CN108913715A - 一种含有flag蛋白融合标签的植物表达质粒载体及其载体的构建方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开的一种含有FLAG蛋白融合标签的植物表达质粒载体，为在植物表达质粒载体的C端含有FLAG蛋白融合标签的植物表达质粒载体。构建所述质粒载体方法，包括如下步骤：(1)以pCAMBIA1302为出发质粒，采用SpeI和Eco065I酶切该质粒，通过凝胶电泳切胶回收大片段；(2)全序列合成包含编码3个FLAG蛋白的核苷酸序列；(3)设计扩增引物；(4)在N端加上SpeI酶切位点，在C端加上Eco065I酶切位点；用SpeI和Eco065I酶切该合成片段；最后连接产物，热激转化DH5α,通过PCR鉴定得到阳性克隆。本发明的优点在于，得到小蛋白的融合标签的植物表达质粒载体，进而帮助使用者快速的研究蛋白功能，并且不会对目标蛋白自身的功能发生干扰，保证能够准确地研究蛋白的功能。

Description

一种含有FLAG蛋白融合标签的植物表达质粒载体及其载体的 构建方法

技术领域

本发明涉及分子生物学技术领域，具体为一种含有FLAG蛋白融合标签的植物表达质粒载体及其载体的构建方法。

背景技术

FLAG标签蛋白，是一个含8个氨基酸的亲水性多肽的小标签，标签序列Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys，这8个氨基酸作为抗原表位表达可识别其相应抗体。而FLAG等小的蛋白融合标签，不会或很少会对融合的蛋白功能产生干扰。而要将FLAG融合蛋白标签规模化、产业化推广，势必要提供一种带有常用的融合蛋白标签的植物表达质粒载体。pCAMBIA的一系列载体被全球许多植物分子生物学实验室广泛使用。随着基因功能和蛋白功能研究的兴起，重组蛋白表达技术现已经广泛应用于生物学各个具体领域，特别是蛋白的体内功能研究和蛋白质的大规模生产都需要应用重组蛋白表达载体。pCAMBIA的系列载体要么不含有蛋白融合标签，必须要制备研究的蛋白自身的特异性抗体，费时费力，不利于快速地研究蛋白功能；要么含有较大的蛋白融合标签(例如GFP和GUS等)，而这些大的蛋白融合标签经常会对目标蛋白自身的功能发生干扰，因此也不利于准确地研究蛋白的功能。所以，本领域技术人员亟待要解决的技术问题是如何构建出含有FLAG融合蛋白标签的pCAMBIA载体。

发明内容

为了解决现有技术中pCAMBIA载体没有和FLAG这种小的蛋白融合标签融合的问题，本发明提供了一种含有FLAG蛋白融合标签的植物表达质粒载体及其载体的构建方法，实现的目的为，能够得到一种含有FLAG蛋白这种小蛋白的融合标签的植物表达质粒载体，进而帮助使用者快速的研究蛋白功能，并且不会对目标蛋白自身的功能发生干扰，保证能够准确地研究蛋白的功能。

为了实现上述目的，本发明提供的技术方案为，本发明公开的一种含有FLAG蛋白融合标签的植物表达质粒载体，该载体为在植物表达质粒载体的C端含有FLAG蛋白融合标签的植物表达质粒载体。

具体地，该载体包含有三段编码FLAG蛋白标签Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys的基因片段，所述三个FLAG蛋白的核苷酸序列分别如SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQID No.3所示。

具体地，该载体的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。

优选的，本发明还公开了构建上述所述质粒载体的方法，包括如下步骤：

(1)以pCAMBIA1302为出发质粒，采用SpeI和Eco065I酶切该质粒，通过凝胶电泳切胶回收9802bp的片段；

(2)全序列合成包含编码3个FLAG蛋白的核苷酸序列，全序列合成包含编码3个FLAG蛋白的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示；

(3)设计用于扩增包含编码3个FLAG蛋白的核苷酸序列基因片段的扩增引物，上游引物如SEQ ID No.6所示，下游引物如SEQ ID No.7所示；采用New England Biolabs的Phusion High-Fidelity DNA Polymerase进行扩增反应，扩增体系：50微升的总体积，包括10微升的5X Phusion HF Buffer、1微升的10mM dNTPs、2.5微升的10微摩尔上游引物、2.5微升的10微摩尔下游引物、1微升的上述合成的包含编码3个FLAG蛋白的核苷酸序列基因片段(浓度为45纳克/微升)、32.5微升的超纯水(由Milli-Q Reference Water PurificationSystem制备)和0.5微升的Phusion High-Fidelity DNA Polymerase。扩增程序：98℃运行30秒；然后30个循环的(98℃运行10秒；60℃运行30秒；72℃运行10秒)；最后72℃运行10分钟。

