组菌株液态发酵总红曲色素发酵动力学图；

图4为出发菌株和重组菌株红曲胞外色素发酵动力学图。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明作进一步说明。

本发明实施例所使用的化学试剂，如无特殊说明，均通过常规商业途径获得。

实施例1

本实施例是利用基因敲除技术使紫色红曲霉菌M. purpureus中编码麦角甾醇合成途径上C-24(28)-甾醇还原酶的ERG4还原酶基因monascus_08018缺失，得到重组菌株，利用所述重组菌株发酵产红曲霉素；ERG4基因monascus_08018的核苷酸序列如SEQ ID No:1所示。

本实施例基因敲除技术是利用同源重组技术，通过根癌农杆菌EHA105介导转化T-DNA技术使得紫色红曲霉菌中编码C-24(28)甾醇还原酶的ERG4基因monascus_08018缺失，包括以下步骤：

1. 紫色红曲霉菌Monascus_08018基因缺失突变株的基因敲除载体构建：

（1）利用软件分析SEQ ID No:1所示的序列；

（2）以紫色红曲霉菌的cDNA 为模板，以8018-up-osc-F（序列为SEQ ID No:2）、8018-up-osc-R（序列为SEQ ID No:3）为一对引物和8018-dn-osc-F（序列为SEQ ID No:4）、8018-dn-osc-R（序列为SEQ ID No:5）为一对引物分别进行PCR扩增得到monascus_08018基因的5’和3’同源臂片段；

（3）以质粒pXS为模板，以G418-F（序列为SEQ ID No:6）、G418-R（序列为SEQ IDNo:7）为一对引物进行PCR扩增得到G418基因片段；

（4）采用Overlap PCR技术，以monascus_08018基因的5’、3’同源臂片段以及G418基因片段为模板，以8018-up-osc-F和8018-dn-osc-R为一对引物进行PCR扩增得到△8018目的片段并测序，将测序正确的目的片段胶回收纯化；

（5）用EcoR I和 Sal I 双酶切双元表达载体pCAMBIA1300并回收，利用一步克隆连接酶将其与△8018目的片段连接，即得到基因敲除载体pCAMBIA1300-△8018，其质粒图谱详见图1；

2. 将构建成功的载体pCAMBIA1300-△8018，转化亲本紫色红曲霉M. purpureus LQ-6，获得基因工程菌株紫色红曲霉△8018。

2.1 根癌农杆菌感受态细胞制备

①将根癌农杆菌EHA105接种于5～10 mL含有50 mg/L利福平的YEB液体培养基中，以温度28℃、转速200 rpm的条件培养约24～48 h至对数生长期；

②取500 μL活化的菌液接种于20mL含有50 mg/L利福平的YEB液体培养基中，以温度28℃、转速200 rpm的条件培养至菌液OD₆₀₀=0.5；

③将菌液冰浴30 min后，在4℃条件下以5000 rpm的转速离心5 min，弃上清，收集菌体；

④用预冷的50 mmol/L CaCl₂洗涤菌体两次，再重悬于预冷的2 mL 50 mmol/LCaCl₂中；

⑤按每管200 μL分装，液氮速冻1min；

⑥此时的菌悬液可以直接转化，也可以储存于-80℃冰箱保存备用。

上述YEB培养基：5g/L牛肉膏，5g/L蛋白胨，5g/L蔗糖，4g/L 七水硫酸镁，1g/L酵母粉，pH 7.4；若为固体培养基则另加2%的琼脂粉。

2.2 液氮冻融法将双元质粒表达载体导入根癌农杆菌

①取2μg所述基因敲除载体pCAMBIA1300-△8018加入到200μL的根癌农杆菌EHA105感受态细胞中，混匀后冰浴30min；

②液氮中速冻1min，后用37℃金属浴保温3min；

③加入800μL的YEB液体培养基，28℃培养3h；

④室温下以5000rpm的转速离心5min，浓缩菌体；

⑤取200μL浓缩后的菌液涂布于含有50μg/mL 利福平、50μg/mL卡那霉素的YEB选择性培养基平板上，28℃倒置培养48h；

⑥挑选转化子于YEB液体培养基中培养，并用引物对克隆子进行筛选，得到阳性克隆子，即为含有基因敲除载体pCAMBIA1300-△8018的根癌农杆菌EHA105。

2.3 根癌农杆菌介导转化紫色红曲霉M. purpureus LQ-6

（1）菌体准备

紫色红曲霉M. purpureus LQ-6：将红曲菌接种到PDA斜培养基，30℃培养7d，用无菌水从斜面上洗下红曲菌孢子，通过两层无菌擦镜纸过滤，调节孢子浓度。

根癌农杆菌：取含有基因敲除载体pCAMBIA1300-△8018的根癌农杆菌EHA105，接种于3mL含50μg/mL 利福平，50μg/mL卡那霉素的YEB液体培养基中，28℃，220rpm12～24h，取250μL的菌液于50mLMM培养基中，在相同条件下培养2d，测培养基中农杆菌的值，并用IM培养基稀释菌液至OD₆₀₀值为0.15。在相同条件下，培养6h得农杆菌液，备用。

（2）农杆菌与紫色红曲霉M. purpureus LQ-6共培养

将上述的紫色红曲霉孢子液和含有基因敲除载体pCAMBIA1300-△8018的根癌农杆菌EHA105菌液，混合涂布于铺有玻璃纸的含200 μmol/L乙酰丁香酮的Co-IM诱导培养基平板上，25℃共培养。

