CN113122554A - 在拟南芥中高效表达Bs3Cas12b蛋白的核酸分子及其在基因组编辑中的应用 - Google Patents

在拟南芥中高效表达Bs3Cas12b蛋白的核酸分子及其在基因组编辑中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种在拟南芥中高效表达Bs3Cas12b蛋白的核酸分子，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，本发明还涉及上述核酸分子在基因组编辑中的应用。本发明为植物基础科学研究提供了新的工具，并为CRISPR‑Cas12b系统在作物育种上的应用提供技术支持。

Description

在拟南芥中高效表达Bs3Cas12b蛋白的核酸分子及其在基因 组编辑中的应用
技术领域
本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及一种在拟南芥中高效表达Bs3Cas12b蛋白的核酸分子、用于转化拟南芥的载体构建及优化方案，用其构建的拟南芥基因组编辑的CRISPR-Bs3Cas12b系统可在拟南芥基因组中进行靶向编辑。
背景技术
CRISPR-Cas系统是细菌中存在的一种可抵御外源遗传物质入侵的后天获得性免疫系统。2012年，美国加州大学伯克利分校的Doudna与法国微生物学家Charpentier首次将CRISPR-Cas9系统用于基因组编辑，随后哈弗大学的张峰将其改造用于哺乳动物，自此该技术迅速发展起来。CRISPR-Cas系统作为第三代基因组编辑技术，具有简单、高效、灵活、低廉等优点，被广泛应用于多个物种的基因组编辑研究中,成为了生命科学领域的革命性工具。2013年，多个研究小组首次分别在水稻、小麦、拟南芥和烟草中同时证明了Cas9蛋白的基因组编辑功能。目前，已报道的可在植物中进行基因组编辑的Cas蛋白有：Cas9、Cas12a和Cas12b（又称C2c1），以及近期Doudna开发的CasΦ（仅在拟南芥原生质体中被验证且效率较低）。但CRISPR-Cas系统也存在一些不足，如编辑范围限定、脱靶效应和精确编辑效率低的问题，不同的Cas蛋白具有不同的可编辑范围，新的编辑系统亟待开发以促进了CRISPR-Cas系统的广泛应用。
Cas12b/C2c1蛋白属于Cas蛋白家族中class 2中的type V-B型。该蛋白具有一个保守的RuvC结构域和一个Nuc结构域，需要crRNA和tracrRNA的共同引导，识别富含AT的PAM序列，切割DNA双链，产生5’粘性末端。因此，Cas12b蛋白的可编辑范围不同于Cas9和Cas12a，可拓展CRISPR-Cas系统的可编辑范围。2015年，哈弗大学的张峰首次鉴定出了Cas12b蛋白（Aac和Bth）具有基因组编辑的潜力。2018年，中科院动物所李伟首次开发AaCas12b蛋白用于哺乳动物基因组编辑。2019年，张峰和李伟又分别开发了另外开发了Bhv4和Bv，以及Bs3、Ak、Am、Ls和Tc等Cas12b蛋白用于哺乳动物基因组编辑。这些蛋白很快被开发用于植物的基因组编辑，2020年电子科技大学张勇将Aac、Bth、Aa和Bh v4用于水稻；河北科技大学孔德晶将Bh v4和Bv用于拟南芥；华中农业大学金双侠将Aac用于棉花。
现有在拟南芥中可进行基因组编辑的CRISPR-Cas12b系统蛋白为Bh v4和Bv，而Bs3Cas12b蛋白仅被报道可用于哺乳动物的基因组编辑，在植物中的功能尚无报道。
发明内容
为了丰富植物基因组编辑工具，促进CRISPR-Cas12b系统在植物上的应用，本发明提供一种在拟南芥中高效表达Bs3Cas12b蛋白的核酸分子及其在基因组编辑中的应用。
本发明采用如下技术方案：
一种在拟南芥中高效表达Bs3Cas12b蛋白的核酸分子，其核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示。
一种质粒，其包含如SEQ ID NO.1所示核苷酸序列。
作为质粒的进一步优化，其还包括位于SEQ ID NO.1所示核苷酸序列之前的PolⅢ启动子-BsaI酶切位点-Poly T-scaffold-Pol Ⅱ型启动子-Ω增强子-Kozak序列以及位于SEQ ID NO.1所示核苷酸序列之后的3×NLS核定位信号-P2A-EGFP-NOS-CaMV 35S启动子-HygR- CaMV Poly（A）。
其中，“-”表示键或核苷酸连接序列。
其中，Pol Ⅲ启动子为AtU6-26。
其中，Pol Ⅱ型启动子为CaMV 35S。
一种农杆菌，其包含上述质粒。
作为农杆菌的进一步优化，农杆菌中质粒的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
一种在拟南芥中高效表达Bs3Cas12b蛋白的核酸分子在拟南芥基因组编辑中的应用。
应用中，上述拟南芥中高效表达Bs3Cas12b蛋白的核酸分子用于拟南芥基因组编辑的CRISPR-Cas12b系统的构建。
本发明的有益效果在于：本发明对Bs3Cas12b蛋白的密码子进行优化，适用于拟南芥中表达，并可对CRISPR-Bs3Cas12b系统的表达质粒进行优化，为植物基础科学研究提供了新的工具，并为CRISPR-Cas12b系统在作物育种上的应用提供技术支持。
附图说明
图1为本发明pAtCas401载体结构示意图。
图2为明场下Bs3Cas12b-P2A-EGFP质粒在原生质体细胞中的表达图。
图3为GFP荧光下EGFP分散在原生质体细胞内的图像。
图4为DsRed视野下叶绿体自发荧光图。
图5为叠加视野下，EGFP荧光蛋白所发荧光与叶绿体自发荧光的叠加图。
图6为本发明CRISPR-Bs3Cas12b系统在拟南芥基因组中靶向编辑图。
具体实施方式
下面将结合本申请实施例中的附图，对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。以下对至少一个示例性实施例的描述实际上仅仅是说明性的，决不作为对本申请及其应用或使用的任何限制。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。
实施例1 Bs3Cas12b蛋白的核酸序列
依据拟南芥的密码子偏好对编码Bs3Cas12b的蛋白的核酸序列进行优化，得到可以在拟南芥中高效表达Bs3Cas12b蛋白的核酸分子的核苷酸序列，如SEQ ID No.1所示。
