CN113727701A - 用于治疗神经变性疾病的sumo肽 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了用于治疗神经变性疾病如帕金森病的新的组合物、试剂盒和方法。
Description
相关申请
本申请要求2019年3月28日提交的美国临时专利申请第62/825,560号的优先权,其内容通过引用整体并入本文用于所有目的。
发明背景
神经变性疾病是主要影响人脑中的神经元的广泛病症的一个涵盖性术语。神经元是包括脑和脊髓的神经系统的结构单元。因为神经元通常不会复制或替换自身,当它们被损坏或死亡时,它们不能被身体替换。因此,神经变性疾病可对受累的那些人具有深远的,破坏性的但不可逆转的作用。最常见的神经变性疾病包括帕金森病、阿尔茨海默病和亨廷顿病。不能治愈的、使人衰弱的神经变性疾病,以渐进和加速的方式影响人的活动和精神功能。在世界范围内,数百万人受到神经变性疾病的影响。据保守估计,超过500万美国人患有阿尔茨海默病,超过50万美国人患有帕金森病。尽管目前可用的治疗可以帮助缓解与神经变性疾病相关的一些身体或精神症状,但还没有已知的方法来减缓疾病进展或提供治愈。因此,对于患有神经变性疾病的个体的护理成本可能是非常大的:在2018年,平均来说,需要每月约$3000至$6000来维持痴呆患者。
由于神经变性疾病的流行,其对患者生活质量的严重影响以及其对社会经济的巨大影响,迫切需要治疗神经变性疾病的新的且更有效的方法。本发明满足了这种和其它相关的需要。
发明内容
本发明人发现小泛素样修饰物(SUMO)蛋白及其区段可抑制α-突触核蛋白的聚集,并因此可抑制α-突触核蛋白介导的细胞毒性。
因此,在第一方面,本发明提供了SUMO衍生的多肽、核酸、表达盒和相关组合物。所述SUMO衍生的多肽包含SEQ ID NO:1的15-55或31-55区段的核心序列,但不包含SEQ IDNO:1的全长,并且所述多肽与异源部分缀合;和/或所述核心序列包含在SEQ ID NO:1的15-55或31-55区段中的一个或多个突变,并且所述多肽抑制α-突触核蛋白聚集。例如,SUMO衍生的多肽包含取自SUMO蛋白的核心序列(因此小于SUMO蛋白的全长),任选地在一个或多个氨基酸残基处修饰(例如,通过缺失、插入和/或取代),但仍保留两个β折叠中的至少一个以及原始存在于野生型SUMO蛋白中的α-螺旋结构,使得SUMO衍生的多肽保留结合α-突触核蛋白的能力,例如通过α-突触核蛋白的SIM。在一些实施方案中,核心序列是SEQ ID NO:1的15-55区段或31-55区段,或另一SUMO蛋白中的相应区段(例如,SUMO2的10-51区段,SUMO3的10-50区段,SUMO4的10-51区段和SUMO5的15-55区段),在所述区段中具有任选的一个或多个突变(插入、删除和/或取代)。在一些实施方案中,所述SUMO衍生的多肽包含异源部分,并且所述异源部分是异源氨基酸序列。在一些实施方案中,异源部分是可检测标记。在一些实施方案中,异源部分是亲和标签。在一些实施方案中,SUMO衍生的多肽由核心序列和在核心序列的N-末端和/或C-末端的一个或多个异源氨基酸序列组成。在一些实施方案中,SUMO衍生的多肽由SEQ ID NO:1的15-55或31-55区段的核心序列以及在核心序列的N-末端的聚精氨酸或聚组氨酸标签组成:例如,核心序列是SEQ ID NO:1的31-55区段,并且聚精氨酸(例如,8xArg)标签或聚组氨酸(例如,10xHis)标签存在于核心序列的N-末端。
在一些实施方案中,本发明提供了包含编码上文和本文所述的SUMO衍生的多肽的多核苷酸序列的核酸,所述多肽是例如包含SEQ ID NO:1的15-55或31-55区段(或另一SUMO蛋白中的相应区段,例如SUMO2的10-51区段,SUMO3的10-50区段,SUMO4的10-51区段,和SUMO5的15-55区段)的核心序列的多肽,并且所述核酸还包含至少一个异源氨基酸序列的至少一个编码序列,和/或所述核心序列包含在SEQ ID NO:1的15-55或31-55区段(或另一SUMO蛋白中的相应区段,例如,SUMO2的10-51区段,SUMO3的10-50区段,SUMO4的10-51区段和SUMO5的15-55区段)中的一个或多个突变。在一些实施方案中,所述核酸编码由所述核心序列和在所述核心序列的N-末端和/或C-末端的一个或多个异源氨基酸序列组成的融合蛋白。在一些实施方案中,本发明提供了包含编码本文和上文所述的SUMO衍生的多肽的多核苷酸序列的表达盒,所述多核苷酸序列与异源启动子可操作地连接。在一些实施方案中,所述多肽由所述核心序列和在所述核心序列的N-末端和/或C-末端的一个或多个异源氨基酸序列组成。在一些实施方案中,本发明提供了包含上文和本文所述的表达盒的载体。在一些实施方案中,提供了包含所述表达盒或载体的宿主细胞。在一些实施方案中,提供了组合物,其包含生理学上可接受的赋形剂和有效量的(1)SUMO衍生的多肽,所述SUMO衍生的多肽包含SEQ ID NO:1的15-55或31-55区段(或如本文所述的另一SUMO蛋白中的相应区段),任选地包含在所述区段中的一个或多个突变;或(2)编码所述SUMO衍生的多肽的核酸。在一些实施方案中,SUMO衍生的多肽由SEQ ID NO:1的15-55或31-55区段组成。在一些实施方案中,SUMO衍生的多肽由SEQ ID NO:1的15-55或31-55区段的核心序列和在所述核心序列的N-末端的聚精氨酸或聚组氨酸标签组成:例如,所述核心序列是SEQ ID NO:1的31-55区段,并且聚精氨酸(例如,8xArg)标签或聚组氨酸(例如,10xHis)标签存在于所述核心序列的N-末端。
在第二方面,本发明提供了抑制细胞中α-突触核蛋白聚集的方法。所述方法包括使细胞与有效量的(1)SUMO衍生的多肽,所述SUMO衍生的多肽包含SEQ ID NO:1的15-55或31-55区段(或如本文所述的另一SUMO蛋白中的相应区段),任选地包含在所述区段中的一个或多个突变;或(2)编码SUMO衍生的多肽的核酸接触的步骤。在一些实施方案中,细胞是神经元细胞。在一些实施方案中,神经元细胞在人类患者体内。在一些实施方案中,SUMO衍生的多肽由SEQ ID NO:1的15-55或31-55区段组成。在一些实施方案中,SUMO衍生的多肽由SEQ ID NO:1的15-55或31-55区段的核心序列和在所述核心序列的N-末端的聚精氨酸或聚组氨酸标签组成:例如,所述核心序列是SEQ ID NO:1的31-55区段,并且聚精氨酸(例如,8xArg)标签或聚组氨酸(例如,10xHis)标签存在于核心序列的N-末端。
在第三方面,本发明提供了用于治疗有需要的人类患者中神经变性疾病的方法。所述方法包括向患者施用有效量的:(1)SUMO衍生的多肽,其包含SEQ ID NO:1的15-55或31-55区段(或如本文所述的另一SUMO蛋白中的相应区段),任选地包含在所述区段中的一个或多个突变;或(2)编码SUMO衍生的多肽的核酸。在一些实施方案中,施用包括静脉内施用或经鼻施用。在一些实施方案中,SUMO衍生的多肽由SEQ ID NO:1的15-55或31-55区段组成。在一些实施方案中,SUMO衍生的多肽由SEQ ID NO:1的15-55或31-55区段的核心序列和在所述核心序列的N-末端的聚精氨酸或聚组氨酸标签组成:例如,所述核心序列是SEQ IDNO:1的31-55区段,并且聚精氨酸(例如,8xArg)标签或聚组氨酸(例如,10xHis)标签存在于核心序列的N-末端。在一些实施方案中,所治疗的神经变性疾病是帕金森病,特别是家族性帕金森病,以及路易体痴呆。
在第四方面,本发明提供了用于治疗神经变性疾病的试剂盒。所述试剂盒包含这些组分:(1)含有SUMO衍生的多肽或编码所述SUMO衍生的多肽的核酸的第一容器,所述SUMO衍生的多肽包含SEQ ID NO:1的15-55或31-55区段(或如本文所述的另一SUMO蛋白中的相应区段),任选地包含在所述区段中的一个或多个突变;和(2)含有神经保护剂的第二容器。在一些实施方案中,SUMO衍生的多肽由SEQ ID NO:1的15-55或31-55区段组成。在一些实施方案中,SUMO衍生的多肽由SEQ ID NO:1的15-55或31-55区段的核心序列和在所述核心序列的N-末端的聚精氨酸或聚组氨酸标签组成:例如,所述核心序列是SEQ ID NO:1的31-55区段,并且聚精氨酸(例如,8xArg)标签或聚组氨酸(例如,10xHis)标签存在于核心序列的N-末端。在一些实施方案中,所治疗的神经变性疾病是帕金森病,特别是家族性帕金森病,以及路易体痴呆。在一些实施方案中,所述试剂盒还包含说明书手册,所述说明书手册为使用者提供使用所述试剂盒的内容物用于其预期目的的说明书。
附图的简要说明
图1.SUMO1(15-55)抑制α-突触核蛋白聚集的剂量依赖性作用。将70μMα-突触核蛋白与SUMO1(15-55)以不同比率(α-突触核蛋白:SUMO1(15-55)=1:1、1:0.5、1:0.2、1:0.1)混合,并在37℃下孵育连续7天。(A)不同比率的SUMO1(15-55)对α-突触核蛋白聚集的影响。(黄色:仅缓冲液)(B)来自原纤化(fibrillization)测定的蛋白质样品的尺寸排阻层析分析。在原纤化测定蛋白结束时,使样品经历Superdex 200GL 5/150柱。(C)分别在(I-M)中的蛋白质样品的淀粉样生成的时间过程。(D-H)在指定的孵育时间记录单独的α-突触核蛋白(D)和比率为(E)1:1、(F)1:0.5、(G)1:0.2、(H)1:0.1的α-突触核蛋白/SUMO1(15-55)的混合物的CD光谱。(I-M)在单独的α-突触核蛋白(I),以及以α-突触核蛋白/SUMO1(15-55)的比率为(J)1:1、(K)1:0.5、(L)1:0.2、(M)1:0.1孵育7天后,来自原纤化测定的α-突触核蛋白/SUMO1(15-55)混合物的TEM图像。比例条:500nm。
图2.SUMO1(15-55)对SH-SY5Y细胞的神经保护作用。(A)在不存在和存在化学计量量的SUMO1(15-55)的情况下老化的α-突触核蛋白对SH-SY5Y细胞的毒性。(B)在不存在和存在化学计量量的SUMO1(15-55)的情况下老化的NACore对SH-SY5Y细胞的毒性。(C)显示在不存在和存在化学计量量的SUMO1(15-55)的情况下老化的α-突触核蛋白的细胞摄入的共聚焦图像。(D-E)通过流式细胞术定量细胞摄入。数据分析使用单向ANOVA然后使用邓尼特事后检验进行;数值表示平均值±SD(与仅α-突触核蛋白/NACore相比,**p<0.01,****p<0.0001)。
图3.通过偶联生物分子荧光互补和流式细胞术的蛋白质相互作用的可视化和定量。(A)用相应的质粒转染的SH-SY5Y细胞和BiFC信号通过共聚焦显微镜检测。阳性对照:mVenus。阴性对照:VN173+SUMO1(15-55)-VC155。比例条:25μm。(B)各样品的代表性BiFC-FC散点图。百分比指BiFC-阳性细胞。(C)用相应的质粒共转染的BiFC-阳性SH-SY5Y细胞的定量。(D)BiFC-阳性细胞的平均荧光值的定量。数据分析使用单向ANOVA然后使用邓尼特事后检验进行;数值表示平均值±SD(与阴性对照相比,**p<0.01,****p<0.0001)。
图4.SUMO1(15-55)抑制光感受器神经变性。SUMO1(15-55)的幼虫喂养抑制羽化后3-4天定量的α-突触核蛋白转基因果蝇中的光感受器退化。(A)果蝇眼睛中可见感杆分体(rhabdomere)的代表性图像。(B)每个复眼的平均感杆分体数。(C)复眼百分比的分布。对于每种条件,使用从三次独立杂交获得的35-40只蝇中的至少650个复眼来计算每只复眼的平均感杆分体数。数据分析使用单向ANOVA然后使用邓尼特事后检验进行;数值表示平均值±SEM(与对照组相比,****p<0.0001)。
图5.SUMO1(15-55)通过保护多巴胺能神经元改善运动功能障碍。在年龄为羽化后第1、4、7、10、13天的成体α-突触核蛋白转基因果蝇的攀爬能力。(A)α-突触核蛋白转基因果蝇的运动功能障碍通过以剂量依赖性方式幼虫喂养SUMO1(15-55)来挽救。(B)检测13天龄α-突触核蛋白转基因果蝇头部蛋白表达水平的代表性蛋白质印迹。(C)TH表达水平的定量。(D)α-突触核蛋白表达水平的定量。数据分析使用单向ANOVA然后使用邓尼特事后检验进行;数值表示平均值±SEM(与无治疗组或对照组相比,*p<0.05,***p<0.001,****p<0.0001)。
图6.1:1浓度的SUMO1衍生的肽抑制SDS-诱导的α-突触核蛋白聚集。通过ThT测定测量的荧光强度。这些数据显示SUMO1(31-55)在抑制α-突触核蛋白聚集方面具有与SUMO1(15-55)类似的能力。然而,SUMO1(20-40)在抑制α-突触核蛋白聚集方面无效。这些数据表明SUMO1(31-55)的折叠-环-螺旋基序足以抑制SUMO1衍生的肽引起的α-突触核蛋白聚集。
图7.用微尺度热泳(MST)测定SUMO(31-55)与α-突触核蛋白的结合。这些数据表明SUMO1(31-55)与SUMO1(15-55)在结合α-突触核蛋白方面具有相似的亲和力。
图8.SUMO1-5蛋白的序列比对。A.由Liang,Y.C.等人,“SUMO5,a Novel Poly-SUMOIsoform,Regulates PML Nuclear Bodies”,Sci Rep.2016May 23;6:26509.doi:10.1038/srep26509重现的。B.SUMO 1(15-55)和其它SUMO蛋白中的相应区段。
图9.SUMO1蛋白的结构。(A)SUMO1(15-55)(青色)。(B)SUMO1(31-55)(黄色)。(c)SUMO1(20-40)(洋红色)。SUMO1蛋白的剩余残基以灰色表示。
图10.对SUMO1(15-55)肽上与α-突触核蛋白结合的位点的认识。A.将两个疏水性残基取代为亲水性残基会降低推定的结合沟的疏水性。SUMO1(15-55)(左)和SUMO1(15-55)(L44E,L47R)(右)的表面表示。在黑框中突出显示区域的特写。亲水性残基(蓝色),疏水性残基(橙色)。盐桥用紫色虚线示出。B.SUMO1(15-55)-αsyn(35-45)复合物(左)和SUMO1(15-55)(L44E,L47R)-αsyn(35-45)复合物(右)的预测模型结构表明αsyn(35-45)不能与突变体结合。所有预测的复合物结构通过使用PIPER-FlexDock将αsyn(35-45)(洋红色)与SUMO1(15-55)构建体(灰色)(来源于PDB ID:2N1V)对接而获得。C.在不存在和存在等摩尔比的SUMO1(15-55)/SUMO1(15-55)(L44E,L47R)的情况下,α-突触核蛋白的聚集动力学。仅缓冲液(黄色)。数据表示为平均值±s.e.m.(n=4)。D.用于SUMO1(15-55)/SUMO1(L44E,L47R)和α-突触核蛋白的结合的MST测定研究相互作用中疏水性的影响。误差条表示基于至少三次独立测量的平均值±s.e.m.。显示了结合曲线和Kd值。
图11.对α-突触核蛋白上SUMO1(15-55)结合位点的认识。A.全长人野生型α-突触核蛋白的氨基酸序列。残基35-45以洋红色着色,残基48-60以绿色着色。SIM/SIM样序列被加下划线。B.用于SUMO1(15-55)和α-突触核蛋白片段肽的结合的MST测定缩小α-突触核蛋白上的相互作用区域。C.用于SUMO1(15-55)和α-突触核蛋白SIM1和SIM2的五元组丙氨酸(5A)突变体的结合的MST测定研究相互作用中的序列选择。误差条表示基于至少三次独立测量的平均值±s.e.m.。显示了结合曲线和Kd值。D.SUMO1(15-55)-αsyn(35-45)复合物的预测模型结构,其使用PIPER-FlexPepDock协议,通过将αsyn(35-45)(洋红色)对接至SUMO1(15-55)(灰色)(来源于PDB ID:2N1V)来获得。特写和省略图显示αsyn(35-45)通过SIM(37VLYV40)结合到推定的疏水性结合沟上,如所预期的那样。Y39显示为黄色,疏水性残基显示为橙色。
图12.SUMO1(15-55)抑制α-突触核蛋白转基因果蝇的神经变性。通过在α-突触核蛋白-A30P转基因果蝇A或α-突触核蛋白-A53T转基因果蝇C中以剂量依赖性方式幼虫喂养SUMO1(15-55)抑制光感受器神经变性。在B,D中示出了相应的频率分布。果蝇眼睛可见感杆分体的代表性图像。对于每种条件,检查从10只蝇眼中收集的至少100个复眼。每个复眼的平均光感受器数±s.e.m.表示在每幅图的底部。
图13.SUMO1(31-55)改善α-突触核蛋白转基因果蝇的运动功能障碍。通过在α-突触核蛋白转基因果蝇A,α-突触核蛋白-A30P转基因果蝇B,α-突触核蛋白-A53T转基因果蝇C中,以剂量依赖性方式(n=20个果蝇/组)对幼虫喂养SUMO1(15-55)来挽救运动功能障碍。数据表示平均值±s.e.m.。P值通过双向ANOVA然后通过邓尼特事后检验来计算。与无治疗对照相比,*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001,****p<0.0001,ns不显著。