（3）转化子筛选验证

共培养4d后将玻璃纸揭起放入空的无菌培养皿中，然后倒入约含有50μg/mL G418和500μg/mL头孢霉素的PDA培养基，25℃培养，从第2天开始观察，将长出的菌落挑至含50μg/mL G418的PDA培养基上，30℃培养7d。如果在培养基上仍然能生长，即推定为转化子，并将之接种到PDB液体培养基中培养，按照SDS裂解法提取丝状真菌总DNA进行分子分析，用两对引物8018-T-F（序列为SEQ ID No:8）和8018-T-R （SEQ ID No:9）、G418-T-F（SEQ ID No:10）和8018-half-R（SEQ ID No:11）进行PCR验证，选取阳性菌株，其电泳结果如图2所示，其中，泳道1：10 000 bp marker；泳道2：2 000bp marker；泳道3：阴性对照；泳道4：亲本菌株；泳道6-8和12：基因8018完全敲除；泳道10、11：假阳性克隆；泳道5和9：基因8018不完全敲除；泳道13：亲本菌株；泳道13-21：重组菌株。经红曲色素初步发酵，确定一株菌株即△8018，为本发明的工程菌株紫色红曲霉（Monascus purpureus）△8018。

上述PDA培养基：马铃薯（去皮）200 g 、葡萄糖20 g、琼脂20g、蒸馏水1000 ml ，自然pH。

3.新构建的重组菌株紫色红曲霉△8018与亲本株M. purpureus LQ-6发酵产胞外红曲色素以及总色素能力的对比。

3.1采用PDA固体培养基培养

将紫色红曲霉△8018与紫色红曲霉M. purpureus LQ-6，在PDA固体培养基培养7d后，用无菌水收集孢子悬液，并调至1×10⁵个/mL，接种量为10%。发酵条件为：30℃，150 rpm发酵至第10天。

发酵培养基：葡萄糖 80 g/L，酵母粉 2.5 g/L，麦芽浸膏 2.5 g/L，蛋白胨 2.5g/L， KH₂PO₄ 5 g/L，CaCl₂ 0.1 g/L，MgSO₄·7H2O 0.5 g/L，FeSO₄·7H₂O 0.01 g/L，ZnSO4·7H₂O 0.01 g/L and MnSO₄·7H₂O 0.03 g/L，pH=5。

3.2 红曲色素色价测定

胞外红曲色素（水溶/发酵液中）色价测定：将发酵液在离心管中定容至25 mL，冷冻高速离心（10000rpm，10min），上清液即为胞外色素。取一定量的滤液用水稀释适当倍数，以水为参照，用紫外分光光度计测定稀释液的吸光度值（红色素吸收主峰在505nm，黄色素吸收主峰在420nm，桔色素吸收主峰在470nm），计算其总色价（红色素+黄色素+桔色素）。计算方法为：总色价=稀释倍数×吸光度。

胞内红曲色素（醇溶）色价测定：发酵液离心后收集沉淀，用70%的乙醇在60℃下萃取2h，期间旋涡震荡数次。冷冻高速离心（10000 rpm，20 min），上清液即为胞内色素。取一定量的滤液用70%乙醇稀释适当倍数，以70%乙醇为参照，用紫外分光光度计测定稀释液的吸光度值（红色素吸收主峰在505nm，黄色素吸收主峰在420 nm，桔色素吸收主峰在470nm），计算其总色价。计算方法同上。

总色价为胞外红曲色素（水溶）色价与胞内红曲色素（醇溶）色价之和。

紫色红曲霉△8018，在发酵第7天，胞外色价与总色价分别为14.57U/mL、106.54U/mL。相比亲本紫色红曲霉M. purpureus LQ-6，胞外色价与总色价分别为21.55U/mL、112.78U/mL，分别提高了47.90%和5.86%，结果如图3、图4所示。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 中南林业科技大学

<120> 一种提高发酵液中红曲色素色价的方法

<141> 2019-03-27

<160> 12

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1902

<212> DNA

<213> monascus_08018基因的核苷酸序列(Monascus purpureus)