(4)扩增后最终在全序列合成的基因片段的N端加上SpeI酶切位点，在C端加上Eco065I酶切位点；用SpeI和Eco065I酶切该合成片段，凝胶电泳后切胶回收该片段；最后利用T4DNA连接酶连接上述酶切后回收纯化的片段；将连接反应的产物，热激转化DH5α,通过PCR鉴定得到阳性克隆；质粒载体的序列通过测序验证。

本发明采用上述技术方案具有以下有益效果，相较于现有技术中pCAMBIA载体与大的蛋白融合标签融合，经常会对目标蛋白自身的功能发生干扰，不能够准确地研究蛋白的功能，本发明提供的这种FLAG蛋白融合标签不影响蛋白功能，进而有效保证研究蛋白功能的准确性；现有技术中无小的蛋白标签pCAMBIA载体时，要想研究蛋白功能，必须要制备研究的蛋白自身的特异性抗体，但是这种方法费时费力，不利于快速地研究蛋白功能，而本发明构建这种FLAG标签质粒载体周期时间短，成本低廉，在保证了时间性的同时又能够节约成本，非常适宜产业化推广。

附图说明

图1为本发明实施例一中含有FLAG蛋白融合标签的植物表达质粒载体的遗传图谱。

图2为本发明实施例一中FLAG蛋白标签融合CHIL基因后并不影响CHIL基因在植物体内的生物学功能。图中，Extractable PAs by DMACA是DMACA法测定的可溶单宁，Extractable PAs by Butanol是Butanol法测定的可溶单宁，Non-extractable PAs是不可溶单宁。纵坐标为单宁的相对含量“relative level of PAs”。Col为野生型，chil-1和chil-2为CHIL基因的突变体，pCHIL:CHIL为在chil-1突变体中表达CHIL自身基因的转基因株系，pCHIL:CHIL-3FLAG为在chil-1突变体中表达CHIL融合3个串联重复的FLAG标签蛋白的转基因株系。Col野生型的单宁含量作为1。＊＊表示达到统计学p<0.01水平上的显著差异。

具体实施方式

实施例一：本发明公开的一种含有FLAG蛋白融合标签的植物表达质粒载体，该载体为在植物表达质粒载体的C端含有FLAG蛋白融合标签的植物表达质粒载体。具体地，该载体包含有三段编码FLAG蛋白标签Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys的基因片段，所述三个FLAG蛋白的核苷酸序列分别如SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3所示。

SEQ ID No.1和SEQ ID No.2之间的连接序列为SEQ ID No.8，SEQ ID No.2和SEQID No.3之间的连接序列为SEQ ID No.9。

当然，作为本领域技术人员公知的常识，该载体还包括有转录启动子、转录终止子、卡那霉素编码序列和复制子片段，该载体的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。本发明的载体，其遗传图谱如图1所示。本发明构建的质粒载体用于在植物中表达目的基因的重组蛋白。利用本发明的质粒载体，可以通过NcoI、BglII和SpeI将目的基因的基因片段引入载体中，确保目的基因的核苷酸序列与C端的3个串联重复的编码FLAG蛋白的核苷酸序列在同一读码框。

相较于现有技术中pCAMBIA载体与大的蛋白融合标签融合，经常会对目标蛋白自身的功能发生干扰，不能够准确地研究蛋白的功能，本发明提供的这种FLAG蛋白融合标签不影响蛋白功能，进而有效保证研究蛋白功能的准确性，以下通过列举试验例用以说明：利用本发明的质粒载体，可以通过NcoI、BglII和SpeI将目的基因的基因片段引入载体中，确保目的基因的核苷酸序列与C端的3个串联重复的编码FLAG蛋白的核苷酸序列在同一读码框。我们实验室发现拟南芥CHIL基因的突变体chil-1和chil-2中单宁的含量显著减少。在chil-1突变体中转入拟南芥CHIL的全长基因(包括启动子和全长基因组序列)，转基因株系能够恢复单宁的含量至野生型的水平。随后，我们将CHIL的全长基因通过引物SEQ IDNo.10和SEQ ID No.11进行PCR扩增，然后利用BamHI和SpeI酶切，连接引入本发明的质粒载体中，将最终质粒载体导入农杆菌GV3101，通过花侵染法转入拟南芥chil-1突变体中。三个转基因株系pCHIL:CHIL-3FLAG-1、pCHIL:CHIL-3FLAG-2和pCHIL:CHIL-3FLAG-3中单宁的含量均恢复到野生型的水平，与在chil-1突变体中表达pCHIL:CHIL的转基因株系的单宁含量之间没有显著差异。这些说明FLAG蛋白标签融合CHIL基因后并不影响CHIL基因在植物体内的生物学功能。该试验效果如图2所示。在这里需要说明的是，为了确保试验结果的稳定性，这样的试验平行重复多次，在这里只不过列举了其中一个试验用以给出示例而已。

