CN105542012A

CN105542012A - 融合蛋白sumo1-pla2及制备方法和医用用途

Info

Publication number: CN105542012A
Application number: CN201510333868.8A
Authority: CN
Inventors: 艾永兴; 于佩峰; 邓晨; 吴山力; 郑海南; 王梦云; 赵程程; 郝林琳; 于浩; 张玉静
Original assignee: Jilin University
Current assignee: Jilin University
Priority date: 2015-06-17
Filing date: 2015-06-17
Publication date: 2016-05-04

Abstract

本发明提供一种融合蛋白SUMO1-PLA2及制备方法，本发明还提供了该SUMO1化融合蛋白的医用用途，解决了PLA2在大肠杆菌不溶性表达的技术难题；利用pColdTF冷诱导表达载体高效制备融合蛋白SUMO1-PLA2，克服现有方法中PLA2？蛋白表达量低、表达产物以包涵体形式存在给后续纯化带来诸多不便，以及表达产物的反应原性和免疫原性不如可溶性蛋白好等缺陷。

Description

融合蛋白SUMO1-PLA2及制备方法和医用用途

技术领域

本发明提供一种融合蛋白SUMO1-PLA2及制备方法，本发明还提供了该SUMO1化融合蛋白的医用用途，属于生物技术领域。

背景技术

SUMO（Smallubiquitin-relatedmodifier）即小泛素相关修饰物，是一种新发现的广泛存在于真核生物中的蛋白质翻译后修饰形式，在生命活动中发挥着重要的作用。在体内SUMO化修饰所起的作用包括调节蛋白质之间的相互作用、调节蛋白质在核与质的相互转运以及对细胞周期的调控等。由于SUMO化修饰的底物蛋白都是一些非常重要的细胞周期调控蛋白，如p53，PML和RanGAP1等，因此SUMO化与去SUMO化过程在细胞内发挥着非常重要的生物学功能，制备出高灵敏的底物及分析方法是进行相关研究的关键。

磷脂酶A2(phospholipaseA2,PLA2)是参与细胞代谢活动、信号转导等过程的重要酶类之一,广泛分布于哺乳动物机体内。磷脂酶是指催化水解磷脂酰、溶血磷脂酰化合物中的羧酸酯键、磷酸酯键和磷酸与胆碱之间酯键的一类脂酶。PLA2可催化水解细胞膜甘油磷脂类的sn-2位酯键从而生成脂肪酸和溶血磷脂。花生四烯酸是其中重要的一种，介导体内一系列病理生理过程,如机体的抗菌抗病毒过程、关节炎、动脉粥样硬化、哮喘、鼻炎、血栓形成等。近期研究还发现,PLA2与巴特综合征、神经轴突营养障碍、新生儿坏死性小肠结肠炎等疾病均具有密切关系。

磷脂酶A2中有大量的二硫键，这可能影响了其在大肠杆菌中的有效表达，另外，目前磷脂酶A2在大肠杆菌中多以包涵体形式表达，对蛋白的纯化带来不便，其反应原性和免疫原性亦不如可溶性蛋白好。所以，目前PLA2蛋白的体外有效表达、纯化是PLA2蛋白应用过程的难点。因PLA2能水解甘油磷脂类的sn-2位酯键的特点，许多人工sn-2位连接荧光基团的脂类是PLA2活性的方便灵敏的产物，但PLA2的活性受其N端序列空间位阻的影响，利用此特点，本研究鸡的SUMO1分子融合于PLA2的N端，应用原核表达纯化出SUMO1-PLA2蛋白，此时融合的PLA2无水解底物活性，当去SUMO化酶水解除去PLA2的N端SUMO1分子解除空间位阻，使PLA2活性，水解人工脂类底物，从而用来分析去SUMO化酶的活性。

发明内容

本发明公开一种融合蛋白SUMO1-PLA2，克服了PLA2在大肠杆菌不溶性表达的技术难题。

本发明进一步提供了融合蛋白SUMO1-PLA2的制备方法，利用pColdTF冷诱导表达载体高效制备融合蛋白SUMO1-PLA2，克服现有方法中PLA2蛋白表达量低、表达产物以包涵体形式存在给后续纯化带来诸多不便，以及表达产物的反应原性和免疫原性不如可溶性蛋白好等缺陷。