图14.R8-SUMO1(31-55)在SH-SY5Y细胞中的内化及其体外抑制作用。A.R8-SUMO1(31-55)的细胞摄入的以时间过程方式的代表性图像。在与SH-SY5Y细胞共孵育之前,用NHS-Alexa488标记R8-SUMO1(31-55)。在不同的时间点(1h和24h)固定细胞,用Hoechst33342(蓝色)染色细胞核,用小麦胚芽凝集素(红色)染色细胞膜。B.在不存在和存在化学计量量的R8-SUMO1(31-55)的情况下α-突触核蛋白的聚集动力学。仅缓冲液(黄色)。数据表示为平均值±s.e.m.(n=4)。
图15.His-SUMO1(31-55)的体外抑制作用。在不存在和存在化学计量量的His-SUMO1(31-55)的情况下α-突触核蛋白的聚集动力学。仅缓冲液(黄色)。数据表示为平均值±s.e.m.(n=4)。
图16.对SUMO1(15-55)在α-突触核蛋白上的结合位点的验证。A,B使用PIPER-FlexPepk协议,通过将αsyn(35-45)(洋红色)或αsyn(48-60)(绿色)对接至SUMO1获得的SUMO1(15-55)-αsyn(35-45)复合物A和SUMO1(15-55)-αsyn(48-60)复合物B的预测模型结构。特写和省略的视图显示αsyn(35-45)/αsyn(48-60)通过SIM1(37VLYV40)/SIM2(48VVHGV52)结合推定的疏水性结合沟,如预期的那样。疏水性残基以橙色显示。C.用于SUMO1(15-55)和α-突触核蛋白突变体的结合的MST测定。误差条表示基于至少三次独立测量的平均值±s.e.m.。显示了结合曲线和Kd值。
图17.不同比率的SUMO2(16-88)(与SUMO3(15-87)相同的序列)对α-突触核蛋白聚集的影响。将70μMα-突触核蛋白与SUMO1(16-88)以不同比率(α-突触核蛋白:SUMO1(16-88)=1:1、1:0.5、1:0.2、1:0.1)混合,并在37℃下孵育连续7天。
图18.不同比率的SUMO2(16-51)(与SUMO3(15-50)相同的序列)对α-突触核蛋白聚集的影响。将70μMα-突触核蛋白与SUMO1(16-51)以不同比率(α-突触核蛋白:SUMO1(16-51)=1:1、1:0.5、1:0.2、1:0.1)混合,并在37℃下孵育连续7天。
定义
本文所用的术语“SUMO”或“小泛素样修饰物”是指小蛋白质家族,其通过共价连接到细胞内的其它蛋白质上和从这些蛋白质上分离来修饰这些蛋白质的功能。大多数SUMO蛋白是小的:约100个氨基酸的长度和12kDa的分子量。与泛素相似,SUMO蛋白被认为是泛素样蛋白家族的成员。与泛素不同,SUMO蛋白不标记用于降解的蛋白,尽管SUMO化是通过类似于参与泛素化的酶促级联来指导的。翻译后修饰过程,SUMO化参与各种细胞过程,例如核胞质转运、转录调节、细胞凋亡、蛋白质稳定性、对应激的应答和通过细胞周期的进展。已经在许多物种中发现了SUMO蛋白。在人类中有4种证实的SUMO同种型:SUMO-1、SUMO-2、SUMO-3和SUMO-4。此外,存在新发现的SUMO5,一种新的灵长类动物特异性和组织特异性的小泛素样修饰物蛋白。人SUMO1蛋白具有SEQ ID NO:1和GenBank登录号AAC50996.1中所示的氨基酸序列,并且其编码序列如SEQ ID NO:2和GenBank登录号NG_011679.1中所示。人SUMO1是具有由α螺旋和β折叠组成的球形核心的球状蛋白,多肽链的两端从所述蛋白质的核心突出。
本文所用的“SUMO衍生的多肽”是指包含核心序列并保留抑制α-突触核蛋白聚集的能力(例如,如在原纤维形成(fibrillation)/硫黄素T(ThT)测定,神经元细胞中的α-突触核蛋白细胞毒性测定,或帕金森病模型如α-突触核蛋白转基因果蝇(Drosophila)中的神经保护测定中测定的)的多肽,所述核心序列通常对应于SUMO蛋白(尤其是人SUMO1蛋白)的片段(如15-55片段或31-55片段)。例如,核心序列可以包含与人SUMO1蛋白的15-55区段中的相应残基相同的至少30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40或多达41个氨基酸残基。或者,核心序列可包含与人SUMO1蛋白的区段31-55相同的至少15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或多达25个氨基酸残基。换句话说,这些核心序列中可能的改变或突变(例如缺失、插入或取代,尤其是保守取代)通常涉及不超过1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11个残基,其中在位置52处的半胱氨酸残基任选地保留。“SUMO 1衍生的多肽”在一些情况下可以涵盖全长SUMO蛋白,而在其它情况下不涵盖全长SUMO蛋白序列。它可以包含在对应于SUMO蛋白片段的核心序列的N-末端和/或C-末端的一个或多个异源多肽序列。“SUMO衍生的多肽”可以在核心序列和/或异源序列中含有一个或多个修饰的或人工的氨基酸,例如D-氨基酸,以及修饰,例如糖基化或PEG化。此外,其它人SUMO蛋白是已知的(人SUMO2蛋白的氨基酸序列在GenBank登录号:AAH71645.1中示出;人SUMO3蛋白的氨基酸序列在NCBI参考序列NP_008867.2中示出;人SUMO4蛋白的氨基酸序列在NCBI参考序列NP_001002255.1中示出;人SUMO5基因在GenBank登录号:FJ042790.1中示出,其蛋白质氨基酸序列在SEQ ID NO:6中示出),并且衍生自这些蛋白质的包含对应于SEQ ID NO:1(人SUMO1蛋白质氨基酸序列)的31-55区段的片段在结合α-突触核蛋白和抑制α-突触核蛋白聚集方面也预期具有相同或相似的活性。序列比对表明SUMO1、SUMO2、SUMO3、SUMO4、SUMO5共有类似的氨基酸序列。SUMO2、SUMO3和SUMO4具有类似的β1-链、β2-链和α-螺旋。对应于SUMO1(15-55)的片段是SUMO2(10-51)、SUMO3(10-50)、SUMO4(10-51)和SUMO5(15-55)。对应于SUMO1(31-55)的片段是SUMO2(27-51)、SUMO3(26-50)、SUMO4(27-51)和SUMO5(31-55)。对应于SUMO2(16-88)的片段是SUMO3(15-87)、SUMO1(20-92)、SUMO4(16-88)和SUMO5(20-92)。对应于SUMO2(16-51)的片段是SUMO3(15-50)、SUMO1(20-55)、SUMO4(16-51)和SUMO5(20-55)。
在本公开中,术语“神经变性疾病”或“神经变性病症”包括但不限于以下病况:中枢运动系统的疾病,包括影响基底神经节的变性病况(亨廷顿病、威尔逊病、纹状体黑质变性、皮质基底节变性)、图雷特综合征、帕金森病(PD,尤其是家族性PD)、进行性核上性麻痹、进行性延髓性麻痹、家族性痉挛性截瘫、脊髓性肌萎缩、肌萎缩性侧索硬化(ALS)及其变型、齿状核红核萎缩、橄榄体-脑桥小脑萎缩、副肿瘤性小脑变性和多巴胺毒性;影响感觉神经元的疾病,例如弗里德赖希共济失调、糖尿病、外周神经病和视网膜神经元变性;边缘和皮质系统的疾病,例如脑淀粉样变性、皮克氏萎缩和雷特氏综合征;涉及多种神经元系统和/或脑干的神经变性病状包括阿尔茨海默病、帕金森病、AIDS相关痴呆、莱氏症、弥漫性路易体病、癫痫、多系统萎缩、格林-巴利综合征、溶酶体贮积症如脂褐质沉着症、唐氏综合征的晚期变性阶段、Alper病、由于中枢神经系统(CNS)变性引起的眩晕、ALS、皮质基底节变性和进行性核上性麻痹;与发育迟缓和学习障碍相关的病状、唐氏综合征和氧化应激诱导的神经元死亡;由衰老和慢性酒精或药物滥用引起的病状,其包括,例如,(i)由酒精中毒、蓝斑、小脑、胆碱能基底前脑中神经元的退化引起的病状,(ii)由衰老、导致认知和运动损伤的小脑神经元和皮层神经元的退化引起的病状,和(iii)由慢性苯异丙胺滥用、导致运动损伤的基底神经节神经元变性引起的病状;由局灶性创伤引起的病理变化,例如中风、局灶性缺血、血管功能不全、缺氧缺血性脑病、高血糖症、低血糖症、闭合性头部创伤和直接创伤;作为治疗药物和治疗(例如,扣带回和内嗅皮质神经元响应于抗惊厥剂量的NMDA类谷氨酸受体拮抗剂的变性)的负面副作用而出现的病状。特别地,“神经变性疾病”或“神经变性病症”用于指其中存在路易体的神经疾病或病症,例如帕金森病、路易体痴呆(LBD,也称为路易体病症,其包括帕金森病痴呆(PDD)和路易体痴呆(DLB),两种类型的痴呆的特征在于α-突触核蛋白在脑中的异常沉积)和多系统萎缩(MSA),也称为Shy-Drager综合征。
在本公开中,术语“或”通常以其包括“和/或”的意义使用,除非内容另外清楚地规定。
在本公开中,术语“分离的”核酸分子是指从其它核酸分子分离的核酸分子,所述其它核酸分子通常与所述分离的核酸分子结合。因此,“分离的”核酸分子包括但不限于不含天然地位于分离的核酸(例如,通过PCR或限制性内切核酸酶消化产生的cDNA或基因组DNA片段)所来源的生物体的基因组中的核酸的一端或两端的核苷酸序列的核酸分子。为了便于操作或产生融合核酸分子,通常将这种分离的核酸分子引入载体(例如克隆载体或表达载体)中。此外,分离的核酸分子可以包括工程化的核酸分子,例如重组的或合成的核酸分子。存在于例如核酸文库(例如,cDNA或基因组文库)或含有限制性消化的基因组DNA的凝胶(例如,琼脂糖或聚丙烯胺)中的数百至数百万个其它核酸分子中的核酸分子不是“分离的”核酸。
术语“核酸”或“多核苷酸”是指单链或双链形式的脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)及其聚合物。除非特别限定,否则该术语涵盖含有天然核苷酸的已知类似物的核酸,所述天然核苷酸的已知类似物具有与参考核酸相似的结合特性,并且以与天然存在的核苷酸相似的方式被代谢。除非另有说明,否则特定的核酸序列也隐含地涵盖其保守修饰的变体(例如简并密码子取代)、等位基因、直系同源物、SNP和互补序列以及明确指出的序列。具体而言,简并密码子取代可以通过产生其中一个或多个选择的(或所有的)密码子的第三位被混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代的序列来实现(Batzer等人,Nucleic Acid Res.19:5081(1991);Ohtsuka等人,J.Biol.Chem.260:2605-2608(1985);和Rossolini等人,Mol.Cell.Probes 8:91-98(1994))。术语核酸与基因、cDNA和基因编码的mRNA可互换使用。
术语“基因”是指参与产生多肽链的DNA区段。它可以包括在编码区之前和之后的区域(前导和尾随)以及在各个编码区(外显子)之间的插入序列(内含子)。
术语“氨基酸”是指天然存在的和合成的氨基酸,以及氨基酸类似物和氨基酸模拟物,其以类似于天然存在的氨基酸的方式起作用。天然存在的氨基酸是由遗传代码编码的那些氨基酸,以及随后被修饰的那些氨基酸,例如羟脯氨酸、γ-羧基谷氨酸和O-磷酸丝氨酸。氨基酸类似物是指具有与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构,即,与氢、羧基、氨基和R基团结合的α碳的化合物,例如,高丝氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亚砜、甲硫氨酸甲基锍。此类类似物具有经修饰的R基团(例如正亮氨酸)或经修饰的肽主链,但保留与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构。“氨基酸模拟物”是指具有与氨基酸的一般化学结构不同的结构,但以类似于天然存在的氨基酸的方式起作用的化合物。例如,D-氨基酸和L-氨基酸都在本公开的“氨基酸”的范围内。
本领域中有各种已知的方法允许以位点特异性方式将非天然氨基酸衍生物或类似物掺入多肽链,参见例如WO02/086075。
氨基酸在本文中可以通过通常已知的三字母符号或IUPAC-IUB生化命名委员会推荐的单字母符号来提及。同样,核苷酸可以用它们通常接受的单字母代码来提及。
“保守修饰的变体”适用于氨基酸和核酸序列。关于特定的核酸序列,“保守修饰的变体”是指编码相同或基本相同的氨基酸序列的那些核酸,或如果核酸不编码氨基酸序列,是指基本相同的序列。由于遗传代码的简并性,大量功能上相同的核酸编码任何给定的蛋白质。例如,密码子GCA、GCC、GCG和GCU都编码氨基酸丙氨酸。因此,在密码子指定丙氨酸的每个位置,密码子可以被改变为所描述的任何相应密码子,而不改变所编码的多肽。这种核酸变异是“沉默变异”,它们是保守修饰变异的一种。本文编码多肽的每条核酸序列也描述了核酸的每种可能的沉默变异。本领域技术人员将认识到,核酸中的每个密码子(除AUG和TGG外,AUG通常是甲硫氨酸的唯一密码子,TGG通常是色氨酸的唯一密码子)可以被修饰以产生功能上相同的分子。因此,编码多肽的核酸的每种沉默变异隐含在每条所述的序列中。
关于氨基酸序列,本领域技术人员将认识到对核酸、肽、多肽或蛋白质序列的单独取代,缺失或添加(其改变,添加或缺失所编码的序列中的单个氨基酸或小百分比的氨基酸),如果该改变导致氨基酸被化学上相似的氨基酸取代,则其是“保守修饰的变体”。提供功能上相似的氨基酸的保守取代表在本领域是众所周知的。这种保守修饰的变体是本发明的多态性变体,种间同系物和等位基因的补充并且不排除它们。
以下八组各自含有彼此为保守取代的氨基酸:
1)丙氨酸(A),甘氨酸(G);
2)天冬氨酸(D),谷氨酸(E);
3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q);
4)精氨酸(R),赖氨酸(K);
5)异亮氨酸(I),亮氨酸(L),甲硫氨酸(M),缬氨酸(V);
6)苯丙氨酸(F),酪氨酸(Y),色氨酸(W);
7)丝氨酸,苏氨酸(T);和
8)半胱氨酸(C),甲硫氨酸(M)
(参见,例如,Creighton,Proteins,W.H.Freeman和Co.,N.Y.(1984))。
氨基酸在本文中可以通过通常已知的三字母符号或IUPAC-IUB生化命名委员会推荐的单字母符号来提及。同样,核苷酸可以用它们通常接受的单字母代码来提及。
在本申请中,氨基酸残基根据它们在未修饰的野生型多肽序列中距离最左边的残基(编号为1)的相对位置进行编号。
“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用,是指氨基酸残基的聚合物。所有三个术语适用于其中一个或多个氨基酸残基是相应的天然存在的氨基酸的人工化学模拟物的氨基酸聚合物,以及适用于天然存在的氨基酸聚合物和非天然存在的氨基酸聚合物。本文所用的术语涵盖任何长度的氨基酸链,包括全长蛋白质,其中氨基酸残基通过共价肽键连接。
当与例如细胞或核酸,蛋白质或载体一起使用时,术语“重组的”表示该细胞,核酸,蛋白质或载体已经通过引入异源核酸或蛋白质或改变天然核酸或蛋白质而被修饰,或者该细胞来源于如此修饰的细胞。因此,例如,重组细胞表达在细胞的天然(非重组)形式中未发现的基因,或表达在其它方面异常表达,低表达或根本不表达的天然基因。
“启动子”定义为指导多核苷酸序列转录的核酸控制序列的阵列。如本文所用,启动子包括转录起始位点附近的必需多核苷酸序列,例如,在聚合酶II型启动子的情况下,包括TATA元件。启动子还任选地包括远端增强子或阻抑物元件,其可以位于距转录起始位点多达几千个碱基对的位置。“组成型”启动子是在大多数环境和发育条件下具有活性的启动子。“诱导型”启动子是在环境或发育调节下具有活性的启动子。术语“可操作地连接”是指多核苷酸表达控制序列(如启动子,或转录因子结合位点的阵列)和第二多核苷酸序列之间的功能连接,其中表达控制序列指导对应于第二序列的多核苷酸序列的转录。
“表达盒”是重组或合成产生的核酸构建体,其具有允许在宿主细胞中转录特定多核苷酸序列的一系列指定的多核苷酸元件。表达盒可以是质粒,病毒基因组或核酸片段的一部分。通常,表达盒包括与启动子可操作地连接的待转录的多核苷酸。
在描述两个元件的相对位置的上下文中使用的术语“异源的”是指两个元件,例如多核苷酸序列(例如,启动子或蛋白质/多肽编码序列)或多肽序列(例如,在融合蛋白内作为融合伴侣的两条肽),它们没有被天然地发现存在于相同的相对位置中。因此,基因的“异源启动子”是指与该基因不是天然可操作地连接的启动子。类似地,特定蛋白或其编码序列的“异源多肽”或“异源多核苷酸”来源于与该特定蛋白不同的来源,或者如果来源于相同的来源,则不是以相同的方式天然连接于该特定蛋白或其编码序列。一种多肽(或其编码序列)与异源多肽(或多核苷酸序列)的融合不会产生可以在自然界中发现的更长的多肽或多核苷酸序列。SUMO衍生的肽(例如,SEQ ID NO:1的15-55或31-55区段)的“异源”融合伴侣是非SUMO来源的另一种肽,例如,用于容易纯化的聚-His标签(例如,包含6、8或10个或更多个His的标签)或用于细胞内易位的聚-Arg标签(例如,包含6、8、10个或更多个Arg的标签)。