构建上述载体的方法可采用任何一种现有技术方法。另外，本实施例中无特殊说明的操作手法均为现有技术，故不在此过多解释。

实施例二：本发明提供的一种含有FLAG蛋白融合标签的植物表达质粒载体，该载体为在植物表达质粒载体的C端含有FLAG蛋白融合标签的植物表达质粒载体。具体地，该载体包含有三段编码FLAG蛋白标签Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys的基因片段，所述三个FLAG蛋白的核苷酸序列分别如SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3所示。该载体还包括有转录启动子、转录终止子、卡那霉素编码序列和复制子片段，该载体的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。

优选的，构建所述质粒载体的方法包括如下步骤：

(1)以pCAMBIA1302为出发质粒，采用SpeI和Eco065I酶切该质粒，通过凝胶电泳切胶回收9802bp的片段；

(2)全序列合成包含编码3个FLAG蛋白的核苷酸序列，全序列合成包含编码3个FLAG蛋白的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示；

(3)设计用于扩增包含编码3个FLAG蛋白的核苷酸序列基因片段的扩增引物，上游引物如SEQ ID No.6所示，下游引物如SEQ ID No.7所示；采用New England Biolabs的Phusion High-Fidelity DNA Polymerase进行扩增反应，扩增体系：50微升的总体积，包括10微升的5X Phusion HF Buffer、1微升的10mM dNTPs、2.5微升的10微摩尔上游引物、2.5微升的10微摩尔下游引物、1微升的上述合成的包含编码3个FLAG蛋白的核苷酸序列基因片段(浓度为45纳克/微升)、32.5微升的超纯水(由Milli-Q Reference Water PurificationSystem制备)和0.5微升的Phusion High-Fidelity DNA Polymerase。扩增程序：98℃运行30秒；然后30个循环的(98℃运行10秒；60℃运行30秒；72℃运行10秒)；最后72℃运行10分钟。

(4)扩增后最终在全序列合成的基因片段的N端加上SpeI酶切位点，在C端加上Eco065I酶切位点；用SpeI和Eco065I酶切该合成片段，凝胶电泳后切胶回收该片段；最后利用T4DNA连接酶连接上述酶切后回收纯化的片段；将连接反应的产物，热激转化DH5α,通过PCR鉴定得到阳性克隆；质粒载体的序列通过测序验证。

现有技术中无小的蛋白标签pCAMBIA载体时，要想研究蛋白功能，必须要制备研究的蛋白自身的特异性抗体，但是这种方法费时费力，不利于快速地研究蛋白功能，而本发明构建这种FLAG标签质粒载体周期时间短，成本低廉，在保证了时间性的同时又能够节约成本，以下表格内容是根据某公司的服务报价和实验周期安排，制备蛋白自身的单克隆抗体需要花费超过4万元，需要耗费37周时间。而采用FLAG标签抗体只需花费1万元，10周以内的时间。

本实施例中无特殊说明的操作手法均为现有技术，故不在此过多解释。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所

<120> 一种含有FLAG蛋白融合标签的植物表达质粒载体及其载体的构建方法

<160> 11

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 24

<212> DNA

<213> 第一段编码FLAG蛋白标签的基因片段(2 Ambystoma laterale x Ambystomajeffersonianum)

<400> 1

gattacaagg atgacgacga taag 24

<210> 2

<211> 24

<212> DNA

<213> 第二段编码FLAG蛋白标签的基因片段(2 Ambystoma laterale x Ambystomajeffersonianum)

<400> 2

gattacaagg atgacgacga taag 24

<210> 3

<211> 24

<212> DNA

<213> 第三段编码FLAG蛋白标签的基因片段(2 Ambystoma laterale x Ambystomajeffersonianum)

