CN114164230B - 一种适用于甘蔗遗传转化的表达载体及其构建方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种适用于甘蔗遗传转化的表达载体及其构建方法和应用，涉及基因工程技术领域。该适用于甘蔗遗传转化的表达载体为SEQ ID NO：13所示序列。本发明还公开了该适用于甘蔗遗传转化的表达载体的构建方法及其在甘蔗转基因中的应用。本发明还公开了一种甘蔗转基因方法，包括：将目的基因插入该适用于甘蔗遗传转化的表达载体，进行甘蔗的遗传转化。本发明提供的适用于甘蔗遗传转化的表达载体大幅度提高了基因枪介导的甘蔗的遗传转化效率及阳性苗筛选效率。

Description

一种适用于甘蔗遗传转化的表达载体及其构建方法和应用

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，特别是涉及一种适用于甘蔗的遗传转化表达载体及其构建方法和应用。

背景技术

甘蔗遗传背景复杂，转基因技术是甘蔗品种遗传改良的重要途径。作物转基因遗传改良主要是通过基因枪法和农杆菌法来实现，农杆菌转化法操作简便，更适合于双子叶植物，但农杆菌转化法不适合于多基因共转化，基因枪法可以很方便地实现两个或多个基因同时转化，且基因枪法没有宿主范围的限制，特别是那些农杆菌感染不敏感的单子叶植物。目前我国的甘蔗转基因技术，存在转化难，转基因效率偏低，获得的转基因株系偏少等问题，且筛选出的阳性苗假阳性较多，大大增加了后续鉴定工作量。因此开发高效的适合甘蔗的表达载体，提高甘蔗的转化效率及转化体的筛选效率具有重要意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种适用于甘蔗遗传转化的表达载体及其构建方法和应用，以解决上述现有技术存在的问题，本发明提供了一种适用于基因枪介导甘蔗遗传转化的高效表达载体，大幅度提高了基因枪介导的甘蔗的遗传转化效率和转基因植株的筛选效率。

为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

一种适用于甘蔗遗传转化的表达载体，所述表达载体为SEQ ID NO：13所示序列。

本发明还提供一种上述的适用于甘蔗遗传转化的表达载体的构建方法，包括以下步骤：

(1)载体pCAMBIA1300-35S-NOS用SacII/SacI酶切，之后与UBI启动子体外连接，得到载体1；

(2)UBI启动子加A连接到T载体，得到含有UBI启动子的T载体，所述含有UBI启动子的T载体和所述载体1分别经SacII/Bsp119I酶切后连接，得到载体2；

(3)KAN-NOS加A连接到T载体，得到含有KAN-NOS的T载体，所述含有KAN-NOS的T载体和所述载体2分别经SacII/AatII酶切后连接，获得载体3，即为所述适用于甘蔗遗传转化的表达载体。

进一步地，在步骤(1)中，所述UBI启动子的获得方法包括：以pTCK303为模板，利用SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示引物，进行PCR扩增。

进一步地，在步骤(2)中，所述UBI启动子的获得方法为：以pTCK303为模板，利用SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示引物，进行PCR扩增。

进一步地，在步骤(3)中，所述KAN-NOS的获得方法包括：以pBI121为模板，利用SEQID NO：5和SEQ ID NO：6所示引物，进行PCR扩增。

本发明还提供上述的适用于甘蔗遗传转化的表达载体在甘蔗转基因中的应用。

本发明还提供一种甘蔗转基因方法，包括以下步骤：将目的基因插入上述的适用于甘蔗遗传转化的表达载体，进行甘蔗的遗传转化。

进一步地，该甘蔗转基因方法采用基因枪法转化甘蔗。

本发明公开了以下技术效果：

本发明构建得到了一种适用于甘蔗遗传转化的表达载体，用UBI启动子启动目的基因，用NOS做终止子，更适合在甘蔗上表达目的基因；用UBI启动子启动筛选标记基因，NOS做终止子，因此更适合在甘蔗上筛选转基因植株，效率更高；用Neo/KAN抗性基因做筛选标记，因此在甘蔗上筛选转基因植株效率更高。本发明用UBI启动子启动目的基因和筛选标记基因，构建出的载体，更适合甘蔗的转化及转基因植株的筛选。

本发明的表达载体适合应用于基因枪介导的甘蔗遗传转化，该表达载体可以大幅度提高基因枪介导的甘蔗的遗传转化效率，经实验验证，转化效率可达到6.2％，同时，大大提高了转化体筛选效率，筛选剂的筛选效率达到100％，大大减少了后续转化体鉴定的工作量。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为UBI启动子扩增图，左三列为目的片段，第四列为Marker；Marker由上至下依次是5000bp，3000bp，2000bp，1500bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp；

图2为UBI启动子扩增图，从左到右依次为Marker，目的片段，目的片段；Marker由上至下依次是2000bp，1500bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp；

图3为KAN-NOS扩增图，从左到右依次为Marker，目的片段，目的片段；Marker由上至下依次是2000bp，1500bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp；

图4为pUMUK酶切鉴定图，从左到右依次为酶切前，酶切后，Marker，使用SacII/SacI进行酶切鉴定，三次插入的片段均被酶切下来，酶切后插入片段约5.8K，骨架约6.6k；

图5为GFP扩增图，从左到右依次为目的片段，目的片段，Marker；Marker由上至下依次是2000bp，1500bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp；

图6为GFP质粒酶切鉴定图，其中从左到右依次为酶切前，酶切后，Marker(酶切后两条带均约6500bp)；所用Marker为1kb DNAladder；

图7为甘蔗愈伤组织转化后GFP表达情况，A为转化后的愈伤组织，B为未转化的对照；

图8为甘蔗愈伤组织转化后筛选，其中左边为加筛选剂的未转化对照，中间为转化的愈伤组织，右边为未加筛选剂的未转化对照；

图9为转化苗PCR检测电泳图，1：DNAladder，2：阴性对照，3：质粒对照，4：未转化甘蔗对照，5-13：转化苗。

具体实施方式

现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。

应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值，以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。