“标记”、“可检测标记”或“可检测部分”是通过放射学、光谱学、光化学、生物化学、免疫化学、化学或其它物理手段可检测的组合物。例如,有用的标记包括放射性同位素例如32P、荧光染料、电子致密试剂、酶(例如通常用于ELISA)、生物素、洋地黄毒苷或半抗原和蛋白质,其例如通过将放射性组分掺入多肽中而可被检测或用于检测与多肽特异性反应的抗体。通常,可检测标记是连接于具有确定的结合特性(例如,具有已知的结合特异性的多肽或多核苷酸)的探针或分子(例如,蛋白质或核酸)的异源部分,从而使得探针/分子(以及因此其结合的靶标)的存在易于检测。标记物的异源性质确保其具有与其标记的探针或分子不同的来源,使得与可检测标记连接的探针/分子不构成天然存在的组合物(例如天然存在的多核苷酸或多肽序列)。
“宿主细胞”是指含有表达载体并支持表达载体复制或表达的细胞。宿主细胞可以是原核细胞如大肠杆菌,或真核细胞如酵母,昆虫,两栖动物,或哺乳动物细胞如CHO,HeLa等,例如培养的细胞,外植体和体内细胞。
本文所用的术语“抑制(inhibiting)”或“抑制(inhibition)”是指对靶生物过程,例如蛋白质磷酸化、细胞信号转导、蛋白质合成、细胞增殖、肿瘤发生和转移潜能等的任何可检测的负面影响。通常,当与对照相比时,抑制反映为靶过程(例如,α-突触核蛋白聚集或α-突触核蛋白介导的细胞毒性)或所提及的下游参数的任一个(例如,由于α-突触核蛋白毒性引起的神经元细胞死亡)中至少10%、20%、30%、40%或50%的降低。以类似的方式,术语“增加(increasing)”或“增加(increase)”用于描述对靶生物过程的任何可检测的正向影响,例如,神经元细胞针对α-突触核蛋白细胞毒性的神经保护作用,例如当与对照相比时,至少25%、50%、75%、100%或高至2、3、4、5倍或高达10或20倍的正向变化。
本文所用的术语“有效量”是指足以产生施用物质的预期效果的量。该效果可以包括生物过程中的期望变化(例如,降低的α-突触核蛋白聚集或α-突触核蛋白细胞毒性)以及预防、校正或抑制疾病/病况和相关并发症的症状进展至任何可检测的程度。实现所需效果“有效”的确切量将取决于治疗剂的性质、施用方式和治疗目的,并且将由本领域技术人员使用已知技术来确定(参见,例如,Lieberman,Pharmaceutical Dosage Forms(vols.1-3,1992);Lloyd,The Art,Science and Technology of Pharmaceutical Compounding(1999);以及Pickar,Dosage Calculations(1999))。
术语“约”表示预定数值的+/-10%的范围。例如,“约10”设定为10的90%至110%的范围,即9至11。
发明的详细描述
I.引言
蛋白质α-突触核蛋白的错误折叠和聚集导致脑中淀粉样原纤维的形成,以及进而导致突触核蛋白病(synucleinopathies),其包括第二最常见的神经变性疾病-帕金森病(PD)。先前的研究已经表明,α-突触核蛋白的SUMO化天然地发生在脑中,并且这种SUMO化的α-突触核蛋白可以抑制α-突触核蛋白聚集。该研究报道了小泛素样修饰物1(SUMO1)蛋白的变体可以直接体外抑制α-突触核蛋白聚集,其效率似乎与SUMO化的α-突触核蛋白报道的效率相当。
在系统地制备并测试一系列SUMO1变体之后,本发明人开发了一种肽作为体内研究的潜在治疗先导物。该肽基于含有两个β折叠和α-螺旋的SUMO 1的核心区域(残基15-55),或基于甚至更短的,进一步截短的SUMO区段的核心区域(残基31-55),所述截短的SUMO区段由β折叠和之后的α-螺旋组成,两个核心区域都含有参与SUMO-SUMO相互作用基序(SIM)相互作用的结合残基。SUMO1(15-55)和(31-55)肽在体外研究中相对于SUMO1本身表现出改善的抑制活性。此外,SUMO1(15-55)肽降低了细胞毒性并阻断SH-SY5Y细胞之间的聚集的α-突触核蛋白传递。SUMO1(15-55)肽的幼虫喂养通过抑制多巴胺能神经元的损失而显著改善果蝇PD模型中的疾病症状。为了阐明SUMO(15-55)与α-突触核蛋白结合的相互作用区域,使用交联研究和微尺度热泳来测试预测区域。数据表明SUMO(15-55)的结合位于α-突触核蛋白中的预测的SIM基序(残基37-41)附近,并且已知α-突触核蛋白中的疏水性节段(残基74-84)在α-突触核蛋白聚集的抑制中是重要的。这些发现表明SUMO1在抑制α-突触核蛋白聚集中具有直接作用,并为开发PD和/或其它突触核蛋白病的新治疗提供了途径。
因此,本文公开的研究提供了SUMO衍生的肽,其包含取自SUMO蛋白的核心序列(因此少于SUMO蛋白的全长),任选地在一个或多个氨基酸残基处被修饰(例如,缺失、插入或取代),但还保留两个β折叠中的至少一个以及α-螺旋结构,使得SUMO衍生的肽保留结合α-突触核蛋白的能力,例如,经由α-突触核蛋白的SIM。这种结合能力通过本领域已知的体外结合测定或交联测定或本文描述的使用包含α-突触核蛋白的至少一个片段(包括SIM)的多肽可容易地验证。
II.多肽的重组表达
A.一般重组技术
公开了重组遗传学领域中的一般方法和技术的基础教科书包括Sambrook和Russell,Molecular Cloning,A Laboratory Manual(第3版,2001);Kriegler,GeneTransfer and Expression:A Laboratory Manual(1990);和Ausubel等人编辑,CurrentProtocols in Molecular Biology(1994)。
对于核酸,尺寸以千碱基(kb)或碱基对(bp)给出。这些由琼脂糖或丙烯酰胺凝胶电泳、测序的核酸或公开的DNA序列估计。对于蛋白质,尺寸以千道尔顿(kDa)或氨基酸残基数给出。蛋白质尺寸由凝胶电泳、测序的蛋白质、衍生的氨基酸序列或公开的蛋白质序列估计。
不可商购的寡核苷酸可以化学合成,例如,根据Beaucage&Caruthers,Tetrahedron Lett.22:1859-1862(1981)最先描述的固相亚磷酰胺三酯方法,使用自动合成仪合成,如Van Devanter等人,Nucleic Acids Res.12:6159-6168(1984)中所述。寡核苷酸的纯化使用任何本领域已知的策略进行,例如天然丙烯酰胺凝胶电泳或阴离子交换HPLC,如Pearson&Reanier,J.Chrom.255:137-149(1983)中所述。
编码目的多肽(例如SUMO衍生的多肽)的多核苷酸序列和合成的寡核苷酸可以在克隆或亚克隆后,使用例如Wallace等人,Gene 16:21-26(1981)的用于测序双链模板的链终止方法来验证。
B.编码序列的克隆和亚克隆
编码人SUMO1的多核苷酸序列被称为GenBank登录号:NG_011679.1并在SEQ IDNO:2中示出。相应的氨基酸序列被称为GenBank登录号:AAC50996.1并在SEQ ID NO:1中示出。这些多核苷酸序列可以从商业供应商获得或通过扩增方法如聚合酶链式反应(PCR)获得。
人类基因组研究的快速进展使得克隆方法成为可能,其中可以搜索人类DNA序列数据库以寻找与已知核苷酸序列具有一定百分比序列同源性的任何基因区段。随后可以通过化学合成和/或PCR技术如重叠延伸方法获得如此鉴定的任何DNA序列。对于短序列,完全从头合成可能是足够的;然而使用合成探针从人cDNA或基因组文库中进一步分离全长编码序列对于获得更大的基因可能是必要的。
可选地,可以使用标准克隆技术如PCR从cDNA或基因组DNA文库中分离编码SUMO多肽的多核苷酸序列,其中基于同源性的引物通常可以衍生自编码SUMO多肽的已知核酸序列。这种方法特别适用于鉴定任何特定SUMO蛋白的变体,直系同源物或同系物。用于该目的的最常用的技术在标准教科书中描述,例如Sambrook和Russell,同上。
适于获得人SUMO,尤其是SUMO1多肽的编码序列的cDNA文库可以是市售的或可以构建。分离mRNA,通过逆转录制备cDNA,将cDNA连接到重组载体中,转染到重组宿主中进行增殖,筛查和克隆的一般方法是众所周知的(参见,例如,Gubler和Hoffman,Gene,25:263-269(1983);Ausubel等人,同上)。当通过PCR获得核苷酸序列的扩增区段时,该区段可进一步用作探针以从cDNA文库中分离编码目的基因(例如人SUMO1)的全长多核苷酸序列。适当程序的一般描述可参见Sambrook和Russell,同上。可以按照类似的程序从人基因组文库获得编码人SUMO1的序列,所述人基因组文库可以是市售的或可以根据本领域已知的各种方法构建。基于序列同源性,可以将简并寡核苷酸设计为引物组,并且可以在合适的条件下进行PCR(参见,例如,White等人,PCR Protocols:Current Methods and Applications,1993;Griffin和Griffin,PCR Technology,CRC Press Inc.1994)以从cDNA或基因组文库扩增核苷酸序列的区段。
在获得编码人SUMO1序列的多核苷酸序列后,可以修饰该序列,然后亚克隆到载体,例如表达载体中,从而可以从所得构建体中产生重组多肽(例如,SUMO衍生的多肽)。随后可以对编码序列进行进一步的修饰,例如核苷酸取代,以改变多肽的特征。
C.多核苷酸编码序列的修饰
SUMO蛋白或片段的氨基酸序列可经修饰以实现抑制α-突触核蛋白聚集的所需功能性,如通过本领域已知的以及本文所述的体外或体内方法测定的,例如,硫黄素T(ThT)测定、成神经细胞瘤细胞中的α-突触核蛋白细胞毒性测定、或α-突触核蛋白转基因果蝇中的神经保护测定。对氨基酸序列的可能的修饰可以包括保守取代;在N-末端和C-末端的一个或两个上缺失或添加一个或多个氨基酸残基(例如,在多肽的一个末端添加标签序列如10xHis以促进纯化或鉴定)。
本领域建立和描述了多种突变产生方案,并且可以容易地用于修饰编码SUMO衍生的多肽的多核苷酸序列。参见例如Zhang等人Proc.Natl.Acad.Sci.USA,94:4504-4509(1997);和Stemmer,Nature,370:389-391(1994)。该程序可单独或组合使用以产生一组核酸的变体,并因此产生编码多肽的变体。用于诱变,文库构建和其它多样性产生方法的试剂盒是可商购的。
产生多样性的突变方法包括,例如,定点诱变(Botstein和Shortle,Science,229:1193-1201(1985))、使用含尿嘧啶模板的诱变(Kunkel,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,82:488-492(1985))、寡核苷酸定向诱变(Zoller和Smith,Nucl.Acids Res.,10:6487-6500(1982))、硫代磷酸酯修饰的DNA诱变(Taylor等人,Nucl.Acids Res.,13:8749-8764and8765-8787(1985))、以及使用缺口双链体DNA的诱变(Kramer等人,Nucl.Acids Res.,12:9441-9456(1984))。
用于产生突变的其它可能的方法包括点错配修复(Kramer等人,Cell,38:879-887(1984))、使用修复缺陷型宿主菌株进行的诱变(Carter等人,Nucl.Acids Res.,13:4431-4443(1985))、缺失诱变(Eghtedarzadeh和Henikoff,Nucl.Acids Res.,14:5115(1986))、限制性选择和限制性纯化(Wells等人,Phil.Trans.R.Soc.Lond.A,317:415-423(1986))、通过总基因合成进行的诱变(Nambiar等人,Science,223:1299-1301(1984))、双链断裂修复(Mandecki,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,83:7177-7181(1986))、通过多核苷酸链终止方法进行的诱变(美国专利号5,965,408)和易出错PCR(Leung等人,Biotechniques,1:11-15(1989))。
D.用于在宿主生物体中的优选密码子使用的核酸修饰
可以进一步改变编码SUMO衍生的多肽的多核苷酸序列,以与特定宿主的优选密码子使用相一致。例如,一个菌株的细菌细胞的优选密码子使用可用于获得编码SUMO衍生的多肽的多核苷酸,其包括该菌株所偏好的密码子。宿主细胞展示的优选密码子使用频率可以通过在宿主细胞表达的大量基因中优选密码子使用的平均频率来计算(例如,计算服务可以从日本Kazusa DNA研究所的网站获得)。该分析优选限于宿主细胞高度表达的基因。
在修饰完成时,通过测序验证编码序列,然后亚克隆到适当的表达载体中,用于重组产生SUMO衍生的多肽。
E.多肽的化学合成
已经建立了人SUMO1蛋白的氨基酸序列(例如GenBank登录号:AAC50996.1和SEQID NO:1)。已知序列的多肽,尤其是长度相对较短的多肽,如SEQ ID NO:1中所示的人SUMO氨基酸序列的15-55区段,可以通过固相肽合成方法,使用与以下所描述的那些类似的程序来合成:Merrifield等人,J.Am.Chem.Soc.,85:2149-2156(1963);Barany和Merrifield,Solid-Phase Peptide Synthesis,in The Peptides:Analysis,Synthesis,BiologyGross and Meienhofer(编辑),Academic Press,N.Y.,vol.2,pp.3-284(1980);以及Stewart等人,Solid Phase Peptide Synthesis第二版,Pierce Chem.Co.,Rockford,Ill.(1984)。在合成过程中,将具有受保护侧链的N-α-保护的氨基酸逐步加入到通过其C-末端连接到固体支持物(即聚苯乙烯珠)的生长的多肽链中。肽是通过将N-α-脱保护的氨基酸的氨基与N-α-保护的氨基酸的α-羧基连接而合成的,所述N-α-保护的氨基酸的α-羧基已通过使其与试剂如二环己基碳二亚胺反应而活化。游离氨基与活化羧基的连接导致肽键的形成。最常用的N-α-保护基团包括酸不稳定的Boc和碱不稳定的Fmoc。
适合用作固体支持物的材料是本领域技术人员熟知的,并且包括但不限于以下:卤代甲基树脂,例如氯代甲基树脂或溴代甲基树脂;羟甲基树脂;酚树脂,例如4-(α-[2,4-二甲氧基苯基]-Fmoc-氨基甲基)苯氧基树脂;叔烷氧羰基酰肼化(hydrazidated)树脂等。这种树脂是可商购的并且它们的制备方法是本领域技术人员已知的。
简言之,首先将C-末端N-α-保护的氨基酸连接到固体支持物上。然后去除N-α-保护基团。脱保护的α-氨基与下一个N-α-保护的氨基酸的活化的α-羧酸酯基团偶联。重复该过程直到合成所需的肽。然后将所得的肽从不溶性聚合物支持物上切割下来,并使得氨基酸侧链脱保护。较长的肽可以通过被保护的肽片段的缩合而得到。合适的化学成分,树脂,保护基团,被保护的氨基酸和试剂的细节在本领域中是众所周知的,因此在本文中不详细讨论(参见,Atherton等人,Solid Phase Peptide Synthesis:A Practical Approach,IRLPress(1989),和Bodanszky,Peptide Chemistry,A Practical Textbook,第2版,Springer-Verlag(1993))。
III.重组多肽的表达和纯化
在验证编码序列之后,可以使用重组遗传学领域中的常规技术,依赖于编码本文公开的多肽的多核苷酸序列来产生目的多肽(例如,SUMO衍生的多肽)。
A.表达系统
为了获得编码目的多肽的核酸的高水平表达,通常将多核苷酸编码序列亚克隆到表达载体中,所述表达载体含有用于指导转录的强启动子,转录/翻译终止子和用于翻译起始的核糖体结合位点。合适的细菌启动子是本领域熟知的,并描述于例如Sambrook和Russell,同上,以及Ausubel等人,同上。用于表达重组多肽的细菌表达系统可在例如大肠杆菌(E.coli)、芽孢杆菌(Bacillus sp.)、沙门氏菌(Salmonella)和柄杆菌(Caulobacter)中获得。用于这种表达系统的试剂盒是可商购的。哺乳动物细胞,酵母和昆虫细胞的真核表达系统在本领域中是众所周知的,并且也是可商购的。在一个实施方案中,真核表达载体是腺病毒载体,腺伴随载体或逆转录病毒载体。
用于指导异源核酸表达的启动子取决于具体的应用。启动子任选地位于距异源转录起始位点的距离与它在其天然环境中距转录起始位点的距离大致相同。然而,如本领域已知的,可以容纳该距离的一些变化而不损失启动子功能。