本发明又提供了融合蛋白SUMO1-PLA2的医用用途，在体外系统中检测去SUMO化酶活性，并且公开了此蛋白作为去SUMO化酶底物的使用方法。

本发明的目的在于提供一种利用pColdTF表达载体高效表达PLA2蛋白的方法，该方法能够高效表达可溶性的SUMO融合的PLA2蛋白，并且表达产物的免疫学反应活性更佳。

本发明所述的一种融合蛋白SUMO1-PLA2，其特征在于：

其的氨基酸序列如SEQno.1所示。

本发明所述的融合蛋白SUMO1-PLA2的制备方法，包括以下步骤：

1）鸡SUMO1基因的获取，具体步骤如下：

提取鸡细胞全基因组

以鸡细胞全基因组为模板设计引物，在引物中引入几个碱基，使之人为的加入一个AgeI的酶切位点，这样当用去SUMO1化酶切割的时候在PLA2的N端没有任何多余的氨基酸，不影响PLA2的水解活性，为去SUMO1化酶活性的分析打下了基础；并且在引物的上游加上NdeI酶切位点，用于原核表达的构建；

所用引物为:

上游引物：CATATGATGTCGGACCAGGAAGCAAAG

下游引物：ACCGGTCTGTTCCTGATAAACTTC

以鸡细胞全基因组为模板，上述两条引物，PCR法扩增得到鸡SUMO1基因序列，图1所示，P为鸡SUMO1基因的PCR产物1%琼脂糖凝胶电泳结果，经测序完全正确。

2）鼠源性PLA2基因的获取方法，步骤如下：

以小鼠细胞全基因组为模板设计引物，在引物中引入了一个甘氨酸（GGA）使之成为SUMO1分子中双甘氨酸的一部分，并且在引物的上游加上AgeI酶切位点，下游加上XhoI酶切位点，用于原核表达的构建；

所用引物为:

上游引物：ACCGGTGGAGGACTCCTGGAGCT

下游引物：CTCGAGTCAATTGCACTTGGGAGAGTC

以小鼠细胞全基因组为模板，上述两条引物，PCR法扩增得到PLA2基因序列，图2所示，Q为鸡SUMO1基因的PCR产物1%琼脂糖凝胶电泳结果，经测序完全正确。

3）SUMO1-PLA2融合蛋白基因全长的构建,步骤如下：

将上述PCR产物SUMO1和PLA2分别用NdeI、AgeI,AgeI、XhoI两组

酶酶切，回收大片段；将原核表达载体pColdTF用NdeI、XhoI双酶切回收大片段；三个回收的片段在T₄DNA酶的作用下构建成pColdTF-SUMO1-PLA2；其中NdeI和XhoI两酶切位点之间的序列即为融合基因SUMO1-PLA2。

2、本发明所述的融合蛋白SUMO1-PLA2的制备方法，具体步骤如下：

1)融合蛋白TF-SUMO1-PLA2的原核表达

将构建完成的pColdTF-SUMO1-PLA2重组质粒，转入到BL21（DE3）原核表达菌体系，37℃终浓度0.1mMIPTG诱导表达融合蛋白。

2）TF-SUMO1-PLA2融合蛋白原核表达产物纯化

非变性条件下，Ni亲和层析一步法纯化融合蛋白TF-SUMO1-PLA2，利用不同浓度的咪唑对融合蛋白TF-SUMO1-PLA2进行洗脱纯化，经过透析、浓缩收集以用于去SUMO化酶切割的蛋白,如图3所示。

3、融合蛋白作为去SUMO酶底物的用途

用来作为人、哺乳动物及鸟类去SUMO1化酶的活性分析，应用去SUMO化酶SENP1对融合蛋白TF-SUMO1-PLA2进行了成功的酶切分离，见图4；通过去SUMO化酶水解SUMO与PLA2间的肽键释放PLA2，再由PLA2水解带有荧光基团的价格低廉的脂类底物NBDC6-HPC，可以产生一种荧光底物NBD,通过检测荧光强度分析去SUMO化酶的水解活性，此信号逐级放大过程可提高检测的灵敏度，见图5。

本发明的积极效果在于：提供了一种新的SUMO1化融合蛋白，解决了PLA2在大肠杆菌不溶性表达的技术难题；利用pColdTF冷诱导表达载体高效制备融合蛋白SUMO1-PLA2，克服现有方法中PLA2蛋白表达量低、表达产物以包涵体形式存在给后续纯化带来诸多不便，以及表达产物的反应原性和免疫原性不如可溶性蛋白好等缺陷。