除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。

在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。

关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。

实施例1

构建思路：第一步是MCS前UBI启动子，第二步是筛选标记前UBI启动子，第三步是筛选标记KAN-NOS。使用SacII/SacI酶切时，保留了载体原有的MCS及MCS后的NOS，第一步加入了UBI启动子后，即可得到完整的UBI-MCS-NOS结构。第二步加入了另一个UBI(用于启动筛选标记)，第三步在第二步的UBI启动子后加了Kan抗性基因和NOS terminator。

pTCK303、pCAMBIA1300-35S-NOS、pBI121、T载体和pCAMBIA1300-35S-GFP均为通用载体，购买自载体公司。

一、载体的构建

第一步：MCS前UBI启动子

1目的片段信息

目的片段名称及片段大小：UBI启动子：1993bp，序列为SEQ ID NO：9所示序列。

材料：质粒；

目的载体：pCAMBIA1300-35S-NOS；

2实验方法

2.2.1目的片段扩增

以pTCK303为模板，根据终载体pCAMBIA1300-35S-NOS的图谱设计SacII/SacI为插入位点并合成引物，引物序列见下表1。

表1

使用高保真酶扩增得到目的片段，扩增体系见表2。

表2 KOD酶扩增体系

②PCR反应程序：

98℃预变性5min；循环为98℃变性10s，60℃退火30s，68℃延伸2min30s，共30个循环；68℃延伸5min。

③电泳检测与回收：PCR产物在l.8％琼脂糖凝胶电泳，调节电压至150V，电泳15min，照相记录电泳结果(图1)，在紫外灯下观察，迅速切下目的条带。用胶回收试剂盒(OMEGA)回收目的片段，具体方法按试剂盒说明书进行。

2.2.2载体的构建

(1)载体的酶切

表3载体的酶切体系

(2)将获得的目的片段与用SacII/SacI酶切的载体pCAMBIA1300-35S-NOS进行体外连接(连接体系见表4)，得到载体1。

表4

a.吸打混匀，稍微离心后加一滴矿物油；

b.16℃连接2h；

c.连接完后放入4℃冰箱中保存过夜。

(3)连接产物的转化

a.超净工作台灭菌30min，从-70℃超低温冰箱中取出100μL的DH5α感受态细胞，放于冰上，预冷10min；

b.取出一个Ep管，标上记号，置于冰上，加入80μL的感受态细胞(冰上操作)

c.然后加入10μL的连接产物，用移液枪吸打混匀后冰浴30min；

d.冰浴结束后，放在42℃的恒温水浴锅中热激90s，然后迅速放入冰块中，冰浴2min；

e.吸500μL不含Kan的LB液体培养液到Ep管中，混匀，置于摇床中160rpm，37℃摇1h；

f.取出摇床结束的Ep管，2000～3000rmp离心5min，弃上清300μL，剩余的菌液轻柔吸打混匀后加在含Kan的LB固体培养皿中，用玻璃涂棒涂匀，涂干；

g.37℃恒温培养箱中培养16～20h。

2.2.3载体的鉴定

(1)将转化出来的单菌落通过摇菌后，用引物进行菌液PCR鉴定。

表5单菌落检测PCR体系

P1：AACCTCGTGTTGTTCGGA(SEQ ID NO：11)；

P2：ACACTGGCAAGTTAGCAA(SEQ ID NO：12)。

(2)将经过菌液PCR鉴定的阳性菌液进行测序验证。

第二步：筛选标记前UBI启动子

1目的片段信息

目的片段名称及片段大小：UBI启动子：1993bp

2实验方法

2.2.1目的片段扩增

(1)目的片段扩增：根据载体的图谱设计SacII/Bsp119I为插入位点并合成引物，引物序列见下表6，扩增及回收步骤见第一步中2实验方法。UBI启动子扩增图见图2。

表6

(2)目的片段加A后连接到T载体上，并测序。

2.2.2载体的构建

(1)目的片段与载体的酶切

表7目的片段与载体的酶切体系

(2)将用SacII/Bsp119I酶切的目的片段与同样用SacII/Bsp119I酶切的载体1进行体外连接，得到载体2；连接体系见表4。

2.2.3载体的鉴定

(1)连接后转化，转化过程见第一步2.2.2。

(2)将转化出来的单菌落通过摇菌后用引物进行菌液PCR鉴定，鉴定体系见表5。

(3)将经过菌液PCR鉴定的阳性菌液进行测序。

第三步：筛选标记KAN-NOS

1目的片段信息

目的片段名称及片段大小：KAN-NOS：1777bp，序列为SEQ ID NO：10所示序列。

2实验方法

2.2.1目的片段扩增

(1)目的片段扩增：根据载体的图谱设计SacII/AatII为插入位点并合成引物，引物序列见下表8，以pBI121为模板，扩增及回收步骤见第一步中2实验方法。KAN-NOS扩增图见图3。

表8

(2)目的片段加A后连接到T载体上，并测序。

2.2.2载体的构建

(1)目的片段与载体的酶切

表9目的片段与载体的酶切体系

(4)将用SacII/AatII酶切的目的片段与同样用SacII/AatII酶切的载体2进行体外连接，获得表达载体pUMUK，载体pUMUK的序列为SEQ ID NO：13所示序列；连接体系见表4。

2.2.3载体的鉴定

(1)连接后转化，转化过程见第一步中2.2.2。

(2)将转化出来的单菌落通过摇菌后用引物进行菌液PCR鉴定，鉴定体系见表5。

(3)将经过菌液PCR鉴定的阳性菌液进行测序，并质粒酶切验证，验证图如图4。

二、应用效果

为了验证所构建的表达载体pUMUK在甘蔗上的应用效果，我们以GFP基因作为目的基因插入该载体进行甘蔗的遗传转化。

将GFP基因连入载体pUMUK的方法如下：

2.1目的基因扩增

根据终载体pUMUK的图谱设计KpnI/MluI为插入位点并合成引物，引物序列为：

F:5’-CTCGGTACCATGGTGAGCAAGGGC-3’(SEQ ID NO：7)

R:5’-GCGACGCGTTTACTTGTACAGCTC-3’(SEQ ID NO：8)。

以载体pCAMBIA1300-35S-GFP为模板，使用高保真酶扩增得到目的片段，扩增体系见表10。

表10 KOD酶扩增体系

②PCR反应程序：

98℃预变性5min；循环为98℃变性10s，60℃退火30s，68℃延伸1min，共30个循环；68℃延伸5min。

③电泳检测与回收：PCR产物在l.8％琼脂糖凝胶电泳，调节电压至150V，电泳15min，照相记录电泳结果(图5)，在紫外灯下观察，迅速切下目的条带。用胶回收试剂盒(OMEGA)回收目的片段，具体方法按试剂盒说明书进行。