实施例2 pAtCas401质粒载体的构建
如图1所示，采用Pol Ⅲ启动子AtU6-26表达sgRNA，其后添加BsaI酶切位点，用于guide的连接与替换，随后采用5种蛋白特异识别的scaffold，终止信号为Poly T。CaMV 35S是Pol Ⅱ型启动子，为植物系统中常用的强启动子，启动（Ak、Am、Bs3、Ls、Tc）Cas12b蛋白表达，引入Ω增强子和Kozak序列增强蛋白表达，5种Cas12b蛋白的核酸序列进行密码子优化，并添加3×NLS核定位信号以保证Cas12b蛋白的细胞核表达；引入P2A减少EGFP和Cas12b蛋白结构的影响，EGFP荧光蛋白标定转入的质粒在原生质体细胞中的转化效率，NOS为CaMV35S的终止子。采用CaMV 35S启动子启动潮霉素表达，为植株水平抗性筛选标记，CaMV Poly（A）为终止子。RB/LB为农杆菌侵染拟南芥时所识别的T-DNA左右边界。
实施例3 pAtCas401载体的保存
将pAtCas401载体转化大肠杆菌DH5α超级感受态细胞：从-80℃冰箱中取出之前制备好的超级感受态细胞，迅速地转移至预先准备的便携式冰盒内，在冰盒内化冻10min，当观察到感受态细胞从冰冻状态转换为液态后，轻轻将感受态细胞弹匀，100μl超级感受态细胞中各加入20μl酶连产物，轻轻充分混匀后冰上放置30min，把装有混合物的PCR管放入PCR仪中，调至42℃金属浴1min30s，取出后冰浴3min。接下来向其中加入600μl不含抗性的液体LB培养基，在37℃ 180rpm条件下放置60min。时间到后，将孵育后的细胞悬浮液室温4000g离心3min，弃去450μl上清液，留下100μl无抗性LB液体培养基重新悬浮菌团，把混合液使用一次性灭菌吸头悉数涂布到内含Kan抗性的LB固体塑料培养平皿，倒置培养于恒温培养箱内，在37℃条件下培养18h。
实施例4 pAtCas401载体的保存
1）在37℃条件下培养18h后，使用GenStar生产的2×Taq PCR StarMix withLoading Dye DNA聚合酶对长出的转化子进行PCR验证。所使用引物如下表1。
表1 验证Scaffold插入和蛋白插入所需引物
Figure 21115DEST_PATH_IMAGE001
。
2）每组单菌落的扩增体系如下：2×Taq PCR StarMix with Loading Dye 5μl，验证Scaffold：pHSN 32 CX F、scaffold YZ R各0.5μl，去离子水补足10μl。验证Bs3蛋白插入引物UpS 40 CX F、Bs3 472 R各0.5μl，去离子水补足10μl；
3）在验证时，每种质粒挑取7个单菌落及1个空白进行验证，之后按10μl/管把混匀后的体系使用移液器分装到200μl PCR 8-Tube and Cap Strip内，在超净工作台中使用2μl移液器吸头蘸取少许菌落，在扩增体系中轻轻吹吸混匀，随后进行PCR扩增。
4）扩增时的程序，验证Scaffold：94℃预变性 2min，94℃变性10s，59℃退火15s，72℃延伸10s，在变性开始到延伸进行29次循环，72℃后延伸2min；验证蛋白插入：94℃预变性 2min，94℃变性10s，59℃退火15s，72℃延伸10s，在变性开始到延伸进行29次循环，72℃后延伸2min。
5）PCR结束的扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳验证，单个管中取5μl点样，扩增完成的片段大小分别为：验证Scaffold：647bp和验证蛋白：Bs3:602bp的PCR产物条带，这样就得到了构建好的阳性质粒也就是待测序菌株。
实施例5 Bs3Cas12b蛋白在原生质体细胞中的表达
采用PEG法转化拟南芥原生质体细胞，随后激光共聚焦检测检测转化原生质体细胞的pAtCas401。图2表明，在明场下，细胞圆润且轮廓皆清晰可见，黑色部分为叶绿体。图3中，GFP荧光视野下，EGFP荧光蛋白分散在细胞质和细胞核中。图4中，DsRed视野下，可观察到叶绿体自发的红色荧光。在图5的叠加视野下，EGFP荧光蛋白所发荧光与叶绿体自发荧光非完全重叠，实验结果证明密码子优化后的Bs3Cas12b蛋白在拟南芥原生质体细胞中可正常表达。
实施例6 gRNA构建
1）选取拟南芥基因TT4作为靶基因，分析基因上的PAM位点，搜索可用于Bs3Cas12b蛋白识别的PAM（ATTN）序列，从3’到5’的方向在PAM序列-1到-20bp选取20碱基。
2）引物设计、合成及交付：设计时，采用上下游引物的形式，分别在设计guide两条链上的5’端添加attg和aaac这4个碱基的接头，用以接下来的载体构建中的连接，最后将设计的单链guide序列导出后交付公司进行合成。
3）引物退火：在200μl PCR管内，添加3μl上游guide引物、3μl下游guide引物、3μl经高压灭菌、紫外灭菌后的超纯水以及1μl NEBuffer 2，关紧管盖后，瞬时离心10s，剧烈涡旋10s，再次瞬时离心10s，使溶液充分混匀，之后将PCR管放入设定好退火程序的PCR仪内，退火程序设定如下：1：96℃，3min，2：95℃开始每循环每秒减2℃，共4个循环数，3：85℃开始每循环每秒减0.2℃，共314个循环数，4：22℃，2min。
4）将退火结束后获取的dsDNA同酶切pAtCas401载体回收后的片段使用全式金公司生产的T4连接酶进行酶连，酶连时的片段量无法精确计算，故添加1μl即可，酶连体系和条件均与之前所提及相同。连接结束后，连接产物转化入大肠杆菌DH5α内，培养16-18h，待菌点长到合适大小，对菌点进行挑取，并用2×Taq DNA聚合酶进行PCR扩增，扩增时所用引物为pHSN 32 CX F gatagtttaaactgaaggcg，下游引物为pHSN401 9829 Rgagctgttggctggctgg。PCR反应体系与前文提及的菌落PCR体系一致，PCR进行时的退火温度均为51℃，延伸时间均为35s，PCR反应完成后，使用1%琼脂糖凝胶进行菌落PCR结果检测，阳性的菌落PCR产物琼脂糖凝胶电泳后的条带应是979bp。