附图说明

图1为1%琼脂糖凝胶电泳显示SUMO1基因片段的调取；

图2为1%琼脂糖凝胶电泳展示融合蛋白PLA2基因的获取；

图3为10%SDS-PAGE电泳图展示Ni亲和层析后的融合蛋白TF-SUMO1-PLA2；

图4为去SUMO化酶SENP1对融合蛋白的酶切；

图5为对PLA2水解NBDC6-HPC产生荧光的监测。

具体实施方式

通过以下实施例进一步举例描述本发明，并不以任何方式限制本发明。下面用实施例来进一步说明本发明的实质性内容，但本发明的内容并不局限于此。

实施例1

基因扩增与融合

本发明所述融合基因SUMO1-PLA2全长的获取

1、鸡SUMO1基因的获取，步骤如下：

检索鸡SUMO1基因全序列。（来源于NCBI核酸数据库）

鸡SUMO1核酸序列

1ATGTCGGACCAGGAAGCAAAGCCTTCAGCTGAGGACTTAGGAGATAAGAAAGAGGGGGAAT

ACATTAAACTCAAAGTCATTGGGCAGGACAGCAGTGAAATTCACTTCAAGGTGAAAATGAC

AACACACCTCAAGAAACTCAAAGAATCATACTGTCAAAGACAGGGTGTTCCAATGAACTCACTCAGGTTTCTCTTCGAGGGTCAGAGAATTACTGATAATCATACCCCCAAGGAGCTGGGGA

288TGGAGGAGGAAGATGTGATTGAAGTTTATCAGGAACAGACCGGT

蛋白序列

1MSDQEAKPSAEDLGDKKEGEYIKLKVIGQDSSEIHFKVKMTTHLKKLKESYCQRQGVPMNS

96LRFLFEGQRITDNHTPKELGMEEEDVIEVYQEQTG

提取鸡基因组，PCR法获得SUMO1基因序列。

上游引物1：

CATATGATGTCGGACCAGGAAGCAAAG

下游引物2：

ACCGGTCTGTTCCTGATAAACTTC

PCR反应条件：

1、95℃3min

2、94℃1min；58℃30s；72℃1min；30cycles

3、72℃10min

4、4℃store

2、鼠源性PLA2_-基因的获取

具体过程如下：

检索小鼠PLA2基因全序列。（来源于NCBI核酸数据库）

PLA2序列基因全长

1GGAGGACTCCTGGAGCTGGCAGGGACCTTGGATTGTGTTGGGCCTCGATCTCCGATGGCTTACATGAACTATGGCTGTTATTGTGGCCTTGGTGGCCATGGAGAGCCACGTGACGCCATTGACTGGTGCTGCTACCACCACGACTGCTGCTACTCTCGGGCTCAGGACGCTGGCTGCAGCCCTAAGTTAGACCGCTACCCATGGAAGTGCATGGACCATCACATCCTGTGTGGACCAGCAGAGAACAAATGCCAAGAACTTTTGTGCAGGTGTGACGAGGAGCTGGCTTACTGCCTGGCAGGGACCGAGTACCACCTGAAATACCTCTTCTTCCCCTCCATTTTATGTGAGAAG

375GACTCTCCCAAGTGCAATTGA

蛋白序列

1GGLLELAGTLDCVGPRSPMAYMNYGCYCGLGGHGEPRDAIDWCCYHHDCCYSRAQDAGCSPKLDRYPWKCMDHHILCGPAENKCQELLCRCDEELAYCLAGTEYHLKYLFFPSILCEK

125DSPKCN.

提取小鼠全基因组，PCR法获得PLA2基因序列。

上游引物3：

ACCGGTGGAGGACTCCTGGAGCT

下游引物4：

CTCGAGTCAATTGCACTTGGGAGAGTC

PCR反应条件：

1、95℃3min

2、94℃1min；58℃30s；72℃1min；30cycles

3、72℃10min

4、4℃store

3、SUMO1-PLA2融合蛋白基因全长的构建

首先用引物1和引物2配对，以鸡的全基因组为模板PCR扩增得到SUMO1基因，然后再以引物3和引物4配对，以鼠细胞全基因组为模板PCR扩增得到PLA2,将PCR得到的两个产物分别双酶切，pColdTF双酶切，琼脂糖凝胶回收双酶切产物，最终经T₄DNA连接酶的作用下将融合基因连接到冷诱导原核表达载体pColdTF上，其中NdeI和XhoI两酶切位点之间一段基因序列即为融合蛋白基因SUMO1-PLA2。