2.2载体的构建

(1)目的片段与载体3的酶切

表11目的片段与载体的酶切体系

(2)将用KpnI/MluI酶切的目的基因与用KpnI/MluI酶切的载体pUMUK进行体外连接，得到含有GFP基因的pUMUK载体，连接体系见表12：

表12目的基因与pUMUK重组质粒连接体系

a.吸打混匀，稍微离心后加一滴矿物油；

b.16℃连接2h；

c.连接完后放入4℃冰箱中保存过夜。

(3)连接产物的转化

a.超净工作台灭菌30min，从-70℃超低温冰箱中取出100μL的DH5α感受态细胞，放于冰上，预冷10min；

b.取出一个Ep管，标上记号，置于冰上，加入80μL的感受态细胞(冰上操作)

c.然后加入10μL的连接产物，用移液枪吸打混匀后冰浴30min；

d.冰浴结束后，放在42℃的恒温水浴锅中热激90s，然后迅速放入冰块中，冰浴2min；

e.吸500μL不含Kan的LB液体培养液到Ep管中，混匀，置于摇床中160rpm，37℃摇1h；

f.取出摇床结束的Ep管，2000～3000rmp离心5min，弃上清300μL，剩余的菌液轻柔吸打混匀后加在含Kan的LB固体培养皿中，用玻璃涂棒涂匀，涂干；

g.37℃恒温培养箱中培养16～20h。

2.3载体的鉴定

(1)将转化出来的单菌落通过摇菌后用引物进行菌液PCR鉴定。

所用引物：F：5’-CTCGGTACCATGGTGAGCAAGGGC-3’(SEQ ID NO：14)；

R：5’-GCGACGCGTTTACTTGTACAGCTC-3’(SEQ ID NO：15)。

表13单菌落检测PCR体系

(2)将经过菌液PCR鉴定的阳性菌液进行测序并进行质粒酶切(SacII/MluI,酶切后两条带均约6500bp)验证，如图6。

2.4甘蔗遗传转化

1.质粒DNA提取：提取构建完成的pUMUK载体质粒DNA。

2.基因枪法转化甘蔗：

(1)愈伤组织准备：选取甘蔗愈伤组织，在添加了0.2mol·L^-1甘露醇+0.2mol·L^-1山梨醇的MS培养基上进行预处理。

(2)DNA的包裹：取50μL金粉悬液于Eppendorf管，依次加入提取的质粒DNA，50μL2.5MCaCl₂和20μL 0.1M亚精胺。

(3)将上述混好的样品，涡旋1min，冰上静置1min，离心去上清。

(4)加入75％乙醇，离心后去上清，重复此步骤3次，最后用无水乙醇重悬颗粒。

(5)愈伤组织转化：采用基因枪法对愈伤组织进行转化。

(6)转化后3天，在显微镜下观察GFP瞬时表达，说明构建的以UBI为启动子，NOS为终止子的MCS模块可以使目的基因正常表达(图7)。

(7)筛选培养：将转化后的愈伤组织恢复培养后，转入含G418的MS继代培养基培养3周后，转入含G418的MS分化培养基进行分化，成功转化的可以在筛选培养基上正常生长，而未转化的不能生长，说明改造后的UBI驱动的Neo/KAN抗性基因作为筛选标记可以正常工作(图8)。

(8)抗性苗的PCR检测：将筛选出的阳性植株，进行PCR检测，并统计转化效率。电泳结果如图9。通过改造后的筛选标记进行筛选得到62个不同的抗性系植株，经PCR检测，100％可扩增出目的片段，说明通过构建UBI驱动的Neo/KAN抗性基因作为筛选标记在甘蔗遗传转化中可以高效的对转化体进行筛选，筛选出的抗性植株全部为阳性植株，大大减少了筛选过程的工作量，也大大减少了后续对阳性苗进行PCR检测的工作量。

(9)转化效率统计：转化效率＝得到的转化系/转化的愈伤数。共转化了1000块愈伤，通过在加了抗生素的筛选培养基上筛选、分化，最终得到了62个不同的转化系植株，转化效率为6.2％，用构建的此载体转化甘蔗，最终获得阳性系植株的转化效率达到6.2％。表明此载体是一种高效适合基因枪介导甘蔗遗传转化的表达载体，大幅度提高了基因枪介导的甘蔗的遗传转化效率。

以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

序列表

<110> 广西壮族自治区农业科学院

<120> 一种适用于甘蔗遗传转化的表达载体及其构建方法和应用

<160> 15

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 57

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gagccgattt tgaaaccgcg gtaattcgaa ttacctagga gcggataaca atttcac 57

<210> 2

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ggatccccgg gtaccgagct cgtaactagt ctgcagaagt aacaccaaac 50

<210> 3

<211> 58

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gagccgattt tgaaaccgcg gtaagacgtc aacaggcctt atctgcagaa gtaacacc 58

<210> 4

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

tccgctccta ggtaattcga attactgcag tgcagcgtga cccg 44

<210> 5

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gagccgattt tgaaaccgcg gtgatcacag gcagc 35