<400> 1

agctaaacaa agagtgtctc gtctaaatgg aggcgttaca ctcttccagg atggctgcct 60

tatgtcattc tcgttgaccc atttctcctt ttatctctgc agtacgtcgt ggactttctt 120

ccatttgtca cagtactcaa ttggtaggtc aattcctatt aaggatcatt atcatcgcac 180

tcgctaacag gcactgctat tctatctagt attgtgtaat gatatggctg ttcaaagttc 240

agcgaatgtg gaagcccgtc aagggcatgc caatggcacc atcgggaaaa tggacaagaa 300

agccaacagc actcccaagg actttgcgag ggagcggtgc cctgtaatgg atcccagggt 360

tgactactcc ggccattttg agttcggggg ctctctgggg actttggctc tcatgatcgg 420

cttccccctt ctgatgtact acatgtggat tggagccacc tactacgatg gcaaattacc 480

actaccaaag gatggccagt tatggggaga ctttggcagg catatggtgc accttgtcta 540

ctcgggggca tttcctcatg ctagggcgtg gcgcatctac tggacctact atatcttcga 600

ggctgcatgc tacatctttc tcccgggctt cacttcttat ggcaagccat tgcctcacct 660

gggtgggaaa caactcgtct accactgctc tgcctatacc agcttctatg tcaccatctt 720

agtgatggcg gttttgcatg gcaccggact attccccatc tacacctttc tggatgaatt 780

cggtcccctc atgtcggttt cgatcatttc cggcttcctg gccagttact ttgcctactt 840

ctctgcgttt gcccgcggtg cccaacacag aatcaccggc tacccgatct acgatttctt 900

tatgggcgcc gagctaaacc cacgcctctt cggcatcctg gatttcaaga tgttccatga 960

agttcgcatc ccatggttta tcctctttgg tttaacctgc gccgccgccg ctcgtcagta 1020

cgaaaactat ggctatgtct caggcgaggt catgttcctc gtcatggccc atttcttgta 1080

cgccaacgca tgctccaaag gggaacacct catcacgacc acctgggaca tgtaccagga 1140

gaaaatgggc tttatgttga tcttctggaa catggccggt gtccccatgt cctactgcca 1200

ctgcacgctg tatcttgcca accacgaccc atctgtctac gcatggaaca aatatgccct 1260

agcctcattt ttcctggcct acctcttcgt ctactgggta tgggatacgg cgaacagcca 1320

taagaactcc ttccgaatga tggaacgcgg cacgttcgtg aagcgcaaga ccttccccca 1380

gcttccgtgg caggagatct ataaccctcg gaccatcgca accgatacgg gagacaagat 1440

cctcgtcgat ggttggtacg gtttagcccg taaggtgcac tattcctgtg acatgttctt 1500

tgctctcgcc tggggtttga ttaccagctt cgagagtccg tttccctggt tttatcccgt 1560

gttcttctgt gccatgattg cgcaccgtgc gatgagagat atccaccgat gcagacagaa 1620

atatggtgat gcgtggaaag agtatgagag acaggttcct tatctcttta tcccagtaag 1680

tcgggttacg gcaacaagag ttctattatt cgacggcctc ttgctaacac agagatagta 1740

cgtgatttaa ataaggtcag tgtacattgt tgttgtagtt attacccagc agctctggtg 1800

cggatgccat ttttccatac acgatttcgc gccgtgtatg catgcatgca tagacaatat 1860

tcttccaata ataatattaa tccagtctcc ccttatttac ca 1902

<210> 2

<211> 41

<212> DNA

<213> 8018-up-osc-F(Monascus purpureus)

<400> 2

acagctatga ccatgattac gacttgcctc ttctcctgtc g 41

<210> 3

<211> 40

<212> DNA

<213> 8018-up-osc-R(Monascus purpureus)

<400> 3

atactagtgg atcccccggg ctgcagttac tcctgtcgat 40

<210> 4

<211> 40

<212> DNA

<213> 8018-dn-osc-F(Monascus purpureus)

<400> 4

ttatacgaag ttatgcggcc gccaccgcgg tggagctcgt 40

<210> 5

<211> 41

<212> DNA

<213> 8018-dn-osc-R(Monascus purpureus)

<400> 5

gcatgcctgc aggtcgactc gagaaggaat ctggcctgtt c 41

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> G418-F(Monascus purpureus)

<400> 6

cccgggggat ccactagtat 20

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> G418-R(Monascus purpureus)

<400> 7

cggccgcata acttcgtata 20

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 8018-T-F(Monascus purpureus)

<400> 8

atcgtctcca tcgacaggag 20

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 8018-T-R(Monascus purpureus)

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gactggatat gggctatggc 20

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> G418-T-F(Monascus purpureus)

<400> 10

tcggagttga aagggcagtt 20

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 8018-half-R(Monascus purpureus)

<400> 11

cgggaagtct ggcacattgt 20

<210> 12

<211> 13978

<212> DNA

<213> 质粒PCAMBIA1300-△8018核苷酸序列(Monascus purpureus)