除了启动子之外,表达载体通常还包括转录单位或表达盒,其含有在宿主细胞中表达所需多肽所需的所有附加元件。因此,典型的表达盒含有与编码多肽的核酸序列可操作地连接的启动子,以及转录物的有效聚腺苷酸化,核糖体结合位点和翻译终止所需的信号。编码所需多肽的核酸序列通常与可切割的信号肽序列连接,以促进转化细胞分泌重组多肽。这种信号肽尤其包括来自组织纤溶酶原激活物,胰岛素和神经元生长因子,以及烟芽夜蛾(Heliothis virescens)的保幼激素酯酶的信号肽。然而,如果重组多肽预期在宿主细胞表面上表达,则适当的锚定序列与编码序列一起使用。盒的其它元件可包括增强子,如果基因组DNA用作结构基因,则可包括具有功能性剪接供体和受体位点的内含子。
除了启动子序列之外,表达盒还应含有结构基因下游的转录终止区以提供有效的终止。终止区可以从与启动子序列相同的基因获得,或者可以从不同的基因获得。
用于将遗传信息转运到细胞中的具体表达载体不是特别关键的。可以使用用于在真核或原核细胞中表达的任何常规载体。标准细菌表达载体包括质粒如基于pBR322的质粒、pSKF、pET23d和融合表达系统如GST和LacZ。也可以将表位标签加入重组蛋白以提供方便的分离方法,例如c-myc。
含有来自真核病毒的调节元件的表达载体通常用于真核表达载体,例如SV40载体,乳头瘤病毒载体和衍生自爱泼斯坦-巴尔病毒的载体。其它示例性真核载体包括pMSG、pAV009/A+、pMTO10/A+、pMAMneo-5、杆状病毒pDSVE和任何其它载体,其允许在SV40早期启动子、SV40晚期启动子、金属硫蛋白启动子、鼠乳腺肿瘤病毒启动子、劳斯肉瘤病毒启动子、多角体蛋白启动子,或其它在真核细胞中有效表达的启动子的指导下表达蛋白质。
一些表达系统具有提供基因扩增的标志物,例如胸苷激酶,潮霉素B磷酸转移酶和二氢叶酸还原酶。或者,不涉及基因扩增的高产量表达系统也是合适的,例如昆虫细胞中的杆状病毒载体,其具有在多角体蛋白启动子或其它强杆状病毒启动子指导下编码所需多肽的多核苷酸序列。
通常包括在表达载体中的元件还包括在大肠杆菌中起作用的复制子,编码抗生素抗性以允许选择含有重组质粒的细菌的基因,以及在质粒的非必需区中的允许插入真核序列的独特限制位点。所选择的具体的抗生素抗性基因不是关键的,本领域已知的许多抗性基因中的任何一种都是合适的。任选地选择原核序列,使得如果需要的话,它们不干扰DNA在真核细胞中的复制。类似于抗生素抗性选择标志物,基于已知代谢途径的代谢选择标志物也可用作选择转化的宿主细胞的手段。
当需要重组多肽的周质表达时,表达载体还包含编码分泌信号的序列,例如大肠杆菌OppA(周质寡肽结合蛋白)分泌信号或其修饰形式,其直接连接于待表达蛋白的编码序列的5'。该信号序列引导在细胞质中产生的重组蛋白通过细胞膜进入周质空间。表达载体可以进一步包含信号肽酶1的编码序列,当重组蛋白进入周质空间时,其能够酶促切割信号序列。关于重组蛋白的周质产生的更详细的描述可以在例如Gray等人,Gene 39:247-254(1985),美国专利号6,160,089和6,436,674中找到。
如上所述,本领域技术人员将认识到,可以对蛋白质或其编码序列进行各种保守取代,同时仍然保留蛋白质的生物活性。此外,也可以对多核苷酸编码序列进行修饰,以适应特定表达宿主中优选的密码子使用,而不改变所得的氨基酸序列。
B.转染方法
使用标准转染方法产生表达大量重组多肽的细菌,哺乳动物,酵母,昆虫或植物细胞系,然后使用标准技术纯化这些重组多肽(参见,例如Colley等人,J.Biol.Chem.264:17619-17622(1989);Guide to Protein Purification,in Methods in Enzymology,vol.182(Deutscher编辑,1990))。真核和原核细胞的转化根据标准技术进行(参见,例如,Morrison,J.Bact.132:349-351(1977);Clark-Curtiss&Curtiss,Methods in Enzymology101:347-362(Wu等人编辑,1983))。
可以使用将外源核苷酸序列引入宿主细胞的任何熟知的程序。这些程序包括使用磷酸钙转染、聚凝胺、原生质体融合、电穿孔、脂质体、显微注射、血浆载体、病毒载体和用于将克隆的基因组DNA、cDNA、合成DNA或其它外源遗传材料引入宿主细胞的任何其它熟知的方法(参见,例如,Sambrook和Russell,同上)。仅需要所用的具体遗传工程程序能够成功地将至少一个基因引入能够表达重组多肽的宿主细胞。
C.重组产生的多肽的纯化
一旦重组多肽在转染的宿主细胞中的表达被证实,例如,通过免疫学测定,则以适当的规模培养宿主细胞用于纯化重组多肽的目的。
1.由细菌重组产生多肽的纯化
当所需多肽通过转化细菌大量重组产生时,通常在启动子诱导后,尽管表达可以是组成型的,但多肽可以形成不溶性聚集体。有几种适用于纯化蛋白质包涵体的方案。例如,聚集体蛋白(下文称为包涵体)的纯化通常涉及通过细菌细胞的破坏,例如通过在约100-150μg/ml溶菌酶和0.1%非离子去污剂Nonidet P40的缓冲液中孵育,来提取,分离和/或纯化包涵体。可以使用Polytron研磨机(Brinkman Instruments,Westbury,NY)研磨细胞悬浮液。或者,细胞可以在冰上超声处理。在Ausubel等人以及Sambrook和Russell(均同上)中描述了另一种裂解细菌的方法,这对于本领域技术人员来说是显而易见的。
通常将细胞悬浮液离心,并将含有包涵体的沉淀重悬于不溶解但洗涤包涵体的缓冲液中,例如20mM Tris-HCl(pH7.2),1mM EDTA,150mM NaCl和2%Triton-X 100(一种非离子去污剂)。可能需要重复洗涤步骤以去除尽可能多的细胞碎片。剩余的包涵体沉淀可以重悬于适当的缓冲液(例如,20mM磷酸钠,pH6.8,150mM NaCl)中。其它合适的缓冲液对本领域技术人员来说是显而易见的。
在洗涤步骤之后,通过添加既是强氢受体又是强氢供体的溶剂(或各自具有这些性质之一的溶剂的组合)来溶解包涵体。然后可以通过用相容的缓冲液稀释或透析使形成包涵体的蛋白质复性。合适的溶剂包括但不限于脲(约4M至约8M)、甲酰胺(至少约80%,基于体积/体积)和盐酸胍(约4M至约8M)。能够溶解形成聚集体的蛋白质的一些溶剂,例如SDS(十二烷基硫酸钠)和70%甲酸,可能不适合用于该程序,因为蛋白质不可逆变性的可能性,连同免疫原性和/或活性的缺乏。尽管盐酸胍和类似试剂是变性剂,但这种变性不是不可逆的,并且在去除(例如通过透析)或稀释变性剂时可以发生复性,从而允许目的免疫和/或生物活性蛋白的再形成。溶解后,可以通过标准分离技术将蛋白质与其它细菌蛋白质分离。关于从细菌包涵体纯化重组多肽的进一步描述,参见例如Patra等人,Protein Expressionand Purification 18:182-190(2000)。
可选地,可以从细菌周质中纯化重组多肽。当重组蛋白被输出到细菌的周质中时,除了本领域技术人员已知的其它方法(参见,例如,Ausubel等人,同上)之外,还可以通过冷的渗透压休克来分离细菌的周质级分。为了从周质中分离重组蛋白,将细菌细胞离心以形成沉淀。将沉淀重悬于含有20%蔗糖的缓冲液中。为了裂解细胞,将细菌离心,将沉淀重悬于冰冷的5mM MgSO4中,在冰浴中保持约10分钟。离心细胞悬浮液,倾析并保存上清液。存在于上清液中的重组蛋白可以通过本领域技术人员熟知的标准分离技术与宿主蛋白分离。
2.用于纯化的标准蛋白质分离技术
当重组多肽以可溶形式在宿主细胞中表达时,其纯化可以按照下述标准蛋白质纯化程序进行。该标准纯化程序也适于纯化从化学合成获得的多肽(例如,SUMO衍生的多肽)。
i.溶解度分级
通常作为初始步骤,并且如果蛋白质混合物是复杂的,则初始盐分级可以将许多不需要的宿主细胞蛋白质(或来自细胞培养基的蛋白质)与目的重组蛋白质分离。优选的盐是硫酸铵。硫酸铵通过有效降低蛋白质混合物中的水的量来沉淀蛋白质。然后蛋白质基于它们的溶解度沉淀。蛋白质越疏水,越有可能在较低的硫酸铵浓度下沉淀。典型的方案是向蛋白质溶液中加入饱和硫酸铵,以使所得硫酸铵浓度为20-30%。这将沉淀最疏水的蛋白质。弃去沉淀(除非目的蛋白质是疏水性的),并将硫酸铵加入到上清液中至已知沉淀目的蛋白质的浓度。然后将沉淀溶解在缓冲液中,必要时通过透析或渗滤去除过量的盐。依赖于蛋白质溶解度的其它方法,如冷乙醇沉淀,是本领域技术人员熟知的,并可用于分级复杂的蛋白质混合物。
ii.尺寸差异过滤
基于计算的分子量,可以使用超滤通过不同孔径的膜(例如,Amicon或Millipore膜)分离更大和更小尺寸的蛋白质。作为第一步,蛋白质混合物通过具有这样的孔径的膜超滤,其具有比目的蛋白(例如,SUMO衍生的多肽)的分子量更低的分子量截留值。然后将超滤的渗余物针对分子截留值大于目的蛋白分子量的膜超滤。重组蛋白将通过膜进入滤液。然后可如下所述对滤液进行层析分离。
iii.柱层析
目的蛋白(如SUMO衍生的多肽)也可以根据它们的尺寸,净表面电荷,疏水性或对配体的亲和力从其它蛋白质中分离出来。此外,针对SUMO蛋白或其区段产生的抗体可以被缀合到柱基质上,并对相应的多肽进行免疫纯化。所有这些方法都是本领域公知的。
对于本领域技术人员显而易见的是,层析技术可以以任何规模和使用来自多个不同制造商(例如Pharmacia Biotech)的设备进行。
IV.药物组合物和施用
本发明还提供了包含有效量的SUMO衍生的多肽的药物组合物,其用于抑制α-突触核蛋白聚集,因此可用于针对涉及α-突触核蛋白聚集和/或淀粉样原纤维形成的各种神经变性疾病和病症设计的预防性和治疗性应用。本发明的药物组合物适用于多种药物递送系统。用于本发明的合适制剂可见于Remington's Pharmaceutical Sciences,MackPublishing Company,Philadelphia,PA,第17版(1985)。关于药物递送方法的简要综述,参见Langer,Science 249:1527-1533(1990)。
本发明的药物组合物可以通过各种途径施用,例如口服、皮下、透皮、经鼻、肌内、静脉内或腹膜内。施用药物组合物的途径包括以日剂量为对于70kg成人,约0.01-5000mg,优选5-500mg SUMO衍生的多肽/天向患有神经变性疾病的受试者全身或局部递送。合适的剂量可以以单一日剂量或以合适的间隔提供的分开的剂量(例如以每天两次,三次,四次或更多次的亚剂量)施用。
为了制备含有SUMO衍生的多肽的药物组合物,使用惰性和药学上可接受的载体。药物载体可以是固体或液体。固体形式制剂包括,例如,粉末剂、片剂、可分散颗粒剂、胶囊剂、扁囊剂和栓剂。固体载体可以是一种或多种还可以充当稀释剂、调味剂、增溶剂、润滑剂、助悬剂、粘合剂或片剂崩解剂的物质;它也可以是封装材料。
在粉末剂中,载体通常是精细分散的固体,其与精细分散的活性组分(例如,SUMO衍生的多肽)一起存在于混合物中。在片剂中,将活性成分(SUMO衍生的多肽)与具有必要粘合特性的载体以合适的比例混合,并压制成所需的形状和尺寸。
为了制备栓剂形式的药物组合物,首先将低熔点蜡如脂肪酸甘油酯和可可脂的混合物熔化,并通过例如搅拌将活性成分分散在其中。然后将熔化的均质混合物倒入合适尺寸的模具中并使其冷却和固化。
粉末剂和片剂优选含有约5%至约70%重量比的活性成分。合适的载体包括,例如,碳酸镁、硬脂酸镁、滑石粉、乳糖、糖、果胶、葡聚糖、淀粉、黄蓍胶、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、低熔点蜡、可可脂等。
药物组合物可以包括SUMO衍生的多肽的活性化合物与作为载体的封装材料的制剂,所述封装材料提供其中多肽(具有或不具有其它载体)被载体包围的胶囊,使得载体因此与化合物结合。以类似的方式,也可以包括扁囊剂。片剂、粉末剂、扁囊剂和胶囊剂可用作适于口服施用的固体剂型。
液体药物组合物包括,例如,适于口服或肠胃外施用的溶液,悬浮液和适于口服施用的乳液。活性组分(例如,SUMO衍生的多肽)的无菌水溶液或活性组分在包括水,缓冲水,盐水,PBS,乙醇或丙二醇的溶剂中的无菌溶液是适于肠胃外施用的液体组合物的实例。组合物可以根据需要含有接近生理条件的药学上可接受的辅助物质,例如pH调节剂和缓冲剂,张力调节剂,润湿剂,去污剂等。
无菌溶液可以通过以下来制备:将活性组分(例如,SUMO衍生的多肽)溶解在期望的溶剂系统中,然后使所得溶液通过膜过滤器以将其灭菌,或者可选地,通过在无菌条件下将无菌化合物溶解在先前灭菌的溶剂中。可以将所得水溶液包装以原样使用,或冻干,在施用前将冻干制剂与无菌水性载体组合。制剂的pH通常为3-11,更优选5-9,最优选7-8。
含有SUMO衍生的多肽的药物组合物可以被施用用于预防性和/或治疗性治疗。在治疗性应用中,将组合物以足以预防,治愈,逆转或至少部分减缓或阻止病况及其并发症的症状的量施用于已经患有神经变性疾病的患者。足以实现此目的的量定义为“治疗有效剂量”。对于这种应用有效的量将取决于疾病或病况的严重程度以及患者的体重和一般状态,但对于70kg患者而言,通常为每天约0.1mg至约2,000mg的多肽,更常用的剂量为对于70kg患者每天约5mg至约500mg的多肽。
在预防性应用中,将含有SUMO衍生的多肽的药物组合物以足以延缓或预防症状发作的量施用于神经变性疾病或病症易患患者或者处于发展神经变性疾病或病症的风险中的患者。这样的量定义为“预防有效剂量”。在该应用中,多肽的精确量再次取决于患者的健康状态和体重,但对于70kg患者而言,通常为每天约0.1mg至约2,000mg的多肽,更通常为对于70kg患者每天约5mg至约500mg。
组合物的单次或多次施用可以由治疗医师选择的剂量水平和模式来进行。在任何事件中,药物制剂应提供足以有效抑制患者中α-突触核蛋白聚集和/或淀粉样原纤维形成的量的化合物,无论是治疗性的还是预防性的。
V.使用核酸的治疗性应用
涉及α-突触核蛋白聚集和/或淀粉样原纤维形成的多种神经变性疾病可以通过治疗性方法治疗,所述治疗性方法包括将编码SUMO衍生的多肽的核酸引入细胞中,使得多肽的表达导致神经元细胞中α-突触核蛋白聚集和淀粉样原纤维形成的减少或消除。通过这种方法进行治疗的那些包括广谱的病况,例如阿尔茨海默病和帕金森病。关于将基因疗法应用于遗传疾病以及获得性疾病的治疗的讨论,参见Miller Nature 357:455-460(1992);和Mulligan Science 260:926-932(1993)。
A.用于核酸递送的载体
为了递送至细胞或生物体,可以将本发明的核酸掺入到载体中。用于这种目的的载体的实例包括能够指导SUMO衍生的多肽在靶细胞中表达的表达质粒。在其它情况下,载体是病毒载体系统,其中多核苷酸编码序列整合到能够转染靶细胞的病毒基因组中。在一个优选的实施方案中,编码序列可以可操作地连接到表达和控制序列上,所述表达和控制序列可以指导序列在所需靶宿主细胞中的转录。因此,可以在靶细胞(例如神经元细胞)中的适当条件下实现α-突触核蛋白聚集的减少或消除。
B.基因递送系统
如本文所用,“基因递送系统”是指将本发明的核酸递送至靶细胞的任何方式。用于引入和表达SUMO衍生的多肽的病毒载体系统包括,例如,天然存在的或重组的病毒载体系统。根据具体应用,合适的病毒载体包括有复制能力的,复制缺陷的和条件复制的病毒载体。例如,病毒载体可以来源于人或牛腺病毒、痘苗病毒、疱疹病毒、腺伴随病毒、小鼠微小病毒(MVM)、HIV、辛德毕斯病毒和逆转录病毒(包括但不限于劳斯肉瘤病毒)以及MoMLV的基因组。通常,将SUMO衍生的多肽的编码序列插入到这样的载体中,以允许包装基因构建体,通常伴随病毒DNA,随后感染敏感的宿主细胞并表达多肽。
类似地,用于包装包括SUMO衍生的多肽的编码序列的基因构建体的病毒包膜可以通过添加受体配体或对受体特异的抗体来修饰,以允许受体介导的向特定细胞的内吞作用(参见,例如,WO93/20221、WO93/14188和WO94/06923)。
逆转录病毒载体也可用于将本发明的SUMO衍生的多肽引入靶细胞或生物体。逆转录病毒载体是通过遗传操作逆转录病毒产生的。逆转录病毒的病毒基因组是RNA。感染后,这种基因组RNA被逆转录成DNA拷贝,该拷贝以高度的稳定性和效率整合到转导细胞的染色体DNA中。整合的DNA拷贝被称为前病毒,并如任何其它基因那样被子细胞遗传。野生型逆转录病毒基因组和前病毒DNA具有三个基因:gag、pol和env基因,它们的侧翼是两个长末端重复(LTR)序列。gag基因编码内部结构(核衣壳)蛋白;pol基因编码RNA指导的DNA聚合酶(逆转录酶);env基因编码病毒包膜糖蛋白。5'和3'LTR用于促进病毒体RNA的转录和聚腺苷酸化。与5'LTR相邻的是基因组逆转录(tRNA引物结合位点)和病毒RNA有效封装到颗粒(Psi位点)中所必需的序列(参见Mulligan,In:Experimental Manipulation of GeneExpression,Inouye(编辑),155-173(1983);Mann等人,Cell 33:153-159(1983);Cone和Mulligan,Proceedings of the National Academy of Sciences,U.S.A.,81:6349-6353(1984))。
