CN105542012A - 融合蛋白sumo1-pla2及制备方法和医用用途 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种融合蛋白SUMO1-PLA2及制备方法,本发明还提供了该SUMO1化融合蛋白的医用用途,解决了PLA2在大肠杆菌不溶性表达的技术难题;利用pColdTF冷诱导表达载体高效制备融合蛋白SUMO1-PLA2,克服现有方法中PLA2?蛋白表达量低、表达产物以包涵体形式存在给后续纯化带来诸多不便,以及表达产物的反应原性和免疫原性不如可溶性蛋白好等缺陷。
Description
技术领域
本发明提供一种融合蛋白SUMO1-PLA2及制备方法,本发明还提供了该SUMO1化融合蛋白的医用用途,属于生物技术领域。
背景技术
SUMO(Smallubiquitin-relatedmodifier)即小泛素相关修饰物,是一种新发现的广泛存在于真核生物中的蛋白质翻译后修饰形式,在生命活动中发挥着重要的作用。在体内SUMO化修饰所起的作用包括调节蛋白质之间的相互作用、调节蛋白质在核与质的相互转运以及对细胞周期的调控等。由于SUMO化修饰的底物蛋白都是一些非常重要的细胞周期调控蛋白,如p53,PML和RanGAP1等,因此SUMO化与去SUMO化过程在细胞内发挥着非常重要的生物学功能,制备出高灵敏的底物及分析方法是进行相关研究的关键。
磷脂酶A2(phospholipaseA2,PLA2)是参与细胞代谢活动、信号转导等过程的重要酶类之一,广泛分布于哺乳动物机体内。磷脂酶是指催化水解磷脂酰、溶血磷脂酰化合物中的羧酸酯键、磷酸酯键和磷酸与胆碱之间酯键的一类脂酶。PLA2可催化水解细胞膜甘油磷脂类的sn-2位酯键从而生成脂肪酸和溶血磷脂。花生四烯酸是其中重要的一种,介导体内一系列病理生理过程,如机体的抗菌抗病毒过程、关节炎、动脉粥样硬化、哮喘、鼻炎、血栓形成等。近期研究还发现,PLA2与巴特综合征、神经轴突营养障碍、新生儿坏死性小肠结肠炎等疾病均具有密切关系。
磷脂酶A2中有大量的二硫键,这可能影响了其在大肠杆菌中的有效表达,另外,目前磷脂酶A2在大肠杆菌中多以包涵体形式表达,对蛋白的纯化带来不便,其反应原性和免疫原性亦不如可溶性蛋白好。所以,目前PLA2蛋白的体外有效表达、纯化是PLA2蛋白应用过程的难点。因PLA2能水解甘油磷脂类的sn-2位酯键的特点,许多人工sn-2位连接荧光基团的脂类是PLA2活性的方便灵敏的产物,但PLA2的活性受其N端序列空间位阻的影响,利用此特点,本研究鸡的SUMO1分子融合于PLA2的N端,应用原核表达纯化出SUMO1-PLA2蛋白,此时融合的PLA2无水解底物活性,当去SUMO化酶水解除去PLA2的N端SUMO1分子解除空间位阻,使PLA2活性,水解人工脂类底物,从而用来分析去SUMO化酶的活性。
发明内容
本发明公开一种融合蛋白SUMO1-PLA2,克服了PLA2在大肠杆菌不溶性表达的技术难题。
本发明进一步提供了融合蛋白SUMO1-PLA2的制备方法,利用pColdTF冷诱导表达载体高效制备融合蛋白SUMO1-PLA2,克服现有方法中PLA2蛋白表达量低、表达产物以包涵体形式存在给后续纯化带来诸多不便,以及表达产物的反应原性和免疫原性不如可溶性蛋白好等缺陷。
本发明又提供了融合蛋白SUMO1-PLA2的医用用途,在体外系统中检测去SUMO化酶活性,并且公开了此蛋白作为去SUMO化酶底物的使用方法。
本发明的目的在于提供一种利用pColdTF表达载体高效表达PLA2蛋白的方法,该方法能够高效表达可溶性的SUMO融合的PLA2蛋白,并且表达产物的免疫学反应活性更佳。