<400> 3

gattacaagg atgacgacga taag 24

<210> 4

<211> 9919

<212> DNA

<213> 含有FLAG蛋白融合标签的植物表达质粒载体的基因序列(2 Ambystomalaterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 4

catggtagat ctgactagtc atatgtcgta ctacgattac aaggatgacg acgataaggg 60

cgattacaag gatgacgacg ataagggcga ttacaaggat gacgacgata agctcgaatc 120

aacaaggtga ggtgaccagc tcgaatttcc ccgatcgttc aaacatttgg caataaagtt 180

tcttaagatt gaatcctgtt gccggtcttg cgatgattat catataattt ctgttgaatt 240

acgttaagca tgtaataatt aacatgtaat gcatgacgtt atttatgaga tgggttttta 300

tgattagagt cccgcaatta tacatttaat acgcgataga aaacaaaata tagcgcgcaa 360

actaggataa attatcgcgc gcggtgtcat ctatgttact agatcgggaa ttaaactatc 420

agtgtttgac aggatatatt ggcgggtaaa cctaagagaa aagagcgttt attagaataa 480

cggatattta aaagggcgtg aaaaggttta tccgttcgtc catttgtatg tgcatgccaa 540

ccacagggtt cccctcggga tcaaagtact ttgatccaac ccctccgctg ctatagtgca 600

gtcggcttct gacgttcagt gcagccgtct tctgaaaacg acatgtcgca caagtcctaa 660

gttacgcgac aggctgccgc cctgcccttt tcctggcgtt ttcttgtcgc gtgttttagt 720

cgcataaagt agaatacttg cgactagaac cggagacatt acgccatgaa caagagcgcc 780

gccgctggcc tgctgggcta tgcccgcgtc agcaccgacg accaggactt gaccaaccaa 840

cgggccgaac tgcacgcggc cggctgcacc aagctgtttt ccgagaagat caccggcacc 900

aggcgcgacc gcccggagct ggccaggatg cttgaccacc tacgccctgg cgacgttgtg 960

acagtgacca ggctagaccg cctggcccgc agcacccgcg acctactgga cattgccgag 1020

cgcatccagg aggccggcgc gggcctgcgt agcctggcag agccgtgggc cgacaccacc 1080

acgccggccg gccgcatggt gttgaccgtg ttcgccggca ttgccgagtt cgagcgttcc 1140

ctaatcatcg accgcacccg gagcgggcgc gaggccgcca aggcccgagg cgtgaagttt 1200

ggcccccgcc ctaccctcac cccggcacag atcgcgcacg cccgcgagct gatcgaccag 1260

gaaggccgca ccgtgaaaga ggcggctgca ctgcttggcg tgcatcgctc gaccctgtac 1320

cgcgcacttg agcgcagcga ggaagtgacg cccaccgagg ccaggcggcg cggtgccttc 1380

cgtgaggacg cattgaccga ggccgacgcc ctggcggccg ccgagaatga acgccaagag 1440

gaacaagcat gaaaccgcac caggacggcc aggacgaacc gtttttcatt accgaagaga 1500

tcgaggcgga gatgatcgcg gccgggtacg tgttcgagcc gcccgcgcac gtctcaaccg 1560

tgcggctgca tgaaatcctg gccggtttgt ctgatgccaa gctggcggcc tggccggcca 1620

gcttggccgc tgaagaaacc gagcgccgcc gtctaaaaag gtgatgtgta tttgagtaaa 1680

acagcttgcg tcatgcggtc gctgcgtata tgatgcgatg agtaaataaa caaatacgca 1740

aggggaacgc atgaaggtta tcgctgtact taaccagaaa ggcgggtcag gcaagacgac 1800

catcgcaacc catctagccc gcgccctgca actcgccggg gccgatgttc tgttagtcga 1860

ttccgatccc cagggcagtg cccgcgattg ggcggccgtg cgggaagatc aaccgctaac 1920

cgttgtcggc atcgaccgcc cgacgattga ccgcgacgtg aaggccatcg gccggcgcga 1980

cttcgtagtg atcgacggag cgccccaggc ggcggacttg gctgtgtccg cgatcaaggc 2040

agccgacttc gtgctgattc cggtgcagcc aagcccttac gacatatggg ccaccgccga 2100

cctggtggag ctggttaagc agcgcattga ggtcacggat ggaaggctac aagcggcctt 2160

tgtcgtgtcg cgggcgatca aaggcacgcg catcggcggt gaggttgccg aggcgctggc 2220

cgggtacgag ctgcccattc ttgagtcccg tatcacgcag cgcgtgagct acccaggcac 2280

tgccgccgcc ggcacaaccg ttcttgaatc agaacccgag ggcgacgctg cccgcgaggt 2340

ccaggcgctg gccgctgaaa ttaaatcaaa actcatttga gttaatgagg taaagagaaa 2400