逆转录病毒载体的设计为本领域技术人员所熟知。简言之,如果在病毒基因组中缺失衣壳化(或将逆转录病毒RNA包装成感染性病毒体)所必需的序列,结果是顺式作用缺陷,其阻止基因组RNA的衣壳化。然而,所得突变体仍然能够指导所有病毒体蛋白的合成。从其中缺失这些序列的逆转录病毒基因组,以及含有稳定整合到染色体中的突变基因组的细胞系在本领域是众所周知的,并用于构建逆转录病毒载体。逆转录病毒载体的制备及其用途描述于许多出版物中,包括例如欧洲专利申请EPA 0 178 220;美国专利4,405,712,Gilboa Biotechniques 4:504-512(1986);Mann等人,Cell 33:153-159(1983);Cone和Mulligan Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:6349-6353(1984);Eglitis等人,Biotechniques6:608-614(1988);Miller等人,Biotechniques 7:981-990(1989);Miller(1992),同上;Mulligan(1993),同上;以及WO 92/07943。
逆转录病毒载体颗粒是通过将所需的编码序列重组插入逆转录病毒载体,并使用包装细胞系将载体与逆转录病毒衣壳蛋白包装在一起而制备的。所得的逆转录病毒载体颗粒在宿主细胞中不能复制,但能够作为含有所需核苷酸序列的前病毒序列整合到宿主细胞基因组中。结果,患者能够产生例如SUMO1蛋白片段15-55,从而减少或消除不需要的α-突触核蛋白聚集和淀粉样原纤维形成。
用于制备逆转录病毒载体颗粒的包装细胞系通常是重组哺乳动物组织培养细胞系,其产生包装所需的必需病毒结构蛋白,但不能产生感染性病毒体。另一方面,所用的缺陷逆转录病毒载体缺少这些结构基因,但编码包装所必需的剩余蛋白。为了制备包装细胞系,可以构建所需逆转录病毒的感染性克隆,其中包装位点已被缺失。包含这种构建体的细胞将表达所有结构病毒蛋白,但引入的DNA将不能包装。可选地,可以通过用一种或多种编码适当核心和包膜蛋白的表达质粒转化细胞系来产生包装细胞系。在这些细胞中,gag、pol和env基因可以来自相同或不同的逆转录病毒。
适用于本发明的许多包装细胞系也可在现有技术中获得。这些细胞系的实例包括Crip、GPE86、PA317和PG13(参见Miller等人,J.Virol.65:2220-2224(1991))。其它包装细胞系的实例描述于Cone和Mulligan Proceedings of the National Academy ofSciences,USA,81:6349-6353(1984);Danos和Mulligan Proceedings of the NationalAcademy of Sciences,USA,85:6460-6464(1988);Eglitis等人,(1988),同上;和Miller(1990),同上。
C.药物制剂
当用于药物目的时,编码SUMO衍生的多肽的核酸通常在合适的缓冲液中配制,其可以是任何药学上可接受的缓冲液,例如磷酸盐缓冲盐水或磷酸钠/硫酸钠、Tris缓冲液、甘氨酸缓冲液、无菌水和普通技术人员已知的其它缓冲液,例如Good等人,Biochemistry5:467(1966)描述的那些。
组合物可进一步包括稳定剂、增强剂和/或其它药学上可接受的载体或媒介物。药学上可接受的载体可以含有生理学上可接受的化合物,其例如起到稳定本发明的核酸和任何相关载体的作用。生理学上可接受的化合物可以包括,例如,碳水化合物,如葡萄糖,蔗糖或葡聚糖,抗氧化剂,如抗坏血酸或谷胱甘肽,螯合剂,低分子量蛋白质或其它稳定剂或赋形剂。其它生理学上可接受的化合物包括湿润剂、乳化剂、分散剂或防腐剂,它们对于防止微生物的生长或作用是特别有用的。各种防腐剂是众所周知的,包括例如苯酚和抗坏血酸。载体,稳定剂或佐剂的实例可见于Remington's Pharmaceutical Sciences,MackPublishing Company,Philadelphia,PA,第17版(1985)。
D.制剂的施用
含有编码SUMO衍生的多肽的核酸的制剂可以使用本领域技术人员已知的任何递送方法递送至任何组织或器官。在本发明的一些实施方案中,核酸被配制成粘膜,局部和/或口腔制剂,特别是粘膜粘附凝胶和局部凝胶制剂。用于透皮递送的示例性渗透增强组合物、聚合物基质和粘膜粘附凝胶制剂公开于美国专利号5,346,701中。
含有编码核酸的制剂通常施用于细胞。细胞,例如神经元细胞,可以作为组织的一部分或作为分离的细胞提供,例如在组织培养中。细胞可以在体内,离体或体外提供。
可以通过多种方法在体内或离体将制剂引入到目的组织中。在本发明的一些实施方案中,通过诸如显微注射、磷酸钙沉淀、脂质体融合、超声、电穿孔或基因枪的方法将编码核酸引入细胞中。在进一步的实施方案中,核酸被目的组织直接吸收。
在本发明的一些实施方案中,将编码核酸离体施用于从患者中取出的细胞或组织,然后将其返回患者。治疗基因构建体的离体施用的实例包括Nolta等人,ProcNatl.Acad.Sci.USA 93(6):2414-9(1996);Koc等人,Seminars in Oncology 23(1):46-65(1996);Raper等人,Annals of Surgery 223(2):116-26(1996);Dalesandro等人,J.Thorac.Cardi.Surg.,11(2):416-22(1996);以及Makarov等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93(1):402-6(1996)。
制剂的有效剂量将根据多种不同的因素而变化,包括施用方式、靶位点、患者的生理状态和施用的其它药物。因此,需要滴定治疗剂量以优化安全性和有效性。在确定待施用的载体的有效量时,医师应评价所用的特定核酸,诊断的疾病状态;患者的年龄,体重和总体状况,循环血浆水平,载体毒性,疾病的进展和抗载体抗体的产生。剂量的大小还将由伴随施用特定载体的任何不良副作用的存在、性质和程度来确定。为了实施本发明,典型的剂量范围为每位患者约10ng-1g、100ng-100mg、1μg-10mg或30-300μg编码核酸。剂量范围通常为每千克体重约0.01至约50mg,优选约0.1至约5mg/kg体重或每次注射约108-1010或1012个病毒颗粒。通常,对于典型的70kg患者,来自载体的裸核酸的剂量当量为约1μg-100μg,并且计算包含逆转录病毒颗粒的载体的剂量以产生等量的编码SUMO衍生的多肽的核酸。
VI.试剂盒
本发明还提供了根据本发明的方法通过施用SUMO衍生的多肽或编码所述多肽的核酸,用于抑制α-突触核蛋白聚集或治疗涉及α-突触核蛋白聚集和/或淀粉样原纤维形成的神经变性病况的试剂盒。所述试剂盒通常包括含有药物组合物的第一容器,所述药物组合物具有有效量的SUMO衍生的多肽,任选地含有第二容器,所述第二容器含有神经保护剂,例如抗氧化剂,例如乙酰半胱氨酸、藏红花素、Δ9-四氢大麻酚(THC)、鱼油、米诺环素、吡咯并喹啉醌(PQQ)、白藜芦醇、长春西汀(vinpcetine)和维生素E,或NMDA受体刺激物,例如咖啡因、烟碱和司来吉兰。在一些情况下,试剂盒还将包括含有关于如何分配药物组合物的说明书的信息材料,包括对可治疗的患者(例如,患有神经变性疾病如阿尔茨海默病或帕金森病的人)的类型、施用时间表(例如,施用的剂量和频率)和施用途径等的描述。
实施例
以下实施例仅以说明的方式,而不是以限制的方式提供。本领域技术人员将容易认识到可改变或修改以产生基本上相同或类似结果的各种非关键参数。
实施例1
引言
人α-突触核蛋白是由SNCA基因(4q21-q23)编码的14-kDa蛋白(Chen等人,1995)。异常的α-突触核蛋白聚集体或路易体是多种神经变性疾病(最值得注意的是帕金森病(PD))的病理学标志。α-突触核蛋白的一级序列(140aa)可以细分为具有不同性质的三个区域:N-末端区域(残基1-60)、非淀粉样蛋白β组分(NAC)结构域(残基61-95)和C-末端区域(残基96-140)。α-突触核蛋白中的N-末端错义突变(A30P,E46K,H50Q,G51D,A53E和A53T)(Appel-Cresswell等人,2013;Kruger等人,1998;Lesage等人,2013;Pasanen等人,2014;Proukakis等人,2013;Zarranz等人,2004)被报道为家族性PD的遗传原因。称为NACore(残基68-78)的α-突触核蛋白的中心区段负责α-突触核蛋白的淀粉样蛋白形成和细胞毒性(Rodriguez等人,2015)。并且疏水性节段,即残基74-82,对于α-突触核蛋白丝组装是必需的(Giasson等人,2001;Guerrero-Ferreira等人,2018)。用作增溶结构域的C-末端区域负责热稳定性(Park等人,2002)和伴侣样功能(Souza等人,2000)。该区域还调节淀粉样蛋白聚集,因为C-末端截短的α-突触核蛋白比全长形式聚集的快(Crowther等人,1998)。淬灭的氢/氘交换NMR数据指示由五条β-链(残基37-43、52-59、62-66、68-77和90-95)组成的α-突触核蛋白原纤维核心,并且固态NMR证实β-折叠二级结构的存在(Vilar等人,2008)。
与正常功能性的α-突触核蛋白不同,聚集的α-突触核蛋白在体外和体内以朊病毒样方式在神经元与神经元之间转移(Angot等人,2012;Aulic等人,2014;Desplats等人,2009;Hansen等人,2011)。在摄入神经元细胞后,α-突触核蛋白原纤维募集内源可溶性α-突触核蛋白,将其转化成路易体样内含物(Luk等人,2009)。多种细胞功能被α-突触核蛋白聚集诱导的毒性所破坏,例如突触囊泡运输、线粒体功能、细胞器动力学和自噬或溶酶体途径的调节(Wong和Krain,2017)。值得注意的是,黑质致密部(SNpc)中多巴胺能神经元的早期显著死亡导致基底神经节中的多巴胺损失,导致临床帕金森运动症状的发作(Kalia和Lang,2015)。尽管哪种形式,即寡聚物或原纤维,更具毒性仍是争议的话题,但减少它们的形成是减缓α-突触核蛋白相关疾病进展或延缓疾病发作的综合治疗策略。
最近的发现已经表明,SUMO化在神经变性疾病包括PD中起重要作用(Krumova和Weishaupt,2013)。SUMO化是翻译后修饰,其涉及借助于三种酶——E1活化酶、E2共轭酶和E3连接酶——向蛋白质上的特定赖氨酸添加小泛素样修饰物(SUMO)。哺乳动物中有4种SUMO蛋白:SUMO1至SUMO4。已经表明,通过创建新的相互作用表面或阻断现有的相互作用结构域,SUMO化影响蛋白质稳定性、直接细胞定位和改变酶促活性(Geiss-Friedlander和Melchior,2007)。有越来越多的证据表明,SUMO化在中枢神经系统(CNS)的发育和神经元特异性功能中是必需的。例如,突触传递,可塑性,海马神经元兴奋性和神经元成熟(Loriol等人,2012;Martin等人,2007;Plant等人,2011)。此外,已经发现,SUMO化通过增加聚集的蛋白质溶解度来减轻一些神经变性疾病(Janer等人,2010;Krumova等人,2011;Mukherjee等人,2009)。此外,SUMO旁系同源物与含有SUMO相互作用基序(SIM)的其它蛋白质非共价结合的能力可影响SUMO化和以下细胞功能。通常由两侧为疏水性和酸性氨基酸的Ser-Xaa-Ser基序组成的SIM形成β链,其可以平行或反平行取向结合SUMO的β2链。除了β2-链外,一些残基位于还参与相互作用的α-螺旋中(Hecker等人,2006;Minty等人,2000)。
在本项研究中,出乎意料地观察到SUMO1变体可以直接延迟或消除α-突触核蛋白聚集,而不形成与SUMO化相关的异肽键。由于治疗性肽具有优于蛋白质的几个优点(Mason和Fairlic,2015),因此研究了肽核心是否能够类似地抑制聚集。如果SUMO1被截短成有效的肽,它将不影响SUMO1在人体内的生理功能。作为来自人体中现有蛋白质的肽,其免疫原性较低。然后保留参与SUMO-SIM相互作用的功能片段β2-链和α-螺旋,并将SUMO1截短成小肽-SUMO1(15-55)或SUMO1(31-55)。
微尺度热泳(MST)数据表明SUMO1(15-55)与α-突触核蛋白的β1、β4链相互作用(表2)。在体外,基于细胞的模型和α-突触核蛋白转基因果蝇模型中,相继测试了SUMO1(15-55)的抑制作用,结果表明SUMO1(15-55)显著抑制了α-突触核蛋白聚集,减轻了其毒性,改善了疾病症状。该研究提供了最终可导致对α-突触核蛋白聚集诱导的PD和/或突触核蛋白病的新治疗的信息。
材料和方法
蛋白表达和纯化
重组α-突触核蛋白的表达和纯化如之前所描述的进行(Giasson等人,1999)。简言之,用相应的引物通过PCR扩增编码人野生型α-突触核蛋白的基因(表3),然后插入到pET-28a载体(Novagen)的NcoI和XhoI位点。用大肠杆菌BL21(DE3)在LB培养基中表达构建体。用0.5mM异丙基β-D-1-硫代半乳糖苷(IPTG)在OD 0.4-0.6下在37℃下诱导蛋白表达4小时。以14,000rpm离心后,将细胞沉淀重悬于20mM HEPES,pH7.4中并通过超声裂解。通过离心去除不溶性级分并将可溶性级分在水浴中煮沸10分钟。将热稳定的上清液通过0.22μM过滤器(Satorius)过滤并装载到高Q阴离子交换柱(5ml,Bio-Rad)上。梯度洗脱后,通过15%SDS-PAGE检测所有级分,并将纯化的级分在4℃下用20mM HEPES,150mM NaCl,pH7.4透析过夜。然后使用Vivaspin柱(MWCO 3kDa,GE Healthcare)浓缩蛋白质,以14,000rpm离心15分钟以去除可能的聚集体。将浓缩的α-突触核蛋白进一步用SEC 70高分辨率大小排阻柱(24ml,Bio-Rad),用20mM HEPES,150mM NaCl,pH7.4作为流动缓冲液进行纯化。使用ε=5960M-1cm-1的消光系数在280nm处光度测定蛋白质浓度。
用相应的引物通过PCR扩增人小泛素样修饰物1(SUMO1)的不同编码区(表3)。将扩增的片段亚克隆到pET-28a载体(Novagen)的NdeI和XhoI位点,并用构建体转化大肠杆菌BL21(DE3)。表达培养物保持在LB培养基中。用0.5mM异丙基β-D-1-硫代半乳糖苷(IPTG)在OD0.4-0.6下在37℃下诱导蛋白表达4小时。以14,000rpm离心后,将细胞沉淀重悬于20mMHEPES,500mM NaCl,pH7.4中,然后通过超声裂解。将上清液通过0.22μM过滤器(Satorius)过滤并装载到镍-琼脂糖柱(GE Healthcare)上。根据说明书通过凝血酶(GE Healthcare)去除N-末端His-标签。梯度洗脱后,通过15%SDS-PAGE检测所有级分并使用Vivaspin柱(MWCO 3kDa,GE Healthcare)浓缩纯化的级分,随后在SEC 70高分辨率大小排阻柱(24ml,Bio-Rad)上,用20mM HEPES,150mM NaCl,pH7.4作为流动缓冲液进行凝胶过滤。使用ε=4470M-1cm-1的消光系数在280nm处光度测定蛋白质浓度。
交联反应
用磷酸盐缓冲盐水(PBS)(pH7.4)透析蛋白质。随后,按照说明书进行交联实验。将磺基-GMBS(N-[γ-马来酰亚胺基丁氧基]琥珀酰亚胺酯)(间隔臂,Thermo FisherScientific)加入到α-突触核蛋白中,并将混合物在环境温度下孵育30分钟。然后使用脱盐柱(7K MWCO,Thermo Fisher Scientific)去除过量的交联剂,将透析的SUMO1(15-92)加入脱盐的α-突触核蛋白中,并将混合物进一步孵育30分钟。用15%SDS-PAGE分离样品。收集上移的条带并胰蛋白酶消化成随机消化的肽,并通过纳米液相层析-傅立叶变换离子回旋共振质谱(NanoLC-FTICR-MS)(Bruker Daltonics Apex Ultra 7.0T with Dionex Ultimate3000Nano LC)处理。在实验前直接输注牛血清白蛋白(BSA)胰蛋白酶肽,进行仪器的外部校准至小于1ppm的质量精确度。通过将实验离子质量与所有理论上消化的片段的质量加上由交联剂引起的分子量变化相匹配来指定交联肽。使用BioTools软件(Bruker Daltronics)中的Sequence Editor工具处理数据。
原纤维形成测定
反应含有70μMα-突触核蛋白和不同浓度的SUMO1变体,40μM硫黄素T(ThT)(Sigma-Aldrich),0.4mM SDS在反应缓冲液(20mM HEPES,150mM NaCl,pH7.4)中的混合物。反应在黑色透明底96孔板(Nunc,Thermo Fisher Scientific)中一式四份进行,最终体积为150μL。将板用密封膜(Thermo Fisher Scientific)密封并装载到Infinite M1000读板器(Tecan)中,在37℃下没有搅拌的情况下进行孵育。激发波长为450nm,发射波长为485nm下,以30分钟的间隔检测荧光。在反应缓冲液中使用Superdex 200GL 5/150柱(3ml,GEHealthcare)上的尺寸排阻层析在原纤维形成测定后分析蛋白质样品。