本发明所述的一种融合蛋白SUMO1-PLA2,其特征在于:
其的氨基酸序列如SEQno.1所示。
本发明所述的融合蛋白SUMO1-PLA2的制备方法,包括以下步骤:
1)鸡SUMO1基因的获取,具体步骤如下:
提取鸡细胞全基因组
以鸡细胞全基因组为模板设计引物,在引物中引入几个碱基,使之人为的加入一个AgeI的酶切位点,这样当用去SUMO1化酶切割的时候在PLA2的N端没有任何多余的氨基酸,不影响PLA2的水解活性,为去SUMO1化酶活性的分析打下了基础;并且在引物的上游加上NdeI酶切位点,用于原核表达的构建;
所用引物为:
上游引物:CATATGATGTCGGACCAGGAAGCAAAG
下游引物:ACCGGTCTGTTCCTGATAAACTTC
以鸡细胞全基因组为模板,上述两条引物,PCR法扩增得到鸡SUMO1基因序列,图1所示,P为鸡SUMO1基因的PCR产物1%琼脂糖凝胶电泳结果,经测序完全正确。
2)鼠源性PLA2基因的获取方法,步骤如下:
以小鼠细胞全基因组为模板设计引物,在引物中引入了一个甘氨酸(GGA)使之成为SUMO1分子中双甘氨酸的一部分,并且在引物的上游加上AgeI酶切位点,下游加上XhoI酶切位点,用于原核表达的构建;
所用引物为:
上游引物:ACCGGTGGAGGACTCCTGGAGCT
下游引物:CTCGAGTCAATTGCACTTGGGAGAGTC
以小鼠细胞全基因组为模板,上述两条引物,PCR法扩增得到PLA2基因序列,图2所示,Q为鸡SUMO1基因的PCR产物1%琼脂糖凝胶电泳结果,经测序完全正确。
3)SUMO1-PLA2融合蛋白基因全长的构建,步骤如下:
将上述PCR产物SUMO1和PLA2分别用NdeI、AgeI,AgeI、XhoI两组
酶酶切,回收大片段;将原核表达载体pColdTF用NdeI、XhoI双酶切回收大片段;三个回收的片段在T4DNA酶的作用下构建成pColdTF-SUMO1-PLA2;其中NdeI和XhoI两酶切位点之间的序列即为融合基因SUMO1-PLA2。
2、本发明所述的融合蛋白SUMO1-PLA2的制备方法,具体步骤如下:
1)融合蛋白TF-SUMO1-PLA2的原核表达
将构建完成的pColdTF-SUMO1-PLA2重组质粒,转入到BL21(DE3)原核表达菌体系,37℃终浓度0.1mMIPTG诱导表达融合蛋白。
2)TF-SUMO1-PLA2融合蛋白原核表达产物纯化
非变性条件下,Ni亲和层析一步法纯化融合蛋白TF-SUMO1-PLA2,利用不同浓度的咪唑对融合蛋白TF-SUMO1-PLA2进行洗脱纯化,经过透析、浓缩收集以用于去SUMO化酶切割的蛋白,如图3所示。
3、融合蛋白作为去SUMO酶底物的用途
用来作为人、哺乳动物及鸟类去SUMO1化酶的活性分析,应用去SUMO化酶SENP1对融合蛋白TF-SUMO1-PLA2进行了成功的酶切分离,见图4;通过去SUMO化酶水解SUMO与PLA2间的肽键释放PLA2,再由PLA2水解带有荧光基团的价格低廉的脂类底物NBDC6-HPC,可以产生一种荧光底物NBD,通过检测荧光强度分析去SUMO化酶的水解活性,此信号逐级放大过程可提高检测的灵敏度,见图5。
本发明的积极效果在于:提供了一种新的SUMO1化融合蛋白,解决了PLA2在大肠杆菌不溶性表达的技术难题;利用pColdTF冷诱导表达载体高效制备融合蛋白SUMO1-PLA2,克服现有方法中PLA2蛋白表达量低、表达产物以包涵体形式存在给后续纯化带来诸多不便,以及表达产物的反应原性和免疫原性不如可溶性蛋白好等缺陷。