<400> 12

tcgacctgca ggcatgcaag cttggcactg gccgtcgttt tacaacgtcg tgactgggaa 60

aaccctggcg ttacccaact taatcgcctt gcagcacatc cccctttcgc cagctggcgt 120

aatagcgaag aggcccgcac cgatcgccct tcccaacagt tgcgcagcct gaatggcgaa 180

tgctagagca gcttgagctt ggatcagatt gtcgtttccc gccttcagtt taaactatca 240

gtgtttgaca ggatatattg gcgggtaaac ctaagagaaa agagcgttta ttagaataac 300

ggatatttaa aagggcgtga aaaggtttat ccgttcgtcc atttgtatgt gcatgccaac 360

cacagggttc ccctcgggat caaagtactt tgatccaacc cctccgctgc tatagtgcag 420

tcggcttctg acgttcagtg cagccgtctt ctgaaaacga catgtcgcac aagtcctaag 480

ttacgcgaca ggctgccgcc ctgccctttt cctggcgttt tcttgtcgcg tgttttagtc 540

gcataaagta gaatacttgc gactagaacc ggagacatta cgccatgaac aagagcgccg 600

ccgctggcct gctgggctat gcccgcgtca gcaccgacga ccaggacttg accaaccaac 660

gggccgaact gcacgcggcc ggctgcacca agctgttttc cgagaagatc accggcacca 720

ggcgcgaccg cccggagctg gccaggatgc ttgaccacct acgccctggc gacgttgtga 780

cagtgaccag gctagaccgc ctggcccgca gcacccgcga cctactggac attgccgagc 840

gcatccagga ggccggcgcg ggcctgcgta gcctggcaga gccgtgggcc gacaccacca 900

cgccggccgg ccgcatggtg ttgaccgtgt tcgccggcat tgccgagttc gagcgttccc 960

taatcatcga ccgcacccgg agcgggcgcg aggccgccaa ggcccgaggc gtgaagtttg 1020

gcccccgccc taccctcacc ccggcacaga tcgcgcacgc ccgcgagctg atcgaccagg 1080

aaggccgcac cgtgaaagag gcggctgcac tgcttggcgt gcatcgctcg accctgtacc 1140

gcgcacttga gcgcagcgag gaagtgacgc ccaccgaggc caggcggcgc ggtgccttcc 1200

gtgaggacgc attgaccgag gccgacgccc tggcggccgc cgagaatgaa cgccaagagg 1260

aacaagcatg aaaccgcacc aggacggcca ggacgaaccg tttttcatta ccgaagagat 1320

cgaggcggag atgatcgcgg ccgggtacgt gttcgagccg cccgcgcacg tctcaaccgt 1380

gcggctgcat gaaatcctgg ccggtttgtc tgatgccaag ctggcggcct ggccggccag 1440

cttggccgct gaagaaaccg agcgccgccg tctaaaaagg tgatgtgtat ttgagtaaaa 1500

cagcttgcgt catgcggtcg ctgcgtatat gatgcgatga gtaaataaac aaatacgcaa 1560

ggggaacgca tgaaggttat cgctgtactt aaccagaaag gcgggtcagg caagacgacc 1620

atcgcaaccc atctagcccg cgccctgcaa ctcgccgggg ccgatgttct gttagtcgat 1680

tccgatcccc agggcagtgc ccgcgattgg gcggccgtgc gggaagatca accgctaacc 1740

gttgtcggca tcgaccgccc gacgattgac cgcgacgtga aggccatcgg ccggcgcgac 1800

ttcgtagtga tcgacggagc gccccaggcg gcggacttgg ctgtgtccgc gatcaaggca 1860

gccgacttcg tgctgattcc ggtgcagcca agcccttacg acatatgggc caccgccgac 1920

ctggtggagc tggttaagca gcgcattgag gtcacggatg gaaggctaca agcggccttt 1980

gtcgtgtcgc gggcgatcaa aggcacgcgc atcggcggtg aggttgccga ggcgctggcc 2040

gggtacgagc tgcccattct tgagtcccgt atcacgcagc gcgtgagcta cccaggcact 2100

gccgccgccg gcacaaccgt tcttgaatca gaacccgagg gcgacgctgc ccgcgaggtc 2160

caggcgctgg ccgctgaaat taaatcaaaa ctcatttgag ttaatgaggt aaagagaaaa 2220

tgagcaaaag cacaaacacg ctaagtgccg gccgtccgag cgcacgcagc agcaaggctg 2280

caacgttggc cagcctggca gacacgccag ccatgaagcg ggtcaacttt cagttgccgg 2340

cggaggatca caccaagctg aagatgtacg cggtacgcca aggcaagacc attaccgagc 2400

tgctatctga atacatcgcg cagctaccag agtaaatgag caaatgaata aatgagtaga 2460

tgaattttag cggctaaagg aggcggcatg gaaaatcaag aacaaccagg caccgacgcc 2520

gtggaatgcc ccatgtgtgg aggaacgggc ggttggccag gcgtaagcgg ctgggttgtc 2580

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aaccatccgg cccggtacaa atcggcgcgg cgctgggtga tgacctggtg gagaagttga 2700

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atgacgtggg cacccgcgat agtcgcagca tcatggacgt ggccgttttc cgtctgtcga 2940

agcgtgaccg acgagctggc gaggtgatcc gctacgagct tccagacggg cacgtagagg 3000

tttccgcagg gccggccggc atggccagtg tgtgggatta cgacctggta ctgatggcgg 3060

tttcccatct aaccgaatcc atgaaccgat accgggaagg gaagggagac aagcccggcc 3120

gcgtgttccg tccacacgtt gcggacgtac tcaagttctg ccggcgagcc gatggcggaa 3180

agcagaaaga cgacctggta gaaacctgca ttcggttaaa caccacgcac gttgccatgc 3240

agcgtacgaa gaaggccaag aacggccgcc tggtgacggt atccgagggt gaagccttga 3300

ttagccgcta caagatcgta aagagcgaaa ccgggcggcc ggagtacatc gagatcgagc 3360

tagctgattg gatgtaccgc gagatcacag aaggcaagaa cccggacgtg ctgacggttc 3420

accccgatta ctttttgatc gatcccggca tcggccgttt tctctaccgc ctggcacgcc 3480

gcgccgcagg caaggcagaa gccagatggt tgttcaagac gatctacgaa cgcagtggca 3540

gcgccggaga gttcaagaag ttctgtttca ccgtgcgcaa gctgatcggg tcaaatgacc 3600

tgccggagta cgatttgaag gaggaggcgg ggcaggctgg cccgatccta gtcatgcgct 3660

accgcaacct gatcgagggc gaagcatccg ccggttccta atgtacggag cagatgctag 3720

ggcaaattgc cctagcaggg gaaaaaggtc gaaaaggtct ctttcctgtg gatagcacgt 3780

acattgggaa cccaaagccg tacattggga accggaaccc gtacattggg aacccaaagc 3840

cgtacattgg gaaccggtca cacatgtaag tgactgatat aaaagagaaa aaaggcgatt 3900

tttccgccta aaactcttta aaacttatta aaactcttaa aacccgcctg gcctgtgcat 3960

aactgtctgg ccagcgcaca gccgaagagc tgcaaaaagc gcctaccctt cggtcgctgc 4020

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tgacacatgc agctcccgga gacggtcaca gcttgtctgt aagcggatgc cgggagcaga 4260

caagcccgtc agggcgcgtc agcgggtgtt ggcgggtgtc ggggcgcagc catgacccag 4320

tcacgtagcg atagcggagt gtatactggc ttaactatgc ggcatcagag cagattgtac 4380

tgagagtgca ccatatgcgg tgtgaaatac cgcacagatg cgtaaggaga aaataccgca 4440

tcaggcgctc ttccgcttcc tcgctcactg actcgctgcg ctcggtcgtt cggctgcggc 4500

gagcggtatc agctcactca aaggcggtaa tacggttatc cacagaatca ggggataacg 4560

caggaaagaa catgtgagca aaaggccagc aaaaggccag gaaccgtaaa aaggccgcgt 4620

tgctggcgtt tttccatagg ctccgccccc ctgacgagca tcacaaaaat cgacgctcaa 4680

gtcagaggtg gcgaaacccg acaggactat aaagatacca ggcgtttccc cctggaagct 4740

ccctcgtgcg ctctcctgtt ccgaccctgc cgcttaccgg atacctgtcc gcctttctcc 4800

cttcgggaag cgtggcgctt tctcatagct cacgctgtag gtatctcagt tcggtgtagg 4860

tcgttcgctc caagctgggc tgtgtgcacg aaccccccgt tcagcccgac cgctgcgcct 4920

tatccggtaa ctatcgtctt gagtccaacc cggtaagaca cgacttatcg ccactggcag 4980

cagccactgg taacaggatt agcagagcga ggtatgtagg cggtgctaca gagttcttga 5040

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gtagcggtgg tttttttgtt tgcaagcagc agattacgcg cagaaaaaaa ggatctcaag 5220