<210> 6

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

cagataaggc ctgttgacgt catgattgaa caagatgg 38

<210> 7

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

ctcggtacca tggtgagcaa gggc 24

<210> 8

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

gcgacgcgtt tacttgtaca gctc 24

<210> 9

<211> 1993

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

ctgcagtgca gcgtgacccg gtcgtgcccc tctctagaga taatgagcat tgcatgtcta 60

agttataaaa aattaccaca tatttttttt gtcacacttg tttgaagtgc agtttatcta 120

tctttataca tatatttaaa ctttactcta cgaataatat aatctatagt actacaataa 180

tatcagtgtt ttagagaatc atataaatga acagttagac atggtctaaa ggacaattga 240

gtattttgac aacaggactc tacagtttta tctttttagt gtgcatgtgt tctccttttt 300

ttttgcaaat agcttcacct atataatact tcatccattt tattagtaca tccatttagg 360

gtttagggtt aatggttttt atagactaat ttttttagta catctatttt attctatttt 420

agcctctaaa ttaagaaaac taaaactcta ttttagtttt tttatttaat aatttagata 480

taaaatagaa taaaataaag tgactaaaaa ttaaacaaat accctttaag aaattaaaaa 540

aactaaggaa acatttttct tgtttcgagt agataatgcc agcctgttaa acgccgtcga 600

cgagtctaac ggacaccaac cagcgaacca gcagcgtcgc gtcgggccaa gcgaagcaga 660

cggcacggca tctctgtcgc tgcctctgga cccctctcga gagttccgct ccaccgttgg 720

acttgctccg ctgtcggcat ccagaaattg cgtggcggag cggcagacgt gagccggcac 780

ggcaggcggc ctcctcctcc tctcacggca ccggcagcta cgggggattc ctttcccacc 840

gctccttcgc tttcccttcc tcgcccgccg taataaatag acaccccctc cacaccctct 900

ttccccaacc tcgtgttgtt cggagcgcac acacacacaa ccagatctcc cccaaatcca 960

cccgtcggca cctccgcttc aaggtacgcc gctcgtcctc cccccccccc cctctctacc 1020

ttctctagat cggcgttccg gtccatggtt agggcccggt agttctactt ctgttcatgt 1080

ttgtgttaga tccgtgtttg tgttagatcc gtgctgctag cgttcgtaca cggatgcgac 1140

ctgtacgtca gacacgttct gattgctaac ttgccagtgt ttctctttgg ggaatcctgg 1200

gatggctcta gccgttccgc agacgggatc gatttcatga ttttttttgt ttcgttgcat 1260

agggtttggt ttgccctttt cctttatttc aatatatgcc gtgcacttgt ttgtcgggtc 1320

atcttttcat gctttttttt gtcttggttg tgatgatgtg gtctggttgg gcggtcgttc 1380

tagatcggag tagaattctg tttcaaacta cctggtggat ttattaattt tggatctgta 1440

tgtgtgtgcc atacatattc atagttacga attgaagatg atggatggaa atatcgatct 1500

aggataggta tacatgttga tgcgggtttt actgatgcat atacagagat gctttttgtt 1560

cgcttggttg tgatgatgtg gtgtggttgg gcggtcgttc attcgttcta gatcggagta 1620

gaatactgtt tcaaactacc tggtgtattt attaattttg gaactgtatg tgtgtgtcat 1680

acatcttcat agttacgagt ttaagatgga tggaaatatc gatctaggat aggtatacat 1740

gttgatgtgg gttttactga tgcatataca tgatggcata tgcagcatct attcatatgc 1800

tctaaccttg agtacctatc tattataata aacaagtatg ttttataatt attttgatct 1860

tgatatactt ggatgatggc atatgcagca gctatatgtg gattttttta gccctgcctt 1920

catacgctat ttatttgctt ggtactgttt cttttgtcga tgctcaccct gttgtttggt 1980

gttacttctg cag 1993

<210> 10

<211> 1777

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

tgatcacagg cagcaacgct ctgtcatcgt tacaatcaac atgctaccct ccgcgagatc 60

atccgtgttt caaacccggc agcttagttg ccgttcttcc gaatagcatc ggtaacatga 120

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ctgtatcgag tggtgatttt gtgccgagct gccggtcggg gagctgttgg ctggctggtg 240