5）阳性菌落一代测序和菌株保存：PCR检测阳性的菌落，送北京睿博兴科进行一代测序，测序时的引物为pHSN 32 CX F：gatagtttaaactgaaggcg。等待反馈测序结果以后，使用SnapGene比对测序结果，并按上文提及菌株保存方法，保存好测序正确的菌株。
实施例7 T7E1检测编辑效果
在原生质体中，通过巢氏PCR的方式扩增编辑靶点序列，采用T7E1酶切的方法验证编辑效果。
1）提取培养72h的拟南芥原生质体细胞的基因组：为进行T7E1检测，需要提取转入质粒后的拟南芥原生质体细胞的基因组DNA，本次我们采用的是DN14植物基因组DNA快速提取试剂盒，由北京艾德莱公司生产。
2）提取培养72h的拟南芥原生质体细胞的富集以及裂解：转入质粒后的拟南芥原生质体细胞在恒温培养箱内培养72h，富集时观察细胞状态，若细胞状态良好，将各管转入质粒后的细胞置于水平转子内，60g，升降速为5，常温，离心2min，此时将洗脱使用的水提前预热，使用真空泵用一次性吸头吸弃绝大部分上清，吸弃时要尽量留有一些上清，以避免弃上清时，意外吸弃原生质体细胞。向Ep管内加入600μl裂解液PL，将Ep管置于可适用Ep管的振动头适配器上，涡旋振荡2min，将细胞彻底裂解。
3）培养72h的拟南芥原生质体细胞基因组的提取：将上一步骤的转入不同质粒的裂解细胞的各Ep管，使用掌上离心机轻轻瞬离，按顺序整理后，在生物通风橱内使用开盖器加入700μl的氯仿，关盖后用手剧烈震荡60-80次，15000g室温，离心15min，离心时准备等数量的2ml Ep管，做好标记，向内先行添加700μl结合液PQ，待离心结束后，将上清转移至加入结合液PQ的管内，此时同样不要吸掉全部上清，以避免吸取到下层溶液，使用涡旋混匀器剧烈震荡10s。将混合液使用掌上离心机轻轻瞬离，并分别分次加入到各自吸附柱AC内，15000g离心10s，弃去收集管内的废液，加入500μl抑制物去除液IR，15000g离心10s，弃去收集管内的废液，加入600μl漂洗液WB，15000g离心10s，弃去收集管内的废液，再加入600μl漂洗液WB，15000g离心10s，弃去收集管内的废液，将吸附柱再次离心，15000g，3min，取出后将吸附柱置于一张洁净纸上晾干6min，并将其放入新的灭菌的1.5ml Ep管内，加入50μl预热60℃的经高压灭菌紫外灭菌的超纯水，常温关盖静置6min，15000g 离心3min，收集收集管内的基因组DNA洗脱液。
4）两轮巢式PCR反应富集放大靶基因范围序列：使用北京艾德莱公司生产的高保真聚合酶2×A8 mix先进行一轮巢式PCR反应：所收集的所有基因组DNA样品一轮巢式PCR反应体系均按以下比例：所收集的所有基因组DNA样品即模板添加5μl，各靶基因上下游引物分别添加0.8μl，2×A8 mix添加10μl，使用经高压灭菌紫外灭菌的超纯水补足至20μl。扩增时所使用的程序如下：94℃预变性 2min，94℃变性10s，59℃退火15s，72℃延伸10s，从第二步进行29次循环，72℃后延伸2min。
5）待第一轮巢式PCR反应结束后，使用1%琼脂糖凝胶进行电泳，检验有无扩增出目标条带。确认含有目标扩增片段时，将其稀释十倍，以其作为第二轮巢式反应的模板。
6）使用江苏南京诺唯赞公司生产的高保真聚合酶2×phanta mix进行二轮巢式PCR反应：所收集的所有基因组DNA样品一轮巢式PCR反应体系均按以下比例：所稀释的第一轮产物即模板添加4μl，各靶基因上下游引物分别添加8μl，2×phanta mix添加50μl，使用经高压灭菌紫外灭菌的超纯水补足至100μl。扩增时所使用的程序如下：94℃预变性 2min，94℃变性10s，59℃退火15s，72℃延伸10s，从第二步进行29次循环，72℃后延伸2min。
7）扩增产物快速回收纯化、退火及T7E1酶切电泳检测：第二轮扩增产物的快速纯化：第二轮巢式扩增反应结束后，用1%琼脂糖凝胶进行电泳，检测扩增效果，与预期条带进行比对，正确的样品进行快速回收纯化，纯化步骤为与前文提及相同，完成快速回收纯化以后，向核酸定量仪器内添加样品，完成定量。
8）扩增产物退火体系：扩增产物纯化后产物800ng，NE Buffer2 2μl，经高压灭菌紫外灭菌的超纯水补足至20μl，退火程序与前文提及相同。
9）T7E1酶切：把所有完成退火反应的二轮回收产物取10μl添加至200μl PCR管内，剩余部分作为对照组，并将所有PCR管放置在PCR板上，将PCR板置于冰盒内，此时从-20℃冰箱内取出NEB公司生产的T7E1酶，使用掌上混匀器涡旋振荡10s，之后将PCR管置于掌上离心机内瞬时离心，随后将其放在冰上，打开PCR仪，并将PCR仪设置为37℃，热盖温度105℃，设置好后观察PCR仪面板，当PCR仪达到温度时，从冰上取出PCR板上的PCR管，迅速转移至PCR仪内，关盖拧紧顶盖后，孵育40min。
10）T7E1酶切产物电泳检测：利用关盖孵育时间制备浓度为3%的琼脂糖凝胶，待孵育完成时，琼脂糖凝胶已凝固，向T7E1酶切后的产物和剩余对照组内加入2.5μl含有EDTA的Loading buffer，使用掌上振荡器涡旋混匀后，放置在PCR板上点样电泳，电泳时电压为100V，恒定电压，电泳30min和45min时分别拍照。
同样的，依照实施例6和实施例7的方法，选择拟南芥基因BRI和FER为靶向编辑位点，筛选含有ATTN的PAM序列，从3’到5’的方向在PAM序列-1到-20bp选取20碱基为guide系列，分别构建guide于载体pAtCas401上。转化拟南芥原生质体细胞后，T7E1检测编辑效果。
上述TT4、BRI和FER为靶向编辑位点的酶切产物电泳结果如图6所示，箭头标志指向为经T7E1酶切割所产生的条带，每个待检样品分为两份，“-”表示样品中不经T7E1酶切割的部分，作为T7E1酶切的阴性对照，“+”表示样品中经T7E1酶切割的部分，作为每次实验的实验组，Control为Cas9阳性对照，所示结果经过多次酶切实验得出，n=4-6。在TT4靶基因上，靶点使用引物经两轮巢式PCR扩增的片段长度为750bp，切割后产生的条带应分别为442bp和308bp，在BRI基因上，靶点使用引物经两轮巢式PCR扩增的片段长度为1124bp，切割后产生的条带应分别为565bp和559bp，在FER基因上，靶点使用引物经两轮巢式PCR扩增的片段长度为917bp，切割后产生的条带应分别为562bp和355bp。编辑后突变序列被切割条带与靶位点一致，表明Bs3Cas12b可在该靶点进行靶向突变。
实施例8 农杆菌GV3101蘸花法转化拟南芥