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ggattttggt catgcattct aggtactaaa acaattcatc cagtaaaata taatatttta 5340

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aatcatacag ctcgcgcgga tctttaaatg gagtgtcttc ttcccagttt tcgcaatcca 5640

catcggccag atcgttattc agtaagtaat ccaattcggc taagcggctg tctaagctat 5700

tcgtataggg acaatccgat atgtcgatgg agtgaaagag cctgatgcac tccgcataca 5760

gctcgataat cttttcaggg ctttgttcat cttcatactc ttccgagcaa aggacgccat 5820

cggcctcact catgagcaga ttgctccagc catcatgccg ttcaaagtgc aggacctttg 5880

gaacaggcag ctttccttcc agccatagca tcatgtcctt ttcccgttcc acatcatagg 5940

tggtcccttt ataccggctg tccgtcattt ttaaatatag gttttcattt tctcccacca 6000

gcttatatac cttagcagga gacattcctt ccgtatcttt tacgcagcgg tatttttcga 6060

tcagtttttt caattccggt gatattctca ttttagccat ttattatttc cttcctcttt 6120

tctacagtat ttaaagatac cccaagaagc taattataac aagacgaact ccaattcact 6180

gttccttgca ttctaaaacc ttaaatacca gaaaacagct ttttcaaagt tgttttcaaa 6240

gttggcgtat aacatagtat cgacggagcc gattttgaaa ccgcggtgat cacaggcagc 6300

aacgctctgt catcgttaca atcaacatgc taccctccgc gagatcatcc gtgtttcaaa 6360

cccggcagct tagttgccgt tcttccgaat agcatcggta acatgagcaa agtctgccgc 6420

cttacaacgg ctctcccgct gacgccgtcc cggactgatg ggctgcctgt atcgagtggt 6480

gattttgtgc cgagctgccg gtcggggagc tgttggctgg ctggtggcag gatatattgt 6540

ggtgtaaaca aattgacgct tagacaactt aataacacat tgcggacgtt tttaatgtac 6600

tgaattaacg ccgaattaat tcgggggatc tggattttag tactggattt tggttttagg 6660

aattagaaat tttattgata gaagtatttt acaaatacaa atacatacta agggtttctt 6720

atatgctcaa cacatgagcg aaaccctata ggaaccctaa ttcccttatc tgggaactac 6780

tcacacatta ttatggagaa actcgagctt gtcgatcgac agatccggtc ggcatctact 6840

ctatttcttt gccctcggac gagtgctggg gcgtcggttt ccactatcgg cgagtacttc 6900

tacacagcca tcggtccaga cggccgcgct tctgcgggcg atttgtgtac gcccgacagt 6960

cccggctccg gatcggacga ttgcgtcgca tcgaccctgc gcccaagctg catcatcgaa 7020

attgccgtca accaagctct gatagagttg gtcaagacca atgcggagca tatacgcccg 7080

gagtcgtggc gatcctgcaa gctccggatg cctccgctcg aagtagcgcg tctgctgctc 7140

catacaagcc aaccacggcc tccagaagaa gatgttggcg acctcgtatt gggaatcccc 7200

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gttggagccg aaatccgcgt gcacgaggtg ccggacttcg gggcagtcct cggcccaaag 7320