gcaggatata ttgtggtgta aacaaattga cgcttagaca acttaataac acattgcgga 300

cgtttttaat gtactgaatt aacgccgaat taattcgggg gatctagtaa catagatgac 360

accgcgcgcg ataatttatc ctagtttgcg cgctatattt tgttttctat cgcgtattaa 420

atgtataatt gcgggactct aatcataaaa acccatctca taaataacgt catgcattac 480

atgttaatta ttacatgctt aacgtaattc aacagaaatt atatgataat catcgcaaga 540

ccggcaacag gattcaatct taagaaactt tattgccaaa tgtttgaacg atcggggatc 600

atccgggtct gtggcgggaa ctccacgaaa atatccgaac gcagcaagat atcgcggtgc 660

atctcggtct tgcctgggca gtcgccgccg acgccgttga tgtggacgcc gggcccgatc 720

atattgtcgc tcaggatcgt ggcgttgtgc ttgtcggccg ttgctgtcgt aatgatatcg 780

gcaccttcga ccgcctgttc cgcagagatc ccgtgggcga agaactccag catgagatcc 840

ccgcgctgga ggatcatcca gccggcgtcc cggaaaacga ttccgaagcc caacctttca 900

tagaaggcgg cggtggaatc gaaatctcgt gatggcaggt tgggcgtcgc ttggtcggtc 960

atttcgaacc ccagagtccc gctcagaaga actcgtcaag aaggcgatag aaggcgatgc 1020

gctgcgaatc gggagcggcg ataccgtaaa gcacgaggaa gcggtcagcc cattcgccgc 1080

caagctcttc agcaatatca cgggtagcca acgctatgtc ctgatagcgg tccgccacac 1140

ccagccggcc acagtcgatg aatccagaaa agcggccatt ttccaccatg atattcggca 1200

agcaggcatc gccatgggtc acgacgagat catcgccgtc gggcatgcgc gccttgagcc 1260

tggcgaacag ttcggctggc gcgagcccct gatgctcttc gtccagatca tcctgatcga 1320

caagaccggc ttccatccga gtacgtgctc gctcgatgcg atgtttcgct tggtggtcga 1380

atgggcaggt agccggatca agcgtatgca gccgccgcat tgcatcagcc atgatggata 1440

ctttctcggc aggagcaagg tgagatgaca ggagatcctg ccccggcact tcgcccaata 1500

gcagccagtc ccttcccgct tcagtgacaa cgtcgagcac agctgcgcaa ggaacgcccg 1560

tcgtggccag ccacgatagc cgcgctgcct cgtcctgcag ttcattcagg gcaccggaca 1620

ggtcggtctt gacaaaaaga accgggcgcc cctgcgctga cagccggaac acggcggcat 1680

cagagcagcc gattgtctgt tgtgcccagt catagccgaa tagcctctcc acccaagcgg 1740

ccggagaacc tgcgtgcaat ccatcttgtt caatcat 1777

<210> 11

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

aacctcgtgt tgttcgga 18

<210> 12

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

acactggcaa gttagcaa 18

<210> 13

<211> 12426

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

caaagttggc gtataacata gtatcgacgg agccgatttt gaaaccgcgg tgatcacagg 60

cagcaacgct ctgtcatcgt tacaatcaac atgctaccct ccgcgagatc atccgtgttt 120

caaacccggc agcttagttg ccgttcttcc gaatagcatc ggtaacatga gcaaagtctg 180

ccgccttaca acggctctcc cgctgacgcc gtcccggact gatgggctgc ctgtatcgag 240

tggtgatttt gtgccgagct gccggtcggg gagctgttgg ctggctggtg gcaggatata 300

ttgtggtgta aacaaattga cgcttagaca acttaataac acattgcgga cgtttttaat 360

gtactgaatt aacgccgaat taattcgggg gatctagtaa catagatgac accgcgcgcg 420

ataatttatc ctagtttgcg cgctatattt tgttttctat cgcgtattaa atgtataatt 480

gcgggactct aatcataaaa acccatctca taaataacgt catgcattac atgttaatta 540

ttacatgctt aacgtaattc aacagaaatt atatgataat catcgcaaga ccggcaacag 600

gattcaatct taagaaactt tattgccaaa tgtttgaacg atcggggatc atccgggtct 660

gtggcgggaa ctccacgaaa atatccgaac gcagcaagat atcgcggtgc atctcggtct 720

tgcctgggca gtcgccgccg acgccgttga tgtggacgcc gggcccgatc atattgtcgc 780

tcaggatcgt ggcgttgtgc ttgtcggccg ttgctgtcgt aatgatatcg gcaccttcga 840

ccgcctgttc cgcagagatc ccgtgggcga agaactccag catgagatcc ccgcgctgga 900

ggatcatcca gccggcgtcc cggaaaacga ttccgaagcc caacctttca tagaaggcgg 960

cggtggaatc gaaatctcgt gatggcaggt tgggcgtcgc ttggtcggtc atttcgaacc 1020

ccagagtccc gctcagaaga actcgtcaag aaggcgatag aaggcgatgc gctgcgaatc 1080

gggagcggcg ataccgtaaa gcacgaggaa gcggtcagcc cattcgccgc caagctcttc 1140

agcaatatca cgggtagcca acgctatgtc ctgatagcgg tccgccacac ccagccggcc 1200

acagtcgatg aatccagaaa agcggccatt ttccaccatg atattcggca agcaggcatc 1260

gccatgggtc acgacgagat catcgccgtc gggcatgcgc gccttgagcc tggcgaacag 1320

ttcggctggc gcgagcccct gatgctcttc gtccagatca tcctgatcga caagaccggc 1380

ttccatccga gtacgtgctc gctcgatgcg atgtttcgct tggtggtcga atgggcaggt 1440

agccggatca agcgtatgca gccgccgcat tgcatcagcc atgatggata ctttctcggc 1500

aggagcaagg tgagatgaca ggagatcctg ccccggcact tcgcccaata gcagccagtc 1560

ccttcccgct tcagtgacaa cgtcgagcac agctgcgcaa ggaacgcccg tcgtggccag 1620

ccacgatagc cgcgctgcct cgtcctgcag ttcattcagg gcaccggaca ggtcggtctt 1680

gacaaaaaga accgggcgcc cctgcgctga cagccggaac acggcggcat cagagcagcc 1740

gattgtctgt tgtgcccagt catagccgaa tagcctctcc acccaagcgg ccggagaacc 1800

tgcgtgcaat ccatcttgtt caatcatgac gtcaacaggc cttatctgca gaagtaacac 1860

caaacaacag ggtgagcatc gacaaaagaa acagtaccaa gcaaataaat agcgtatgaa 1920

ggcagggcta aaaaaatcca catatagctg ctgcatatgc catcatccaa gtatatcaag 1980

atcaaaataa ttataaaaca tacttgttta ttataataga taggtactca aggttagagc 2040