具体过程如下：

（1）NdeⅠ和XhoⅠ双酶切原核表达载体质粒pColdTF，回收大片段。

（2）NdeⅠ和AgeⅠ双酶切SUMO1，回收酶切产物。

（3）AgeⅠ和XhoⅠ双酶切PLA2，回收酶切产物。

（4）将上述三个回收产物连接得到pColdTF-SUMO1-PLA2重组质粒，转入TOP10感受态细菌中，挑单菌落，提取质粒，测序结果，与预期一致。构建入原核表达载体后，阅读框为：

1ATGTCGGACCAGGAAGCAAAGCCTTCAGCTGAGGACTTAGGAGATAAGAAAGAGGGGGAATACATTAAACTCAAAGTCATTGGGCAGGACAGCAGTGAAATTCACTTCAAGGTGAAAATGACAACACACCTCAAGAAACTCAAAGAATCATACTGTCAAAGACAGGGTGTTCCAATGAACTCACTCAGGTTTCTCTTCGAGGGTCAGAGAATTACTGATAATCATACCCCCAAGGAGCTGGGGATGGAGGAGGAAGATGTGATTGAAGTTTATCAGGAACAGACCGGTGGAGGACTCCTGGAGCTGGCAGGGACCTTGGATTGTGTTGGGCCTCGATCTCCGATGGCTTACATGAACTATGGCTGTTATTGTGGCCTTGGTGGCCATGGAGAGCCACGTGACGCCATTGACTGGTGCTGCTACCACCACGACTGCTGCTACTCTCGGGCTCAGGACGCTGGCTGCAGCCCTAAGTTAGACCGCTACCCATGGAAGTGCATGGACCATCACATCCTGTGTGGACCAGCAGAGAACAAATGCCAAGAACTTTTGTGCAGGTGTGACGAGGAGCTGGCTTACTGCCTGGCAGGGACCGAGTACCACCTGAAATACCTCTTCTTCCCCTCCATTTTATGTGAGAAGGACTCTCC

663CAAGTGCAATTGA

表达序列为：

1MSDQEAKPSAEDLGDKKEGEYIKLKVIGQDSSEIHFKVKMTTHLKKLKESYCQRQGVPMNSLRFLFEGQRITDNHTPKELGMEEEDVIEVYQEQTGGGLLELAGTLDCVGPRSPMAYMNYGCYCGLGGHGEPRDAIDWCCYHHDCCYSRAQDAGCSPKLDRYPWKCMDHHILCGPAENKCQELLCRCDEELAYCL

221AGTEYHLKYLFFPSILCEKDSPKCN。

4、融合蛋白TF-SUMO1-PLA2的制备

（1）pColdTF-SUMO1-PLA2²⁹质粒转入Bl21(DE3)感受态细菌中；

（2）挑单菌落至5mlLB培养基中，37℃震荡培养过夜，1/1000接菌至400mlLB培养基中，37℃震荡培养至OD₆₀₀至0.8-1.0，加入终浓度为0.1mMIPTG,继续15℃震荡培养12小时；

（3）TF-SUMO1-PLA2^29-151融合蛋白纯化

1）4℃4000g离心收集菌体，PBS（pH7.4）洗涤一次，按照每克湿菌加入50mlBufferA（500mMNaCl,50mMTris，10mMimidazol,10%glycerol;(pH7.4)）重悬菌体；

2）超声裂解细菌（工作时间3秒，间歇时间5秒，强度450W，总工作时长10分钟）。12,000×g，4℃离心30分钟，留取上清；

3）收集上清，0.45μm滤膜过滤，备用；

4）Ni层析介质空跑，10倍体积的ddH₂0洗涤后，再用5倍体积的BufferA平衡；

5）将步骤3所制备的样品，与步骤4的Ni介质（0.5mlNi介质/g湿菌）混合，4℃翻转摇床上，轻摇2小时；

6）将步骤5的样品连同Ni介质一同装柱。200mlBufferA充分洗涤；

7）洗脱；10ml洗脱液（500mMNaCl,50mMTris，100mMimidazol,10%glycerol;(pH7.4)）（用BufferA与BufferD适当比例混合而成）洗脱，流速控制在8-10滴/分钟。收集OD₂₈₀峰值处流出液，约6-8ml；