附图说明
图1为1%琼脂糖凝胶电泳显示SUMO1基因片段的调取;
图2为1%琼脂糖凝胶电泳展示融合蛋白PLA2基因的获取;
图3为10%SDS-PAGE电泳图展示Ni亲和层析后的融合蛋白TF-SUMO1-PLA2;
图4为去SUMO化酶SENP1对融合蛋白的酶切;
图5为对PLA2水解NBDC6-HPC产生荧光的监测。
具体实施方式
通过以下实施例进一步举例描述本发明,并不以任何方式限制本发明。下面用实施例来进一步说明本发明的实质性内容,但本发明的内容并不局限于此。
实施例1
基因扩增与融合
本发明所述融合基因SUMO1-PLA2全长的获取
1、鸡SUMO1基因的获取,步骤如下:
检索鸡SUMO1基因全序列。(来源于NCBI核酸数据库)
鸡SUMO1核酸序列
1ATGTCGGACCAGGAAGCAAAGCCTTCAGCTGAGGACTTAGGAGATAAGAAAGAGGGGGAAT
ACATTAAACTCAAAGTCATTGGGCAGGACAGCAGTGAAATTCACTTCAAGGTGAAAATGAC
AACACACCTCAAGAAACTCAAAGAATCATACTGTCAAAGACAGGGTGTTCCAATGAACTCACTCAGGTTTCTCTTCGAGGGTCAGAGAATTACTGATAATCATACCCCCAAGGAGCTGGGGA
288TGGAGGAGGAAGATGTGATTGAAGTTTATCAGGAACAGACCGGT
蛋白序列
1MSDQEAKPSAEDLGDKKEGEYIKLKVIGQDSSEIHFKVKMTTHLKKLKESYCQRQGVPMNS
96LRFLFEGQRITDNHTPKELGMEEEDVIEVYQEQTG
提取鸡基因组,PCR法获得SUMO1基因序列。
上游引物1:
CATATGATGTCGGACCAGGAAGCAAAG
下游引物2:
ACCGGTCTGTTCCTGATAAACTTC
PCR反应条件:
1、95℃3min
2、94℃1min;58℃30s;72℃1min;30cycles
3、72℃10min
4、4℃store
2、鼠源性PLA2-基因的获取
具体过程如下:
检索小鼠PLA2基因全序列。(来源于NCBI核酸数据库)
PLA2序列基因全长
1GGAGGACTCCTGGAGCTGGCAGGGACCTTGGATTGTGTTGGGCCTCGATCTCCGATGGCTTACATGAACTATGGCTGTTATTGTGGCCTTGGTGGCCATGGAGAGCCACGTGACGCCATTGACTGGTGCTGCTACCACCACGACTGCTGCTACTCTCGGGCTCAGGACGCTGGCTGCAGCCCTAAGTTAGACCGCTACCCATGGAAGTGCATGGACCATCACATCCTGTGTGGACCAGCAGAGAACAAATGCCAAGAACTTTTGTGCAGGTGTGACGAGGAGCTGGCTTACTGCCTGGCAGGGACCGAGTACCACCTGAAATACCTCTTCTTCCCCTCCATTTTATGTGAGAAG
375GACTCTCCCAAGTGCAATTGA
蛋白序列
1GGLLELAGTLDCVGPRSPMAYMNYGCYCGLGGHGEPRDAIDWCCYHHDCCYSRAQDAGCSPKLDRYPWKCMDHHILCGPAENKCQELLCRCDEELAYCLAGTEYHLKYLFFPSILCEK
125DSPKCN.