1）提取已连接guide的pAtCas401质粒转化商业购置的农杆菌GV3101化学感受态细胞。PCR方式鉴定农杆菌阳性菌落：转化产物即农杆菌在LB固体培养基上生长48 h后，通过菌落PCR方式进行验证。引物为：Esg 55 F-atcaacttgaaaaagtggc，scaffold YZ R-tgctccaccatgttgacc。扩增后的片段长度应为714 bp的目的条带，挑取对应菌点，并接种到含50 μg/mL Kan、25 μg/mg Rif抗性的5 mL LB液体培养基的12 mL摇菌管内，在28 ℃，230rpm的培养条件下，使菌液摇动16 h左右，随后转移至100 mL培养基内继续培养48 h。
2）配制蘸花法所需转化液：称取MS盐2.15 g、蔗糖10 g、MES 0.5 g、6-BA 0.005mg、200×VB5 5000 μl，将上述所有试剂添加至洗净晾干的烧杯内，放入洗净的转子，使用磁力混合器进行搅拌，充分混匀。
3）经过长日照培养一段时间，拟南芥植株抽薹进入开花期，把拟南芥连同花盆育苗托盘等一并从植物培养室取出，剪去完全盛开的拟南芥花朵，并使用条形纸将植株周围土层包裹。使用一次性灭菌皮筋固定牢固，将花盆内用于捆扎茎部防止倒伏的竹签取下。将准备盛放稀释后农杆菌菌液的烧杯做好标记，并置于紫外下灭菌30 min以上。
4）取出摇动48 h的农杆菌菌液，取1 mL在分光光度计下测量菌液OD600值，确保OD为1.8左右。随后离心弃去上清，加入灭菌的不含抗性的LB培养基重悬农杆菌，重复该步骤两次后，根据OD值及体积进行稀释，将菌液使用配制的转化液稀释至OD为0.6左右。将周围环境使用75%酒精进行消毒，将花盆底部插入竹签，将竹签搭在烧杯壁上，使植株可以倒置悬空于菌液上方，过程中避免菌液沾湿条形纸，否则会导致植株连同土层一同掉入菌液。把经过修剪过的拟南芥的花苞倒置浸入各种农杆菌菌液，避免植株在放置时茎部折断，计时4min，取出后使用吸水纸将拟南芥植株表面残留菌液充分吸干，避免出现菌液烧苗的现象。将拟南芥植株平放在育苗托盘内，每种农杆菌菌液转化6~8盆，将同一个转化样本的植株放于同一育苗托盘内，每盆使用一次性防水标记标签做好标记，每盆转化完均须使用不透光覆盖膜盖住以保持湿度，转化完后使用不透光覆盖膜将育苗托盘封住，转移至植物培养室，在23 ℃条件下避光培养24 h。随后将覆盖膜取下，使用竹签将拟南芥茎部进行捆扎，避免倒伏，不同转化样本的植株隔开距离放置。继续依照长日照培养模式培养植株，培养一星期后，重复对拟南芥植株进行二次转化。
5）待转化后的拟南芥植株生长到拟南芥果荚泛黄干枯时，即可收取T0代拟南芥转基因种子。准备好MS培养基后，向每100mlmS培养基中加入1ml 30mg/ml潮霉素溶液，灭菌后倒入提前准备好的一次性塑料平皿。取出T0代种子，按照每200粒种子每平皿的密度，准备所需的潮霉素抗性平皿，将消毒完毕后的种子全部播种在含有潮霉素抗性的皿中。同时，另取一个含有潮霉素抗性的空白平皿，播种约30粒本身含有潮霉素抗性的拟南芥种子，作为潮霉素筛选的阳性对照。
6）最后，将具有潮霉素抗性的苗进行进一步的传代培养，并提取叶片基因组，对靶标位点进行的深度测序验证编辑类型，确定编辑阳性植株。
SEQUENCE LISTING
<110> 河北科技大学
<120> 在拟南芥中高效表达Bs3Cas12b蛋白的核酸分子及其在基因组编辑中的应用
<130> 2021
<160> 2
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 3561
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 1
tctagatgga ttacaaggac cacgacgggg attacaagga ccacgacatt gattacaagg 60
atgatgatga caagatggct ccgaagaaga agaggaaggt tggcatccac ggggtgccag 120
ctgctatggc tattaggtct attaaactta agatgaagac taattctgga actgattcaa 180
tctacctcag aaaggctctc tggaggactc atcaattgat taatgaggga atcgcttatt 240
acatgaactt gcttacactt tacaggcagg aggctattgg agataaaaca aaagaagcat 300
atcaagctga gttgattaat attattagaa atcagcagag aaacaacgga agctctgaag 360
aacatggttc tgatcaagag attttagcac tcttgagaca actttatgag cttattatcc 420
catcttctat cggagaatct ggagatgcta atcaacttgg aaacaagttt ttgtatcctc 480
ttgttgatcc taattctcaa tctggtaaag gaacatctaa cgcaggacga aagcctaggt 540
ggaaacgttt aaaagaggaa ggtaatcctg attgggaact tgaaaagaag aaagatgagg 600
agagaaaggc taaggatcct acagtgaaga tatttgataa tcttaataag tatggacttc 660
ttccactttt ccctcttttc actaatattc aaaaagatat tgagtggctt cctttgggta 720
aacgtcaatc agtgagaaag tgggataagg atatgttcat ccaagctatt gaaagacttc 780
tttcatggga atcttggaat agaagagtgg ctgatgagta taagcaattg aaagaaaaaa 840
ctgaatctta ttacaaagaa catttgacgg gaggtgaaga gtggatcgaa aagattagaa 900
aattcgaaaa ggaaagaaac atggaacttg aaaagaatgc attcgctcca aatgatggtt 960