透射电子显微术
将样品直接点样到安装在200目铜格栅(Electron Microscopy Sciences)上的弗姆瓦支持膜上,孵育5分钟,然后用蒸馏水漂洗两次。通过用2%乙酸铀酰染色2min进行阴性染色。在空气干燥之后,用在80keV下操作的Hitachi H-7650透射电子显微镜检查样本。
圆二色光谱
将蛋白质样品在37℃孵育设计的时间点,然后在20mM Tris,150mM NaCl,pH7.4的缓冲液中稀释用于CD测量。α-突触核蛋白的最终浓度固定在20μM。在JASCO J-810CD光谱仪上在25℃下使用1mm路径长度的石英比色杯从250至200nm测量溶液样品的光谱。将带宽设定为1nm,数据间距为0.1nm且扫描速度为50nm/min。通过平滑和减去缓冲液光谱来处理原始数据。
微尺度热泳
使用Alexa Fluor 647NHS酯染料(Thermo Fisher Scientific)标记蛋白质靶标。标记反应根据制造商的说明书进行。用提供在蛋白质标记试剂盒RED-NHS(NanoTemperTechnologies)中的染料去除柱或脱盐柱(Bio-Rad)去除未反应的染料。在净化程序之后,通过测量蛋白质与染料的比率来监测纯度(例如,通过测量蛋白质在280nm处的吸收和染料在650nm处的吸收来进行光谱分析;摩尔吸光度:239,000M-1cm-1)。将标记的靶标调节至合适的浓度用于检测。将配体溶解在反应缓冲液中并制备一系列16个1:1稀释液。为了测量,将每种配体稀释液与一体积的标记蛋白靶标混合。孵育10分钟后,将样品装载到标准或优质Monolith NT.115Capillaries(NanoTemper Technologies)中。使用Monolith NT.115仪器(NanoTemper Technologies),在25℃的环境温度下,测量MST。将仪器参数调节至20%LED功率和中等MST功率。使用来自5s的MST-on时间的信号分析三次独立吸移测量的数据(MO.Affinity Analysis软件版本2.1.3,NanoTemper Technologies)。
在不存在和存在SUMO1(15-55)的情况下制备老化的α-突触核蛋白样品
在不存在和存在化学计量量的SUMO1(15-55)的情况下,将在20mM HEPES,150mMNaCl,pH7.4中的纯化的α-突触核蛋白以70μM的浓度在37℃下孵育5天。对于NACore样品,将冻干的NACore肽以500μM的浓度,在不存在或存在化学计量量的SUMO1(15-55)的情况下,溶解在蒸馏水中。在Thermomixer(Eppendorf)中以500rpm连续摇动将样品在37℃下摇动3天。
MTT细胞活力测定
将SH-SY5Y成神经细胞瘤细胞(ATCC CRL-2266)在96孔组织培养板中以每孔2,000个细胞的密度培养至最终体积为100μL的培养基(DMEM/F-12,10%胎牛血清,1%青霉素-链霉素)并孵育24小时。加入相应的蛋白质样品后,将细胞进一步孵育24小时。然后,用3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑溴化物(MTT)溶液(0.5mg/mL)处理细胞。孵育4小时后,小心地去除培养基。将细胞用100μL DMSO裂解,然后在Infinite M1000读板器(Tecan)中测量540nm处的吸光度。将所有培养物在37℃下保持在5%CO2湿化气氛中并且从不超过25代。将数据归一化至用反应缓冲液处理的细胞的值。重复实验至少三次,结果相似。
SH-SY5Y中的外源性α-突触核蛋白原纤维内化
SH-SY5Y成神经细胞瘤细胞(ATCC CRL-2266)在12孔板(SPL Life Sciences)中以每孔100,000个细胞的密度培养。然后,用Alexa 488荧光标记的聚集样品处理细胞3小时,并且对于每组,α-突触核蛋白的最终浓度固定在0.5μM。在水浴中内化1.5小时之前超声处理聚集样品。为了去除细胞外聚集样品,将细胞用PBS洗涤三次,胰蛋白酶消化,然后再次接种并培养20小时,随后进行共聚焦显微术和流式细胞术。
生物分子荧光互补(BiFC)
SH-SY5Y成神经细胞瘤细胞(ATCC CRL-2266)在35mm玻璃底培养皿(MatTek)中以每皿100,000个细胞的密度培养。使用Lipofectamine2000(Thermo Fisher Scientific)按照标准方案用相应的质粒转染细胞。转染后24小时对活细胞成像。
共聚焦显微术
对于核和细胞膜染色,将Hoechst 33342(Thermo Fisher Scientific)和Alexa647缀合的小麦胚芽凝集素(WGA)(Thermo Fisher Scientific)直接加入到培养基中,并在暗处孵育10分钟,然后成像。在Leica TCS SP8共聚焦显微镜上用63X油浸物镜获得活细胞成像。
流式细胞术
对于样品制备,用PBS洗涤SH-SY5Y细胞,胰蛋白酶消化,沉淀,重悬于冰冷的PBS中并通过尼龙网过滤器(Millipore)过滤。对于每个样品,在BD FACSVerse(BD Biosciences)上分析100,000个细胞,激发波长为488nm。使用FlowJo软件(FlowJo LLC)进行原始数据分析。
幼虫喂养
分别用补充有100μM、200μM或400μM SUMO1(15-55)的2%蔗糖溶液喂养第三龄幼虫2小时,然后在25℃下在不含药物的食物中继续培养(Chau等人,2006)。
假瞳孔测定
如之前所描述(Berger等人,2005),在羽化后3-4天进行假瞳孔测定。通过SPOTInsight CCD照相机获得图像,该照相机具有由SPOT Advanced软件(DiagnosticInstruments Inc.)控制的60X油物镜。对于每种条件,使用从三次独立杂交获得的35-40只蝇中的至少650个复眼来计算每个复眼的平均感杆分体数。
攀爬测定
根据先前所描述的(Feany和Bender,2000)进行攀爬测定。简言之,将一组10只蝇放置在单独的管中,总共4个管。将蝇轻轻地轻敲到管的底部,并且记录在15s内能够爬升2cm高度的蝇的数目。对于每种条件,测试从三次独立杂交获得的最少60只蝇。每次试验重复5次。在行为测定的整个过程中,将所有蝇维持在25℃。
蛋白质印迹分析
在攀爬测定结束时,将每组的果蝇头部均质化并煮沸10分钟。通过在4℃以15,000rpm离心10分钟来去除碎片。上清液进行15%SDS-PAGE用于分析。将蛋白质转移至硝化纤维膜(Bio-Rad),在含0.1%Tween 20(Sigma-Aldrich)的PBS中的5%封闭级封闭剂(Bio-Rad)中封闭,并根据标准程序进行免疫印迹。使用以下第一抗体:抗酪氨酸羟化酶(1:1000;Millipore),抗α-突触核蛋白(克隆42,1:1000;BD Biosciences),抗GAPDH(克隆6C5,1:5000;Thermo Fisher Scientific)。应用适当的辣根过氧化物酶缀合的第二抗体,并通过化学发光(Bio-Rad)测量信号。所有免疫印迹重复至少三次,结果相似。
结果
用于α-突触核蛋白聚集的短治疗肽的设计
最初的研究集中于检查SUMO1(1-97)抑制α-突触核蛋白聚集的能力。为了暴露有效区域,SUMO1(15-92)通过截短N-末端和C-末端松软的尾部来产生。同时,本发明人注意到由三个连续谷氨酸(残基78-80,EEE)组成的带负电荷的环,并决定探索这三个残基突变为赖氨酸(SUMO1(15-92)-KKK)的影响,以研究静电对聚集抑制的重要性。值得注意的是,该EEE序列与β1-链上的K23(残基21-26,YIKLKV)形成盐桥。因此,如果这种盐桥相互作用对于稳定性是重要的,那么突变它应该改变其抑制α-突触核蛋白聚集的能力是有理由的。SUMO1(15-92)-KKK突变体还将允许我们评估总蛋白电荷对α-突触核蛋白聚集抑制的作用。这些变化将等电点从6.47移动到9.41,使SUMO1(15-92)-KKK在中性pH环境下从带电负荷变为带正电荷。
原纤维形成测定表明SUMO1(15-92)和SUMO1(15-92)-KKK均直接抑制α-突触核蛋白聚集,而SUMO1(1-97)几乎不抑制聚集。这些数据证实,如预期的,SUMO1的N-末端和C-末端尾部对于α-突触核蛋白聚集抑制不是重要的,并且确实阻碍了这种能力。此外,SUMO1(15-92)-KKK突变的类似结果表明总电荷不是观察到的抑制的因素,也不是残基21-26(YIKLKV)和残基78-80(EEE)之间的盐桥。
为了将SUMO1构建体的尺寸进一步减小至仅有结合区,最后两条β-链(β4,β5)均被截短。只有包含参与SUMO-SIM相互作用的残基的前两条β-链(β1,β2)和α-螺旋保留,产生较短的构建体SUMO1(15-55)。
SUMO1(15-55)对α-突触核蛋白聚集的抑制作用
SUMO1(15-55)抑制α-突触核蛋白聚集的效力最初由广泛用于定量错误折叠的蛋白质聚集体的硫黄素T(ThT)检测。当该染料与淀粉样蛋白聚集体中的富含β-折叠的结构结合时,其显示出增强的荧光信号(Groenning,2010)。将十二烷基硫酸钠(SDS)加入到模拟膜环境中并用作成核支架以刺激α-突触核蛋白聚集(Giehm等人,2010)。在原纤维形成测定中,SUMO1(15-55)在等摩尔比下完全抑制α-突触核蛋白聚集,并且在7天实验内在亚化学计量水平下延迟聚集(图1A)。与原纤维形成测定一致,TEM揭示了在所有与SUMO1(15-55)孵育的原纤维形成测定样品中淀粉样原纤维的长度和丰度均显著降低(图1I-M)。
为了探索亚化学计量抑制机制,通过尺寸排阻层析分析来自原纤维形成测定的蛋白质样品。结果表明,等摩尔量的SUMO1(15-55)完全保持单体状态的α-突触核蛋白,并且亚化学计量比的SUMO1(15-55)仅保持部分α-突触核蛋白处于单体状态(图1B)。此外,采用圆二色性(CD)来监测参与原纤维形成中的二级结构变化。如图1C所示,SUMO1(15-55)明显抑制了α-突触核蛋白CD光谱中β-折叠的累积(在218nm处负椭圆度增加)和随机卷曲的减少(在200nm处负椭圆度减少)(图1D-H)。然而,SUMO1(15-55)无法撤销聚合过程(数据未示出)。
SUMO1(15-55)对聚集的α-突触核蛋白诱导的细胞毒性的减毒作用
通过测量用在不存在和存在SUMO1(15-55)的情况下老化的α-突触核蛋白或NACore样品处理的SH-SY5Y细胞的活力,进行MTT测定以确定SUMO1(15-55)能否降低聚集的α-突触核蛋白或NACore诱导的细胞毒性。聚集的α-突触核蛋白和NACore均对SH-SY5Y细胞具有显著的细胞毒性,然而,当老化的样品在SUMO1(15-55)存在下孵育时,细胞活力得到改善。挽救能力取决于SUMO1(15-55)的浓度,其中在等摩尔比下完全挽救和在亚化学计量的量下部分挽救(图2A-B)。单独的SUMO1(15-55)的相应浓度不影响细胞活力(数据未显示)。
进一步探讨保护作用是否与外源性α-突触核蛋白原纤维内化有关。使用共聚焦显微术,可以在处理24小时后观察到荧光标记的原纤维的摄入(图2C)。含有标记的α-突触核蛋白原纤维的细胞的比例为99.6%,其中SUMO1(15-55)处理组的阳性细胞的比例以剂量依赖性方式显著降低(3.4%、47.1%、50.7%、95.1%)(图2D-E)。
验证神经元细胞内SUMO1(15-55)和α-突触核蛋白之间的相互作用
在体外证实抑制作用后,检测到α-突触核蛋白与SUMO1(15-55)之间的直接蛋白质-蛋白质相互作用。Morell等人(2008)报道了通过偶联生物分子荧光互补(BiFC)和流式细胞术来可视化和定量体内弱蛋白质相互作用的方法。具体而言,α-突触核蛋白和SUMO1(15-55)分别融合至分开的Venus,一种经修饰的黄色荧光报告基因(VN173和VC155)(Shyu等人,2008)。相互作用使分开的Venus的两半非常接近,从而允许完整的黄色荧光蛋白的重构。因此,黄色荧光信号的出现与α-突触核蛋白和SUMO1(15-55)之间的蛋白质-蛋白质相互作用相关。
α-突触核蛋白和SUMO1(15-55)与互补荧光片段在SH-SY5Y细胞中共表达。同时设置相应的对照组以确保荧光信号特异性地由靶蛋白之间的结合引起。黄色荧光信号最初在共焦显微镜下观察到。如图3A所示,荧光信号对α-突触核蛋白-SUMO1(15-55)复合物形成具有特异性,背景荧光低。流式细胞术证实了共聚焦结果,即BiFC阳性细胞的百分比显著高于阴性对照组(图3C),和与相互作用强度直接相关的实验组的平均荧光值(Morell等人,2008)显著高于阴性对照组(图3D)。这一事实表明,缀合的α-突触核蛋白和SUMO1(15-55)有助于黄荧光蛋白的两个分开的半部分(这两个分开的半部分不能彼此相互作用或缀合成蛋白质)由于蛋白质-蛋白质相互作用而重构为完整的形式并发射荧光。此外,根据平均荧光值,分开的Venus(VN173)与α-突触核蛋白的缀合方向对相互作用没有差异。在含有作为BiFC阳性的分开的Venus的两个半部分的实验组中鉴定约9%的细胞与在阳性对照组中用完整的Venus质粒转染约35%的细胞的事实是一致的(图3B)。
SUMO1(15-55)对WTα-突触核蛋白转基因果蝇模型的神经保护作用
为了评估SUMO1(15-55)在体内的保护作用,采用典型的动物帕金森病模型(Auluck和Bonini,2002;Auluck等人,2005;Outeiro等人,2007)。α-突触核蛋白的表达是在酵母转录因子GAL4的上游活化序列(UAS)(GAL4-UAS,二元表达系统)的控制下,并受组织或细胞类型特异性驱动器的指导。
假瞳孔测定通过计数每个复眼中的感杆分体来定量神经变性(Marsh等人,2003)。与先前的研究(Feany和Bender,2000)一致,α-突触核蛋白在果蝇眼中的特异性表达使用gmr-GAL4驱动器引起的视网膜变性。与无治疗对照组相比,SUMO1(15-55)治疗组以剂量依赖性方式显著改善α-突触核蛋白诱导的神经变性过程(图4)。
使用elav-GAL4驱动器的α-突触核蛋白的泛神经表达在果蝇中诱导年龄依赖性负向地性攀爬能力损伤(Feany和Bender,2000)。与以前的报道一致,α-突触核蛋白转基因果蝇从羽化后4天开始表现出显著下降的负向地性攀爬反应。然而,在疾病发作阶段(幼虫阶段)期间在SUMO1(15-55)溶液中饲养转基因果蝇在随后的攀爬测定期间以剂量依赖性方式显著抑制运动功能的进行性损失(图5A)。
进行蛋白质印迹分析以进一步研究这种神经保护作用的潜在机制。α-突触核蛋白的表达水平不受SUMO1(15-55)的影响,然而,酪氨酸羟化酶(TH)的量与SUMO1(15-55)的剂量相关(图5B-D)。总之,SUMO1(15-55)通过挽救多巴胺能神经元而不是减少α-突触核蛋白产生来提供针对α-突触核蛋白毒性的神经保护。
探索参与相互作用的结合区
在确认体外和体内的抑制作用后,进行交联反应和纳米液相层析-傅立叶变换离子回旋共振质谱(NanoLC-FTICR-MS)以鉴定参与抑制的相互作用区域。利用SUMO1(15-92)构建体,检测到几个强上移的条带,然后通过NanoLC-FTICR-MS分析。人α-突触核蛋白含有15个赖氨酸(K6、K10、K12、K21、K23、K32、K34、K43、K45、K58、K60、K80、K96、K97、K102),并且SUMO1(15-92)仅具有一个半胱氨酸(C52)可以交联。C52也接近参与SUMO-SIM相互作用的残基(Hecker等人,2006),这使得其成为研究α-突触核蛋白上的结合区域的理想靶标。理论上可以形成15种交联的二肽。事实上,仅检测到α-突触核蛋白中主要位于β1和β2链上的赖氨酸残基(K34、K43、K45、K58、K96)的一部分与SUMO1(15-92)中的C52交联(表1)。所有这些事实表明抑制机制可能与SUMO1(15-92)和α-突触核蛋白的β1-β2区结合相关。为了验证这些区域的结合,使用来自α-突触核蛋白的合成肽片段,即αsyn(35-45)(β1链)和αsyn(33-58)(β1-β2区域),以及SUMO1(15-55),通过MST来测量解离常数(Kd)值。结果,SUMO1(15-55)仅与αsyn(35-45)相互作用,并且其与αsyn(33-58)没有结合(表2)。
在α-突触核蛋白的氨基酸序列中的残基60-80和C-末端(残基102-140)之间没有赖氨酸或精氨酸。这意味着这些区域不能被胰蛋白酶消化成短片段并通过NanoLC-FTICR-MS检测。因此,产生αsyn(74-84)(α-突触核蛋白丝组装的必需区域)和α-突触核蛋白(1-100)以用SUMO1(15-55)进行MST。结果,αsyn(74-84)可以与SUMO1(15-55)结合,并且α-突触核蛋白(1-100)与全长α-突触核蛋白相比具有类似的结合能力(表2),这意味着SUMO1(15-55)不与α-突触核蛋白的C-末端相互作用。