catcagctca tcgagagcct gcgcgacgga cgcactgacg gtgtcgtcca tcacagtttg 7380

ccagtgatac acatggggat cagcaatcgc gcatatgaaa tcacgccatg tagtgtattg 7440

accgattcct tgcggtccga atgggccgaa cccgctcgtc tggctaagat cggccgcagc 7500

gatcgcatcc atagcctccg cgaccggttg tagaacagcg ggcagttcgg tttcaggcag 7560

gtcttgcaac gtgacaccct gtgcacggcg ggagatgcaa taggtcaggc tctcgctaaa 7620

ctccccaatg tcaagcactt ccggaatcgg gagcgcggcc gatgcaaagt gccgataaac 7680

ataacgatct ttgtagaaac catcggcgca gctatttacc cgcaggacat atccacgccc 7740

tcctacatcg aagctgaaag cacgagattc ttcgccctcc gagagctgca tcaggtcgga 7800

gacgctgtcg aacttttcga tcagaaactt ctcgacagac gtcgcggtga gttcaggctt 7860

tttcatatct cattgccccc cgggatctgc gaaagctcga gagagataga tttgtagaga 7920

gagactggtg atttcagcgt gtcctctcca aatgaaatga acttccttat atagaggaag 7980

gtcttgcgaa ggatagtggg attgtgcgtc atcccttacg tcagtggaga tatcacatca 8040

atccacttgc tttgaagacg tggttggaac gtcttctttt tccacgatgc tcctcgtggg 8100

tgggggtcca tctttgggac cactgtcggc agaggcatct tgaacgatag cctttccttt 8160

atcgcaatga tggcatttgt aggtgccacc ttccttttct actgtccttt tgatgaagtg 8220

acagatagct gggcaatgga atccgaggag gtttcccgat attacccttt gttgaaaagt 8280

ctcaatagcc ctttggtctt ctgagactgt atctttgata ttcttggagt agacgagagt 8340

gtcgtgctcc accatgttat cacatcaatc cacttgcttt gaagacgtgg ttggaacgtc 8400

ttctttttcc acgatgctcc tcgtgggtgg gggtccatct ttgggaccac tgtcggcaga 8460

ggcatcttga acgatagcct ttcctttatc gcaatgatgg catttgtagg tgccaccttc 8520

cttttctact gtccttttga tgaagtgaca gatagctggg caatggaatc cgaggaggtt 8580

tcccgatatt accctttgtt gaaaagtctc aatagccctt tggtcttctg agactgtatc 8640

tttgatattc ttggagtaga cgagagtgtc gtgctccacc atgttggcaa gctgctctag 8700

ccaatacgca aaccgcctct ccccgcgcgt tggccgattc attaatgcag ctggcacgac 8760

aggtttcccg actggaaagc gggcagtgag cgcaacgcaa ttaatgtgag ttagctcact 8820

cattaggcac cccaggcttt acactttatg cttccggctc gtatgttgtg tggaattgtg 8880

agcggataac aatttcacac aggaaacagc tatgaccatg attacgaatt cgaacttgcc 8940

tcttctcctg tcggcgtgat gtccacgtga tcgtacgcag gatactccgt agtctgggga 9000

gatgccgaga tggagaagtt gaagcttatg tcttatggca tacaattagt ctagcatgct 9060

gtgaacagtc tattgtcgaa gtgaaagccg cggtattgca actagcagtg tattaagaac 9120

catagcttat tccccaggtc ctttctagtg ggatgccatt ttccactgac ttagactata 9180

cagacaaggt ccatattacc gataagctgc aatgtgaaga tcaaacaggc aagatcagaa 9240

aggcgtagtc ggaataaaag ccccccctaa gctacattcc tgcgtatgct tgcaaccggt 9300

cgtcctaatg agcagggacc acaacgttca gttgagattc ccggctgagc ttcttggaat 9360

gagatgttcg ccgccggtaa agctgagcta ccgtcggctt ttctctttgg gcattatgat 9420

cttcgggtat agtcatcggc acgtaccgcg agcaactgca tctgagacga aatgaacagg 9480

ggatccggtc cgccttccag tgtgcatttg caaaaacacc ttcctcaagg gggctggcag 9540

cacagataac ccacgaatgg aagcaacgtc ttgaaccggc aagacaaatc gtggctaagt 9600

ggcgggggat gagatagcac cacgacgatt cagaaaggaa tattcgaaaa agcaaagccg 9660

taattagagg cgttgatctc gcccagactt gtctcgttca tctaaaagat ccaaccaagg 9720

accagccaga ttcccacacc tacaccggca cagatcccag ccaccttcaa cacagcgacg 9780

gtgtcaccct gtttcgccat ccgggtgaga cgggaggcgc tgcctttcag actcgttgag 9840

aaagacgcga agacatcatt ctgtatttca gcaccaacat cagtctcaat ggccaatcca 9900

acaaagcata aatcccgcag tgagaagaat ctgctagaag aggacaaggg ggctggaagt 9960

acgaaccgca ttatcaaggg tctcctggtc tcgcgcatta tcatagatat ccaccgtgac 10020

agatcggaga gccgacacct tggatgagag ggaattaagg agtgcgttat tttgtctgtt 10080

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gtaaaaaggg tgaacgcaaa cactatatgg aacagagact ggggatgaaa gaacctactg 10200