atatgaatag atgctgcata tgccatcatg tatatgcatc agtaaaaccc acatcaacat 2100

gtatacctat cctagatcga tatttccatc catcttaaac tcgtaactat gaagatgtat 2160

gacacacaca tacagttcca aaattaataa atacaccagg tagtttgaaa cagtattcta 2220

ctccgatcta gaacgaatga acgaccgccc aaccacacca catcatcaca accaagcgaa 2280

caaaaagcat ctctgtatat gcatcagtaa aacccgcatc aacatgtata cctatcctag 2340

atcgatattt ccatccatca tcttcaattc gtaactatga atatgtatgg cacacacata 2400

cagatccaaa attaataaat ccaccaggta gtttgaaaca gaattctact ccgatctaga 2460

acgaccgccc aaccagacca catcatcaca accaagacaa aaaaaagcat gaaaagatga 2520

cccgacaaac aagtgcacgg catatattga aataaaggaa aagggcaaac caaaccctat 2580

gcaacgaaac aaaaaaaatc atgaaatcga tcccgtctgc ggaacggcta gagccatccc 2640

aggattcccc aaagagaaac actggcaagt tagcaatcag aacgtgtctg acgtacaggt 2700

cgcatccgtg tacgaacgct agcagcacgg atctaacaca aacacggatc taacacaaac 2760

atgaacagaa gtagaactac cgggccctaa ccatggaccg gaacgccgat ctagagaagg 2820

tagagagggg ggggggggga ggacgagcgg cgtaccttga agcggaggtg ccgacgggtg 2880

gatttggggg agatctggtt gtgtgtgtgt gcgctccgaa caacacgagg ttggggaaag 2940

agggtgtgga gggggtgtct atttattacg gcgggcgagg aagggaaagc gaaggagcgg 3000

tgggaaagga atcccccgta gctgccggtg ccgtgagagg aggaggaggc cgcctgccgt 3060

gccggctcac gtctgccgct ccgccacgca atttctggat gccgacagcg gagcaagtcc 3120

aacggtggag cggaactctc gagaggggtc cagaggcagc gacagagatg ccgtgccgtc 3180

tgcttcgctt ggcccgacgc gacgctgctg gttcgctggt tggtgtccgt tagactcgtc 3240

gacggcgttt aacaggctgg cattatctac tcgaaacaag aaaaatgttt ccttagtttt 3300

tttaatttct taaagggtat ttgtttaatt tttagtcact ttattttatt ctattttata 3360

tctaaattat taaataaaaa aactaaaata gagttttagt tttcttaatt tagaggctaa 3420

aatagaataa aatagatgta ctaaaaaaat tagtctataa aaaccattaa ccctaaaccc 3480

taaatggatg tactaataaa atggatgaag tattatatag gtgaagctat ttgcaaaaaa 3540

aaaggagaac acatgcacac taaaaagata aaactgtaga gtcctgttgt caaaatactc 3600

aattgtcctt tagaccatgt ctaactgttc atttatatga ttctctaaaa cactgatatt 3660

attgtagtac tatagattat attattcgta gagtaaagtt taaatatatg tataaagata 3720

gataaactgc acttcaaaca agtgtgacaa aaaaaatatg tggtaatttt ttataactta 3780

gacatgcaat gctcattatc tctagagagg ggcacgaccg ggtcacgctg cactgcagta 3840

attcgaatta cctaggagcg gataacaatt tcacacagga ctgcagtgca gcgtgacccg 3900

gtcgtgcccc tctctagaga taatgagcat tgcatgtcta agttataaaa aattaccaca 3960

tatttttttt gtcacacttg tttgaagtgc agtttatcta tctttataca tatatttaaa 4020

ctttactcta cgaataatat aatctatagt actacaataa tatcagtgtt ttagagaatc 4080

atataaatga acagttagac atggtctaaa ggacaattga gtattttgac aacaggactc 4140

tacagtttta tctttttagt gtgcatgtgt tctccttttt ttttgcaaat agcttcacct 4200

atataatact tcatccattt tattagtaca tccatttagg gtttagggtt aatggttttt 4260

atagactaat ttttttagta catctatttt attctatttt agcctctaaa ttaagaaaac 4320

taaaactcta ttttagtttt tttatttaat aatttagata taaaatagaa taaaataaag 4380

tgactaaaaa ttaaacaaat accctttaag aaattaaaaa aactaaggaa acatttttct 4440

tgtttcgagt agataatgcc agcctgttaa acgccgtcga cgagtctaac ggacaccaac 4500

cagcgaacca gcagcgtcgc gtcgggccaa gcgaagcaga cggcacggca tctctgtcgc 4560

tgcctctgga cccctctcga gagttccgct ccaccgttgg acttgctccg ctgtcggcat 4620

ccagaaattg cgtggcggag cggcagacgt gagccggcac ggcaggcggc ctcctcctcc 4680

tctcacggca ccggcagcta cgggggattc ctttcccacc gctccttcgc tttcccttcc 4740

tcgcccgccg taataaatag acaccccctc cacaccctct ttccccaacc tcgtgttgtt 4800

cggagcgcac acacacacaa ccagatctcc cccaaatcca cccgtcggca cctccgcttc 4860

aaggtacgcc gctcgtcctc cccccccccc cctctctacc ttctctagat cggcgttccg 4920

gtccatggtt agggcccggt agttctactt ctgttcatgt ttgtgttaga tccgtgtttg 4980

tgttagatcc gtgctgctag cgttcgtaca cggatgcgac ctgtacgtca gacacgttct 5040

gattgctaac ttgccagtgt ttctctttgg ggaatcctgg gatggctcta gccgttccgc 5100

agacgggatc gatttcatga ttttttttgt ttcgttgcat agggtttggt ttgccctttt 5160

cctttatttc aatatatgcc gtgcacttgt ttgtcgggtc atcttttcat gctttttttt 5220

gtcttggttg tgatgatgtg gtctggttgg gcggtcgttc tagatcggag tagaattctg 5280

tttcaaacta cctggtggat ttattaattt tggatctgta tgtgtgtgcc atacatattc 5340

atagttacga attgaagatg atggatggaa atatcgatct aggataggta tacatgttga 5400

tgcgggtttt actgatgcat atacagagat gctttttgtt cgcttggttg tgatgatgtg 5460

gtgtggttgg gcggtcgttc attcgttcta gatcggagta gaatactgtt tcaaactacc 5520

tggtgtattt attaattttg gaactgtatg tgtgtgtcat acatcttcat agttacgagt 5580

ttaagatgga tggaaatatc gatctaggat aggtatacat gttgatgtgg gttttactga 5640

tgcatataca tgatggcata tgcagcatct attcatatgc tctaaccttg agtacctatc 5700

tattataata aacaagtatg ttttataatt attttgatct tgatatactt ggatgatggc 5760

atatgcagca gctatatgtg gattttttta gccctgcctt catacgctat ttatttgctt 5820