atgagcaaaa gcacaaacac gctaagtgcc ggccgtccga gcgcacgcag cagcaaggct 2460

gcaacgttgg ccagcctggc agacacgcca gccatgaagc gggtcaactt tcagttgccg 2520

gcggaggatc acaccaagct gaagatgtac gcggtacgcc aaggcaagac cattaccgag 2580

ctgctatctg aatacatcgc gcagctacca gagtaaatga gcaaatgaat aaatgagtag 2640

atgaatttta gcggctaaag gaggcggcat ggaaaatcaa gaacaaccag gcaccgacgc 2700

cgtggaatgc cccatgtgtg gaggaacggg cggttggcca ggcgtaagcg gctgggttgt 2760

ctgccggccc tgcaatggca ctggaacccc caagcccgag gaatcggcgt gacggtcgca 2820

aaccatccgg cccggtacaa atcggcgcgg cgctgggtga tgacctggtg gagaagttga 2880

aggccgcgca ggccgcccag cggcaacgca tcgaggcaga agcacgcccc ggtgaatcgt 2940

ggcaagcggc cgctgatcga atccgcaaag aatcccggca accgccggca gccggtgcgc 3000

cgtcgattag gaagccgccc aagggcgacg agcaaccaga ttttttcgtt ccgatgctct 3060

atgacgtggg cacccgcgat agtcgcagca tcatggacgt ggccgttttc cgtctgtcga 3120

agcgtgaccg acgagctggc gaggtgatcc gctacgagct tccagacggg cacgtagagg 3180

tttccgcagg gccggccggc atggccagtg tgtgggatta cgacctggta ctgatggcgg 3240

tttcccatct aaccgaatcc atgaaccgat accgggaagg gaagggagac aagcccggcc 3300

gcgtgttccg tccacacgtt gcggacgtac tcaagttctg ccggcgagcc gatggcggaa 3360

agcagaaaga cgacctggta gaaacctgca ttcggttaaa caccacgcac gttgccatgc 3420

agcgtacgaa gaaggccaag aacggccgcc tggtgacggt atccgagggt gaagccttga 3480

ttagccgcta caagatcgta aagagcgaaa ccgggcggcc ggagtacatc gagatcgagc 3540

tagctgattg gatgtaccgc gagatcacag aaggcaagaa cccggacgtg ctgacggttc 3600

accccgatta ctttttgatc gatcccggca tcggccgttt tctctaccgc ctggcacgcc 3660

gcgccgcagg caaggcagaa gccagatggt tgttcaagac gatctacgaa cgcagtggca 3720

gcgccggaga gttcaagaag ttctgtttca ccgtgcgcaa gctgatcggg tcaaatgacc 3780

tgccggagta cgatttgaag gaggaggcgg ggcaggctgg cccgatccta gtcatgcgct 3840

accgcaacct gatcgagggc gaagcatccg ccggttccta atgtacggag cagatgctag 3900

ggcaaattgc cctagcaggg gaaaaaggtc gaaaaggtct ctttcctgtg gatagcacgt 3960

acattgggaa cccaaagccg tacattggga accggaaccc gtacattggg aacccaaagc 4020

cgtacattgg gaaccggtca cacatgtaag tgactgatat aaaagagaaa aaaggcgatt 4080

tttccgccta aaactcttta aaacttatta aaactcttaa aacccgcctg gcctgtgcat 4140

aactgtctgg ccagcgcaca gccgaagagc tgcaaaaagc gcctaccctt cggtcgctgc 4200

gctccctacg ccccgccgct tcgcgtcggc ctatcgcggc cgctggccgc tcaaaaatgg 4260

ctggcctacg gccaggcaat ctaccagggc gcggacaagc cgcgccgtcg ccactcgacc 4320

gccggcgccc acatcaaggc accctgcctc gcgcgtttcg gtgatgacgg tgaaaacctc 4380

tgacacatgc agctcccgga gacggtcaca gcttgtctgt aagcggatgc cgggagcaga 4440

caagcccgtc agggcgcgtc agcgggtgtt ggcgggtgtc ggggcgcagc catgacccag 4500

tcacgtagcg atagcggagt gtatactggc ttaactatgc ggcatcagag cagattgtac 4560

tgagagtgca ccatatgcgg tgtgaaatac cgcacagatg cgtaaggaga aaataccgca 4620

tcaggcgctc ttccgcttcc tcgctcactg actcgctgcg ctcggtcgtt cggctgcggc 4680

gagcggtatc agctcactca aaggcggtaa tacggttatc cacagaatca ggggataacg 4740

caggaaagaa catgtgagca aaaggccagc aaaaggccag gaaccgtaaa aaggccgcgt 4800

tgctggcgtt tttccatagg ctccgccccc ctgacgagca tcacaaaaat cgacgctcaa 4860

gtcagaggtg gcgaaacccg acaggactat aaagatacca ggcgtttccc cctggaagct 4920