ctcgcgttcg taggcgtcac ccatcttgga aatgactctt gttgaagctt atccgtggta 10260

tgcagtagga tcaaagaaag agaaacgcag ttctgatctg gagatgcaag gaaccagatt 10320

gaacccttga tcttgaaatt ctcacgtgac cagtgccacc ctctaataat acttagtacc 10380

taggcagcat gtttaatcgt ctccatcgac aggagtaact gcagcccggg ggatccacta 10440

gtataacttc gtatagcata cattatacga agttattcga cagaagatga tattgaagga 10500

gcactttttg ggcttggctg gagctagtgg aggtcaacaa tgaatgccta ttttggttta 10560

gtcgtccagg cggtgagcac aaaatttgtg tcgtttgaca agatggttca tttaggcaac 10620

tggtcagatc agccccactt gtagcagtag cggcggcgct cgaagtgtga ctcttattag 10680

cagacaggaa cgaggacatt attatcatct gctgcttggt gcacgataac ttggtgcgtt 10740

tgtcaagcaa ggtaagtgaa cgacccggtc ataccttctt aagttcgccc ttcctccctt 10800

tatttcagat tcaatctgac ttacctattc tacccaagca tcgataagct tcgattagga 10860

agtagccacc atgggcaagg agaagaccca cgtctcccgc ccccgtctca actccaacat 10920

ggacgctgac ctctacggtt acaagtgggc ccgcgacaac gtcggccagt ccggtgctac 10980

catctaccgt ctctacggca agcccgacgc ccctgagctg ttcctcaagc acggcaaggg 11040

ctccgtcgct aacgatgtca ccgacgagat ggtccgcctc aactggctca ccgagttcat 11100

gcccctccct accatcaagc acttcatccg tacccctgac gacgcttggc tcctcaccac 11160

cgctatccct ggcaagaccg ccttccaggt cctggaggag taccccgact ccggcgagaa 11220

catcgtcgat gccctcgctg tcttcctccg ccgtctccac tccatccccg tctgcaactg 11280

ccctttcaac tccgaccgtg tcttccgtct cgctcaggct cagtcccgca tgaacaacgg 11340

tctcgtcgat gcctccgact tcgacgacga gcgtaacggc tggcctgtcg agcaggtctg 11400

gaaggagatg cacaagctcc tccccttctc ccctgactcc gtcgtcaccc acggcgactt 11460

ctccctcgac aacctcatct tcgacgaggg caagctcatc ggctgcatcg atgtcggtcg 11520

cgtcggcatc gctgaccgtt accaggacct cgccatcctc tggaactgcc tcggcgagtt 11580

ctccccctcc ctccagaagc gcctcttcca gaagtacggc atcgacaacc ctgacatgaa 11640

caagctccag ttccacctca tgctcgacga gttcttctaa ctcgagagta gatgccgacc 11700

gggatccact taacgttact gaaatcatca aacagcttga cgaatctgga tataagatcg 11760

ttggtgtcga tgtcagctcc ggagttgaga caaatggtgt tcaggatctc gataagatac 11820

gttcatttgt ccaagcagca aagagtgcct tctagtgatt taatagctcc atgtcaacaa 11880

gaataaaacg cgtttcgggt ttacctcttc cagatacagc tcatctgcaa tgcattaatg 11940

cattggacct cgcaacccta gtacgccctt caggctccgg cgaagcagaa gaatagctta 12000

gcagagtcta ttttcatttt cgggagacga gatcaagcag atcaacggtc gtcaagagac 12060

ctacgagact gaggaatccg ctcttggctc cacgcgacta tatatttgtc tctaattgta 12120

ctttgacatg ctcctcttct ttactctgat agcttgacta tgaaaattcc gtcaccagcc 12180

cctgggttcg caaagataat tgcactgttt cttccttgaa ctctcaagcc tacaggacac 12240

acattcatcg taggtataaa cctcgaaaat cattcctact aagatgggta tacaatagta 12300

accatggttg cctagtgaat gctccgtaac acccaatacg ccggccgaaa cttttttaca 12360

actctcctat gagtcgttta cccagaatgc acaggtacac ttgtttagag gtaatccttc 12420

tttctagaat aacttcgtat agcatacatt atacgaagtt atgcggccgc caccgcggtg 12480

gagctcgttg ccatagccca tatccagtct ctacttgcca acgactacca gaagttccaa 12540

tataggaata aatataaaaa ctgtctgtgt agcatacaag gaatgaaata tagggcacgt 12600

agacctacaa tggctacaac ataatgggct ctgcaggtgt gatagggtca cacacagctt 12660

aaaagattat cgaagaatct caccaaaaag atctatctaa attcccttga acgaatgagc 12720

gaggattatc cgatgctttt acgaaatggg aaggagacgc agaactgtta ccggaatcca 12780

taattatgga atctaaaggc ctaagctttg cttggactat cacaaagtga ggtcaatgcc 12840

aaattgtcgg aagatttcat agaccatgac cgcagtacta acagggaaac gagaaccaaa 12900

gaaaacccaa cgcagacgct atgcaaagtc agaaatcgga caatgtgcca gacttcccgg 12960

gtaccagacc gtatgcagag tcaagatcaa gaatatgctc ggttgtgtac ctaaggtgtc 13020

ttaaagggca caatgatgac aaggacagca gtatatcaaa tgaaatagac tgcggccctt 13080

ggacggcatc agtcctggca gtttactcca gtttccctgg tgtatataac aatatgaaca 13140

ttagccttct cgtctcgcca gaagccagaa agaaggcggg acaagagaag aatatcggtc 13200

gtcagtgtgc aattctatca acggcttgga gcttcacaaa aatcaagggt attttccgcg 13260

cgctcgagaa taaacaaaaa tagcagcaga gaaacaccag ttactggcgg tctagcttcc 13320

cttaaaacat gtcatcgtca tcgtcatcta attggttttg tccggcatat gccgggtttg 13380

cataattata ctgctggtaa tgccccgggc catatgcact tccactatca taactgtgcg 13440

aacggctcga tccgtaagcg tcatgcctgt tgtcgtgatc gtactcatac atttgaggat 13500

tgtcataggc attatcgtca aattgcatct gttgctgtgg tttgatgtta gtatattttg 13560

gtgaaaagca cagacggaac gacggggtct ggcttacctc ttggtatctc tgatattgca 13620

gatactcgtc cgtttggtcc gatttttgct gcctctgtgc agctgctgcg gccatcatca 13680

ttgttggatg catttgctgc actttcgcaa ggtaggagta catgaaattg ctcaaaagaa 13740

cttgagagta aagcgctcgt cgaggatttg cgagtttgat atgcgccatt cggtagatcg 13800

ctcgctcttc aaggatcgaa aacctgctcc aagcgtagtc gatatctggc cgaagctcac 13860

gaacaggagg gtcgggggat agattccgcg agacgtgctt tttgtgatga ccatccccgt 13920

tgctcttctt cttcacgcca ccaaatatcg atgagaacag gccagattcc ttctcgag 13978

Claims (6)

1.一种提高发酵液中红曲色素色价的方法，其特征在于：利用基因敲除技术使红曲霉菌中编码C-24(28)-甾醇还原酶的ERG4基因缺失，得到重组菌株，利用所述重组菌株发酵产红曲色素；所述红曲霉菌为紫色红曲霉菌M. purpureus；所述编码C-24(28)-甾醇还原酶的ERG4基因为monascus_08018，其核苷酸序列如SEQ ID No:1所示。

2.根据权利要求1所述提高发酵液中红曲色素色价的方法，其特征在于：所述基因敲除技术是利用同源重组技术，通过根癌农杆菌EHA105介导转化T-DNA技术使得紫色红曲霉菌中编码甾醇还原酶的ERG4基因monascus_08018缺失，包括以下步骤：