acttcattac ttcacgacaa attagaggat gggatagggt gtatgagaag tggtcaaagc 1020
tccctgagag tgcatctccg gaggaacttt ggaaagttgt tgctgaacaa cagaacaaaa 1080
tgtctgaagg tttcggtgac cctaaggttt ttagcttttt ggctaacaga gaaaataggg 1140
atatatggag aggtcattca gagagaatct accacattgc tgcttacaat ggcctacaga 1200
aaaaactttc ccgtactaag gagcaagcta ctttcacatt gccagatgct attgaacatc 1260
ctctctggat cagatatgaa agtcctggtg gaaccaacct taacttgttt aagctcgagg 1320
aaaagcagaa aaagaattat tatgtgaccc ttagtaagat catttggcct tctgaggaaa 1380
agtggatcga gaaggaaaat atcgaaatcc ctcttgcccc atctatccag tttaataggc 1440
aaattaagtt gaaacaacat gttaaaggga aacaagaaat ttcattttcc gattattctt 1500
caagaatttc ccttgatgga gtccttggtg gtagcaggat ccagtttaac agaaaataca 1560
tcaaaaacca taaggagctt ttgggagaag gggatattgg acctgtgttt ttcaaccttg 1620
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aagctcttaa agttatctct tcagattttt ctaaggttat tgattacaaa cctaaggaac 1740
ttatggactg gatgaatact ggaagtgcat ctaattcttt cggagtggct tcattgcttg 1800
aaggaatgag agtaatgtcc attgatatgg gacaacgtac atctgctagt gtttcaattt 1860
ttgaagttgt taaagaatta cctaaggatc aagagcaaaa attgttctat agtattaatg 1920
atactgagtt gttcgctatt cataagagat catttctttt gaacctacca ggtgaagttg 1980
ttacgaaaaa caataagcaa caaaggcaag aaagaagaaa gaaaagacaa tttgttagaa 2040
gtcaaattag aatgttagct aacgtcttaa gacttgagac taaaaagact cctgatgaga 2100
gaaaaaaggc tatccataaa ttgatggaga ttgttcagtc ttatgactct tggacagcat 2160
ctcaaaaaga agtttgggaa aaggaactta accttttgac aaacatggct gctttcaatg 2220
atgaaatatg gaaggagtct cttgttgagc ttcatcatag aattgaacct tatgttggac 2280
aaatcgtgtc taaatggcgt aagggtcttt cagaaggaag aaagaatctc gctggtattt 2340
ctatgtggaa cattgatgaa cttgaagata caagaagatt gcttatttct tggagtaaga 2400
gaagtagaac tcctggagaa gcaaatagaa ttgaaactga tgagccattt ggatcttctc 2460
tcttacaaca cattcaaaat gttaaggatg atagattaaa gcaaatggca aatcttatca 2520
ttatgactgc tcttgggttc aagtatgata aagaggagaa ggatagatat aagagatgga 2580
aagagactta tccagcatgt caaattattc tctttgaaaa tcttaatagg taccttttca 2640
accttgatag gagtagacgt gagaattcaa gacttatgaa atgggcacat aggtctattc 2700
ctagaactgt ttctatgcag ggtgagatgt ttggattgca agtcggggat gttcgttctg 2760
aatactctag taggttccat gctaaaacag gagcccctgg aattagatgt catgctttaa 2820
cagaagaaga ccttaaagct ggatctaata cacttaaaag attgatagag gatggattca 2880
ttaatgagtc ggaacttgca tatttgaaaa aaggagatat cattccatca cagggtggag 2940
aattgttcgt gactctttct aaaagatata agaaagattc tgataataac gaattgactg 3000
ttattcatgc tgatattaac gcagctcaaa atttgcaaaa gagattttgg caacaaaata 3060
gtgaagttta tagagttcct tgtcaattgg ctagaatggg tgaggataag ttgtatattc 3120
ctaagtctca aactgaaaca attaaaaagt acttcggaaa gggttctttt gttaaaaata 3180
acactgaaca agaagtttac aaatgggaga aatctgaaaa gatgaagatt aagactgata 3240
ctacatttga tcttcaggat cttgatggat ttgaggatat tagtaagaca attgaacttg 3300