提取小鼠全基因组,PCR法获得PLA2基因序列。
上游引物3:
ACCGGTGGAGGACTCCTGGAGCT
下游引物4:
CTCGAGTCAATTGCACTTGGGAGAGTC
PCR反应条件:
1、95℃3min
2、94℃1min;58℃30s;72℃1min;30cycles
3、72℃10min
4、4℃store
3、SUMO1-PLA2融合蛋白基因全长的构建
首先用引物1和引物2配对,以鸡的全基因组为模板PCR扩增得到SUMO1基因,然后再以引物3和引物4配对,以鼠细胞全基因组为模板PCR扩增得到PLA2,将PCR得到的两个产物分别双酶切,pColdTF双酶切,琼脂糖凝胶回收双酶切产物,最终经T4DNA连接酶的作用下将融合基因连接到冷诱导原核表达载体pColdTF上,其中NdeI和XhoI两酶切位点之间一段基因序列即为融合蛋白基因SUMO1-PLA2。
具体过程如下:
(1)NdeⅠ和XhoⅠ双酶切原核表达载体质粒pColdTF,回收大片段。
(2)NdeⅠ和AgeⅠ双酶切SUMO1,回收酶切产物。
(3)AgeⅠ和XhoⅠ双酶切PLA2,回收酶切产物。
(4)将上述三个回收产物连接得到pColdTF-SUMO1-PLA2重组质粒,转入TOP10感受态细菌中,挑单菌落,提取质粒,测序结果,与预期一致。构建入原核表达载体后,阅读框为:
1ATGTCGGACCAGGAAGCAAAGCCTTCAGCTGAGGACTTAGGAGATAAGAAAGAGGGGGAATACATTAAACTCAAAGTCATTGGGCAGGACAGCAGTGAAATTCACTTCAAGGTGAAAATGACAACACACCTCAAGAAACTCAAAGAATCATACTGTCAAAGACAGGGTGTTCCAATGAACTCACTCAGGTTTCTCTTCGAGGGTCAGAGAATTACTGATAATCATACCCCCAAGGAGCTGGGGATGGAGGAGGAAGATGTGATTGAAGTTTATCAGGAACAGACCGGTGGAGGACTCCTGGAGCTGGCAGGGACCTTGGATTGTGTTGGGCCTCGATCTCCGATGGCTTACATGAACTATGGCTGTTATTGTGGCCTTGGTGGCCATGGAGAGCCACGTGACGCCATTGACTGGTGCTGCTACCACCACGACTGCTGCTACTCTCGGGCTCAGGACGCTGGCTGCAGCCCTAAGTTAGACCGCTACCCATGGAAGTGCATGGACCATCACATCCTGTGTGGACCAGCAGAGAACAAATGCCAAGAACTTTTGTGCAGGTGTGACGAGGAGCTGGCTTACTGCCTGGCAGGGACCGAGTACCACCTGAAATACCTCTTCTTCCCCTCCATTTTATGTGAGAAGGACTCTCC
663CAAGTGCAATTGA
表达序列为:
1MSDQEAKPSAEDLGDKKEGEYIKLKVIGQDSSEIHFKVKMTTHLKKLKESYCQRQGVPMNSLRFLFEGQRITDNHTPKELGMEEEDVIEVYQEQTGGGLLELAGTLDCVGPRSPMAYMNYGCYCGLGGHGEPRDAIDWCCYHHDCCYSRAQDAGCSPKLDRYPWKCMDHHILCGPAENKCQELLCRCDEELAYCL
221AGTEYHLKYLFFPSILCEKDSPKCN。
4、融合蛋白TF-SUMO1-PLA2的制备
(1)pColdTF-SUMO1-PLA229质粒转入Bl21(DE3)感受态细菌中;
(2)挑单菌落至5mlLB培养基中,37℃震荡培养过夜,1/1000接菌至400mlLB培养基中,37℃震荡培养至OD600至0.8-1.0,加入终浓度为0.1mMIPTG,继续15℃震荡培养12小时;
(3)TF-SUMO1-PLA229-151融合蛋白纯化
1)4℃4000g离心收集菌体,PBS(pH7.4)洗涤一次,按照每克湿菌加入50mlBufferA(500mMNaCl,50mMTris,10mMimidazol,10%glycerol;(pH7.4))重悬菌体;
2)超声裂解细菌(工作时间3秒,间歇时间5秒,强度450W,总工作时长10分钟)。12,000×g,4℃离心30分钟,留取上清;
3)收集上清,0.45μm滤膜过滤,备用;
4)Ni层析介质空跑,10倍体积的ddH20洗涤后,再用5倍体积的BufferA平衡;
5)将步骤3所制备的样品,与步骤4的Ni介质(0.5mlNi介质/g湿菌)混合,4℃翻转摇床上,轻摇2小时;