ccctcgtgcg ctctcctgtt ccgaccctgc cgcttaccgg atacctgtcc gcctttctcc 4980

cttcgggaag cgtggcgctt tctcatagct cacgctgtag gtatctcagt tcggtgtagg 5040

tcgttcgctc caagctgggc tgtgtgcacg aaccccccgt tcagcccgac cgctgcgcct 5100

tatccggtaa ctatcgtctt gagtccaacc cggtaagaca cgacttatcg ccactggcag 5160

cagccactgg taacaggatt agcagagcga ggtatgtagg cggtgctaca gagttcttga 5220

agtggtggcc taactacggc tacactagaa ggacagtatt tggtatctgc gctctgctga 5280

agccagttac cttcggaaaa agagttggta gctcttgatc cggcaaacaa accaccgctg 5340

gtagcggtgg tttttttgtt tgcaagcagc agattacgcg cagaaaaaaa ggatctcaag 5400

aagatccttt gatcttttct acggggtctg acgctcagtg gaacgaaaac tcacgttaag 5460

ggattttggt catgcattct aggtactaaa acaattcatc cagtaaaata taatatttta 5520

ttttctccca atcaggcttg atccccagta agtcaaaaaa tagctcgaca tactgttctt 5580

ccccgatatc ctccctgatc gaccggacgc agaaggcaat gtcataccac ttgtccgccc 5640

tgccgcttct cccaagatca ataaagccac ttactttgcc atctttcaca aagatgttgc 5700

tgtctcccag gtcgccgtgg gaaaagacaa gttcctcttc gggcttttcc gtctttaaaa 5760

aatcatacag ctcgcgcgga tctttaaatg gagtgtcttc ttcccagttt tcgcaatcca 5820

catcggccag atcgttattc agtaagtaat ccaattcggc taagcggctg tctaagctat 5880

tcgtataggg acaatccgat atgtcgatgg agtgaaagag cctgatgcac tccgcataca 5940

gctcgataat cttttcaggg ctttgttcat cttcatactc ttccgagcaa aggacgccat 6000

cggcctcact catgagcaga ttgctccagc catcatgccg ttcaaagtgc aggacctttg 6060

gaacaggcag ctttccttcc agccatagca tcatgtcctt ttcccgttcc acatcatagg 6120

tggtcccttt ataccggctg tccgtcattt ttaaatatag gttttcattt tctcccacca 6180

gcttatatac cttagcagga gacattcctt ccgtatcttt tacgcagcgg tatttttcga 6240

tcagtttttt caattccggt gatattctca ttttagccat ttattatttc cttcctcttt 6300

tctacagtat ttaaagatac cccaagaagc taattataac aagacgaact ccaattcact 6360

gttccttgca ttctaaaacc ttaaatacca gaaaacagct ttttcaaagt tgttttcaaa 6420

gttggcgtat aacatagtat cgacggagcc gattttgaaa ccgcggtgat cacaggcagc 6480

aacgctctgt catcgttaca atcaacatgc taccctccgc gagatcatcc gtgtttcaaa 6540

cccggcagct tagttgccgt tcttccgaat agcatcggta acatgagcaa agtctgccgc 6600

cttacaacgg ctctcccgct gacgccgtcc cggactgatg ggctgcctgt atcgagtggt 6660

gattttgtgc cgagctgccg gtcggggagc tgttggctgg ctggtggcag gatatattgt 6720

ggtgtaaaca aattgacgct tagacaactt aataacacat tgcggacgtt tttaatgtac 6780

tgaattaacg ccgaattaat tcgggggatc tggattttag tactggattt tggttttagg 6840

aattagaaat tttattgata gaagtatttt acaaatacaa atacatacta agggtttctt 6900

atatgctcaa cacatgagcg aaaccctata ggaaccctaa ttcccttatc tgggaactac 6960

tcacacatta ttatggagaa actcgagctt gtcgatcgac agatccggtc ggcatctact 7020

ctatttcttt gccctcggac gagtgctggg gcgtcggttt ccactatcgg cgagtacttc 7080

tacacagcca tcggtccaga cggccgcgct tctgcgggcg atttgtgtac gcccgacagt 7140

cccggctccg gatcggacga ttgcgtcgca tcgaccctgc gcccaagctg catcatcgaa 7200

attgccgtca accaagctct gatagagttg gtcaagacca atgcggagca tatacgcccg 7260

gagtcgtggc gatcctgcaa gctccggatg cctccgctcg aagtagcgcg tctgctgctc 7320

catacaagcc aaccacggcc tccagaagaa gatgttggcg acctcgtatt gggaatcccc 7380

gaacatcgcc tcgctccagt caatgaccgc tgttatgcgg ccattgtccg tcaggacatt 7440

gttggagccg aaatccgcgt gcacgaggtg ccggacttcg gggcagtcct cggcccaaag 7500