8）透析与储存；

透析：一个小时之内，至少四次更换透析液（500mMNaCl,50mMTris，10%glycerol;(pH7.4)），用以除去残存的咪唑和尿素；

透析后的样品，12,000×g，4℃离心5分钟，分装上清，迅速置于液氮中过夜。-80℃冰箱保存，备用；

4、融合蛋白TF-SUMO1-PLA2作为去SUMO化酶底物的用途

（1）SENP1对融合蛋白TF-SUMO1-PLA2的切割

在20μL体系中50nMSENP1可以将500nMTF-SUMO1-PLA2完全切开，形成TF-SUMO1和PLA2，酶切结果如图4所示；

（2）上述得到的PLA2可以特异性水解底物NBDC6-HPC形成荧光产物NBD，通过检测荧光的强度得到酶及融合蛋白的活性及酶切效率，结果如5所示。

SEQno.1

　　<110>吉林大学

　　<120>融合蛋白SUMO1-PLA2及制备方法和医用用途

　　<140>20151033868.8

<141>2016-03-04

　　<160>1

　　<210>1

　　<211>27

　　<212>DNA

　　<213>人工序列

　　<400>1

CATATGATGTCGGACCAGGAAGCAAAG

SEQno.2

　　<110>吉林大学

　　<120>融合蛋白SUMO1-PLA2及制备方法和医用用途

　　<140>20151033868.8

<141>2016-03-04

　　<160>1

　　<210>1

　　<211>24

　　<212>DNA

　　<213>人工序列

　　<400>1

ACCGGTCTGTTCCTGATAAACTTC

SEQno.3

　　<110>吉林大学

　　<120>融合蛋白SUMO1-PLA2及制备方法和医用用途

　　<140>20151033868.8

<141>2016-03-04

　　<160>1

　　<210>1

　　<211>23

　　<212>DNA

　　<213>人工序列

　　<400>1

ACCGGTGGAGGACTCCTGGAGCT

SEQno.4

　　<110>吉林大学

　　<120>融合蛋白SUMO1-PLA2及制备方法和医用用途

　　<140>20151033868.8

<141>2016-03-04

　　<160>1

　　<210>1

　　<211>27

　　<212>DNA

　　<213>人工序列

　　<400>1

CTCGAGTCAATTGCACTTGGGAGAGTC

SEQno.5

　　<110>吉林大学

　　<120>融合蛋白SUMO1-PLA2及制备方法和医用用途

　　<140>20151033868.8

<141>2016-03-04

　　<160>1

　　<210>1

　　<211>288

　　<212>DNA

　　<213>鸡SUMO1

　　<400>1

ATGTCGGACCAGGAAGCAAAGCCTTCAGCTGAGGACTTAGGAGATAAGAAAGAGGGGGAA60

TACATTAAACTCAAAGTCATTGGGCAGGACAGCAGTGAAATTCACTTCAAGGTGAAAATG120

ACAACACACCTCAAGAAACTCAAAGAATCATACTGTCAAAGACAGGGTGTTCCAATGAAC180

TCACTCAGGTTTCTCTTCGAGGGTCAGAGAATTACTGATAATCATACCCCCAAGGAGCTG240

GGGATGGAGGAGGAAGATGTGATTGAAGTTTATCAGGAACAGACGGGG288

SEQno.6

　　<110>吉林大学

　　<120>融合蛋白SUMO1-PLA2及制备方法和医用用途

　　<140>20151033868.8

<141>2016-03-04

　　<160>1

　　<210>1

　　<211>375

　　<212>DNA

　　<213>鼠PLA2

　　<400>1

GGAGGACTCCTGGAGCTGGCAGGGACCTTGGATTGTGTTGGGCCTCGATCTCCGATGGCT60

TACATGAACTATGGCTGTTATTGTGGCCTTGGTGGCCATGGAGAGCCACGTGACGCCATT120

GACTGGTGCTGCTACCACCACGACTGCTGCTACTCTCGGGCTCAGGACGCTGGCTGCAGC180