6)将步骤5的样品连同Ni介质一同装柱。200mlBufferA充分洗涤;
7)洗脱;10ml洗脱液(500mMNaCl,50mMTris,100mMimidazol,10%glycerol;(pH7.4))(用BufferA与BufferD适当比例混合而成)洗脱,流速控制在8-10滴/分钟。收集OD280峰值处流出液,约6-8ml;
8)透析与储存;
透析:一个小时之内,至少四次更换透析液(500mMNaCl,50mMTris,10%glycerol;(pH7.4)),用以除去残存的咪唑和尿素;
透析后的样品,12,000×g,4℃离心5分钟,分装上清,迅速置于液氮中过夜。-80℃冰箱保存,备用;
4、融合蛋白TF-SUMO1-PLA2作为去SUMO化酶底物的用途
(1)SENP1对融合蛋白TF-SUMO1-PLA2的切割
在20μL体系中50nMSENP1可以将500nMTF-SUMO1-PLA2完全切开,形成TF-SUMO1和PLA2,酶切结果如图4所示;
(2)上述得到的PLA2可以特异性水解底物NBDC6-HPC形成荧光产物NBD,通过检测荧光的强度得到酶及融合蛋白的活性及酶切效率,结果如5所示。
SEQno.1
<110>吉林大学
<120>融合蛋白SUMO1-PLA2及制备方法和医用用途
<140>20151033868.8
<141>2016-03-04
<160>1
<210>1
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<400>1
CATATGATGTCGGACCAGGAAGCAAAG
SEQno.2
<110>吉林大学
<120>融合蛋白SUMO1-PLA2及制备方法和医用用途
<140>20151033868.8
<141>2016-03-04
<160>1
<210>1
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>1
ACCGGTCTGTTCCTGATAAACTTC
SEQno.3
<110>吉林大学
<120>融合蛋白SUMO1-PLA2及制备方法和医用用途
<140>20151033868.8
<141>2016-03-04
<160>1
<210>1
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<400>1
ACCGGTGGAGGACTCCTGGAGCT
SEQno.4
<110>吉林大学
<120>融合蛋白SUMO1-PLA2及制备方法和医用用途
<140>20151033868.8
<141>2016-03-04
<160>1
<210>1
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<400>1
CTCGAGTCAATTGCACTTGGGAGAGTC
SEQno.5
<110>吉林大学
<120>融合蛋白SUMO1-PLA2及制备方法和医用用途
<140>20151033868.8
<141>2016-03-04
<160>1
<210>1
<211>288
<212>DNA
<213>鸡SUMO1
<400>1
ATGTCGGACCAGGAAGCAAAGCCTTCAGCTGAGGACTTAGGAGATAAGAAAGAGGGGGAA60
TACATTAAACTCAAAGTCATTGGGCAGGACAGCAGTGAAATTCACTTCAAGGTGAAAATG120
ACAACACACCTCAAGAAACTCAAAGAATCATACTGTCAAAGACAGGGTGTTCCAATGAAC180
TCACTCAGGTTTCTCTTCGAGGGTCAGAGAATTACTGATAATCATACCCCCAAGGAGCTG240
GGGATGGAGGAGGAAGATGTGATTGAAGTTTATCAGGAACAGACGGGG288
SEQno.6
<110>吉林大学
<120>融合蛋白SUMO1-PLA2及制备方法和医用用途
<140>20151033868.8
<141>2016-03-04
<160>1
<210>1
<211>375
<212>DNA
<213>鼠PLA2
<400>1
GGAGGACTCCTGGAGCTGGCAGGGACCTTGGATTGTGTTGGGCCTCGATCTCCGATGGCT60
TACATGAACTATGGCTGTTATTGTGGCCTTGGTGGCCATGGAGAGCCACGTGACGCCATT120
GACTGGTGCTGCTACCACCACGACTGCTGCTACTCTCGGGCTCAGGACGCTGGCTGCAGC180