为了探索潜在的结合机制,在线SUMO相互作用基序(SIM)预测软件(Zhao等人,2014)用于算出α-突触核蛋白上的SIM。将阈值设置为零,结果显示三个可能的区域,残基37-41(P值:0.202),残基48-52(P值:0.819)和残基70-74(P值:0.643)。这与以下事实是一致的:αsyn(35-45)显示与SUMO1(15-55)的强结合;SUMO1(15-55)可降低NACore(残基68-78)的细胞毒性;β2链上的结合只能通过交联检测到,而不能通过MST检测到。还测试了SUMO1(15-55)与另一种淀粉样生成肽42-merβ-淀粉样蛋白肽(Aβ42)之间的结合能力,Aβ42为在阿尔茨海默患者的脑中发现的淀粉样蛋白斑中的主要Aβ种类(Luhrs等人,2005)。使用牛血清白蛋白(BSA)作为阴性对照。与阴性对照相比,对Aβ42的结合能力增加了约20倍(表2)。结合所有这些数据,推测SIM和淀粉样生成结构是参与与SUMO1(15-55)结合的两个影响因素。
讨论
此处的发现首次报道了SUMO1变体对α-突触核蛋白聚集的直接抑制作用。将全长蛋白质截短成短的治疗肽SUMO1(15-55),其可以与α-突触核蛋白相互作用,消除聚集,降低细胞毒性,改善帕金森病果蝇模型的疾病症状。该研究还说明了SUMO1(15-55)和Aβ42之间的相互作用,从而提供了设计用于其它神经变性疾病的治疗肽的可能性。
尽管已经提出了许多淀粉样原纤维的基于肽的抑制剂(Funke和Willbold,2012;Sciarretta等人,2006),这种新的治疗肽SUMO1(15-55)具有独特的特征和优点。它衍生自存在于人体内的普通人蛋白,没有聚集的倾向,因此它可能比许多蛋白质具有更小的免疫原性,并且比衍生自疾病特异性淀粉样生成序列的β-折叠破坏肽具有更小的聚集倾向。在尝试将肽转化为临床应用时,需要克服以下障碍:生物利用度问题,蛋白酶降解,跨细胞膜和血脑屏障的限制能力。这些能力可以通过修饰,例如乙酰化,聚乙二醇化,添加疏水尾或电荷尾来给与。此外,如果SUMO1(15-55)-α-突触核蛋白复合物的原子结构被解决,则通过骨架修饰或进一步将SUMO1(15-55)截短成较小的肽可以增强抑制作用。
实施例2
引言
本项研究提供了对SUMO(15-55)和α-突触核蛋白之间的结合相互作用的性质的认识。在果蝇中的实验表明SUMO(31-55)肽可以在体内抑制α-突触核蛋白诱导的神经变性。此外,在本项研究中获得的实验数据表明(1)向SUMO(31-55)肽添加N-末端聚精氨酸序列可促进其摄入细胞;和(2)向SUMO(31-55)添加N-末端His-标签序列显著提高其能力,允许其在甚至亚化学计量水平抑制α-突触核蛋白聚集。
材料和方法
硫黄素T测定
硫黄素T(ThT)测定如先前描述的5进行,并进行较小的修改。在不存在和存在等摩尔比的SUMO1(15-55)/SUMO1(L44E,L47R),R8-SUMO1(31-55)或His-SUMO1(31-55),40μM硫黄素T(ThT)(Sigma-Aldrich)和0.4mM SDS的情况下,将新鲜纯化的70μMα-突触核蛋白溶解在反应缓冲液(20mM HEPES,150mM NaCl,pH7.4)中,在每个孔中具有150μL的最终体积。在实验之前,通过在15,000rpm下离心15分钟并通过0.2μm过滤器过滤来去除α-突触核蛋白中的潜在的预形成的聚集体。在用透明胶粘密封片(Thermo Fisher Scientific)密封的黑色透明底96孔板(Nunc,Thermo Fisher Scientific)中进行反应,以避免蒸发并将其装载到M1000读板器(Tecan)中,在37℃下,没有搅拌的情况下孵育7天。激发波长为450nm,间隔30分钟,在485nm处记录荧光。
微尺度热泳
使用Alexa Fluor 647 NHS酯染料(Thermo Fisher Scientific),根据制造商的说明书标记蛋白质靶标。用脱盐柱(2K MWCO,Bio-Rad)去除未反应的染料。在净化程序之后,通过测量蛋白质与染料的比率来监测纯度。将标记的靶标调节至合适的浓度用于检测,并保持在含0.1%Tween 20的ddH2O中,同时将配体保持在相应的缓冲液中(肽:ddH2O;α-突触核蛋白:20mM HEPES,150mM NaCl,pH7.4)。对于每次测定,将未标记的配体与等体积的以16种不同的连续稀释浓度的标记蛋白质靶标在室温下混合。孵育10分钟后,将样品加载到标准Monolith NT.115Capillaries(NanoTemper Technologies)中,并使用MonolithNT.115仪器(NanoTemper Technologies)测量。将仪器参数调节至20%LED功率和中等MST功率。使用MO.Affinity Analysis v.2.2.4软件(NanoTemper Technologies)从至少三次独立的实验,用单位点特异性结合模型计算解离常数(Kd),作为平均值±s.e.m.。
α-突触核蛋白肽与SUMO1(15-55)的计算对接
考虑到单体α-突触核蛋白的高度无序构象和没有关于α-突触核蛋白与SUMO1(15-55)之间的结合位点的知识,采用基于片段的高分辨率全局对接协议(PIPER-FlexPepDock3)来建模相互作用。将αsyn(35-45)的氨基酸序列作为配体并对接至SUMO1(15-55)或SUMO1(15-55)(L44E,L47R),其从人SUMO1的溶液结构(PDB ID:2N1V)复制。PIPER-FlexPepdock在web服务器上运行(网站:piperfpd.furmanlab.cs.huji.ac.il/)。使用Rosetta片段定位器产生代表肽构象异构体集合的片段组,然后使用PIPER快速傅立叶变换(FFT)对接算法通过刚体对接将其对接到受体上。然后,使用Rosetta FlexPepdockRefinement算法对粗PIPER模型执行灵活的全原子细化。基于每个聚类中的最佳评分模型的重新加权得分,对排序最高的细化模型进行聚类和排序。选择第1级模型作为预测。使用分子可视化系统Chimera6或PyMOL7绘制分子图。
果蝇遗传与幼虫喂养
本项研究采用以下蝇品系:gmr-GAL4(RRID:BDSC_1104),elav-GAL4(RRID:BDSC_458),UAS-α-突触核蛋白-A30P(RRID:BDSC_8147)和UAS-α-突触核蛋白-A53T(RRID:BDSC_8148)。所有品系均获自布鲁明顿果蝇库存中心(Bloomington Drosophila StockCenter)。为了获得PD模式蝇,使在X染色体上携带驱动器gmr-GAL4或elav-GAL4的处女蝇与来自UAS-α突触核蛋白-A30P/UAS-α突触核蛋白-A53T原种的雄性杂交。在25℃培养箱中,将这些杂交后代保持在补充了干酵母的标准玉米粉培养基上。对于肽处理,分别用补充有60μM、120μM或240μM SUMO1(31-55)/SUMO1(15-55)的2%蔗糖溶液喂养第三龄幼虫2小时,然后在25℃下在标准玉米粉培养基中继续培养8。
假瞳孔测定
攀爬测定
根据先前所描述的10进行攀爬测定。简言之,将来自每种条件的一组10只蝇放置在单独的塑料管中,并将蝇轻轻地轻敲到管的底部。记录在15s内能够爬升2cm高度的蝇的数目。每次试验重复5次,每次试验之间有1分钟的恢复时间。对来自每种条件的总共20只(10只雄性和10只雌性)蝇进行一次遗传杂交的测试。
共聚焦显微术
将SH-SY5Y细胞接种在35mm玻璃底共聚焦培养皿上并孵育过夜。在与Alexa 488标记的R8-SUMO1(31-55)共孵育后,在室温下在不同时间点用4%多聚甲醛固定细胞15分钟,并通过Leica TCS SP8共聚焦显微镜以63X油浸物镜观察。
结果和讨论
SUMO1(15-55)肽中与α-突触核蛋白结合的位点
假设SUMO1(15-55)通过分子间疏水性相互作用在由两条链和α-螺旋形成的推定的结合沟上结合α-突触核蛋白。为了检验这种假设,SUMO1(15-55)(L44E,L47R)被设计成通过将推定的结合沟中的两个疏水性残基突变成亲水性残基以降低其疏水性而不改变净电荷来验证这种假设(图10A)。α-突触核蛋白肽(35-45)与SUMO1(15-55)的计算对接提示这些突变应使SUMO1(15-55)突变体不能结合α-突触核蛋白(图10B)。通过测定SUMO1(15-55)/SUMO1(L44E,L47R)与α-突触核蛋白之间的抑制能力和结合强度来在实验上测试这种假设。这些数据表明,与SUMO1(15-55)相比,SUMO1(L44E,L47R)在等摩尔比下显示出弱得多的抑制作用(图10C),并且与SUMO1(15-55)相比,其与α-突触核蛋白的结合能力降低了约1/40(图10D)。所有这些结果表明,由残基I22、L24、V26、I34、F36、V38、L44和L47形成的疏水性结合沟是SUMO1(15-55)上与α-突触核蛋白结合的区域,从而抑制其聚集。
这些数据表明SUMO衍生的肽包含β-折叠和α-螺旋以形成结合α-突触核蛋白的疏水性沟,例如SUMO 1片段(例如SEQ ID NO:1的15-55或31-55片段),其在该片段内保留了SEQ ID NO:1的残基I22、L24、V26、I34、F36、V38、L44和L47中的全部或一些,可用于抑制α-突触核蛋白聚集,因此可用于治疗神经变性疾病。
α-突触核蛋白中与SUMO1(15-55)结合的位点
在证实SUMO1(15-55)上的结合位点后,进一步探索α-突触核蛋白上的潜在相互作用位点。为了验证相互作用区域,产生α-突触核蛋白(1-100)以检查C-末端结构域的截短是否将影响相互作用。结果表明,α-突触核蛋白(1-100)显示出与全长α-突触核蛋白相当的Kd值,这意味着C-末端对这种相互作用具有有限的影响(图11B)。然后评估SUMO1(15-55)和β-链肽(其对应于根据Vilar等人1指定的原纤维α-突触核蛋白中的5条β-链)之间的亲和力。合成来源于这些链的肽并分别通过MST测试以鉴定潜在的相互作用区域。发现β1-链肽-具有预测的SIM(37VLYV40)的αsyn(35-45)和含有SIM样基序(48VVHGV52)(具有β型基序([V/I]-[V/I]-[X]-[V/I/L])2中的额外氨基酸)的β2-链肽αsyn(48-60)与SUMO1(15-55)具有合理的亲和力,而β3、β4、β5-链肽(αsyn(59-66)、αsyn(74-84)、αsyn(87-95))仅显示出弱相互作用。此外,包含β1-链和β2-链的发夹构建体-αsyn(33-58)显示出较弱的结合能力,与单独的β1、β2-链肽相比,约为1/27(图11B)。
这些数据表明SUMO1(15-55)优先与没有二级结构的片段相互作用,这与先前的结果一致,即SUMO1(15-55)对αsyn预形成的原纤维显示出有限的作用。随后产生在预测的SIM区(αsyn-SIM1(5A))和SIM样基序区(αsyn-SIM2(5A))的任一个中具有五元组丙氨酸突变的两个α-突触核蛋白突变体,以研究在该相互作用中的序列选择。如图11C所示,SIM1中的五元组丙氨酸突变将结合亲和力降低到约1/7,而SIM2中的突变不影响相互作用,而是增强结合能力,这表明SIM中的氨基酸序列影响与SUMO1(15-55)的结合以及SIM样基序与SIM竞争识别SUMO1(15-55)。SUMO1(15-55)-αsyn(35-45)复合物模型通过使用基于片段的高分辨率全局对接协议(PIPER-FlexPepDock3)的计算预测来产生。与这种假设一致,αsyn(35-45)通过SIM(37VLYV40)与SUMO1(15-55)上推定的疏水性结合沟结合(图11D)。
随着先前的实验将α-突触核蛋白上的结合区域缩小到两个SUMO相互作用基序(SIM),即SIM1(残基35-45)和SIM2(残基48-60),最近进行的进一步实验被设定为通过产生可潜在地阻断这种相互作用的α-突触核蛋白突变体来验证α-突触核蛋白上的结合位点。
在预测的SUMO1(15-55)-αsyn肽模型中,如所预期的,α-突触核蛋白上的SIM(37VLYV40和48VVHGV52)结合SUMO1(15-55)上的推定的疏水性结合沟(图3A,B)。基于这种假设,α-突触核蛋白与SUMO1(15-55)之间的相互作用取决于SIM识别和分子间疏水性相互作用,因此,设计α-突触核蛋白(V40R)、α-突触核蛋白(V49R)和α-突触核蛋白(V40R,V49R)突变体,其应弱化这些区域的疏水性,从而抑制SUMO(15-55)与一个或两个SIM位点的结合。值得注意的是,任一SIM上的突变不会消除SUMO(15-55)-α-突触核蛋白相互作用,但两个位点上的同时突变抑制了这种相互作用(图16C)。
这些数据进一步支持SUMO1(15-55)通过α-突触核蛋白的SIM1(37VLYV40)和SIM2(48VVHGV52)基序与α-突触核蛋白结合的概念,其进而阻碍形成更高级的毒性物质。应该注意,Doherty等人11最近已经强调了这些位点抑制α-突触核蛋白聚集的重要性。
因此,α-突触核蛋白片段(即,小于全长的α-突触核蛋白,例如,总长度上不超过50个、40个、30个或20个氨基酸),其是包含SEQ ID NO:7的35-45或48-60区段的多肽,例如SEQID NO:7的37-41、或37-40、或48-52区段,任选地,在N-末端和/或C-末端添加一个或多个异源肽序列(例如,每种长度不超过6、8、10、12、15或20个氨基酸,例如聚His或聚Arg标签),可以以基本上与本文所述的SUMO衍生肽相同的方式用于基本上相同的目的,例如,用于抑制细胞中的α-突触核蛋白聚集和用于治疗神经变性疾病如帕金森病。类似地,来源于α-突触核蛋白的肽包含如本文所述的全长α-突触核蛋白或α-突触核蛋白的片段,其包括SIM1或SIM2中的一个或多个突变,优选不是SIM1和SIM2中的突变(例如取代突变体V40R或V49R,但不包括双突变体V40R/V49R),任选地,在N-末端和/或C-末端添加一个或多个异源肽序列(例如,每种的长度不超过6、8、10、12、15或20个氨基酸,例如聚-His或聚-Arg标签),可以以基本上与本文所述的SUMO衍生肽相同的方式用于基本上相同的目的,例如用于抑制细胞中的α-突触核蛋白聚集和用于治疗神经变性疾病,例如帕金森病。还提供了编码这样的α-突触核蛋白片段或来源于α-突触核蛋白的肽的核酸,指导α-突触核蛋白片段或来源于α-突触核蛋白的肽的表达的表达盒,包含所述表达盒的载体,或包含所述核酸、表达盒或载体的宿主细胞,以及包含生理学上可接受的赋形剂和有效量的一种这样的α-突触核蛋白片段或来源于α-突触核蛋白的肽的组合物。
SUMO1(15-55)肽对α-突触核蛋白转基因果蝇的神经保护作用
SUMO1(15-55)的神经保护作用先前在野生型α-突触核蛋白转基因果蝇中显示。在本项研究中,产生了新的数据,以显示SUMO1(15-55)在表达α-突触核蛋白突变体(α-突触核蛋白A30P和α-突触核蛋白A53T)的α-突触核蛋白转基因果蝇中的神经保护作用,所述α-突触核蛋白转基因果蝇与家族性帕金森病相关。假瞳孔测定通过计数每个复眼中的感杆分体来定量神经变性4。与无治疗对照组相比,SUMO1(15-55)治疗组以剂量依赖性方式显著改善由α-突触核蛋白-A30P(图12A,B)或α-突触核蛋白-A53T(图12C,D)诱导的神经变性过程。
这些数据表明SUMO1(15-55)可用于治疗由除了野生型α-突触核蛋白过表达之外的α-突触核蛋白中的不同突变引起的家族性帕金森病。
SUMO1(31-55)肽对α-突触核蛋白转基因果蝇的神经保护作用
先前已经公开了较短的肽SUMO1(31-55)也可以在体外抑制α-突触核蛋白聚集。在α-突触核蛋白(野生型、A30P、A53T)转基因果蝇中,用攀爬测定测试了SUMO1(31-55)的神经保护作用。较短的肽SUMO1(31-55)在所有三种α-突触核蛋白转基因果蝇品系的试点行为研究中改善了运动功能障碍(图13)。
这些数据表明SUMO1(31-55)在体内对α-突触核蛋白诱导的神经变性具有相当的保护能力。
R8-SUMO1(31-55)的细胞穿透功能
先前的行为测试已经显示SUMO1(31-55)在α-突触核蛋白转基因果蝇模型中的保护作用。为了进一步研究在小鼠模型中的治疗效果,在SUMO1(31-55)的N-末端添加聚精氨酸标签以增强其细胞穿透功能和潜在的治疗效果。如图14A所示,聚精氨酸标签的存在导致SUMO1(31-55)以时间过程方式高效内化入SH-SY5Y细胞,而聚精氨酸标签不影响SUMO1(31-55)在体外对α-突触核蛋白聚集的抑制能力(图14B)。
这些数据表明R8-SUMO1(31-55)可以用作在神经变性疾病的治疗中具有改善的特性的肽药物。
His-SUMO1(31-55)亚化学计量地体外抑制α-突触核蛋白聚集