catcagctca tcgagagcct gcgcgacgga cgcactgacg gtgtcgtcca tcacagtttg 7560

ccagtgatac acatggggat cagcaatcgc gcatatgaaa tcacgccatg tagtgtattg 7620

accgattcct tgcggtccga atgggccgaa cccgctcgtc tggctaagat cggccgcagc 7680

gatcgcatcc atagcctccg cgaccggttg tagaacagcg ggcagttcgg tttcaggcag 7740

gtcttgcaac gtgacaccct gtgcacggcg ggagatgcaa taggtcaggc tctcgctaaa 7800

ctccccaatg tcaagcactt ccggaatcgg gagcgcggcc gatgcaaagt gccgataaac 7860

ataacgatct ttgtagaaac catcggcgca gctatttacc cgcaggacat atccacgccc 7920

tcctacatcg aagctgaaag cacgagattc ttcgccctcc gagagctgca tcaggtcgga 7980

gacgctgtcg aacttttcga tcagaaactt ctcgacagac gtcgcggtga gttcaggctt 8040

tttcatatct cattgccccc cgggatctgc gaaagctcga gagagataga tttgtagaga 8100

gagactggtg atttcagcgt gtcctctcca aatgaaatga acttccttat atagaggaag 8160

gtcttgcgaa ggatagtggg attgtgcgtc atcccttacg tcagtggaga tatcacatca 8220

atccacttgc tttgaagacg tggttggaac gtcttctttt tccacgatgc tcctcgtggg 8280

tgggggtcca tctttgggac cactgtcggc agaggcatct tgaacgatag cctttccttt 8340

atcgcaatga tggcatttgt aggtgccacc ttccttttct actgtccttt tgatgaagtg 8400

acagatagct gggcaatgga atccgaggag gtttcccgat attacccttt gttgaaaagt 8460

ctcaatagcc ctttggtctt ctgagactgt atctttgata ttcttggagt agacgagagt 8520

gtcgtgctcc accatgttat cacatcaatc cacttgcttt gaagacgtgg ttggaacgtc 8580

ttctttttcc acgatgctcc tcgtgggtgg gggtccatct ttgggaccac tgtcggcaga 8640

ggcatcttga acgatagcct ttcctttatc gcaatgatgg catttgtagg tgccaccttc 8700

cttttctact gtccttttga tgaagtgaca gatagctggg caatggaatc cgaggaggtt 8760

tcccgatatt accctttgtt gaaaagtctc aatagccctt tggtcttctg agactgtatc 8820

tttgatattc ttggagtaga cgagagtgtc gtgctccacc atgttggcaa gctgctctag 8880

ccaatacgca aaccgcctct ccccgcgcgt tggccgattc attaatgcag ctggcacgac 8940

aggtttcccg actggaaagc gggcagtgag cgcaacgcaa ttaatgtgag ttagctcact 9000

cattaggcac cccaggcttt acactttatg cttccggctc gtatgttgtg tggaattgtg 9060

agcggataac aatttcacac aggaaacagc tatgaccatg attacgaatt cgagctcggt 9120

acccggggat cctctagagt cgacctgcag gcatgcaagc ttggcactgg ccgtcgtttt 9180

acaacgtcgt gactgggaaa accctggcgt tacccaactt aatcgccttg cagcacatcc 9240

ccctttcgcc agctggcgta atagcgaaga ggcccgcacc gatcgccctt cccaacagtt 9300

gcgcagcctg aatggcgaat gctagagcag cttgagcttg gatcagattg tcgtttcccg 9360

ccttcagttt agcttcatgg agtcaaagat tcaaatagag gacctaacag aactcgccgt 9420

aaagactggc gaacagttca tacagagtct cttacgactc aatgacaaga agaaaatctt 9480

cgtcaacatg gtggagcacg acacacttgt ctactccaaa aatatcaaag atacagtctc 9540

agaagaccaa agggcaattg agacttttca acaaagggta atatccggaa acctcctcgg 9600

attccattgc ccagctatct gtcactttat tgtgaagata gtggaaaagg aaggtggctc 9660

ctacaaatgc catcattgcg ataaaggaaa ggccatcgtt gaagatgcct ctgccgacag 9720

tggtcccaaa gatggacccc cacccacgag gagcatcgtg gaaaaagaag acgttccaac 9780

cacgtcttca aagcaagtgg attgatgtga tatctccact gacgtaaggg atgacgcaca 9840

atcccactat ccttcgcaag acccttcctc tatataagga agttcatttc atttggagag 9900

aacacggggg actcttgac 9919

<210> 5

<211> 111

<212> DNA

<213> 全序列合成包含编码3个FLAG蛋白的核苷酸序列(2 Ambystoma laterale xAmbystoma jeffersonianum)