cacaagaaca acagaaaaaa tatttgacta tgtttagaga tccatcggga tactttttca 3360
acaacgagac atggcgtcct cagaaggagt actggtctat cgttaacaac atcatcaagt 3420
catgtcttaa gaagaagatt cttagtaata aggttgagct taagcggcca gcggcgacga 3480
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accaccaccc atggtgagct c 3561
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<211> 11416
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 2
gtttacccgc caatatatcc tgtcaaacac tgatagttta aactgaaggc gggaaacgac 60
aatctgatcc aagctcaagc taagctcacg tgacggaatt aagcttcgac ttgccttccg 120
cacaatacat catttcttct tagctttttt tcttcttctt cgttcataca gttttttttt 180
gtttatcagc ttacattttc ttgaaccgta gctttcgttt tcttcttttt aactttccat 240
tcggagtttt tgtatcttgt ttcatagttt gtcccaggat tagaatgatt aggcatcgaa 300
ccttcaagaa tttgattgaa taaaacatct tcattcttaa gatatgaaga taatcttcaa 360
aaggcccctg ggaatctgaa agaagagaag caggcccatt tatatgggaa agaacaatag 420
tatttcttat ataggcccat ttaagttgaa aacaatcttc aaaagtccca catcgcttag 480
ataagaaaac gaagctgagt ttatatacag ctagagtcga agtagtgatt gggtgaccta 540
tagggtcaat gaatctgtgc gtgtgccata agtaattaaa aattacccac cacaggatta 600
tcttatttct gctaagtgtt tagttgcctg aatacttagc agaaataatg atgattggca 660
cagagaccga gagagggtct catttttttt gcatgcctgc aggtcaacat ggtggagcac 720
gacacacttg tctactccaa aaatatcaaa gatacagtct cagaagacca aagggcaatt 780
gagacttttc aacaaagggt aatatccgga aacctcctcg gattccattg cccagctatc 840
tgtcacttta ttgtgaagat agtggaaaag gaaggtggct cctacaaatg ccatcattgc 900
gataaaggaa aggccatcgt tgaagatgcc tctgccgaca gtggtcccaa agatggaccc 960
ccacccacga ggagcatcgt ggaaaaagaa gacgttccaa ccacgtcttc aaagcaagtg 1020
gattgatgtg ataacatggt ggagcacgac acacttgtct actccaaaaa tatcaaagat 1080
acagtctcag aagaccaaag ggcaattgag acttttcaac aaagggtaat atccggaaac 1140
ctcctcggat tccattgccc agctatctgt cactttattg tgaagatagt ggaaaaggaa 1200
ggtggctcct acaaatgcca tcattgcgat aaaggaaagg ccatcgttga agatgcctct 1260
gccgacagtg gtcccaaaga tggaccccca cccacgagga gcatcgtgga aaaagaagac 1320
gttccaacca cgtcttcaaa gcaagtggat tgatgtgata tctccactga cgtaagggat 1380
gacgcacaat cccactatcc ttcgcaagac ccttcctcta tataaggaag ttcatttcat 1440
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gcattctact tctattgcag caatttaaat catttctttt aaagcaaaag caattttctg 1560
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gccgctattt ttacaacaat taccttacaa ttactattta caattacatc tagagccacc 1680
atgggagcta ttaggtctat taaacttaag atgaagacta attctggaac tgattcaatc 1740
tacctcagaa aggctctctg gaggactcat caattgatta atgagggaat cgcttattac 1800
atgaacttgc ttacacttta caggcaggag gctattggag ataaaacaaa agaagcatat 1860
caagctgagt tgattaatat tattagaaat cagcagagaa acaacggaag ctctgaagaa 1920
catggttctg atcaagagat tttagcactc ttgagacaac tttatgagct tattatccca 1980