CCTAAGTTAGACCGCTACCCATGGAAGTGCATGGACCATCACATCCTGTGTGGACCAGCA240

GAGAACAAATGCCAAGAACTTTTGTGCAGGTGTGACGAGGAGCTGGCTTACTGCCTGGCA300

GGGACCGAGTACCACCTGAAATACCTCTTCTTCCCCTCCATTTTATGTGAGAAGGACTCT360

CCCAAGTGCAATTGA375

SEQno.7

　　<110>吉林大学

　　<120>融合蛋白SUMO1-PLA2及制备方法和医用用途

　　<140>20151033868.8

<141>2016-03-04

　　<160>1

　　<210>1

　　<211>663

　　<212>DNA

　　<213>SUMO1-PLA2

　　<400>1

ATGTCGGACCAGGAAGCAAAGCCTTCAGCTGAGGACTTAGGAGATAAGAAAGAGGGGGAA60

TACATTAAACTCAAAGTCATTGGGCAGGACAGCAGTGAAATTCACTTCAAGGTGAAAATG120

ACAACACACCTCAAGAAACTCAAAGAATCATACTGTCAAAGACAGGGTGTTCCAATGAAC180

TCACTCAGGTTTCTCTTCGAGGGTCAGAGAATTACTGATAATCATACCCCCAAGGAGCTG240

GGGATGGAGGAGGAAGATGTGATTGAAGTTTATCAGGAACAGACCGGTGGAGGACTCCTG300

GAGCTGGCAGGGACCTTGGATTGTGTTGGGCCTCGATCTCCGATGGCTTACATGAACTAT360

GGCTGTTATTGTGGCCTTGGTGGCCATGGAGAGCCACGTGACGCCATTGACTGGTGCTGC420

TACCACCACGACTGCTGCTACTCTCGGGCTCAGGACGCTGGCTGCAGCCCTAAGTTAGAC480

CGCTACCCATGGAAGTGCATGGACCATCACATCCTGTGTGGACCAGCAGAGAACAAATGC540

CAAGAACTTTTGTGCAGGTGTGACGAGGAGCTGGCTTACTGCCTGGCAGGGACCGAGTAC600

CACCTGAAATACCTCTTCTTCCCCTCCATTTTATGTGAGAAGGACTCTCCCAAGTGCAAT660

TGA663

Claims

1.一种融合蛋白SUMO1-PLA2，其特征在于：其的氨基酸序列如SEQno.1所示。

2.权利要求1所述的融合蛋白SUMO1-PLA2的制备方法，包括以下步骤：

1）鸡SUMO1基因的获取

提取鸡全基因组；PCR法扩增SUMO1基因序列；所用引物为：

上游引物：

CATATGATGTCGGACCAGGAAGCAAAG

下游引物：

ACCGGTCTGTTCCTGATAAACTTC

以鸡全基因组为模板，上述两条引物，PCR方法得到鸡SUMO1基因；

2）鼠源性PLA2_-基因的获取

提取小鼠基因组；PCR法扩增PLA2基因序列；所用引物为：

上游引物：

ACCGGTGGAGGACTCCTGGAGCT

下游引物：

CTCGAGTCAATTGCACTTGGGAGAGTC

以小鼠全基因组为模板，上述两条引物，PCR方法得到PLA2基因序列；

3）SUMO1-PLA2融合蛋白基因全长的构建

SUMO3基因PCR扩增后产物经双酶切（NdeI和AgeI）和PLA2基因PCR扩增产物经双酶切（AgeI和XhoI）后，凝胶回收双酶切产物；pColdTF表达质粒双酶切（NdeI和XhoI）后，凝胶回收大片段；将上述三个回收片段连接，获得将融合蛋白全长基因构建入pColdTF表达载体中的重组质粒，既融合蛋白原核表达质粒pColdTF-SUMO3-PLA2；其中NdeI和XhoI两酶切位点之间一段基因序列即为融合蛋白基因SUMO3-PLA2；

4）融合蛋白TF-SUMO1-PLA2的制备

将融合蛋白原核表达质粒TF-SUMO1-PLA2导入到BL21（DE3）原核表达菌体系，37℃终浓度0.1mMIPTG诱导表达载体蛋白；非变性条件下，Ni亲和层析一步法纯化融合蛋白。

3.权利要求1中的融合蛋白作为去SUMO酶底物的用途，可以作为一种底物用来作人、哺乳动物及鸟类去SUMO3化酶类的活性分析检测试剂盒。