还发现,N-末端10xHis标签的掺入显著改善了SUMO1(31-55)的抑制作用,允许其在亚化学计量水平抑制α-突触核蛋白聚集。这是主要的进步,因为先前的构建体以1:5或1:10的α-突触核蛋白:SUMO肽抑制剂的比率失去了其抑制α-突触核蛋白的能力。然而,加His-标签的SUMO1(31-55)甚至在这些降低的水平下在体外显示出对α-突触核蛋白聚集的部分抑制(图15)。
这些数据表明His-SUMO1(31-55)是用于治疗突触核蛋白病的甚至更有效的肽药物。
尽管SUMO2仅与SUMO1具有约50%的序列同一性,但其显示出与SUMO1的结构同源性,并且还显示出与α-突触核蛋白相互作用。因此,进一步研究了SUMO2(16-88)和SUMO2(16-51)的抑制作用。这些片段与先前研究的SUMO1(15-92)和SUMO1(15-55)肽比对上,尽管没有这些SUMO1肽中的5-氨基酸N-末端尾部,因为它们在SUMO2序列中不存在。
如对于SUMO1(15-92)所观察到的,SUMO2(16-88)以与α-突触核蛋白等摩尔比完全抑制α-突触核蛋白聚集,而以半摩尔比延迟聚集(图17)。较短的SUMO2肽,即SUMO2(16-51)也以等摩尔比抑制α-突触核蛋白聚集,而以半摩尔比延迟聚集的开始2天(图18)。这些数据表明SUMO2片段也具有抑制α-突触核蛋白聚集的能力,与它们的SUMO1对应物相当。
本申请中引用的所有专利,专利申请和其它出版物,包括GenBank登录号,通过引用整体并入,用于所有目的。
序列表
SEQ ID NO:1人SUMO1蛋白质的氨基酸序列,GenBank登录号:AAC50996.1MSDQEAKPSTEDLGDKKEGEYIKLKVIGQDSSEIHFKVKMTTHLKKLKESYCQRQGVPMNSLRFLFEGQRIADNHTPKELGMEEEDVIEVYQEQTGGHSTV
SEQ ID NO:2人SUMO1编码序列,GenBank登录号:NG_011679.1
ATGTCTGACCAGGAGGCAAAACCTTCAACTGAGGACTTGGGGGATAAGAAGGAAGGTGAATATATTAAACTCAAAGTCATTGGACAGGATAGCAGTGAGATTCACTTCAAAGTGAAAATGACAACACATCTCAAGAAACTCAAAGAATCATACTGTCAAAGACAGGGTGTTCCAATGAATTCACTCAGGTTTCTCTTTGAGGGTCAGAGAATTGCTGATAATCATACTCCAAAAGAACTGGGAATGGAGGAAGAAGATGTGATTGAAGTTTATCAGGAACAAACGGGGGGTCATTCAACAGTT
SEQ ID NO:3人SUMO2蛋白质的氨基酸序列,GenBank号:AAH71645.1
MADEKPKEGVKTENNDHINLKVAGQDGSVVQFKIKRHTPLSKLMKAYCERQGLSMRQIRFRFDGQPINETDTPAQLEMEDEDTIDVFQQQTGGVY
SEQ ID NO:4人SUMO3蛋白质的氨基酸序列,NCBI参考序列:NP_008867.2
MSEEKPKEGVKTENDHINLKVAGQDGSVVQFKIKRHTPLSKLMKAYCERQGLSMRQIRFRFDGQPINETDTPAQLEMEDEDTIDVFQQQTGGVPESSLAGHSF
SEQ ID NO:5人SUMO4蛋白质的氨基酸序列,NCBI参考序列:NP_001002255.1
MANEKPTEEVKTENNNHINLKVAGQDGSVVQFKIKRQTPLSKLMKAYCEPRGLSVKQIRFRFGGQPISGTDKPAQLEMEDEDTIDVFQQPTGGVY
SEQ ID NO:6人SUMO5蛋白质的氨基酸序列
MSDLEAKPSTEHLGDKIKDEDIKLRVIGQDSSEIHFKVKMTTPLKKLKKSYCQRQGVPVNSLRFLFEGQRIADNHTPEELGMEEEDVIEVYQEQIGGHSTV
SEQ ID NO:7人α-突触核蛋白的蛋白质的氨基酸序列,NCBI参考序列:NP_000336.1(预测的α-突触核蛋白中的SIM基序(残基37-41)加下划线)
MDVFMKGLSKAKEGVVAAAEKTKQGVAEAAGKTKEGVLYVGSKTKEGVVHGVATVAEKTKEQVTNVGGAVVTGVTAVAQKTVEGAGSIAAATGFVKKDQLGKNEEGAPQEGILEDMPVDPDNEAYEMPSEEGYQDYEPEA
表1:消化的含有硫代-GMBS交联剂的α-突触核蛋白-SUMO1二肽的理论和实验质量
表2:通过微尺度热泳测量的相互作用的解离常数
靶标 | 配体 | Kd(μM) |
NHS-647α-突触核蛋白 | SUMO1(15-55) | 4.71±1.42 |
NHS-647 WTα-突触核蛋白(1-100) | SUMO1(15-55) | 2.73±1.11 |
NHS-647 SUMO1(15-55) | αsyn(35-45) | 1.15±0.54 |
NHS-647 SUMO1(15-55) | αsyn(33-58) | 没有检测到结合 |
NHS-647 SUMO1(15-55) | αsyn(74-84) | 2.21±0.71 |
NHS-647 SUMO1(15-55) | BSA | 64.71±24.82 |
NHS-647 SUMO1(15-55) | Aβ42 | 2.94±0.69 |
表3:用于本研究的引物
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Claims (37)
1.包含核心序列的SUMO衍生的多肽,所述核心序列是SEQ ID NO:1的31-55区段,SEQID NO:3的27-51区段,或SEQ ID NO:4的26-50区段,或SEQ ID NO:5的27-51区段,或SEQ IDNO:6的31-55区段,其中所述核心序列与异源部分缀合,并且其中所述多肽抑制α-突触核蛋白聚集。
2.如权利要求1所述的多肽,其中所述异源部分是异源氨基酸序列。
3.如权利要求1所述的多肽,其中所述异源部分是可检测标记。
4.如权利要求1所述的多肽,其中所述异源部分是亲和标签。
5.如权利要求1所述的多肽,其由所述核心序列和在所述核心序列的N-末端和/或C-末端的一个或多个异源氨基酸序列组成。
6.如权利要求5所述的多肽,其由以下组成:SEQ ID NO:1的15-55、31-55、20-92或20-55区段、SEQ ID NO:3的10-51、27-51、16-88或16-51区段,或SEQ ID NO:4的10-50、26-50、15-87或15-50区段,或SEQ ID NO:5的10-51、27-51、16-88或16-51区段,或SEQ ID NO:6的15-55、31-55、20-92或20-55区段的核心序列,以及在所述核心序列的N-末端的聚精氨酸或聚组氨酸标签。
7.如权利要求6所述的多肽,其由以下组成:SEQ ID NO:1的31-55区段,SEQ ID NO:3的27-51区段,SEQ ID NO:4的26-50区段,SEQ ID NO:5的27-51区段,或SEQ ID NO:6的31-55区段的核心序列,以及在所述核心序列的N-末端的聚精氨酸或聚组氨酸标签。
8.核酸,其包含编码核心序列的多核苷酸序列,所述核心序列是SEQ ID NO:1的31-55区段,SEQ ID NO:3的27-51区段,或SEQ ID NO:4的26-50区段,或SEQ ID NO:5的27-51区段,或SEQ ID NO:6的31-55区段,其中所述核酸还包含用于在所述核心序列的N-末端和/或C-末端的至少一个异源氨基酸序列的至少一个编码序列。
9.如权利要求8所述的核酸,其编码由所述核心序列和在所述核心序列的N-末端和/或C-末端的一个或多个异源氨基酸序列组成的融合蛋白。
10.如权利要求9所述的核酸,其中所述融合蛋白由以下组成:SEQ ID NO:1的15-55、31-55、20-92或20-55区段,SEQ ID NO:3的10-51、27-51、16-88或16-51区段,或SEQ ID NO:4的10-50、26-50、15-87或15-50区段,或SEQ ID NO:5的10-51、27-51、16-88或16-51区段,或SEQ ID NO:6的15-55、31-55、20-92或20-55区段的核心序列,以及在所述核心序列的N-末端的聚精氨酸或聚组氨酸标签。
11.如权利要求10所述的核酸,其中所述融合蛋白由以下组成:SEQ ID NO:1的31-55区段,SEQ ID NO:3的27-51区段,SEQ ID NO:4的26-50区段,SEQ ID NO:5的27-51区段,或SEQID NO:6的31-55区段的核心序列,以及在所述核心序列的N-末端的聚精氨酸或聚组氨酸标签。
12.表达盒,其包含与异源启动子可操作地连接的编码权利要求1所述的多肽的多核苷酸序列。
13.如权利要求12所述的表达盒,其中所述多肽由所述核心序列和在所述核心序列的N-末端和/或C-末端的一个或多个异源氨基酸序列组成。
14.载体,其包含权利要求12或13所述的表达盒。
15.宿主细胞,其包含权利要求14所述的载体。
16.组合物,其包含生理学上可接受的赋形剂和有效量的(1)多肽或(2)编码所述多肽的核酸,所述多肽包含SEQ ID NO:1的31-55区段,SEQ ID NO:3的27-51区段,或SEQ ID NO:4的26-50区段,或SEQ ID NO:5的27-51区段,或SEQ ID NO:6的31-55区段,任选地还包含一个或多个异源氨基酸序列。
17.如权利要求16所述的组合物,其中所述多肽由SEQ ID NO:1的15-55、31-55、20-92或20-55区段,SEQ ID NO:3的10-51、27-51、16-88或16-51区段,或SEQ ID NO:4的10-50、26-50、15-87或15-50区段,或SEQ ID NO:5的10-51、27-51、16-88或16-51区段,或SEQ IDNO:6的15-55、31-55、20-92或20-55区段组成。
18.如权利要求16所述的组合物,其中所述多肽由以下组成:SEQ ID NO:1的15-55、31-55、20-92或20-55区段,SEQ ID NO:3的10-51、27-51、16-88或16-51区段,或SEQ ID NO:4的10-50、26-50、15-87或15-50区段,或SEQ ID NO:5的10-51、27-51、16-88或16-51区段,或SEQ ID NO:6的15-55、31-55、20-92或20-55区段,以及在N-末端的聚精氨酸或聚组氨酸标签。
19.如权利要求18所述的组合物,其中所述多肽由以下组成:SEQ ID NO:1的31-55区段,SEQ ID NO:3的27-51区段,SEQ ID NO:4的26-50区段,SEQ ID NO:5的27-51区段或SEQID NO:6的31-55区段,以及在N-末端的聚精氨酸或聚组氨酸标签。
20.抑制细胞中α-突触核蛋白聚集的方法,其包括使所述细胞与有效量的(1)多肽或(2)编码所述多肽的核酸接触,所述多肽包含SEQ ID NO:1的31-55区段,SEQ ID NO:3的27-51区段,或SEQ ID NO:4的26-50区段,或SEQ ID NO:5的27-51区段,或SEQ ID NO:6的31-55区段,任选地还包含一个或多个异源氨基酸序列。
21.如权利要求20所述的方法,其中所述细胞是神经元细胞。
22.如权利要求21所述的方法,其中所述神经元细胞在人类患者体内。
23.如权利要求20所述的方法,其中所述多肽由SEQ ID NO:1的15-55、31-55、20-92或20-55区段,SEQ ID NO:3的10-51、27-51、16-88或16-51区段,或SEQ ID NO:4的10-50、26-50、15-87或15-50区段,或SEQ ID NO:5的10-51、27-51、16-88或16-51区段,或SEQ ID NO:6的15-55、31-55、20-92或20-55区段组成。
24.如权利要求20所述的方法,其中所述多肽由以下组成:SEQ ID NO:1的15-55、31-55、20-92或20-55区段,SEQ ID NO:3的10-51、27-51、16-88或16-51区段,或SEQ ID NO:4的10-50、26-50、15-87或15-50区段,或SEQ ID NO:5的10-51、27-51、16-88或16-51区段,或SEQ ID NO:6的15-55、31-55、20-92或20-55区段,以及在N-末端的聚精氨酸或聚组氨酸标签。
25.如权利要求24所述的方法,其中所述多肽由以下组成:SEQ ID NO:1的31-55区段,SEQ ID NO:3的27-51区段,SEQ ID NO:4的26-50区段,SEQ ID NO:5的27-51区段或SEQ IDNO:6的31-55区段,以及在N-末端的聚精氨酸或聚组氨酸标签。
26.用于治疗有需要的人类患者中神经变性疾病的方法,其包括向所述患者施用有效量的:
(1)多肽,其包含SEQ ID NO:1的31-55区段,SEQ ID NO:3的27-51区段,或SEQ ID NO:4的26-50区段,或SEQ ID NO:5的27-51区段,或SEQ ID NO:6的31-55区段,任选地还包含一个或多个异源氨基酸序列;或
(2)编码所述多肽的核酸。
27.如权利要求26所述的方法,其中所述施用包括静脉内施用或经鼻施用。
28.如权利要求26所述的方法,其中所述多肽由SEQ ID NO:1的15-55、31-55、20-92或20-55区段,SEQ ID NO:3的10-51、27-51、16-88或16-51区段,或SEQ ID NO:4的10-50、26-50、15-87或15-50区段,或SEQ ID NO:5的10-51、27-51、16-88或16-51区段,或SEQ ID NO:6的15-55、31-55、20-92或20-55区段组成。
29.如权利要求26所述的方法,其中所述多肽包含SEQ ID NO:1的15-55、31-55、20-92或20-55区段,SEQ ID NO:3的10-51、27-51、16-88或16-51区段,或SEQ ID NO:4的10-50、26-50、15-87或15-50区段,或SEQ ID NO:5的10-51、27-51、16-88或16-51区段,或SEQ IDNO:6的15-55、31-55、20-92或20-55区段,以及在N-末端的聚精氨酸或聚组氨酸标签。
30.如权利要求29所述的方法,其中所述多肽由以下组成:SEQ ID NO:1的31-55区段,SEQ ID NO:3的27-51区段,SEQ ID NO:4的26-50区段,SEQ ID NO:5的27-51区段或SEQ IDNO:6的31-55区段,以及在N-末端的聚精氨酸或聚组氨酸标签。
31.如权利要求26所述的方法,其中所述神经变性疾病是帕金森病。
32.如权利要求31所述的方法,其中所述帕金森病是家族性帕金森病。
33.用于治疗神经变性疾病的试剂盒,其包含(1)含有多肽或编码所述多肽的核酸的第一容器,所述多肽包含SEQ ID NO:1的31-55区段,SEQ ID NO:3的27-51区段,或SEQ ID NO:4的26-50区段,或SEQ ID NO:5的27-51区段,或SEQ ID NO:6的31-55区段,任选地还包含一个或多个异源氨基酸序列;和(2)含有神经保护剂的第二容器。
34.如权利要求33所述的试剂盒,其中所述多肽包含SEQ ID NO:1的15-55、31-55、20-92或20-55区段,SEQ ID NO:3的10-51、27-51、16-88或16-51区段,或SEQ ID NO:4的10-50、26-50、15-87或15-50区段,或SEQ ID NO:5的10-51、27-51、16-88或16-51区段,或SEQ IDNO:6的15-55、31-55、20-92或20-55区段。
35.如权利要求33所述的试剂盒,其中所述多肽由以下组成:SEQ ID NO:1的15-55、31-55、20-92或20-55区段,SEQ ID NO:3的10-51、27-51、16-88或16-51区段,或SEQ ID NO:4的10-50、26-50、15-87或15-50区段,或SEQ ID NO:5的10-51、27-51、16-88或16-51区段,或SEQ ID NO:6的15-55、31-55、20-92或20-55区段,以及在N-末端的聚精氨酸或聚组氨酸标签。
36.如权利要求33所述的试剂盒,其中所述多肽由以下组成:SEQ ID NO:1的31-55区段,SEQ ID NO:3的27-51区段,SEQ ID NO:4的26-50区段,SEQ ID NO:5的27-51区段或SEQID NO:6的31-55区段,以及在N-末端的聚精氨酸或聚组氨酸标签。
37.如权利要求33所述的试剂盒,其还包含说明书手册。
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