tcttctatcg gagaatctgg agatgctaat caacttggaa acaagttttt gtatcctctt 2040
gttgatccta attctcaatc tggtaaagga acatctaacg caggacgaaa gcctaggtgg 2100
aaacgtttaa aagaggaagg taatcctgat tgggaacttg aaaagaagaa agatgaggag 2160
agaaaggcta aggatcctac agtgaagata tttgataatc ttaataagta tggacttctt 2220
ccacttttcc ctcttttcac taatattcaa aaagatattg agtggcttcc tttgggtaaa 2280
cgtcaatcag tgagaaagtg ggataaggat atgttcatcc aagctattga aagacttctt 2340
tcatgggaat cttggaatag aagagtggct gatgagtata agcaattgaa agaaaaaact 2400
gaatcttatt acaaagaaca tttgacggga ggtgaagagt ggatcgaaaa gattagaaaa 2460
ttcgaaaagg aaagaaacat ggaacttgaa aagaatgcat tcgctccaaa tgatggttac 2520
ttcattactt cacgacaaat tagaggatgg gatagggtgt atgagaagtg gtcaaagctc 2580
cctgagagtg catctccgga ggaactttgg aaagttgttg ctgaacaaca gaacaaaatg 2640
tctgaaggtt tcggtgaccc taaggttttt agctttttgg ctaacagaga aaatagggat 2700
atatggagag gtcattcaga gagaatctac cacattgctg cttacaatgg cctacagaaa 2760
aaactttccc gtactaagga gcaagctact ttcacattgc cagatgctat tgaacatcct 2820
ctctggatca gatatgaaag tcctggtgga accaacctta acttgtttaa gctcgaggaa 2880
aagcagaaaa agaattatta tgtgaccctt agtaagatca tttggccttc tgaggaaaag 2940
tggatcgaga aggaaaatat cgaaatccct cttgccccat ctatccagtt taataggcaa 3000
attaagttga aacaacatgt taaagggaaa caagaaattt cattttccga ttattcttca 3060
agaatttccc ttgatggagt ccttggtggt agcaggatcc agtttaacag aaaatacatc 3120
aaaaaccata aggagctttt gggagaaggg gatattggac ctgtgttttt caaccttgtc 3180
gtggatgttg ctcctctcca agaaacaaga aacggacgat tgcaatctcc cattggtaaa 3240
gctcttaaag ttatctcttc agatttttct aaggttattg attacaaacc taaggaactt 3300
atggactgga tgaatactgg aagtgcatct aattctttcg gagtggcttc attgcttgaa 3360
ggaatgagag taatgtccat tgatatggga caacgtacat ctgctagtgt ttcaattttt 3420
gaagttgtta aagaattacc taaggatcaa gagcaaaaat tgttctatag tattaatgat 3480
actgagttgt tcgctattca taagagatca tttcttttga acctaccagg tgaagttgtt 3540
acgaaaaaca ataagcaaca aaggcaagaa agaagaaaga aaagacaatt tgttagaagt 3600
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ctctcgctta gtagttagac gtccccgaga tccatgctag accatgaatc cagaagcccg 9060
agaggttgcc gcctttcggg ctttttcttt ttcaaaaaaa aaaatttata aaacgatctg 9120
ttgcggccgg ccgccgggtt gtgggcaaag gcgctcgacg gtgggcaacc gcttgcggtt 9180
gtccacgggc ggagccggtg cgcgtagcgc attgtccaca agccaagggc gaccaataat 9240
tgatatatat attcataatt gaaaagctaa ttgaacatac tacttgctgt aactacttgc 9300
cggagcgagg ggtgtttgca agctgttgat ctgaaagggc tattagcgtt ctcacgtgcc 9360
tttttgatta gcgatttcac gtgaccttat tagcgatttc acgtactccg attagcgatt 9420
tcacgtaccc tgattagcga tttcacgtgg atagtttttg gagcgggccg gaaagccccg 9480
tgaatcaagg ctttgcgggg cattagcggt ttcacgtgga taactaccct ctatccacag 9540
gcttccgggg ataaaaaagc ccgctcgacg gcgggctgtt ggatggggat ctagcggtaa 9600
tacggttatc cacagaatca ggggataacg caggaaagaa catgtgagca aaaggccagc 9660