CCTAAGTTAGACCGCTACCCATGGAAGTGCATGGACCATCACATCCTGTGTGGACCAGCA240
GAGAACAAATGCCAAGAACTTTTGTGCAGGTGTGACGAGGAGCTGGCTTACTGCCTGGCA300
GGGACCGAGTACCACCTGAAATACCTCTTCTTCCCCTCCATTTTATGTGAGAAGGACTCT360
CCCAAGTGCAATTGA375
SEQno.7
<110>吉林大学
<120>融合蛋白SUMO1-PLA2及制备方法和医用用途
<140>20151033868.8
<141>2016-03-04
<160>1
<210>1
<211>663
<212>DNA
<213>SUMO1-PLA2
<400>1
ATGTCGGACCAGGAAGCAAAGCCTTCAGCTGAGGACTTAGGAGATAAGAAAGAGGGGGAA60
TACATTAAACTCAAAGTCATTGGGCAGGACAGCAGTGAAATTCACTTCAAGGTGAAAATG120
ACAACACACCTCAAGAAACTCAAAGAATCATACTGTCAAAGACAGGGTGTTCCAATGAAC180
TCACTCAGGTTTCTCTTCGAGGGTCAGAGAATTACTGATAATCATACCCCCAAGGAGCTG240
GGGATGGAGGAGGAAGATGTGATTGAAGTTTATCAGGAACAGACCGGTGGAGGACTCCTG300
GAGCTGGCAGGGACCTTGGATTGTGTTGGGCCTCGATCTCCGATGGCTTACATGAACTAT360
GGCTGTTATTGTGGCCTTGGTGGCCATGGAGAGCCACGTGACGCCATTGACTGGTGCTGC420
TACCACCACGACTGCTGCTACTCTCGGGCTCAGGACGCTGGCTGCAGCCCTAAGTTAGAC480
CGCTACCCATGGAAGTGCATGGACCATCACATCCTGTGTGGACCAGCAGAGAACAAATGC540
CAAGAACTTTTGTGCAGGTGTGACGAGGAGCTGGCTTACTGCCTGGCAGGGACCGAGTAC600
CACCTGAAATACCTCTTCTTCCCCTCCATTTTATGTGAGAAGGACTCTCCCAAGTGCAAT660
TGA663
Claims (3)
1.一种融合蛋白SUMO1-PLA2,其特征在于:其的氨基酸序列如SEQno.1所示。
2.权利要求1所述的融合蛋白SUMO1-PLA2的制备方法,包括以下步骤:
1)鸡SUMO1基因的获取
提取鸡全基因组;PCR法扩增SUMO1基因序列;所用引物为:
上游引物:
CATATGATGTCGGACCAGGAAGCAAAG
下游引物:
ACCGGTCTGTTCCTGATAAACTTC
以鸡全基因组为模板,上述两条引物,PCR方法得到鸡SUMO1基因;
2)鼠源性PLA2-基因的获取
提取小鼠基因组;PCR法扩增PLA2基因序列;所用引物为:
上游引物:
ACCGGTGGAGGACTCCTGGAGCT
下游引物:
CTCGAGTCAATTGCACTTGGGAGAGTC
以小鼠全基因组为模板,上述两条引物,PCR方法得到PLA2基因序列;
3)SUMO1-PLA2融合蛋白基因全长的构建
SUMO3基因PCR扩增后产物经双酶切(NdeI和AgeI)和PLA2基因PCR扩增产物经双酶切(AgeI和XhoI)后,凝胶回收双酶切产物;pColdTF表达质粒双酶切(NdeI和XhoI)后,凝胶回收大片段;将上述三个回收片段连接,获得将融合蛋白全长基因构建入pColdTF表达载体中的重组质粒,既融合蛋白原核表达质粒pColdTF-SUMO3-PLA2;其中NdeI和XhoI两酶切位点之间一段基因序列即为融合蛋白基因SUMO3-PLA2;
4)融合蛋白TF-SUMO1-PLA2的制备
将融合蛋白原核表达质粒TF-SUMO1-PLA2导入到BL21(DE3)原核表达菌体系,37℃终浓度0.1mMIPTG诱导表达载体蛋白;非变性条件下,Ni亲和层析一步法纯化融合蛋白。
3.权利要求1中的融合蛋白作为去SUMO酶底物的用途,可以作为一种底物用来作人、哺乳动物及鸟类去SUMO3化酶类的活性分析检测试剂盒。
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WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |