図1は、図1Aから図1Lを含むが、これはPMLが、Atxn1 82Q及び他の核内ミスフォールドタンパク質の分解を促進することを実証した実験例の結果を示す。(図1A)Atxn1 82Q−GFPを用いてトランスフェクトされたHeLa細胞を、抗PML抗体(赤色)及びDAPI(青色)を用いて染色した。個々の画像及び合体させた画像が示されている。スケールバー、10μm。(図1B)Atxn1 82Q−GFPを単独で又はPMLと一緒にHeLa細胞内で発現させた。左、代表的な細胞の蛍光画像。スケールバー、20μm。右、Atxn1 82Q−GFP封入体のサイズに基づいた細胞の定量。(図1C)Atxn1 82Q−GFPを単独で又はPMLと一緒にHeLa細胞内で発現させたか(左)、あるいは、対照(−)又はPML siRNAを用いて事前に処置されたHeLa細胞内で単独で発現させた。細胞溶解液画分(示されている場合)及び全細胞溶解液(WCL)を、フィルター位相差アッセイ(SR画分について)又はウェスタンブロット(WB;残りについて)によって分析した。分子量標準物質(kDa単位)及びSS又はSR Atxn1対アクチンの相対比が示されている。(図1D)単独で又はPMLと一緒にHeLa細胞内で発現させた場合(左)、あるいは対照又はPML siRNAを用いて処置されたHeLa細胞内で単独で発現させた場合(右)の、WBによって分析された、FLAG−Atxn1 82Q又は30Qの定常状態レベル。(図1E)パルスチェイスアッセイ及びオートラジオグラフィーによって分析された、全FLAG−Atxn1 82Qタンパク質の安定性に対するPMLの効果。35Sで標識されたAtxn1 82Qの相対量が示されている。(図1F及び図1G)CHXによる処置及びWBによって分析された、Atxn1 82Q−GFPの安定性に対するPML過剰発現(図1F)及びノックダウン(図1G)の効果。(図1H)MG132の非存在下又は存在下におけるAtxn1 82Q−GFPレベルに対するPMLの効果。(図1I)上、PMLの非存在下又は存在下における、細胞質内(左)及び核内(右)封入体を有するHttex1p97QP発現細胞の相対的比率(平均値+標準偏差、n=3)。下、抗Htt抗体を用いて免疫染色されたトランスフェクト細胞の代表的な蛍光画像。矢頭は、Httex1p97QP凝集物を示す。(図1J及び図1K)PMLの過剰発現を伴う及び伴わない細胞内のHA−Httex1p97QP及びHA−Httex1p97QP(KR)(図1J)及びGFP−TDP−43(図1K)のレベル。実質的に全てのHtt凝集物がSR画分にあった。(図1L)CHXによる処置及びWBによって分析された、対照細胞及びPML枯渇細胞におけるnFucDM−GFPの安定性。
図1は、図1Aから図1Lを含むが、これはPMLが、Atxn1 82Q及び他の核内ミスフォールドタンパク質の分解を促進することを実証した実験例の結果を示す。(図1A)Atxn1 82Q−GFPを用いてトランスフェクトされたHeLa細胞を、抗PML抗体(赤色)及びDAPI(青色)を用いて染色した。個々の画像及び合体させた画像が示されている。スケールバー、10μm。(図1B)Atxn1 82Q−GFPを単独で又はPMLと一緒にHeLa細胞内で発現させた。左、代表的な細胞の蛍光画像。スケールバー、20μm。右、Atxn1 82Q−GFP封入体のサイズに基づいた細胞の定量。(図1C)Atxn1 82Q−GFPを単独で又はPMLと一緒にHeLa細胞内で発現させたか(左)、あるいは、対照(−)又はPML siRNAを用いて事前に処置されたHeLa細胞内で単独で発現させた。細胞溶解液画分(示されている場合)及び全細胞溶解液(WCL)を、フィルター位相差アッセイ(SR画分について)又はウェスタンブロット(WB;残りについて)によって分析した。分子量標準物質(kDa単位)及びSS又はSR Atxn1対アクチンの相対比が示されている。(図1D)単独で又はPMLと一緒にHeLa細胞内で発現させた場合(左)、あるいは対照又はPML siRNAを用いて処置されたHeLa細胞内で単独で発現させた場合(右)の、WBによって分析された、FLAG−Atxn1 82Q又は30Qの定常状態レベル。(図1E)パルスチェイスアッセイ及びオートラジオグラフィーによって分析された、全FLAG−Atxn1 82Qタンパク質の安定性に対するPMLの効果。35Sで標識されたAtxn1 82Qの相対量が示されている。(図1F及び図1G)CHXによる処置及びWBによって分析された、Atxn1 82Q−GFPの安定性に対するPML過剰発現(図1F)及びノックダウン(図1G)の効果。(図1H)MG132の非存在下又は存在下におけるAtxn1 82Q−GFPレベルに対するPMLの効果。(図1I)上、PMLの非存在下又は存在下における、細胞質内(左)及び核内(右)封入体を有するHttex1p97QP発現細胞の相対的比率(平均値+標準偏差、n=3)。下、抗Htt抗体を用いて免疫染色されたトランスフェクト細胞の代表的な蛍光画像。矢頭は、Httex1p97QP凝集物を示す。(図1J及び図1K)PMLの過剰発現を伴う及び伴わない細胞内のHA−Httex1p97QP及びHA−Httex1p97QP(KR)(図1J)及びGFP−TDP−43(図1K)のレベル。実質的に全てのHtt凝集物がSR画分にあった。(図1L)CHXによる処置及びWBによって分析された、対照細胞及びPML枯渇細胞におけるnFucDM−GFPの安定性。
図1は、図1Aから図1Lを含むが、これはPMLが、Atxn1 82Q及び他の核内ミスフォールドタンパク質の分解を促進することを実証した実験例の結果を示す。(図1A)Atxn1 82Q−GFPを用いてトランスフェクトされたHeLa細胞を、抗PML抗体(赤色)及びDAPI(青色)を用いて染色した。個々の画像及び合体させた画像が示されている。スケールバー、10μm。(図1B)Atxn1 82Q−GFPを単独で又はPMLと一緒にHeLa細胞内で発現させた。左、代表的な細胞の蛍光画像。スケールバー、20μm。右、Atxn1 82Q−GFP封入体のサイズに基づいた細胞の定量。(図1C)Atxn1 82Q−GFPを単独で又はPMLと一緒にHeLa細胞内で発現させたか(左)、あるいは、対照(−)又はPML siRNAを用いて事前に処置されたHeLa細胞内で単独で発現させた。細胞溶解液画分(示されている場合)及び全細胞溶解液(WCL)を、フィルター位相差アッセイ(SR画分について)又はウェスタンブロット(WB;残りについて)によって分析した。分子量標準物質(kDa単位)及びSS又はSR Atxn1対アクチンの相対比が示されている。(図1D)単独で又はPMLと一緒にHeLa細胞内で発現させた場合(左)、あるいは対照又はPML siRNAを用いて処置されたHeLa細胞内で単独で発現させた場合(右)の、WBによって分析された、FLAG−Atxn1 82Q又は30Qの定常状態レベル。(図1E)パルスチェイスアッセイ及びオートラジオグラフィーによって分析された、全FLAG−Atxn1 82Qタンパク質の安定性に対するPMLの効果。35Sで標識されたAtxn1 82Qの相対量が示されている。(図1F及び図1G)CHXによる処置及びWBによって分析された、Atxn1 82Q−GFPの安定性に対するPML過剰発現(図1F)及びノックダウン(図1G)の効果。(図1H)MG132の非存在下又は存在下におけるAtxn1 82Q−GFPレベルに対するPMLの効果。(図1I)上、PMLの非存在下又は存在下における、細胞質内(左)及び核内(右)封入体を有するHttex1p97QP発現細胞の相対的比率(平均値+標準偏差、n=3)。下、抗Htt抗体を用いて免疫染色されたトランスフェクト細胞の代表的な蛍光画像。矢頭は、Httex1p97QP凝集物を示す。(図1J及び図1K)PMLの過剰発現を伴う及び伴わない細胞内のHA−Httex1p97QP及びHA−Httex1p97QP(KR)(図1J)及びGFP−TDP−43(図1K)のレベル。実質的に全てのHtt凝集物がSR画分にあった。(図1L)CHXによる処置及びWBによって分析された、対照細胞及びPML枯渇細胞におけるnFucDM−GFPの安定性。
図1は、図1Aから図1Lを含むが、これはPMLが、Atxn1 82Q及び他の核内ミスフォールドタンパク質の分解を促進することを実証した実験例の結果を示す。(図1A)Atxn1 82Q−GFPを用いてトランスフェクトされたHeLa細胞を、抗PML抗体(赤色)及びDAPI(青色)を用いて染色した。個々の画像及び合体させた画像が示されている。スケールバー、10μm。(図1B)Atxn1 82Q−GFPを単独で又はPMLと一緒にHeLa細胞内で発現させた。左、代表的な細胞の蛍光画像。スケールバー、20μm。右、Atxn1 82Q−GFP封入体のサイズに基づいた細胞の定量。(図1C)Atxn1 82Q−GFPを単独で又はPMLと一緒にHeLa細胞内で発現させたか(左)、あるいは、対照(−)又はPML siRNAを用いて事前に処置されたHeLa細胞内で単独で発現させた。細胞溶解液画分(示されている場合)及び全細胞溶解液(WCL)を、フィルター位相差アッセイ(SR画分について)又はウェスタンブロット(WB;残りについて)によって分析した。分子量標準物質(kDa単位)及びSS又はSR Atxn1対アクチンの相対比が示されている。(図1D)単独で又はPMLと一緒にHeLa細胞内で発現させた場合(左)、あるいは対照又はPML siRNAを用いて処置されたHeLa細胞内で単独で発現させた場合(右)の、WBによって分析された、FLAG−Atxn1 82Q又は30Qの定常状態レベル。(図1E)パルスチェイスアッセイ及びオートラジオグラフィーによって分析された、全FLAG−Atxn1 82Qタンパク質の安定性に対するPMLの効果。35Sで標識されたAtxn1 82Qの相対量が示されている。(図1F及び図1G)CHXによる処置及びWBによって分析された、Atxn1 82Q−GFPの安定性に対するPML過剰発現(図1F)及びノックダウン(図1G)の効果。(図1H)MG132の非存在下又は存在下におけるAtxn1 82Q−GFPレベルに対するPMLの効果。(図1I)上、PMLの非存在下又は存在下における、細胞質内(左)及び核内(右)封入体を有するHttex1p97QP発現細胞の相対的比率(平均値+標準偏差、n=3)。下、抗Htt抗体を用いて免疫染色されたトランスフェクト細胞の代表的な蛍光画像。矢頭は、Httex1p97QP凝集物を示す。(図1J及び図1K)PMLの過剰発現を伴う及び伴わない細胞内のHA−Httex1p97QP及びHA−Httex1p97QP(KR)(図1J)及びGFP−TDP−43(図1K)のレベル。実質的に全てのHtt凝集物がSR画分にあった。(図1L)CHXによる処置及びWBによって分析された、対照細胞及びPML枯渇細胞におけるnFucDM−GFPの安定性。
図1は、図1Aから図1Lを含むが、これはPMLが、Atxn1 82Q及び他の核内ミスフォールドタンパク質の分解を促進することを実証した実験例の結果を示す。(図1A)Atxn1 82Q−GFPを用いてトランスフェクトされたHeLa細胞を、抗PML抗体(赤色)及びDAPI(青色)を用いて染色した。個々の画像及び合体させた画像が示されている。スケールバー、10μm。(図1B)Atxn1 82Q−GFPを単独で又はPMLと一緒にHeLa細胞内で発現させた。左、代表的な細胞の蛍光画像。スケールバー、20μm。右、Atxn1 82Q−GFP封入体のサイズに基づいた細胞の定量。(図1C)Atxn1 82Q−GFPを単独で又はPMLと一緒にHeLa細胞内で発現させたか(左)、あるいは、対照(−)又はPML siRNAを用いて事前に処置されたHeLa細胞内で単独で発現させた。細胞溶解液画分(示されている場合)及び全細胞溶解液(WCL)を、フィルター位相差アッセイ(SR画分について)又はウェスタンブロット(WB;残りについて)によって分析した。分子量標準物質(kDa単位)及びSS又はSR Atxn1対アクチンの相対比が示されている。(図1D)単独で又はPMLと一緒にHeLa細胞内で発現させた場合(左)、あるいは対照又はPML siRNAを用いて処置されたHeLa細胞内で単独で発現させた場合(右)の、WBによって分析された、FLAG−Atxn1 82Q又は30Qの定常状態レベル。(図1E)パルスチェイスアッセイ及びオートラジオグラフィーによって分析された、全FLAG−Atxn1 82Qタンパク質の安定性に対するPMLの効果。35Sで標識されたAtxn1 82Qの相対量が示されている。(図1F及び図1G)CHXによる処置及びWBによって分析された、Atxn1 82Q−GFPの安定性に対するPML過剰発現(図1F)及びノックダウン(図1G)の効果。(図1H)MG132の非存在下又は存在下におけるAtxn1 82Q−GFPレベルに対するPMLの効果。(図1I)上、PMLの非存在下又は存在下における、細胞質内(左)及び核内(右)封入体を有するHttex1p97QP発現細胞の相対的比率(平均値+標準偏差、n=3)。下、抗Htt抗体を用いて免疫染色されたトランスフェクト細胞の代表的な蛍光画像。矢頭は、Httex1p97QP凝集物を示す。(図1J及び図1K)PMLの過剰発現を伴う及び伴わない細胞内のHA−Httex1p97QP及びHA−Httex1p97QP(KR)(図1J)及びGFP−TDP−43(図1K)のレベル。実質的に全てのHtt凝集物がSR画分にあった。(図1L)CHXによる処置及びWBによって分析された、対照細胞及びPML枯渇細胞におけるnFucDM−GFPの安定性。
図1は、図1Aから図1Lを含むが、これはPMLが、Atxn1 82Q及び他の核内ミスフォールドタンパク質の分解を促進することを実証した実験例の結果を示す。(図1A)Atxn1 82Q−GFPを用いてトランスフェクトされたHeLa細胞を、抗PML抗体(赤色)及びDAPI(青色)を用いて染色した。個々の画像及び合体させた画像が示されている。スケールバー、10μm。(図1B)Atxn1 82Q−GFPを単独で又はPMLと一緒にHeLa細胞内で発現させた。左、代表的な細胞の蛍光画像。スケールバー、20μm。右、Atxn1 82Q−GFP封入体のサイズに基づいた細胞の定量。(図1C)Atxn1 82Q−GFPを単独で又はPMLと一緒にHeLa細胞内で発現させたか(左)、あるいは、対照(−)又はPML siRNAを用いて事前に処置されたHeLa細胞内で単独で発現させた。細胞溶解液画分(示されている場合)及び全細胞溶解液(WCL)を、フィルター位相差アッセイ(SR画分について)又はウェスタンブロット(WB;残りについて)によって分析した。分子量標準物質(kDa単位)及びSS又はSR Atxn1対アクチンの相対比が示されている。(図1D)単独で又はPMLと一緒にHeLa細胞内で発現させた場合(左)、あるいは対照又はPML siRNAを用いて処置されたHeLa細胞内で単独で発現させた場合(右)の、WBによって分析された、FLAG−Atxn1 82Q又は30Qの定常状態レベル。(図1E)パルスチェイスアッセイ及びオートラジオグラフィーによって分析された、全FLAG−Atxn1 82Qタンパク質の安定性に対するPMLの効果。35Sで標識されたAtxn1 82Qの相対量が示されている。(図1F及び図1G)CHXによる処置及びWBによって分析された、Atxn1 82Q−GFPの安定性に対するPML過剰発現(図1F)及びノックダウン(図1G)の効果。(図1H)MG132の非存在下又は存在下におけるAtxn1 82Q−GFPレベルに対するPMLの効果。(図1I)上、PMLの非存在下又は存在下における、細胞質内(左)及び核内(右)封入体を有するHttex1p97QP発現細胞の相対的比率(平均値+標準偏差、n=3)。下、抗Htt抗体を用いて免疫染色されたトランスフェクト細胞の代表的な蛍光画像。矢頭は、Httex1p97QP凝集物を示す。(図1J及び図1K)PMLの過剰発現を伴う及び伴わない細胞内のHA−Httex1p97QP及びHA−Httex1p97QP(KR)(図1J)及びGFP−TDP−43(図1K)のレベル。実質的に全てのHtt凝集物がSR画分にあった。(図1L)CHXによる処置及びWBによって分析された、対照細胞及びPML枯渇細胞におけるnFucDM−GFPの安定性。
図1は、図1Aから図1Lを含むが、これはPMLが、Atxn1 82Q及び他の核内ミスフォールドタンパク質の分解を促進することを実証した実験例の結果を示す。(図1A)Atxn1 82Q−GFPを用いてトランスフェクトされたHeLa細胞を、抗PML抗体(赤色)及びDAPI(青色)を用いて染色した。個々の画像及び合体させた画像が示されている。スケールバー、10μm。(図1B)Atxn1 82Q−GFPを単独で又はPMLと一緒にHeLa細胞内で発現させた。左、代表的な細胞の蛍光画像。スケールバー、20μm。右、Atxn1 82Q−GFP封入体のサイズに基づいた細胞の定量。(図1C)Atxn1 82Q−GFPを単独で又はPMLと一緒にHeLa細胞内で発現させたか(左)、あるいは、対照(−)又はPML siRNAを用いて事前に処置されたHeLa細胞内で単独で発現させた。細胞溶解液画分(示されている場合)及び全細胞溶解液(WCL)を、フィルター位相差アッセイ(SR画分について)又はウェスタンブロット(WB;残りについて)によって分析した。分子量標準物質(kDa単位)及びSS又はSR Atxn1対アクチンの相対比が示されている。(図1D)単独で又はPMLと一緒にHeLa細胞内で発現させた場合(左)、あるいは対照又はPML siRNAを用いて処置されたHeLa細胞内で単独で発現させた場合(右)の、WBによって分析された、FLAG−Atxn1 82Q又は30Qの定常状態レベル。(図1E)パルスチェイスアッセイ及びオートラジオグラフィーによって分析された、全FLAG−Atxn1 82Qタンパク質の安定性に対するPMLの効果。35Sで標識されたAtxn1 82Qの相対量が示されている。(図1F及び図1G)CHXによる処置及びWBによって分析された、Atxn1 82Q−GFPの安定性に対するPML過剰発現(図1F)及びノックダウン(図1G)の効果。(図1H)MG132の非存在下又は存在下におけるAtxn1 82Q−GFPレベルに対するPMLの効果。(図1I)上、PMLの非存在下又は存在下における、細胞質内(左)及び核内(右)封入体を有するHttex1p97QP発現細胞の相対的比率(平均値+標準偏差、n=3)。下、抗Htt抗体を用いて免疫染色されたトランスフェクト細胞の代表的な蛍光画像。矢頭は、Httex1p97QP凝集物を示す。(図1J及び図1K)PMLの過剰発現を伴う及び伴わない細胞内のHA−Httex1p97QP及びHA−Httex1p97QP(KR)(図1J)及びGFP−TDP−43(図1K)のレベル。実質的に全てのHtt凝集物がSR画分にあった。(図1L)CHXによる処置及びWBによって分析された、対照細胞及びPML枯渇細胞におけるnFucDM−GFPの安定性。
図1は、図1Aから図1Lを含むが、これはPMLが、Atxn1 82Q及び他の核内ミスフォールドタンパク質の分解を促進することを実証した実験例の結果を示す。(図1A)Atxn1 82Q−GFPを用いてトランスフェクトされたHeLa細胞を、抗PML抗体(赤色)及びDAPI(青色)を用いて染色した。個々の画像及び合体させた画像が示されている。スケールバー、10μm。(図1B)Atxn1 82Q−GFPを単独で又はPMLと一緒にHeLa細胞内で発現させた。左、代表的な細胞の蛍光画像。スケールバー、20μm。右、Atxn1 82Q−GFP封入体のサイズに基づいた細胞の定量。(図1C)Atxn1 82Q−GFPを単独で又はPMLと一緒にHeLa細胞内で発現させたか(左)、あるいは、対照(−)又はPML siRNAを用いて事前に処置されたHeLa細胞内で単独で発現させた。細胞溶解液画分(示されている場合)及び全細胞溶解液(WCL)を、フィルター位相差アッセイ(SR画分について)又はウェスタンブロット(WB;残りについて)によって分析した。分子量標準物質(kDa単位)及びSS又はSR Atxn1対アクチンの相対比が示されている。(図1D)単独で又はPMLと一緒にHeLa細胞内で発現させた場合(左)、あるいは対照又はPML siRNAを用いて処置されたHeLa細胞内で単独で発現させた場合(右)の、WBによって分析された、FLAG−Atxn1 82Q又は30Qの定常状態レベル。(図1E)パルスチェイスアッセイ及びオートラジオグラフィーによって分析された、全FLAG−Atxn1 82Qタンパク質の安定性に対するPMLの効果。35Sで標識されたAtxn1 82Qの相対量が示されている。(図1F及び図1G)CHXによる処置及びWBによって分析された、Atxn1 82Q−GFPの安定性に対するPML過剰発現(図1F)及びノックダウン(図1G)の効果。(図1H)MG132の非存在下又は存在下におけるAtxn1 82Q−GFPレベルに対するPMLの効果。(図1I)上、PMLの非存在下又は存在下における、細胞質内(左)及び核内(右)封入体を有するHttex1p97QP発現細胞の相対的比率(平均値+標準偏差、n=3)。下、抗Htt抗体を用いて免疫染色されたトランスフェクト細胞の代表的な蛍光画像。矢頭は、Httex1p97QP凝集物を示す。(図1J及び図1K)PMLの過剰発現を伴う及び伴わない細胞内のHA−Httex1p97QP及びHA−Httex1p97QP(KR)(図1J)及びGFP−TDP−43(図1K)のレベル。実質的に全てのHtt凝集物がSR画分にあった。(図1L)CHXによる処置及びWBによって分析された、対照細胞及びPML枯渇細胞におけるnFucDM−GFPの安定性。
図1は、図1Aから図1Lを含むが、これはPMLが、Atxn1 82Q及び他の核内ミスフォールドタンパク質の分解を促進することを実証した実験例の結果を示す。(図1A)Atxn1 82Q−GFPを用いてトランスフェクトされたHeLa細胞を、抗PML抗体(赤色)及びDAPI(青色)を用いて染色した。個々の画像及び合体させた画像が示されている。スケールバー、10μm。(図1B)Atxn1 82Q−GFPを単独で又はPMLと一緒にHeLa細胞内で発現させた。左、代表的な細胞の蛍光画像。スケールバー、20μm。右、Atxn1 82Q−GFP封入体のサイズに基づいた細胞の定量。(図1C)Atxn1 82Q−GFPを単独で又はPMLと一緒にHeLa細胞内で発現させたか(左)、あるいは、対照(−)又はPML siRNAを用いて事前に処置されたHeLa細胞内で単独で発現させた。細胞溶解液画分(示されている場合)及び全細胞溶解液(WCL)を、フィルター位相差アッセイ(SR画分について)又はウェスタンブロット(WB;残りについて)によって分析した。分子量標準物質(kDa単位)及びSS又はSR Atxn1対アクチンの相対比が示されている。(図1D)単独で又はPMLと一緒にHeLa細胞内で発現させた場合(左)、あるいは対照又はPML siRNAを用いて処置されたHeLa細胞内で単独で発現させた場合(右)の、WBによって分析された、FLAG−Atxn1 82Q又は30Qの定常状態レベル。(図1E)パルスチェイスアッセイ及びオートラジオグラフィーによって分析された、全FLAG−Atxn1 82Qタンパク質の安定性に対するPMLの効果。35Sで標識されたAtxn1 82Qの相対量が示されている。(図1F及び図1G)CHXによる処置及びWBによって分析された、Atxn1 82Q−GFPの安定性に対するPML過剰発現(図1F)及びノックダウン(図1G)の効果。(図1H)MG132の非存在下又は存在下におけるAtxn1 82Q−GFPレベルに対するPMLの効果。(図1I)上、PMLの非存在下又は存在下における、細胞質内(左)及び核内(右)封入体を有するHttex1p97QP発現細胞の相対的比率(平均値+標準偏差、n=3)。下、抗Htt抗体を用いて免疫染色されたトランスフェクト細胞の代表的な蛍光画像。矢頭は、Httex1p97QP凝集物を示す。(図1J及び図1K)PMLの過剰発現を伴う及び伴わない細胞内のHA−Httex1p97QP及びHA−Httex1p97QP(KR)(図1J)及びGFP−TDP−43(図1K)のレベル。実質的に全てのHtt凝集物がSR画分にあった。(図1L)CHXによる処置及びWBによって分析された、対照細胞及びPML枯渇細胞におけるnFucDM−GFPの安定性。
図1は、図1Aから図1Lを含むが、これはPMLが、Atxn1 82Q及び他の核内ミスフォールドタンパク質の分解を促進することを実証した実験例の結果を示す。(図1A)Atxn1 82Q−GFPを用いてトランスフェクトされたHeLa細胞を、抗PML抗体(赤色)及びDAPI(青色)を用いて染色した。個々の画像及び合体させた画像が示されている。スケールバー、10μm。(図1B)Atxn1 82Q−GFPを単独で又はPMLと一緒にHeLa細胞内で発現させた。左、代表的な細胞の蛍光画像。スケールバー、20μm。右、Atxn1 82Q−GFP封入体のサイズに基づいた細胞の定量。(図1C)Atxn1 82Q−GFPを単独で又はPMLと一緒にHeLa細胞内で発現させたか(左)、あるいは、対照(−)又はPML siRNAを用いて事前に処置されたHeLa細胞内で単独で発現させた。細胞溶解液画分(示されている場合)及び全細胞溶解液(WCL)を、フィルター位相差アッセイ(SR画分について)又はウェスタンブロット(WB;残りについて)によって分析した。分子量標準物質(kDa単位)及びSS又はSR Atxn1対アクチンの相対比が示されている。(図1D)単独で又はPMLと一緒にHeLa細胞内で発現させた場合(左)、あるいは対照又はPML siRNAを用いて処置されたHeLa細胞内で単独で発現させた場合(右)の、WBによって分析された、FLAG−Atxn1 82Q又は30Qの定常状態レベル。(図1E)パルスチェイスアッセイ及びオートラジオグラフィーによって分析された、全FLAG−Atxn1 82Qタンパク質の安定性に対するPMLの効果。35Sで標識されたAtxn1 82Qの相対量が示されている。(図1F及び図1G)CHXによる処置及びWBによって分析された、Atxn1 82Q−GFPの安定性に対するPML過剰発現(図1F)及びノックダウン(図1G)の効果。(図1H)MG132の非存在下又は存在下におけるAtxn1 82Q−GFPレベルに対するPMLの効果。(図1I)上、PMLの非存在下又は存在下における、細胞質内(左)及び核内(右)封入体を有するHttex1p97QP発現細胞の相対的比率(平均値+標準偏差、n=3)。下、抗Htt抗体を用いて免疫染色されたトランスフェクト細胞の代表的な蛍光画像。矢頭は、Httex1p97QP凝集物を示す。(図1J及び図1K)PMLの過剰発現を伴う及び伴わない細胞内のHA−Httex1p97QP及びHA−Httex1p97QP(KR)(図1J)及びGFP−TDP−43(図1K)のレベル。実質的に全てのHtt凝集物がSR画分にあった。(図1L)CHXによる処置及びWBによって分析された、対照細胞及びPML枯渇細胞におけるnFucDM−GFPの安定性。
図1は、図1Aから図1Lを含むが、これはPMLが、Atxn1 82Q及び他の核内ミスフォールドタンパク質の分解を促進することを実証した実験例の結果を示す。(図1A)Atxn1 82Q−GFPを用いてトランスフェクトされたHeLa細胞を、抗PML抗体(赤色)及びDAPI(青色)を用いて染色した。個々の画像及び合体させた画像が示されている。スケールバー、10μm。(図1B)Atxn1 82Q−GFPを単独で又はPMLと一緒にHeLa細胞内で発現させた。左、代表的な細胞の蛍光画像。スケールバー、20μm。右、Atxn1 82Q−GFP封入体のサイズに基づいた細胞の定量。(図1C)Atxn1 82Q−GFPを単独で又はPMLと一緒にHeLa細胞内で発現させたか(左)、あるいは、対照(−)又はPML siRNAを用いて事前に処置されたHeLa細胞内で単独で発現させた。細胞溶解液画分(示されている場合)及び全細胞溶解液(WCL)を、フィルター位相差アッセイ(SR画分について)又はウェスタンブロット(WB;残りについて)によって分析した。分子量標準物質(kDa単位)及びSS又はSR Atxn1対アクチンの相対比が示されている。(図1D)単独で又はPMLと一緒にHeLa細胞内で発現させた場合(左)、あるいは対照又はPML siRNAを用いて処置されたHeLa細胞内で単独で発現させた場合(右)の、WBによって分析された、FLAG−Atxn1 82Q又は30Qの定常状態レベル。(図1E)パルスチェイスアッセイ及びオートラジオグラフィーによって分析された、全FLAG−Atxn1 82Qタンパク質の安定性に対するPMLの効果。35Sで標識されたAtxn1 82Qの相対量が示されている。(図1F及び図1G)CHXによる処置及びWBによって分析された、Atxn1 82Q−GFPの安定性に対するPML過剰発現(図1F)及びノックダウン(図1G)の効果。(図1H)MG132の非存在下又は存在下におけるAtxn1 82Q−GFPレベルに対するPMLの効果。(図1I)上、PMLの非存在下又は存在下における、細胞質内(左)及び核内(右)封入体を有するHttex1p97QP発現細胞の相対的比率(平均値+標準偏差、n=3)。下、抗Htt抗体を用いて免疫染色されたトランスフェクト細胞の代表的な蛍光画像。矢頭は、Httex1p97QP凝集物を示す。(図1J及び図1K)PMLの過剰発現を伴う及び伴わない細胞内のHA−Httex1p97QP及びHA−Httex1p97QP(KR)(図1J)及びGFP−TDP−43(図1K)のレベル。実質的に全てのHtt凝集物がSR画分にあった。(図1L)CHXによる処置及びWBによって分析された、対照細胞及びPML枯渇細胞におけるnFucDM−GFPの安定性。
図1は、図1Aから図1Lを含むが、これはPMLが、Atxn1 82Q及び他の核内ミスフォールドタンパク質の分解を促進することを実証した実験例の結果を示す。(図1A)Atxn1 82Q−GFPを用いてトランスフェクトされたHeLa細胞を、抗PML抗体(赤色)及びDAPI(青色)を用いて染色した。個々の画像及び合体させた画像が示されている。スケールバー、10μm。(図1B)Atxn1 82Q−GFPを単独で又はPMLと一緒にHeLa細胞内で発現させた。左、代表的な細胞の蛍光画像。スケールバー、20μm。右、Atxn1 82Q−GFP封入体のサイズに基づいた細胞の定量。(図1C)Atxn1 82Q−GFPを単独で又はPMLと一緒にHeLa細胞内で発現させたか(左)、あるいは、対照(−)又はPML siRNAを用いて事前に処置されたHeLa細胞内で単独で発現させた。細胞溶解液画分(示されている場合)及び全細胞溶解液(WCL)を、フィルター位相差アッセイ(SR画分について)又はウェスタンブロット(WB;残りについて)によって分析した。分子量標準物質(kDa単位)及びSS又はSR Atxn1対アクチンの相対比が示されている。(図1D)単独で又はPMLと一緒にHeLa細胞内で発現させた場合(左)、あるいは対照又はPML siRNAを用いて処置されたHeLa細胞内で単独で発現させた場合(右)の、WBによって分析された、FLAG−Atxn1 82Q又は30Qの定常状態レベル。(図1E)パルスチェイスアッセイ及びオートラジオグラフィーによって分析された、全FLAG−Atxn1 82Qタンパク質の安定性に対するPMLの効果。35Sで標識されたAtxn1 82Qの相対量が示されている。(図1F及び図1G)CHXによる処置及びWBによって分析された、Atxn1 82Q−GFPの安定性に対するPML過剰発現(図1F)及びノックダウン(図1G)の効果。(図1H)MG132の非存在下又は存在下におけるAtxn1 82Q−GFPレベルに対するPMLの効果。(図1I)上、PMLの非存在下又は存在下における、細胞質内(左)及び核内(右)封入体を有するHttex1p97QP発現細胞の相対的比率(平均値+標準偏差、n=3)。下、抗Htt抗体を用いて免疫染色されたトランスフェクト細胞の代表的な蛍光画像。矢頭は、Httex1p97QP凝集物を示す。(図1J及び図1K)PMLの過剰発現を伴う及び伴わない細胞内のHA−Httex1p97QP及びHA−Httex1p97QP(KR)(図1J)及びGFP−TDP−43(図1K)のレベル。実質的に全てのHtt凝集物がSR画分にあった。(図1L)CHXによる処置及びWBによって分析された、対照細胞及びPML枯渇細胞におけるnFucDM−GFPの安定性。
図2は、図2Aから図2Eを含むが、これはPMLによるミスフォールドタンパク質の認識を実証する実験例の結果を示す。(図2A)インビトロプルダウンアッセイ、その後のWB(上及び下)及びポンソーS染色(中央)によって分析された、固定されたFLAG−PML及びFLAG−GFP(陰性対照)へのGST−Htt25Q及びGST−Htt103Qの結合。*IgG重鎖。(図2B)(図2A)のように分析された、Ni−NTAビーズ上に固定された天然(N)及び尿素で変性させた(D)ルシフェラーゼ(luc)に対する、GST−PML(右に示される)及び対照GSTタンパク質の結合。*対照ビーズに結合させたBL21細菌溶解液に由来する非特異的タンパク質。(図2C)WB(上及び中央)及びクーマシー染色(下)によって分析された、抗FlagM2ビーズ又は対照ビーズにコンジュゲートさせたFLAG−PML CCへの示されたGST−Htt融合物の結合。(図2D)ルシフェラーゼ由来のペプチドライブラリーに対するPML F12/SRS2(右に示される)の結合。各列にスポットされた最初のペプチドのN末端アミノ酸及び最後のペプチドの番号が示されている。(図2E)ルシフェラーゼペプチドアレイにおけるその存在率と比較した(100%に設定)、PML SRS2結合ペプチドにおける各アミノ酸の存在率。
図2は、図2Aから図2Eを含むが、これはPMLによるミスフォールドタンパク質の認識を実証する実験例の結果を示す。(図2A)インビトロプルダウンアッセイ、その後のWB(上及び下)及びポンソーS染色(中央)によって分析された、固定されたFLAG−PML及びFLAG−GFP(陰性対照)へのGST−Htt25Q及びGST−Htt103Qの結合。*IgG重鎖。(図2B)(図2A)のように分析された、Ni−NTAビーズ上に固定された天然(N)及び尿素で変性させた(D)ルシフェラーゼ(luc)に対する、GST−PML(右に示される)及び対照GSTタンパク質の結合。*対照ビーズに結合させたBL21細菌溶解液に由来する非特異的タンパク質。(図2C)WB(上及び中央)及びクーマシー染色(下)によって分析された、抗FlagM2ビーズ又は対照ビーズにコンジュゲートさせたFLAG−PML CCへの示されたGST−Htt融合物の結合。(図2D)ルシフェラーゼ由来のペプチドライブラリーに対するPML F12/SRS2(右に示される)の結合。各列にスポットされた最初のペプチドのN末端アミノ酸及び最後のペプチドの番号が示されている。(図2E)ルシフェラーゼペプチドアレイにおけるその存在率と比較した(100%に設定)、PML SRS2結合ペプチドにおける各アミノ酸の存在率。
図2は、図2Aから図2Eを含むが、これはPMLによるミスフォールドタンパク質の認識を実証する実験例の結果を示す。(図2A)インビトロプルダウンアッセイ、その後のWB(上及び下)及びポンソーS染色(中央)によって分析された、固定されたFLAG−PML及びFLAG−GFP(陰性対照)へのGST−Htt25Q及びGST−Htt103Qの結合。*IgG重鎖。(図2B)(図2A)のように分析された、Ni−NTAビーズ上に固定された天然(N)及び尿素で変性させた(D)ルシフェラーゼ(luc)に対する、GST−PML(右に示される)及び対照GSTタンパク質の結合。*対照ビーズに結合させたBL21細菌溶解液に由来する非特異的タンパク質。(図2C)WB(上及び中央)及びクーマシー染色(下)によって分析された、抗FlagM2ビーズ又は対照ビーズにコンジュゲートさせたFLAG−PML CCへの示されたGST−Htt融合物の結合。(図2D)ルシフェラーゼ由来のペプチドライブラリーに対するPML F12/SRS2(右に示される)の結合。各列にスポットされた最初のペプチドのN末端アミノ酸及び最後のペプチドの番号が示されている。(図2E)ルシフェラーゼペプチドアレイにおけるその存在率と比較した(100%に設定)、PML SRS2結合ペプチドにおける各アミノ酸の存在率。
図2は、図2Aから図2Eを含むが、これはPMLによるミスフォールドタンパク質の認識を実証する実験例の結果を示す。(図2A)インビトロプルダウンアッセイ、その後のWB(上及び下)及びポンソーS染色(中央)によって分析された、固定されたFLAG−PML及びFLAG−GFP(陰性対照)へのGST−Htt25Q及びGST−Htt103Qの結合。*IgG重鎖。(図2B)(図2A)のように分析された、Ni−NTAビーズ上に固定された天然(N)及び尿素で変性させた(D)ルシフェラーゼ(luc)に対する、GST−PML(右に示される)及び対照GSTタンパク質の結合。*対照ビーズに結合させたBL21細菌溶解液に由来する非特異的タンパク質。(図2C)WB(上及び中央)及びクーマシー染色(下)によって分析された、抗FlagM2ビーズ又は対照ビーズにコンジュゲートさせたFLAG−PML CCへの示されたGST−Htt融合物の結合。(図2D)ルシフェラーゼ由来のペプチドライブラリーに対するPML F12/SRS2(右に示される)の結合。各列にスポットされた最初のペプチドのN末端アミノ酸及び最後のペプチドの番号が示されている。(図2E)ルシフェラーゼペプチドアレイにおけるその存在率と比較した(100%に設定)、PML SRS2結合ペプチドにおける各アミノ酸の存在率。
図2は、図2Aから図2Eを含むが、これはPMLによるミスフォールドタンパク質の認識を実証する実験例の結果を示す。(図2A)インビトロプルダウンアッセイ、その後のWB(上及び下)及びポンソーS染色(中央)によって分析された、固定されたFLAG−PML及びFLAG−GFP(陰性対照)へのGST−Htt25Q及びGST−Htt103Qの結合。*IgG重鎖。(図2B)(図2A)のように分析された、Ni−NTAビーズ上に固定された天然(N)及び尿素で変性させた(D)ルシフェラーゼ(luc)に対する、GST−PML(右に示される)及び対照GSTタンパク質の結合。*対照ビーズに結合させたBL21細菌溶解液に由来する非特異的タンパク質。(図2C)WB(上及び中央)及びクーマシー染色(下)によって分析された、抗FlagM2ビーズ又は対照ビーズにコンジュゲートさせたFLAG−PML CCへの示されたGST−Htt融合物の結合。(図2D)ルシフェラーゼ由来のペプチドライブラリーに対するPML F12/SRS2(右に示される)の結合。各列にスポットされた最初のペプチドのN末端アミノ酸及び最後のペプチドの番号が示されている。(図2E)ルシフェラーゼペプチドアレイにおけるその存在率と比較した(100%に設定)、PML SRS2結合ペプチドにおける各アミノ酸の存在率。
図3は、図3Aから図3Fを含むが、これはSUMO2/3が、Atxn1 82Qのユビキチン化及びPMLにより媒介される分解に関与していることを実証する、実験例の結果を示す。(図3A)MG132を用いずに又は用いて処置されたHeLa細胞におけるSUMO1及びSUMO2/3によるAtxn1 82Qの修飾。修飾されたAtxn1 82Qをより良く比較するために、同じようなレベルの未修飾のAtxn1 82Qを含む変性免疫沈降(d−IP)産物をWBによって分析した。*非特異的バンド。(図3B)MG132を用いて又は用いずに処置されたGFP−SUMO2又はGFP−SUMO3発現U2OS細胞におけるAtxn1 82Q(抗FLAG抗体によって検出、赤色)の局在化。スケールバー、10μm。(図3C)d−IP、その後のWB(上)及びポンリーS染色(下)によって分析された、HeLa細胞におけるSUMO2/3によるAtxn1 82Q及び30Qの修飾。(図3D)Atxn1 82Qを、示されたsiRNAを用いて事前にトランスフェクトされたか又はトランスフェクトされていない(−)HeLa細胞において、単独で又はSUMO1若しくはHA−SUMO2 KRと一緒に発現させた。細胞をMG132を用いて又は用いずに処置した。FLAG−Atxn1 82QのSUMO化及びユビキチン化をd−IP及びWBによって分析した。(図3E)示されたsiRNAを用いて予め処置されたHeLa細胞において、単独で又は漸増量のPMLと一緒に発現させたAtxn1 82Q−GFPのレベル。(図3F)SUMO1又はSUMO2 KRの存在下又は非存在下における、Atxn1 82Q−GFPレベルに対するPMLの効果。
図3は、図3Aから図3Fを含むが、これはSUMO2/3が、Atxn1 82Qのユビキチン化及びPMLにより媒介される分解に関与していることを実証する、実験例の結果を示す。(図3A)MG132を用いずに又は用いて処置されたHeLa細胞におけるSUMO1及びSUMO2/3によるAtxn1 82Qの修飾。修飾されたAtxn1 82Qをより良く比較するために、同じようなレベルの未修飾のAtxn1 82Qを含む変性免疫沈降(d−IP)産物をWBによって分析した。*非特異的バンド。(図3B)MG132を用いて又は用いずに処置されたGFP−SUMO2又はGFP−SUMO3発現U2OS細胞におけるAtxn1 82Q(抗FLAG抗体によって検出、赤色)の局在化。スケールバー、10μm。(図3C)d−IP、その後のWB(上)及びポンリーS染色(下)によって分析された、HeLa細胞におけるSUMO2/3によるAtxn1 82Q及び30Qの修飾。(図3D)Atxn1 82Qを、示されたsiRNAを用いて事前にトランスフェクトされたか又はトランスフェクトされていない(−)HeLa細胞において、単独で又はSUMO1若しくはHA−SUMO2 KRと一緒に発現させた。細胞をMG132を用いて又は用いずに処置した。FLAG−Atxn1 82QのSUMO化及びユビキチン化をd−IP及びWBによって分析した。(図3E)示されたsiRNAを用いて予め処置されたHeLa細胞において、単独で又は漸増量のPMLと一緒に発現させたAtxn1 82Q−GFPのレベル。(図3F)SUMO1又はSUMO2 KRの存在下又は非存在下における、Atxn1 82Q−GFPレベルに対するPMLの効果。
図3は、図3Aから図3Fを含むが、これはSUMO2/3が、Atxn1 82Qのユビキチン化及びPMLにより媒介される分解に関与していることを実証する、実験例の結果を示す。(図3A)MG132を用いずに又は用いて処置されたHeLa細胞におけるSUMO1及びSUMO2/3によるAtxn1 82Qの修飾。修飾されたAtxn1 82Qをより良く比較するために、同じようなレベルの未修飾のAtxn1 82Qを含む変性免疫沈降(d−IP)産物をWBによって分析した。*非特異的バンド。(図3B)MG132を用いて又は用いずに処置されたGFP−SUMO2又はGFP−SUMO3発現U2OS細胞におけるAtxn1 82Q(抗FLAG抗体によって検出、赤色)の局在化。スケールバー、10μm。(図3C)d−IP、その後のWB(上)及びポンリーS染色(下)によって分析された、HeLa細胞におけるSUMO2/3によるAtxn1 82Q及び30Qの修飾。(図3D)Atxn1 82Qを、示されたsiRNAを用いて事前にトランスフェクトされたか又はトランスフェクトされていない(−)HeLa細胞において、単独で又はSUMO1若しくはHA−SUMO2 KRと一緒に発現させた。細胞をMG132を用いて又は用いずに処置した。FLAG−Atxn1 82QのSUMO化及びユビキチン化をd−IP及びWBによって分析した。(図3E)示されたsiRNAを用いて予め処置されたHeLa細胞において、単独で又は漸増量のPMLと一緒に発現させたAtxn1 82Q−GFPのレベル。(図3F)SUMO1又はSUMO2 KRの存在下又は非存在下における、Atxn1 82Q−GFPレベルに対するPMLの効果。
図3は、図3Aから図3Fを含むが、これはSUMO2/3が、Atxn1 82Qのユビキチン化及びPMLにより媒介される分解に関与していることを実証する、実験例の結果を示す。(図3A)MG132を用いずに又は用いて処置されたHeLa細胞におけるSUMO1及びSUMO2/3によるAtxn1 82Qの修飾。修飾されたAtxn1 82Qをより良く比較するために、同じようなレベルの未修飾のAtxn1 82Qを含む変性免疫沈降(d−IP)産物をWBによって分析した。*非特異的バンド。(図3B)MG132を用いて又は用いずに処置されたGFP−SUMO2又はGFP−SUMO3発現U2OS細胞におけるAtxn1 82Q(抗FLAG抗体によって検出、赤色)の局在化。スケールバー、10μm。(図3C)d−IP、その後のWB(上)及びポンリーS染色(下)によって分析された、HeLa細胞におけるSUMO2/3によるAtxn1 82Q及び30Qの修飾。(図3D)Atxn1 82Qを、示されたsiRNAを用いて事前にトランスフェクトされたか又はトランスフェクトされていない(−)HeLa細胞において、単独で又はSUMO1若しくはHA−SUMO2 KRと一緒に発現させた。細胞をMG132を用いて又は用いずに処置した。FLAG−Atxn1 82QのSUMO化及びユビキチン化をd−IP及びWBによって分析した。(図3E)示されたsiRNAを用いて予め処置されたHeLa細胞において、単独で又は漸増量のPMLと一緒に発現させたAtxn1 82Q−GFPのレベル。(図3F)SUMO1又はSUMO2 KRの存在下又は非存在下における、Atxn1 82Q−GFPレベルに対するPMLの効果。
図3は、図3Aから図3Fを含むが、これはSUMO2/3が、Atxn1 82Qのユビキチン化及びPMLにより媒介される分解に関与していることを実証する、実験例の結果を示す。(図3A)MG132を用いずに又は用いて処置されたHeLa細胞におけるSUMO1及びSUMO2/3によるAtxn1 82Qの修飾。修飾されたAtxn1 82Qをより良く比較するために、同じようなレベルの未修飾のAtxn1 82Qを含む変性免疫沈降(d−IP)産物をWBによって分析した。*非特異的バンド。(図3B)MG132を用いて又は用いずに処置されたGFP−SUMO2又はGFP−SUMO3発現U2OS細胞におけるAtxn1 82Q(抗FLAG抗体によって検出、赤色)の局在化。スケールバー、10μm。(図3C)d−IP、その後のWB(上)及びポンリーS染色(下)によって分析された、HeLa細胞におけるSUMO2/3によるAtxn1 82Q及び30Qの修飾。(図3D)Atxn1 82Qを、示されたsiRNAを用いて事前にトランスフェクトされたか又はトランスフェクトされていない(−)HeLa細胞において、単独で又はSUMO1若しくはHA−SUMO2 KRと一緒に発現させた。細胞をMG132を用いて又は用いずに処置した。FLAG−Atxn1 82QのSUMO化及びユビキチン化をd−IP及びWBによって分析した。(図3E)示されたsiRNAを用いて予め処置されたHeLa細胞において、単独で又は漸増量のPMLと一緒に発現させたAtxn1 82Q−GFPのレベル。(図3F)SUMO1又はSUMO2 KRの存在下又は非存在下における、Atxn1 82Q−GFPレベルに対するPMLの効果。
図3は、図3Aから図3Fを含むが、これはSUMO2/3が、Atxn1 82Qのユビキチン化及びPMLにより媒介される分解に関与していることを実証する、実験例の結果を示す。(図3A)MG132を用いずに又は用いて処置されたHeLa細胞におけるSUMO1及びSUMO2/3によるAtxn1 82Qの修飾。修飾されたAtxn1 82Qをより良く比較するために、同じようなレベルの未修飾のAtxn1 82Qを含む変性免疫沈降(d−IP)産物をWBによって分析した。*非特異的バンド。(図3B)MG132を用いて又は用いずに処置されたGFP−SUMO2又はGFP−SUMO3発現U2OS細胞におけるAtxn1 82Q(抗FLAG抗体によって検出、赤色)の局在化。スケールバー、10μm。(図3C)d−IP、その後のWB(上)及びポンリーS染色(下)によって分析された、HeLa細胞におけるSUMO2/3によるAtxn1 82Q及び30Qの修飾。(図3D)Atxn1 82Qを、示されたsiRNAを用いて事前にトランスフェクトされたか又はトランスフェクトされていない(−)HeLa細胞において、単独で又はSUMO1若しくはHA−SUMO2 KRと一緒に発現させた。細胞をMG132を用いて又は用いずに処置した。FLAG−Atxn1 82QのSUMO化及びユビキチン化をd−IP及びWBによって分析した。(図3E)示されたsiRNAを用いて予め処置されたHeLa細胞において、単独で又は漸増量のPMLと一緒に発現させたAtxn1 82Q−GFPのレベル。(図3F)SUMO1又はSUMO2 KRの存在下又は非存在下における、Atxn1 82Q−GFPレベルに対するPMLの効果。
図4は、図4Aから図4Fを含むが、これはPMLがAtxn1 82QのSUMO化を促進することを実証する実験例の結果を示す。(図4A)HA−PML細胞の非存在下又は存在下、及びMG132による処置を伴わない又は伴う、HeLa細胞におけるFLAG−Atxn1 82QのSUMO化。トランスフェクションに使用されたAtxn1 82Q DNAの量は、同等なレベルの未修飾タンパク質を生じるように調整された。(図4B及び図4C)MG132を用いずに又は用いて処置された対照細胞及びPMLsiRNAでトランスフェクトされたHeLa細胞における、FLAG−Atxn1 82Q(図4B)及びFLAG−nFlucDM−GFP(図4C)のSUMO化。(図4D及び図4E)精製されたHA−Atxn1 82Q−FLAGのSUMO化を、示されているような組換えFLAG−PML、FLAG−PML M6、及びSUMO2の存在下で実施した。(図4D)においては、様々なd−IP産物の量は、同じようなレベルの未修飾Atxn1 82Q(中央)が生じるように調整された。(図4F)漸増量のPML又はPML M6の非存在下又は存在下における、HeLa細胞内のAtxn1 82Q−GFPのレベル。
図4は、図4Aから図4Fを含むが、これはPMLがAtxn1 82QのSUMO化を促進することを実証する実験例の結果を示す。(図4A)HA−PML細胞の非存在下又は存在下、及びMG132による処置を伴わない又は伴う、HeLa細胞におけるFLAG−Atxn1 82QのSUMO化。トランスフェクションに使用されたAtxn1 82Q DNAの量は、同等なレベルの未修飾タンパク質を生じるように調整された。(図4B及び図4C)MG132を用いずに又は用いて処置された対照細胞及びPMLsiRNAでトランスフェクトされたHeLa細胞における、FLAG−Atxn1 82Q(図4B)及びFLAG−nFlucDM−GFP(図4C)のSUMO化。(図4D及び図4E)精製されたHA−Atxn1 82Q−FLAGのSUMO化を、示されているような組換えFLAG−PML、FLAG−PML M6、及びSUMO2の存在下で実施した。(図4D)においては、様々なd−IP産物の量は、同じようなレベルの未修飾Atxn1 82Q(中央)が生じるように調整された。(図4F)漸増量のPML又はPML M6の非存在下又は存在下における、HeLa細胞内のAtxn1 82Q−GFPのレベル。
図4は、図4Aから図4Fを含むが、これはPMLがAtxn1 82QのSUMO化を促進することを実証する実験例の結果を示す。(図4A)HA−PML細胞の非存在下又は存在下、及びMG132による処置を伴わない又は伴う、HeLa細胞におけるFLAG−Atxn1 82QのSUMO化。トランスフェクションに使用されたAtxn1 82Q DNAの量は、同等なレベルの未修飾タンパク質を生じるように調整された。(図4B及び図4C)MG132を用いずに又は用いて処置された対照細胞及びPMLsiRNAでトランスフェクトされたHeLa細胞における、FLAG−Atxn1 82Q(図4B)及びFLAG−nFlucDM−GFP(図4C)のSUMO化。(図4D及び図4E)精製されたHA−Atxn1 82Q−FLAGのSUMO化を、示されているような組換えFLAG−PML、FLAG−PML M6、及びSUMO2の存在下で実施した。(図4D)においては、様々なd−IP産物の量は、同じようなレベルの未修飾Atxn1 82Q(中央)が生じるように調整された。(図4F)漸増量のPML又はPML M6の非存在下又は存在下における、HeLa細胞内のAtxn1 82Q−GFPのレベル。
図4は、図4Aから図4Fを含むが、これはPMLがAtxn1 82QのSUMO化を促進することを実証する実験例の結果を示す。(図4A)HA−PML細胞の非存在下又は存在下、及びMG132による処置を伴わない又は伴う、HeLa細胞におけるFLAG−Atxn1 82QのSUMO化。トランスフェクションに使用されたAtxn1 82Q DNAの量は、同等なレベルの未修飾タンパク質を生じるように調整された。(図4B及び図4C)MG132を用いずに又は用いて処置された対照細胞及びPMLsiRNAでトランスフェクトされたHeLa細胞における、FLAG−Atxn1 82Q(図4B)及びFLAG−nFlucDM−GFP(図4C)のSUMO化。(図4D及び図4E)精製されたHA−Atxn1 82Q−FLAGのSUMO化を、示されているような組換えFLAG−PML、FLAG−PML M6、及びSUMO2の存在下で実施した。(図4D)においては、様々なd−IP産物の量は、同じようなレベルの未修飾Atxn1 82Q(中央)が生じるように調整された。(図4F)漸増量のPML又はPML M6の非存在下又は存在下における、HeLa細胞内のAtxn1 82Q−GFPのレベル。
図4は、図4Aから図4Fを含むが、これはPMLがAtxn1 82QのSUMO化を促進することを実証する実験例の結果を示す。(図4A)HA−PML細胞の非存在下又は存在下、及びMG132による処置を伴わない又は伴う、HeLa細胞におけるFLAG−Atxn1 82QのSUMO化。トランスフェクションに使用されたAtxn1 82Q DNAの量は、同等なレベルの未修飾タンパク質を生じるように調整された。(図4B及び図4C)MG132を用いずに又は用いて処置された対照細胞及びPMLsiRNAでトランスフェクトされたHeLa細胞における、FLAG−Atxn1 82Q(図4B)及びFLAG−nFlucDM−GFP(図4C)のSUMO化。(図4D及び図4E)精製されたHA−Atxn1 82Q−FLAGのSUMO化を、示されているような組換えFLAG−PML、FLAG−PML M6、及びSUMO2の存在下で実施した。(図4D)においては、様々なd−IP産物の量は、同じようなレベルの未修飾Atxn1 82Q(中央)が生じるように調整された。(図4F)漸増量のPML又はPML M6の非存在下又は存在下における、HeLa細胞内のAtxn1 82Q−GFPのレベル。
図4は、図4Aから図4Fを含むが、これはPMLがAtxn1 82QのSUMO化を促進することを実証する実験例の結果を示す。(図4A)HA−PML細胞の非存在下又は存在下、及びMG132による処置を伴わない又は伴う、HeLa細胞におけるFLAG−Atxn1 82QのSUMO化。トランスフェクションに使用されたAtxn1 82Q DNAの量は、同等なレベルの未修飾タンパク質を生じるように調整された。(図4B及び図4C)MG132を用いずに又は用いて処置された対照細胞及びPMLsiRNAでトランスフェクトされたHeLa細胞における、FLAG−Atxn1 82Q(図4B)及びFLAG−nFlucDM−GFP(図4C)のSUMO化。(図4D及び図4E)精製されたHA−Atxn1 82Q−FLAGのSUMO化を、示されているような組換えFLAG−PML、FLAG−PML M6、及びSUMO2の存在下で実施した。(図4D)においては、様々なd−IP産物の量は、同じようなレベルの未修飾Atxn1 82Q(中央)が生じるように調整された。(図4F)漸増量のPML又はPML M6の非存在下又は存在下における、HeLa細胞内のAtxn1 82Q−GFPのレベル。
図5は、図5Aから図5Iを含むが、これはAtxn1 82Qの分解におけるRNF4の役割を実証した実験例の結果を示す。(図5A)RNF4の過剰発現を伴わない及び伴うHeLa細胞内のAtxn1 82Q−GFPのレベル。(図5B及び図5C)CHXによる処置及びWBによって分析された、対照細胞及びPML枯渇HeLa細胞におけるAtxn1 82Q−GFP安定性に対するRNF4過剰発現の効果。SS Atxn1 82Q/アクチンの相対比が(図5C)に示されている。(図5D)対照siRNA(−)又は3つのRNF4 siRNAの組合せを用いて前処置されたHeLa細胞内のFLAG−Atxn1 82Qのレベル。(図5E)対照細胞及びRNF4ノックダウンHeLa細胞内のAtxn1 82Q−GFPの代表的な蛍光画像。スケールバー、20μm。(図5F)ビヒクル(DMSO)又はMG132を用いて処置されたHeLa細胞内のAtxn1 82Q−GFP及び内因性RNF4の局在化。スケールバー、10μm。(図5G及び図5H)RNF4の過剰発現を伴わない及び伴うHeLa細胞内のFLAG−Atxn1 82Q及びFLAG−Atxn1 30Q(図5G)又はHA−Httex1p 97QP及びHA−Httex1p 97QP(KR)(図5H)のレベル。(図5I)shCtrl及びshRNF4を安定に発現しているHeLa細胞内のnFlucDM−GFPの安定性(左)及びこれらの細胞内のRNF4のレベル(右)。
図5は、図5Aから図5Iを含むが、これはAtxn1 82Qの分解におけるRNF4の役割を実証した実験例の結果を示す。(図5A)RNF4の過剰発現を伴わない及び伴うHeLa細胞内のAtxn1 82Q−GFPのレベル。(図5B及び図5C)CHXによる処置及びWBによって分析された、対照細胞及びPML枯渇HeLa細胞におけるAtxn1 82Q−GFP安定性に対するRNF4過剰発現の効果。SS Atxn1 82Q/アクチンの相対比が(図5C)に示されている。(図5D)対照siRNA(−)又は3つのRNF4 siRNAの組合せを用いて前処置されたHeLa細胞内のFLAG−Atxn1 82Qのレベル。(図5E)対照細胞及びRNF4ノックダウンHeLa細胞内のAtxn1 82Q−GFPの代表的な蛍光画像。スケールバー、20μm。(図5F)ビヒクル(DMSO)又はMG132を用いて処置されたHeLa細胞内のAtxn1 82Q−GFP及び内因性RNF4の局在化。スケールバー、10μm。(図5G及び図5H)RNF4の過剰発現を伴わない及び伴うHeLa細胞内のFLAG−Atxn1 82Q及びFLAG−Atxn1 30Q(図5G)又はHA−Httex1p 97QP及びHA−Httex1p 97QP(KR)(図5H)のレベル。(図5I)shCtrl及びshRNF4を安定に発現しているHeLa細胞内のnFlucDM−GFPの安定性(左)及びこれらの細胞内のRNF4のレベル(右)。
図5は、図5Aから図5Iを含むが、これはAtxn1 82Qの分解におけるRNF4の役割を実証した実験例の結果を示す。(図5A)RNF4の過剰発現を伴わない及び伴うHeLa細胞内のAtxn1 82Q−GFPのレベル。(図5B及び図5C)CHXによる処置及びWBによって分析された、対照細胞及びPML枯渇HeLa細胞におけるAtxn1 82Q−GFP安定性に対するRNF4過剰発現の効果。SS Atxn1 82Q/アクチンの相対比が(図5C)に示されている。(図5D)対照siRNA(−)又は3つのRNF4 siRNAの組合せを用いて前処置されたHeLa細胞内のFLAG−Atxn1 82Qのレベル。(図5E)対照細胞及びRNF4ノックダウンHeLa細胞内のAtxn1 82Q−GFPの代表的な蛍光画像。スケールバー、20μm。(図5F)ビヒクル(DMSO)又はMG132を用いて処置されたHeLa細胞内のAtxn1 82Q−GFP及び内因性RNF4の局在化。スケールバー、10μm。(図5G及び図5H)RNF4の過剰発現を伴わない及び伴うHeLa細胞内のFLAG−Atxn1 82Q及びFLAG−Atxn1 30Q(図5G)又はHA−Httex1p 97QP及びHA−Httex1p 97QP(KR)(図5H)のレベル。(図5I)shCtrl及びshRNF4を安定に発現しているHeLa細胞内のnFlucDM−GFPの安定性(左)及びこれらの細胞内のRNF4のレベル(右)。
図5は、図5Aから図5Iを含むが、これはAtxn1 82Qの分解におけるRNF4の役割を実証した実験例の結果を示す。(図5A)RNF4の過剰発現を伴わない及び伴うHeLa細胞内のAtxn1 82Q−GFPのレベル。(図5B及び図5C)CHXによる処置及びWBによって分析された、対照細胞及びPML枯渇HeLa細胞におけるAtxn1 82Q−GFP安定性に対するRNF4過剰発現の効果。SS Atxn1 82Q/アクチンの相対比が(図5C)に示されている。(図5D)対照siRNA(−)又は3つのRNF4 siRNAの組合せを用いて前処置されたHeLa細胞内のFLAG−Atxn1 82Qのレベル。(図5E)対照細胞及びRNF4ノックダウンHeLa細胞内のAtxn1 82Q−GFPの代表的な蛍光画像。スケールバー、20μm。(図5F)ビヒクル(DMSO)又はMG132を用いて処置されたHeLa細胞内のAtxn1 82Q−GFP及び内因性RNF4の局在化。スケールバー、10μm。(図5G及び図5H)RNF4の過剰発現を伴わない及び伴うHeLa細胞内のFLAG−Atxn1 82Q及びFLAG−Atxn1 30Q(図5G)又はHA−Httex1p 97QP及びHA−Httex1p 97QP(KR)(図5H)のレベル。(図5I)shCtrl及びshRNF4を安定に発現しているHeLa細胞内のnFlucDM−GFPの安定性(左)及びこれらの細胞内のRNF4のレベル(右)。
図5は、図5Aから図5Iを含むが、これはAtxn1 82Qの分解におけるRNF4の役割を実証した実験例の結果を示す。(図5A)RNF4の過剰発現を伴わない及び伴うHeLa細胞内のAtxn1 82Q−GFPのレベル。(図5B及び図5C)CHXによる処置及びWBによって分析された、対照細胞及びPML枯渇HeLa細胞におけるAtxn1 82Q−GFP安定性に対するRNF4過剰発現の効果。SS Atxn1 82Q/アクチンの相対比が(図5C)に示されている。(図5D)対照siRNA(−)又は3つのRNF4 siRNAの組合せを用いて前処置されたHeLa細胞内のFLAG−Atxn1 82Qのレベル。(図5E)対照細胞及びRNF4ノックダウンHeLa細胞内のAtxn1 82Q−GFPの代表的な蛍光画像。スケールバー、20μm。(図5F)ビヒクル(DMSO)又はMG132を用いて処置されたHeLa細胞内のAtxn1 82Q−GFP及び内因性RNF4の局在化。スケールバー、10μm。(図5G及び図5H)RNF4の過剰発現を伴わない及び伴うHeLa細胞内のFLAG−Atxn1 82Q及びFLAG−Atxn1 30Q(図5G)又はHA−Httex1p 97QP及びHA−Httex1p 97QP(KR)(図5H)のレベル。(図5I)shCtrl及びshRNF4を安定に発現しているHeLa細胞内のnFlucDM−GFPの安定性(左)及びこれらの細胞内のRNF4のレベル(右)。
図5は、図5Aから図5Iを含むが、これはAtxn1 82Qの分解におけるRNF4の役割を実証した実験例の結果を示す。(図5A)RNF4の過剰発現を伴わない及び伴うHeLa細胞内のAtxn1 82Q−GFPのレベル。(図5B及び図5C)CHXによる処置及びWBによって分析された、対照細胞及びPML枯渇HeLa細胞におけるAtxn1 82Q−GFP安定性に対するRNF4過剰発現の効果。SS Atxn1 82Q/アクチンの相対比が(図5C)に示されている。(図5D)対照siRNA(−)又は3つのRNF4 siRNAの組合せを用いて前処置されたHeLa細胞内のFLAG−Atxn1 82Qのレベル。(図5E)対照細胞及びRNF4ノックダウンHeLa細胞内のAtxn1 82Q−GFPの代表的な蛍光画像。スケールバー、20μm。(図5F)ビヒクル(DMSO)又はMG132を用いて処置されたHeLa細胞内のAtxn1 82Q−GFP及び内因性RNF4の局在化。スケールバー、10μm。(図5G及び図5H)RNF4の過剰発現を伴わない及び伴うHeLa細胞内のFLAG−Atxn1 82Q及びFLAG−Atxn1 30Q(図5G)又はHA−Httex1p 97QP及びHA−Httex1p 97QP(KR)(図5H)のレベル。(図5I)shCtrl及びshRNF4を安定に発現しているHeLa細胞内のnFlucDM−GFPの安定性(左)及びこれらの細胞内のRNF4のレベル(右)。
図5は、図5Aから図5Iを含むが、これはAtxn1 82Qの分解におけるRNF4の役割を実証した実験例の結果を示す。(図5A)RNF4の過剰発現を伴わない及び伴うHeLa細胞内のAtxn1 82Q−GFPのレベル。(図5B及び図5C)CHXによる処置及びWBによって分析された、対照細胞及びPML枯渇HeLa細胞におけるAtxn1 82Q−GFP安定性に対するRNF4過剰発現の効果。SS Atxn1 82Q/アクチンの相対比が(図5C)に示されている。(図5D)対照siRNA(−)又は3つのRNF4 siRNAの組合せを用いて前処置されたHeLa細胞内のFLAG−Atxn1 82Qのレベル。(図5E)対照細胞及びRNF4ノックダウンHeLa細胞内のAtxn1 82Q−GFPの代表的な蛍光画像。スケールバー、20μm。(図5F)ビヒクル(DMSO)又はMG132を用いて処置されたHeLa細胞内のAtxn1 82Q−GFP及び内因性RNF4の局在化。スケールバー、10μm。(図5G及び図5H)RNF4の過剰発現を伴わない及び伴うHeLa細胞内のFLAG−Atxn1 82Q及びFLAG−Atxn1 30Q(図5G)又はHA−Httex1p 97QP及びHA−Httex1p 97QP(KR)(図5H)のレベル。(図5I)shCtrl及びshRNF4を安定に発現しているHeLa細胞内のnFlucDM−GFPの安定性(左)及びこれらの細胞内のRNF4のレベル(右)。
図5は、図5Aから図5Iを含むが、これはAtxn1 82Qの分解におけるRNF4の役割を実証した実験例の結果を示す。(図5A)RNF4の過剰発現を伴わない及び伴うHeLa細胞内のAtxn1 82Q−GFPのレベル。(図5B及び図5C)CHXによる処置及びWBによって分析された、対照細胞及びPML枯渇HeLa細胞におけるAtxn1 82Q−GFP安定性に対するRNF4過剰発現の効果。SS Atxn1 82Q/アクチンの相対比が(図5C)に示されている。(図5D)対照siRNA(−)又は3つのRNF4 siRNAの組合せを用いて前処置されたHeLa細胞内のFLAG−Atxn1 82Qのレベル。(図5E)対照細胞及びRNF4ノックダウンHeLa細胞内のAtxn1 82Q−GFPの代表的な蛍光画像。スケールバー、20μm。(図5F)ビヒクル(DMSO)又はMG132を用いて処置されたHeLa細胞内のAtxn1 82Q−GFP及び内因性RNF4の局在化。スケールバー、10μm。(図5G及び図5H)RNF4の過剰発現を伴わない及び伴うHeLa細胞内のFLAG−Atxn1 82Q及びFLAG−Atxn1 30Q(図5G)又はHA−Httex1p 97QP及びHA−Httex1p 97QP(KR)(図5H)のレベル。(図5I)shCtrl及びshRNF4を安定に発現しているHeLa細胞内のnFlucDM−GFPの安定性(左)及びこれらの細胞内のRNF4のレベル(右)。
図5は、図5Aから図5Iを含むが、これはAtxn1 82Qの分解におけるRNF4の役割を実証した実験例の結果を示す。(図5A)RNF4の過剰発現を伴わない及び伴うHeLa細胞内のAtxn1 82Q−GFPのレベル。(図5B及び図5C)CHXによる処置及びWBによって分析された、対照細胞及びPML枯渇HeLa細胞におけるAtxn1 82Q−GFP安定性に対するRNF4過剰発現の効果。SS Atxn1 82Q/アクチンの相対比が(図5C)に示されている。(図5D)対照siRNA(−)又は3つのRNF4 siRNAの組合せを用いて前処置されたHeLa細胞内のFLAG−Atxn1 82Qのレベル。(図5E)対照細胞及びRNF4ノックダウンHeLa細胞内のAtxn1 82Q−GFPの代表的な蛍光画像。スケールバー、20μm。(図5F)ビヒクル(DMSO)又はMG132を用いて処置されたHeLa細胞内のAtxn1 82Q−GFP及び内因性RNF4の局在化。スケールバー、10μm。(図5G及び図5H)RNF4の過剰発現を伴わない及び伴うHeLa細胞内のFLAG−Atxn1 82Q及びFLAG−Atxn1 30Q(図5G)又はHA−Httex1p 97QP及びHA−Httex1p 97QP(KR)(図5H)のレベル。(図5I)shCtrl及びshRNF4を安定に発現しているHeLa細胞内のnFlucDM−GFPの安定性(左)及びこれらの細胞内のRNF4のレベル(右)。
図6は、図6Aから図6Iを含むが、これはRNF4が、SUMO2/3により修飾されたAtxn1 82Qのユビキチン化及び分解を促進することを実証する実験例の結果を示す。(図6A及び図6B)RNF4の非存在下又は存在下において、MG132を用いて又は用いずに処置されたHeLa細胞における、SUMO化FLAG−Atxn1 82Q(図6A)及びFLAG−nFlucDM−GFP(図6B)のレベル。同じようなレベルの未修飾のタンパク質を有するd−IP産物並びにWCLを分析した。(図6C)(図6A)のように分析された、対照siRNA又はRNF4 siRNAの組合せを用いて前処置されたHeLa細胞内のSUMO化FLAG−Atxn1 82Qのレベル。(図6D及び図6E)M2ビーズ(+)又は対照M2ビーズ(−)にコンジュゲートさせた未修飾の及びSUMO2により修飾されたFLAG−Atxn1 82Qタンパク質を、GST−RNF4の非存在下又は存在下、ユビキチン化反応混合物と共にインキュベートした。(図6D)実験デザインの図解。(図6E)FLAG−Atxn1 82Q(左)及びGST−RNF4(右)のWB分析。(図6F及び図6G)HeLaにおけるAtxn1 82Q−GFP及びRNF4タンパク質の局在化(抗FLAG抗体によって検出)。スケールバー、10μm。(図6H)HeLa細胞におけるAtxn1 82Q−GFPレベルに対する示されたRNF4タンパク質の効果。(図6I)対照又はRNF4 siRNAを用いて前処置されたHeLa細胞内のAtxn1 82Q−GFPレベルに対するPML過剰発現の効果。
図6は、図6Aから図6Iを含むが、これはRNF4が、SUMO2/3により修飾されたAtxn1 82Qのユビキチン化及び分解を促進することを実証する実験例の結果を示す。(図6A及び図6B)RNF4の非存在下又は存在下において、MG132を用いて又は用いずに処置されたHeLa細胞における、SUMO化FLAG−Atxn1 82Q(図6A)及びFLAG−nFlucDM−GFP(図6B)のレベル。同じようなレベルの未修飾のタンパク質を有するd−IP産物並びにWCLを分析した。(図6C)(図6A)のように分析された、対照siRNA又はRNF4 siRNAの組合せを用いて前処置されたHeLa細胞内のSUMO化FLAG−Atxn1 82Qのレベル。(図6D及び図6E)M2ビーズ(+)又は対照M2ビーズ(−)にコンジュゲートさせた未修飾の及びSUMO2により修飾されたFLAG−Atxn1 82Qタンパク質を、GST−RNF4の非存在下又は存在下、ユビキチン化反応混合物と共にインキュベートした。(図6D)実験デザインの図解。(図6E)FLAG−Atxn1 82Q(左)及びGST−RNF4(右)のWB分析。(図6F及び図6G)HeLaにおけるAtxn1 82Q−GFP及びRNF4タンパク質の局在化(抗FLAG抗体によって検出)。スケールバー、10μm。(図6H)HeLa細胞におけるAtxn1 82Q−GFPレベルに対する示されたRNF4タンパク質の効果。(図6I)対照又はRNF4 siRNAを用いて前処置されたHeLa細胞内のAtxn1 82Q−GFPレベルに対するPML過剰発現の効果。
図6は、図6Aから図6Iを含むが、これはRNF4が、SUMO2/3により修飾されたAtxn1 82Qのユビキチン化及び分解を促進することを実証する実験例の結果を示す。(図6A及び図6B)RNF4の非存在下又は存在下において、MG132を用いて又は用いずに処置されたHeLa細胞における、SUMO化FLAG−Atxn1 82Q(図6A)及びFLAG−nFlucDM−GFP(図6B)のレベル。同じようなレベルの未修飾のタンパク質を有するd−IP産物並びにWCLを分析した。(図6C)(図6A)のように分析された、対照siRNA又はRNF4 siRNAの組合せを用いて前処置されたHeLa細胞内のSUMO化FLAG−Atxn1 82Qのレベル。(図6D及び図6E)M2ビーズ(+)又は対照M2ビーズ(−)にコンジュゲートさせた未修飾の及びSUMO2により修飾されたFLAG−Atxn1 82Qタンパク質を、GST−RNF4の非存在下又は存在下、ユビキチン化反応混合物と共にインキュベートした。(図6D)実験デザインの図解。(図6E)FLAG−Atxn1 82Q(左)及びGST−RNF4(右)のWB分析。(図6F及び図6G)HeLaにおけるAtxn1 82Q−GFP及びRNF4タンパク質の局在化(抗FLAG抗体によって検出)。スケールバー、10μm。(図6H)HeLa細胞におけるAtxn1 82Q−GFPレベルに対する示されたRNF4タンパク質の効果。(図6I)対照又はRNF4 siRNAを用いて前処置されたHeLa細胞内のAtxn1 82Q−GFPレベルに対するPML過剰発現の効果。
図6は、図6Aから図6Iを含むが、これはRNF4が、SUMO2/3により修飾されたAtxn1 82Qのユビキチン化及び分解を促進することを実証する実験例の結果を示す。(図6A及び図6B)RNF4の非存在下又は存在下において、MG132を用いて又は用いずに処置されたHeLa細胞における、SUMO化FLAG−Atxn1 82Q(図6A)及びFLAG−nFlucDM−GFP(図6B)のレベル。同じようなレベルの未修飾のタンパク質を有するd−IP産物並びにWCLを分析した。(図6C)(図6A)のように分析された、対照siRNA又はRNF4 siRNAの組合せを用いて前処置されたHeLa細胞内のSUMO化FLAG−Atxn1 82Qのレベル。(図6D及び図6E)M2ビーズ(+)又は対照M2ビーズ(−)にコンジュゲートさせた未修飾の及びSUMO2により修飾されたFLAG−Atxn1 82Qタンパク質を、GST−RNF4の非存在下又は存在下、ユビキチン化反応混合物と共にインキュベートした。(図6D)実験デザインの図解。(図6E)FLAG−Atxn1 82Q(左)及びGST−RNF4(右)のWB分析。(図6F及び図6G)HeLaにおけるAtxn1 82Q−GFP及びRNF4タンパク質の局在化(抗FLAG抗体によって検出)。スケールバー、10μm。(図6H)HeLa細胞におけるAtxn1 82Q−GFPレベルに対する示されたRNF4タンパク質の効果。(図6I)対照又はRNF4 siRNAを用いて前処置されたHeLa細胞内のAtxn1 82Q−GFPレベルに対するPML過剰発現の効果。
図6は、図6Aから図6Iを含むが、これはRNF4が、SUMO2/3により修飾されたAtxn1 82Qのユビキチン化及び分解を促進することを実証する実験例の結果を示す。(図6A及び図6B)RNF4の非存在下又は存在下において、MG132を用いて又は用いずに処置されたHeLa細胞における、SUMO化FLAG−Atxn1 82Q(図6A)及びFLAG−nFlucDM−GFP(図6B)のレベル。同じようなレベルの未修飾のタンパク質を有するd−IP産物並びにWCLを分析した。(図6C)(図6A)のように分析された、対照siRNA又はRNF4 siRNAの組合せを用いて前処置されたHeLa細胞内のSUMO化FLAG−Atxn1 82Qのレベル。(図6D及び図6E)M2ビーズ(+)又は対照M2ビーズ(−)にコンジュゲートさせた未修飾の及びSUMO2により修飾されたFLAG−Atxn1 82Qタンパク質を、GST−RNF4の非存在下又は存在下、ユビキチン化反応混合物と共にインキュベートした。(図6D)実験デザインの図解。(図6E)FLAG−Atxn1 82Q(左)及びGST−RNF4(右)のWB分析。(図6F及び図6G)HeLaにおけるAtxn1 82Q−GFP及びRNF4タンパク質の局在化(抗FLAG抗体によって検出)。スケールバー、10μm。(図6H)HeLa細胞におけるAtxn1 82Q−GFPレベルに対する示されたRNF4タンパク質の効果。(図6I)対照又はRNF4 siRNAを用いて前処置されたHeLa細胞内のAtxn1 82Q−GFPレベルに対するPML過剰発現の効果。
図6は、図6Aから図6Iを含むが、これはRNF4が、SUMO2/3により修飾されたAtxn1 82Qのユビキチン化及び分解を促進することを実証する実験例の結果を示す。(図6A及び図6B)RNF4の非存在下又は存在下において、MG132を用いて又は用いずに処置されたHeLa細胞における、SUMO化FLAG−Atxn1 82Q(図6A)及びFLAG−nFlucDM−GFP(図6B)のレベル。同じようなレベルの未修飾のタンパク質を有するd−IP産物並びにWCLを分析した。(図6C)(図6A)のように分析された、対照siRNA又はRNF4 siRNAの組合せを用いて前処置されたHeLa細胞内のSUMO化FLAG−Atxn1 82Qのレベル。(図6D及び図6E)M2ビーズ(+)又は対照M2ビーズ(−)にコンジュゲートさせた未修飾の及びSUMO2により修飾されたFLAG−Atxn1 82Qタンパク質を、GST−RNF4の非存在下又は存在下、ユビキチン化反応混合物と共にインキュベートした。(図6D)実験デザインの図解。(図6E)FLAG−Atxn1 82Q(左)及びGST−RNF4(右)のWB分析。(図6F及び図6G)HeLaにおけるAtxn1 82Q−GFP及びRNF4タンパク質の局在化(抗FLAG抗体によって検出)。スケールバー、10μm。(図6H)HeLa細胞におけるAtxn1 82Q−GFPレベルに対する示されたRNF4タンパク質の効果。(図6I)対照又はRNF4 siRNAを用いて前処置されたHeLa細胞内のAtxn1 82Q−GFPレベルに対するPML過剰発現の効果。