ggtactgttt cttttgtcga tgctcaccct gttgtttggt gttacttctg cagactagtt 5880

acgagctcgg tacccgggga tcctctagag tcgacgaaga tcttccatgc catggcatgc 5940

gacgcgtcgc tgcaggatcg ttcaaacatt tggcaataaa gtttcttaag attgaatcct 6000

gttgccggtc ttgcgatgat tatcatataa tttctgttga attacgttaa gcatgtaata 6060

attaacatgt aatgcatgac gttatttatg agatgggttt ttatgattag agtcccgcaa 6120

ttatacattt aatacgcgat agaaaacaaa atatagcgcg caaactagga taaattatcg 6180

cgcgcggtgt catctatgtt actagatcaa gcttggcact ggccgtcgtt ttacaacgtc 6240

gtgactggga aaaccctggc gttacccaac ttaatcgcct tgcagcacat ccccctttcg 6300

ccagctggcg taatagcgaa gaggcccgca ccgatcgccc ttcccaacag ttgcgcagcc 6360

tgaatggcga atgctagagc agcttgagct tggatcagat tgtcgtttcc cgccttcagt 6420

ttaaactatc agtgtttgac aggatatatt ggcgggtaaa cctaagagaa aagagcgttt 6480

attagaataa cggatattta aaagggcgtg aaaaggttta tccgttcgtc catttgtatg 6540

tgcatgccaa ccacagggtt cccctcggga tcaaagtact ttgatccaac ccctccgctg 6600

ctatagtgca gtcggcttct gacgttcagt gcagccgtct tctgaaaacg acatgtcgca 6660

caagtcctaa gttacgcgac aggctgccgc cctgcccttt tcctggcgtt ttcttgtcgc 6720

gtgttttagt cgcataaagt agaatacttg cgactagaac cggagacatt acgccatgaa 6780

caagagcgcc gccgctggcc tgctgggcta tgcccgcgtc agcaccgacg accaggactt 6840

gaccaaccaa cgggccgaac tgcacgcggc cggctgcacc aagctgtttt ccgagaagat 6900

caccggcacc aggcgcgacc gcccggagct ggccaggatg cttgaccacc tacgccctgg 6960

cgacgttgtg acagtgacca ggctagaccg cctggcccgc agcacccgcg acctactgga 7020

cattgccgag cgcatccagg aggccggcgc gggcctgcgt agcctggcag agccgtgggc 7080

cgacaccacc acgccggccg gccgcatggt gttgaccgtg ttcgccggca ttgccgagtt 7140

cgagcgttcc ctaatcatcg accgcacccg gagcgggcgc gaggccgcca aggcccgagg 7200

cgtgaagttt ggcccccgcc ctaccctcac cccggcacag atcgcgcacg cccgcgagct 7260

gatcgaccag gaaggccgca ccgtgaaaga ggcggctgca ctgcttggcg tgcatcgctc 7320

gaccctgtac cgcgcacttg agcgcagcga ggaagtgacg cccaccgagg ccaggcggcg 7380

cggtgccttc cgtgaggacg cattgaccga ggccgacgcc ctggcggccg ccgagaatga 7440

acgccaagag gaacaagcat gaaaccgcac caggacggcc aggacgaacc gtttttcatt 7500

accgaagaga tcgaggcgga gatgatcgcg gccgggtacg tgttcgagcc gcccgcgcac 7560

gtctcaaccg tgcggctgca tgaaatcctg gccggtttgt ctgatgccaa gctggcggcc 7620

tggccggcca gcttggccgc tgaagaaacc gagcgccgcc gtctaaaaag gtgatgtgta 7680

tttgagtaaa acagcttgcg tcatgcggtc gctgcgtata tgatgcgatg agtaaataaa 7740

caaatacgca aggggaacgc atgaaggtta tcgctgtact taaccagaaa ggcgggtcag 7800

gcaagacgac catcgcaacc catctagccc gcgccctgca actcgccggg gccgatgttc 7860

tgttagtcga ttccgatccc cagggcagtg cccgcgattg ggcggccgtg cgggaagatc 7920

aaccgctaac cgttgtcggc atcgaccgcc cgacgattga ccgcgacgtg aaggccatcg 7980

gccggcgcga cttcgtagtg atcgacggag cgccccaggc ggcggacttg gctgtgtccg 8040

cgatcaaggc agccgacttc gtgctgattc cggtgcagcc aagcccttac gacatatggg 8100

ccaccgccga cctggtggag ctggttaagc agcgcattga ggtcacggat ggaaggctac 8160

aagcggcctt tgtcgtgtcg cgggcgatca aaggcacgcg catcggcggt gaggttgccg 8220

aggcgctggc cgggtacgag ctgcccattc ttgagtcccg tatcacgcag cgcgtgagct 8280

acccaggcac tgccgccgcc ggcacaaccg ttcttgaatc agaacccgag ggcgacgctg 8340

cccgcgaggt ccaggcgctg gccgctgaaa ttaaatcaaa actcatttga gttaatgagg 8400

taaagagaaa atgagcaaaa gcacaaacac gctaagtgcc ggccgtccga gcgcacgcag 8460

cagcaaggct gcaacgttgg ccagcctggc agacacgcca gccatgaagc gggtcaactt 8520

tcagttgccg gcggaggatc acaccaagct gaagatgtac gcggtacgcc aaggcaagac 8580

cattaccgag ctgctatctg aatacatcgc gcagctacca gagtaaatga gcaaatgaat 8640

aaatgagtag atgaatttta gcggctaaag gaggcggcat ggaaaatcaa gaacaaccag 8700

gcaccgacgc cgtggaatgc cccatgtgtg gaggaacggg cggttggcca ggcgtaagcg 8760

gctgggttgt ctgccggccc tgcaatggca ctggaacccc caagcccgag gaatcggcgt 8820

gacggtcgca aaccatccgg cccggtacaa atcggcgcgg cgctgggtga tgacctggtg 8880

gagaagttga aggccgcgca ggccgcccag cggcaacgca tcgaggcaga agcacgcccc 8940

ggtgaatcgt ggcaagcggc cgctgatcga atccgcaaag aatcccggca accgccggca 9000

gccggtgcgc cgtcgattag gaagccgccc aagggcgacg agcaaccaga ttttttcgtt 9060

ccgatgctct atgacgtggg cacccgcgat agtcgcagca tcatggacgt ggccgttttc 9120

cgtctgtcga agcgtgaccg acgagctggc gaggtgatcc gctacgagct tccagacggg 9180

cacgtagagg tttccgcagg gccggccggc atggccagtg tgtgggatta cgacctggta 9240

ctgatggcgg tttcccatct aaccgaatcc atgaaccgat accgggaagg gaagggagac 9300

aagcccggcc gcgtgttccg tccacacgtt gcggacgtac tcaagttctg ccggcgagcc 9360

gatggcggaa agcagaaaga cgacctggta gaaacctgca ttcggttaaa caccacgcac 9420

gttgccatgc agcgtacgaa gaaggccaag aacggccgcc tggtgacggt atccgagggt 9480

gaagccttga ttagccgcta caagatcgta aagagcgaaa ccgggcggcc ggagtacatc 9540