aaaaggccag gaaccgtaaa aaggccgcgt tgctggcgtt tttccatagg ctccgccccc 9720
ctgacgagca tcacaaaaat cgacgctcaa gtcagaggtg gcgaaacccg acaggactat 9780
aaagatacca ggcgtttccc cctggaagct ccctcgtgcg ctctcctgtt ccgaccctgc 9840
cgcttaccgg atacctgtcc gcctttctcc cttcgggaag cgtggcgctt tctcatagct 9900
cacgctgtag gtatctcagt tcggtgtagg tcgttcgctc caagctgggc tgtgtgcacg 9960
aaccccccgt tcagcccgac cgctgcgcct tatccggtaa ctatcgtctt gagtccaacc 10020
cggtaagaca cgacttatcg ccactggcag cagccactgg taacaggatt agcagagcga 10080
ggtatgtagg cggtgctaca gagttcttga agtggtggcc taactacggc tacactagaa 10140
gaacagtatt tggtatctgc gctctgctga agccagttac cttcggaaaa agagttggta 10200
gctcttgatc cggcaaacaa accaccgctg gtagcggtgg tttttttgtt tgcaagcagc 10260
agattacgcg cagaaaaaaa ggatctcaag aagatccttt gatcttttct accgggtctg 10320
acgctcagtg gaacggggcc caatctgaat aatgttacaa ccaattaacc aattctgatt 10380
agaaaaactc atcgagcatc aaatgaaact gcaatttatt catatcagga ttatcaatac 10440
catatttttg aaaaagccgt ttctgtaatg aaggagaaaa ctcaccgagg cagttccata 10500
ggatggcaag atcctggtat cggtctgcga ttccgactcg tccaacatca atacaaccta 10560
ttaatttccc ctcgtcaaaa ataaggttat caagtgagaa atcaccatga gtgacgactg 10620
aatccggtga gaatggcaaa agtttatgca tttctttcca gacttgttca acaggccagc 10680
cattacgctc gtcatcaaaa tcactcgcat caaccaaacc gttattcatt cgtgattgcg 10740
cctgagcgag acgaaatacg cgatcgctgt taaaaggaca attacaaaca ggaatcgaat 10800
gcaaccggcg cagggacact gccagcgcat caacaatatt ttcacctgaa tcaggatatt 10860
cttctaatac ctggaatgct gtttttccgg ggatcgcagt ggtgagtaac catgcatcat 10920
caggagtacg gataaaatgc ttgatggtcg gaagaggcat aaattccgtc agccagttta 10980
gtctgaccat ctcatctgta acatcattgg caacgctacc tttgccatgt ttcagaaaca 11040
actctggcgc atcgggcttc ccatacaagc gatagattgt cgcacctgat tgcccgacat 11100
tatcgcgagc ccatttatac ccatataaat cagcatccat gttggaattt aatcgcggcc 11160
tcgacgtttc ccgttgaata tggctcataa caccccttgt attactgttt atgtaagcag 11220
acagttttat tgttcatgat gatatatttt tatcttgtgc aatgtaacat cagagatttt 11280
gagacacggg ccagagctgc agtttgatcc cgaggggaac cctgtggttg acatgcacat 11340
acaaatggac gaacggataa accttttcac gcccttttaa atatccgtta ttctaataaa 11400
cgctcttttc tcttag 11416

Claims (7)

1.一种在拟南芥中高效表达Bs3Cas12b蛋白的核酸分子，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.一种质粒，其特征在于，其包含如SEQ ID NO.1所示核苷酸序列。
3.根据权利要求2所述的质粒，其特征在于，其还包括位于SEQ ID NO.1所示核苷酸序列之前的Pol Ⅲ启动子-BsaI酶切位点-scaffold-Poly T-Pol Ⅱ型启动子-Ω增强子-Kozak序列以及位于SEQ ID NO.1所示核苷酸序列之后的3×NLS核定位信号-P2A-EGFP-NOS-CaMV 35S启动子-HygR- CaMV Poly（A）。
4.一种农杆菌，其特征在于，其包含如权利要求1或2所述的质粒。
5.根据权利要求4所述的农杆菌，其特征在于，所述质粒的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
6.一种利用权利要求1所述的核酸分子在拟南芥基因组编辑中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，用于拟南芥基因组编辑的CRISPR-Cas12b系统的构建。
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