（1）利用软件分析编码甾醇还原酶的ERG4基因monascus_08018的核苷酸序列；

（2）以紫色红曲霉菌M. purpureus LQ-6的cDNA 为模板，以8018-up-osc-F和8018-up-osc-R为第一对引物，以8018-dn-osc-F和8018-dn-osc-R为第二对引物，将两对引物分别进行PCR扩增得到monascus_08018基因的5＇端和3＇端同源臂片段；所述8018-up-osc-F的序列为SEQ ID No:2；所述8018-up-osc-R的序列为SEQ ID No:3；所述8018-dn-osc-F的序列为SEQ ID No:4；所述8018-dn-osc-R的序列为SEQ ID No:5；

（3）以质粒pXS为模板，以G418-F和G418-R为一对引物进行PCR扩增得到G418基因片段；所述G418-F的序列为SEQ ID No:6；所述G418-R的序列为SEQ ID No:7；

（4）采用Overlap PCR技术，以monascus_08018基因的5＇端和3＇端同源臂片段以及G418基因片段为模板，以8018-up-osc-F和8018-dn-osc-R为一对引物进行PCR扩增得到△8018目的片段；

（5）用EcoR I和Sal I双酶切双元表达载体pCAMBIA1300，胶回收线性化载体，利用一步克隆技术连接线性化双元载体pCAMBIA1300与△8018目的片段，即得到基因敲除载体pCAMBIA1300-△8018；所述质粒pCAMBIA1300-△8018序列为SEQ ID No:12；

（6）根癌农杆菌EHA105介导基因敲除载体pCAMBIA1300-△8018转化至紫色红曲霉菌中，筛选阳性克隆，即得到液态发酵中红曲色素高产菌株；其中，步骤（2）中所述紫色红曲霉M. purpureus LQ-6于2018年09月07日在中国典型保藏中心保藏，保藏编号是CCTCC M2018600。

3.根据权利要求2 所述提高发酵液中红曲色素色价的方法，其特征在于：步骤（6）中所述根癌农杆菌EHA105介导基因敲除载体pCAMBIA1300-△8018是通过液氮冻融法将所述基因敲除载体pCAMBIA1300-△8018导入根癌农杆菌EHA105，具体步骤如下：取2 μg所述基因敲除载体pCAMBIA1300-△8018加入到200μL的根癌农杆菌EHA105感受态细胞中，混匀后冰浴30 min；液氮中速冻1min，后用37℃金属浴保温3 min；加入800 μL的YEB液体培养基，28℃培养3h；室温下以5000 rpm的转速离心5min，浓缩菌体；取200 μL浓缩后的菌液涂布于含有50 mg/L 利福平、50 mg/L卡那霉素的YEB选择性培养基平板上，28℃倒置培养48 h；挑选转化子于YEB液体培养基中培养，并用引物对克隆子进行筛选，得到阳性克隆子，即为含有基因敲除载体pCAMBIA1300-△8018的根癌农杆菌EHA105。

4.根据权利要求2所述提高发酵液中红曲色素色价的方法，其特征在于，步骤（6）中转化步骤如下：将所述紫色红曲霉菌接种到PDA斜面培养基，30℃培养7d，用无菌水从斜面上洗下紫色红曲霉菌孢子，通过两层无菌擦镜纸过滤，调节孢子浓度；取含有基因敲除载体pCAMBIA1300-△8018的根癌农杆菌EHA105，接种于3mL含50μg/mL 利福平，50μg/mL卡那霉素的YEB液体培养基中，28℃，220rpm培养12～24h，取250μL的菌液于50mLMM培养基中，在相同条件下培养2d，测培养基中农杆菌的值，并用IM培养基稀释菌液至OD₆₀₀值为0.15；再在相同条件下培养6h得农杆菌液备用；将所得的紫色红曲霉孢子液和含有基因敲除载体pCAMBIA1300-△8018的根癌农杆菌EHA105菌液，混合涂布于铺有玻璃纸的含200 μmol/L乙酰丁香酮的Co-IM诱导培养基平板上，25℃共培养。

5.根据权利要求4所述的提高发酵液中红曲色素色价的方法，其特征在于，步骤（6）中筛选阳性克隆的具体步骤如下：共培养4d后将玻璃纸揭起放入空的无菌培养皿中，然后倒入含有50 μg/mL G418和500 μg/mL头孢霉素的PDA培养基，25℃培养，从第2天开始观察，将长出的菌落挑至含50 μg/mL G418的PDA培养基上，30℃培养7d；如果在培养基上仍然能生长，即推定为转化子，并将之接种到PDB液体培养基中培养，按照SDS裂解法提取丝状真菌总DNA进行分子分析，以提取基因组为模板，用两对引物8018-T-F和8018-T-R、G418-T-F和8018-half-R进行PCR验证，选取阳性菌株；所述8018-T-F的序列为SEQ ID No:8；所述8018-T-R的序列为SEQ ID No:9；所述G418-T-F的序列为SEQ ID No:10；所述8018-half-R的序列为SEQ ID No:11。

6.根据权利要求3所述提高发酵液中红曲色素色价的方法，其特征在于：所述根癌农杆菌EHA105感受态细胞的制备方法如下：将根癌农杆菌EHA105接种于5～10 mL含有50 mg/L利福平的YEB液体培养基中，以温度28℃、转速200 rpm的条件培养24～48 h至对数生长期；取500 μL活化的菌液接种于20 mL含有50 mg/L利福平的YEB液体培养基中，以温度28℃、转速200rpm的条件培养至菌液OD₆₀₀=0.5；将菌液冰浴30 min后，在4℃条件下以5000 rpm的转速离心5 min，弃上清，收集菌体；用50 mmol/L CaCl₂洗涤菌体两次，再重悬于2 mL 50mmol/L CaCl₂中，得到根癌农杆菌EHA105感受态细胞。

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