gagatcgagc tagctgattg gatgtaccgc gagatcacag aaggcaagaa cccggacgtg 9600

ctgacggttc accccgatta ctttttgatc gatcccggca tcggccgttt tctctaccgc 9660

ctggcacgcc gcgccgcagg caaggcagaa gccagatggt tgttcaagac gatctacgaa 9720

cgcagtggca gcgccggaga gttcaagaag ttctgtttca ccgtgcgcaa gctgatcggg 9780

tcaaatgacc tgccggagta cgatttgaag gaggaggcgg ggcaggctgg cccgatccta 9840

gtcatgcgct accgcaacct gatcgagggc gaagcatccg ccggttccta atgtacggag 9900

cagatgctag ggcaaattgc cctagcaggg gaaaaaggtc gaaaaggtct ctttcctgtg 9960

gatagcacgt acattgggaa cccaaagccg tacattggga accggaaccc gtacattggg 10020

aacccaaagc cgtacattgg gaaccggtca cacatgtaag tgactgatat aaaagagaaa 10080

aaaggcgatt tttccgccta aaactcttta aaacttatta aaactcttaa aacccgcctg 10140

gcctgtgcat aactgtctgg ccagcgcaca gccgaagagc tgcaaaaagc gcctaccctt 10200

cggtcgctgc gctccctacg ccccgccgct tcgcgtcggc ctatcgcggc cgctggccgc 10260

tcaaaaatgg ctggcctacg gccaggcaat ctaccagggc gcggacaagc cgcgccgtcg 10320

ccactcgacc gccggcgccc acatcaaggc accctgcctc gcgcgtttcg gtgatgacgg 10380

tgaaaacctc tgacacatgc agctcccgga gacggtcaca gcttgtctgt aagcggatgc 10440

cgggagcaga caagcccgtc agggcgcgtc agcgggtgtt ggcgggtgtc ggggcgcagc 10500

catgacccag tcacgtagcg atagcggagt gtatactggc ttaactatgc ggcatcagag 10560

cagattgtac tgagagtgca ccatatgcgg tgtgaaatac cgcacagatg cgtaaggaga 10620

aaataccgca tcaggcgctc ttccgcttcc tcgctcactg actcgctgcg ctcggtcgtt 10680

cggctgcggc gagcggtatc agctcactca aaggcggtaa tacggttatc cacagaatca 10740

ggggataacg caggaaagaa catgtgagca aaaggccagc aaaaggccag gaaccgtaaa 10800

aaggccgcgt tgctggcgtt tttccatagg ctccgccccc ctgacgagca tcacaaaaat 10860

cgacgctcaa gtcagaggtg gcgaaacccg acaggactat aaagatacca ggcgtttccc 10920

cctggaagct ccctcgtgcg ctctcctgtt ccgaccctgc cgcttaccgg atacctgtcc 10980

gcctttctcc cttcgggaag cgtggcgctt tctcatagct cacgctgtag gtatctcagt 11040

tcggtgtagg tcgttcgctc caagctgggc tgtgtgcacg aaccccccgt tcagcccgac 11100

cgctgcgcct tatccggtaa ctatcgtctt gagtccaacc cggtaagaca cgacttatcg 11160

ccactggcag cagccactgg taacaggatt agcagagcga ggtatgtagg cggtgctaca 11220

gagttcttga agtggtggcc taactacggc tacactagaa ggacagtatt tggtatctgc 11280

gctctgctga agccagttac cttcggaaaa agagttggta gctcttgatc cggcaaacaa 11340

accaccgctg gtagcggtgg tttttttgtt tgcaagcagc agattacgcg cagaaaaaaa 11400

ggatctcaag aagatccttt gatcttttct acggggtctg acgctcagtg gaacgaaaac 11460

tcacgttaag ggattttggt catgcattct aggtactaaa acaattcatc cagtaaaata 11520

taatatttta ttttctccca atcaggcttg atccccagta agtcaaaaaa tagctcgaca 11580

tactgttctt ccccgatatc ctccctgatc gaccggacgc agaaggcaat gtcataccac 11640

ttgtccgccc tgccgcttct cccaagatca ataaagccac ttactttgcc atctttcaca 11700

aagatgttgc tgtctcccag gtcgccgtgg gaaaagacaa gttcctcttc gggcttttcc 11760

gtctttaaaa aatcatacag ctcgcgcgga tctttaaatg gagtgtcttc ttcccagttt 11820

tcgcaatcca catcggccag atcgttattc agtaagtaat ccaattcggc taagcggctg 11880

tctaagctat tcgtataggg acaatccgat atgtcgatgg agtgaaagag cctgatgcac 11940

tccgcataca gctcgataat cttttcaggg ctttgttcat cttcatactc ttccgagcaa 12000

aggacgccat cggcctcact catgagcaga ttgctccagc catcatgccg ttcaaagtgc 12060

aggacctttg gaacaggcag ctttccttcc agccatagca tcatgtcctt ttcccgttcc 12120

acatcatagg tggtcccttt ataccggctg tccgtcattt ttaaatatag gttttcattt 12180

tctcccacca gcttatatac cttagcagga gacattcctt ccgtatcttt tacgcagcgg 12240

tatttttcga tcagtttttt caattccggt gatattctca ttttagccat ttattatttc 12300

cttcctcttt tctacagtat ttaaagatac cccaagaagc taattataac aagacgaact 12360

ccaattcact gttccttgca ttctaaaacc ttaaatacca gaaaacagct ttttcaaagt 12420

tgtttt 12426

<210> 14

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

ctcggtacca tggtgagcaa gggc 24

<210> 15

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

gcgacgcgtt tacttgtaca gctc 24

Claims (6)

1.一种适用于基因枪介导的甘蔗遗传转化的表达载体，其特征在于，所述表达载体为SEQ ID NO：13所示序列；所述表达载体的构建方法包括以下步骤：

(1)载体pCAMBIA1300-35S-NOS用SacII/SacI酶切，之后与UBI启动子体外连接，得到载体1；

(2)UBI启动子加A连接到T载体，得到含有UBI启动子的T载体，所述含有UBI启动子的T载体和所述载体1分别经SacII/Bsp119I酶切后连接，得到载体2；

(3)KAN-NOS加A连接到T载体，得到含有KAN-NOS的T载体，所述含有KAN-NOS的T载体和所述载体2分别经SacII/AatII酶切后连接，获得载体3，即为所述适用于基因枪介导的甘蔗遗传转化的表达载体。

2.根据权利要求1所述的适用于基因枪介导的甘蔗遗传转化的表达载体，其特征在于，在步骤(1)中，所述UBI启动子的获得方法包括：以pTCK303为模板，利用SEQ ID NO：1和SEQID NO：2所示引物，进行PCR扩增。

3.根据权利要求1所述的适用于基因枪介导的甘蔗遗传转化的表达载体，其特征在于，在步骤(2)中，所述UBI启动子的获得方法为：以pTCK303为模板，利用SEQ ID NO：3和SEQ IDNO：4所示引物，进行PCR扩增。

4.根据权利要求1所述的适用于基因枪介导的甘蔗遗传转化的表达载体，其特征在于，在步骤(3)中，所述KAN-NOS的获得方法包括：以pBI121为模板，利用SEQ ID NO：5和SEQ IDNO：6所示引物，进行PCR扩增。

5.根据权利要求1所述的适用于基因枪介导的甘蔗遗传转化的表达载体在甘蔗转基因中的应用。

6.一种基因枪介导的甘蔗转基因方法，其特征在于，包括以下步骤：将目的基因插入权利要求1所述的表达载体中，进行甘蔗的遗传转化。

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