<400> 5

catatgtcgt actacgatta caaggatgac gacgataagg gcgattacaa ggatgacgac 60

gataagggcg attacaagga tgacgacgat aagctcgaat caacaaggtg a 111

<210> 6

<211> 30

<212> DNA

<213> 扩增包含编码3个FLAG蛋白的核苷酸序列基因片段的上游引物(2 Ambystomalaterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 6

ctgactagtc atatgtcgta ctacgattac 30

<210> 7

<211> 34

<212> DNA

<213> 扩增包含编码3个FLAG蛋白的核苷酸序列基因片段的下游引物(2 Ambystomalaterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 7

gctggtcacc tcaccttgtt gattcgagct tatc 34

<210> 8

<211> 3

<212> DNA

<213> SEQ ID No.1和SEQ ID No.2之间的连接序列(2 Ambystoma laterale xAmbystoma jeffersonianum)

<400> 8

ggc 3

<210> 9

<211> 3

<212> DNA

<213> SEQ ID No.2和SEQ ID No.3之间的连接序列(2 Ambystoma laterale xAmbystoma jeffersonianum)

<400> 9

ggc 3

<210> 10

<211> 31

<212> DNA

<213> 扩增CHIL的全长基因的上游引物(2 Ambystoma laterale x Ambystomajeffersonianum)

<400> 10

tttggatcct ggggtggagt caagcatttt t 31

<210> 11

<211> 32

<212> DNA

<213> 扩增CHIL的全长基因的下游引物(2 Ambystoma laterale x Ambystomajeffersonianum)

<400> 11

tttactagtg gttaaaactg cggagattga at 32

Claims (4)

1.一种含有FLAG蛋白融合标签的植物表达质粒载体，其特征在于，该载体为在植物表达质粒载体的C端含有FLAG蛋白融合标签的植物表达质粒载体。

2.根据权利要求1所述的含有FLAG蛋白融合标签的植物表达质粒载体，其特征在于，该载体包含有三段编码FLAG蛋白标签Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys的基因片段，所述三个FLAG蛋白的核苷酸序列分别如SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3所示。

3.根据权利要求1所述的含有FLAG蛋白融合标签的植物表达质粒载体，其特征在于，该载体的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。

4.一种构建权利要求1-3任意一项所述含有FLAG蛋白融合标签的植物表达质粒载体的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：

(1)以pCAMBIA1302为出发质粒，采用SpeI和Eco065I酶切该质粒，通过凝胶电泳切胶回收9802bp的片段；

(2)全序列合成包含编码3个FLAG蛋白的核苷酸序列，全序列合成包含编码3个FLAG蛋白的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示；

(3)设计用于扩增包含编码3个FLAG蛋白的核苷酸序列基因片段的扩增引物，上游引物如SEQ ID No.6所示，下游引物如SEQ ID No.7所示；采用New England Biolabs的PhusionHigh-Fidelity DNA Polymerase进行扩增反应，扩增体系：50微升的总体积，包括10微升的5X Phusion HF Buffer、1微升的10mM dNTPs、2.5微升的10微摩尔上游引物、2.5微升的10微摩尔下游引物、1微升的上述合成的包含编码3个FLAG蛋白、浓度为45纳克/微升核苷酸序列基因片段、32.5微升的超纯水和0.5微升的Phusion High-Fidelity DNA Polymerase；扩增程序：98℃运行30秒；然后30个循环的：98℃运行10秒；60℃运行30秒；72℃运行10秒；最后72℃运行10分钟；

(4)扩增后最终在全序列合成的基因片段的N端加上SpeI酶切位点，在C端加上Eco065I酶切位点；用SpeI和Eco065I酶切该合成片段，凝胶电泳后切胶回收该片段；最后利用T4DNA连接酶连接上述酶切后回收纯化的片段；将连接反应的产物，热激转化DH5α,通过PCR鉴定得到阳性克隆；质粒载体的序列通过测序验证。