図6は、図6Aから図6Iを含むが、これはRNF4が、SUMO2/3により修飾されたAtxn1 82Qのユビキチン化及び分解を促進することを実証する実験例の結果を示す。(図6A及び図6B)RNF4の非存在下又は存在下において、MG132を用いて又は用いずに処置されたHeLa細胞における、SUMO化FLAG−Atxn1 82Q(図6A)及びFLAG−nFlucDM−GFP(図6B)のレベル。同じようなレベルの未修飾のタンパク質を有するd−IP産物並びにWCLを分析した。(図6C)(図6A)のように分析された、対照siRNA又はRNF4 siRNAの組合せを用いて前処置されたHeLa細胞内のSUMO化FLAG−Atxn1 82Qのレベル。(図6D及び図6E)M2ビーズ(+)又は対照M2ビーズ(−)にコンジュゲートさせた未修飾の及びSUMO2により修飾されたFLAG−Atxn1 82Qタンパク質を、GST−RNF4の非存在下又は存在下、ユビキチン化反応混合物と共にインキュベートした。(図6D)実験デザインの図解。(図6E)FLAG−Atxn1 82Q(左)及びGST−RNF4(右)のWB分析。(図6F及び図6G)HeLaにおけるAtxn1 82Q−GFP及びRNF4タンパク質の局在化(抗FLAG抗体によって検出)。スケールバー、10μm。(図6H)HeLa細胞におけるAtxn1 82Q−GFPレベルに対する示されたRNF4タンパク質の効果。(図6I)対照又はRNF4 siRNAを用いて前処置されたHeLa細胞内のAtxn1 82Q−GFPレベルに対するPML過剰発現の効果。
図6は、図6Aから図6Iを含むが、これはRNF4が、SUMO2/3により修飾されたAtxn1 82Qのユビキチン化及び分解を促進することを実証する実験例の結果を示す。(図6A及び図6B)RNF4の非存在下又は存在下において、MG132を用いて又は用いずに処置されたHeLa細胞における、SUMO化FLAG−Atxn1 82Q(図6A)及びFLAG−nFlucDM−GFP(図6B)のレベル。同じようなレベルの未修飾のタンパク質を有するd−IP産物並びにWCLを分析した。(図6C)(図6A)のように分析された、対照siRNA又はRNF4 siRNAの組合せを用いて前処置されたHeLa細胞内のSUMO化FLAG−Atxn1 82Qのレベル。(図6D及び図6E)M2ビーズ(+)又は対照M2ビーズ(−)にコンジュゲートさせた未修飾の及びSUMO2により修飾されたFLAG−Atxn1 82Qタンパク質を、GST−RNF4の非存在下又は存在下、ユビキチン化反応混合物と共にインキュベートした。(図6D)実験デザインの図解。(図6E)FLAG−Atxn1 82Q(左)及びGST−RNF4(右)のWB分析。(図6F及び図6G)HeLaにおけるAtxn1 82Q−GFP及びRNF4タンパク質の局在化(抗FLAG抗体によって検出)。スケールバー、10μm。(図6H)HeLa細胞におけるAtxn1 82Q−GFPレベルに対する示されたRNF4タンパク質の効果。(図6I)対照又はRNF4 siRNAを用いて前処置されたHeLa細胞内のAtxn1 82Q−GFPレベルに対するPML過剰発現の効果。
図6は、図6Aから図6Iを含むが、これはRNF4が、SUMO2/3により修飾されたAtxn1 82Qのユビキチン化及び分解を促進することを実証する実験例の結果を示す。(図6A及び図6B)RNF4の非存在下又は存在下において、MG132を用いて又は用いずに処置されたHeLa細胞における、SUMO化FLAG−Atxn1 82Q(図6A)及びFLAG−nFlucDM−GFP(図6B)のレベル。同じようなレベルの未修飾のタンパク質を有するd−IP産物並びにWCLを分析した。(図6C)(図6A)のように分析された、対照siRNA又はRNF4 siRNAの組合せを用いて前処置されたHeLa細胞内のSUMO化FLAG−Atxn1 82Qのレベル。(図6D及び図6E)M2ビーズ(+)又は対照M2ビーズ(−)にコンジュゲートさせた未修飾の及びSUMO2により修飾されたFLAG−Atxn1 82Qタンパク質を、GST−RNF4の非存在下又は存在下、ユビキチン化反応混合物と共にインキュベートした。(図6D)実験デザインの図解。(図6E)FLAG−Atxn1 82Q(左)及びGST−RNF4(右)のWB分析。(図6F及び図6G)HeLaにおけるAtxn1 82Q−GFP及びRNF4タンパク質の局在化(抗FLAG抗体によって検出)。スケールバー、10μm。(図6H)HeLa細胞におけるAtxn1 82Q−GFPレベルに対する示されたRNF4タンパク質の効果。(図6I)対照又はRNF4 siRNAを用いて前処置されたHeLa細胞内のAtxn1 82Q−GFPレベルに対するPML過剰発現の効果。
図7は、図7Aから図7Iを含むが、これはPMLの欠損が、SCA1マウスモデルの行動表現型及び病理学的的表現型を悪化させることを実証する実験例の結果を示す。(図7A及び図7B)7週齢(図7A)及び11週齢(図7B)における加速式ロータロッド上での保持時間(平均値+標準誤差)であり、動物数が括弧内に示されている。(図7C及び図7D)12週齢の動物の小脳切片をヘマトキシリンを用いて染色した。(図7C)分子層の厚さの定量(平均値±標準誤差、1つの遺伝子型あたり3匹のマウス)。(図7D)代表的な染色画像。スケールバー、200μm。(図7E及び7F)1才齢の動物の小脳切片を、抗カルビンディン抗体を用いて染色した。(E)長さ1mmあたりの細胞体の平均数としてグラフにした、プルキンエ細胞の定量(平均値±標準誤差、1つの遺伝子型あたり4匹のマウス)。(F)代表的な染色画像。スケールバー、200μm。(図7G及び図7H)12週齢のマウス由来の小脳皮質切片を、抗ユビキチン抗体を用いて染色し、そしてヘマトキシリンを用いて対比染色した。(図7G)凝集物を含むプルキンエ細胞の比率(平均値±標準誤差、1つの遺伝子型あたり3匹のマウス)。(図7H)代表的な免疫組織化学的染色画像。矢頭は、プルキンエ細胞体内のユビキチン陽性凝集物を示す。スケールバー、50μm。Atxn1tg/−を含まないマウスのプルキンエ細胞においてユビキチン陽性凝集物は全く観察されなかった(図14D参照)。(図7I)PML−RNF4系によるPQCのモデル。PMLは、SRSを通してミスフォールドタンパク質を認識し、そしてそれらをそのSUMO E3リガーゼ活性を通してポリ−SUMO2/3鎖とコンジュゲートさせる(a)。RNF4は、SUMO化ミスフォールドタンパク質をユビキチン化し(b)、そしてプロテアソームによる分解のためにそれらを標的化する(c)。
図7は、図7Aから図7Iを含むが、これはPMLの欠損が、SCA1マウスモデルの行動表現型及び病理学的的表現型を悪化させることを実証する実験例の結果を示す。(図7A及び図7B)7週齢(図7A)及び11週齢(図7B)における加速式ロータロッド上での保持時間(平均値+標準誤差)であり、動物数が括弧内に示されている。(図7C及び図7D)12週齢の動物の小脳切片をヘマトキシリンを用いて染色した。(図7C)分子層の厚さの定量(平均値±標準誤差、1つの遺伝子型あたり3匹のマウス)。(図7D)代表的な染色画像。スケールバー、200μm。(図7E及び7F)1才齢の動物の小脳切片を、抗カルビンディン抗体を用いて染色した。(E)長さ1mmあたりの細胞体の平均数としてグラフにした、プルキンエ細胞の定量(平均値±標準誤差、1つの遺伝子型あたり4匹のマウス)。(F)代表的な染色画像。スケールバー、200μm。(図7G及び図7H)12週齢のマウス由来の小脳皮質切片を、抗ユビキチン抗体を用いて染色し、そしてヘマトキシリンを用いて対比染色した。(図7G)凝集物を含むプルキンエ細胞の比率(平均値±標準誤差、1つの遺伝子型あたり3匹のマウス)。(図7H)代表的な免疫組織化学的染色画像。矢頭は、プルキンエ細胞体内のユビキチン陽性凝集物を示す。スケールバー、50μm。Atxn1tg/−を含まないマウスのプルキンエ細胞においてユビキチン陽性凝集物は全く観察されなかった(図14D参照)。(図7I)PML−RNF4系によるPQCのモデル。PMLは、SRSを通してミスフォールドタンパク質を認識し、そしてそれらをそのSUMO E3リガーゼ活性を通してポリ−SUMO2/3鎖とコンジュゲートさせる(a)。RNF4は、SUMO化ミスフォールドタンパク質をユビキチン化し(b)、そしてプロテアソームによる分解のためにそれらを標的化する(c)。
図7は、図7Aから図7Iを含むが、これはPMLの欠損が、SCA1マウスモデルの行動表現型及び病理学的的表現型を悪化させることを実証する実験例の結果を示す。(図7A及び図7B)7週齢(図7A)及び11週齢(図7B)における加速式ロータロッド上での保持時間(平均値+標準誤差)であり、動物数が括弧内に示されている。(図7C及び図7D)12週齢の動物の小脳切片をヘマトキシリンを用いて染色した。(図7C)分子層の厚さの定量(平均値±標準誤差、1つの遺伝子型あたり3匹のマウス)。(図7D)代表的な染色画像。スケールバー、200μm。(図7E及び7F)1才齢の動物の小脳切片を、抗カルビンディン抗体を用いて染色した。(E)長さ1mmあたりの細胞体の平均数としてグラフにした、プルキンエ細胞の定量(平均値±標準誤差、1つの遺伝子型あたり4匹のマウス)。(F)代表的な染色画像。スケールバー、200μm。(図7G及び図7H)12週齢のマウス由来の小脳皮質切片を、抗ユビキチン抗体を用いて染色し、そしてヘマトキシリンを用いて対比染色した。(図7G)凝集物を含むプルキンエ細胞の比率(平均値±標準誤差、1つの遺伝子型あたり3匹のマウス)。(図7H)代表的な免疫組織化学的染色画像。矢頭は、プルキンエ細胞体内のユビキチン陽性凝集物を示す。スケールバー、50μm。Atxn1tg/−を含まないマウスのプルキンエ細胞においてユビキチン陽性凝集物は全く観察されなかった(図14D参照)。(図7I)PML−RNF4系によるPQCのモデル。PMLは、SRSを通してミスフォールドタンパク質を認識し、そしてそれらをそのSUMO E3リガーゼ活性を通してポリ−SUMO2/3鎖とコンジュゲートさせる(a)。RNF4は、SUMO化ミスフォールドタンパク質をユビキチン化し(b)、そしてプロテアソームによる分解のためにそれらを標的化する(c)。
図7は、図7Aから図7Iを含むが、これはPMLの欠損が、SCA1マウスモデルの行動表現型及び病理学的的表現型を悪化させることを実証する実験例の結果を示す。(図7A及び図7B)7週齢(図7A)及び11週齢(図7B)における加速式ロータロッド上での保持時間(平均値+標準誤差)であり、動物数が括弧内に示されている。(図7C及び図7D)12週齢の動物の小脳切片をヘマトキシリンを用いて染色した。(図7C)分子層の厚さの定量(平均値±標準誤差、1つの遺伝子型あたり3匹のマウス)。(図7D)代表的な染色画像。スケールバー、200μm。(図7E及び7F)1才齢の動物の小脳切片を、抗カルビンディン抗体を用いて染色した。(E)長さ1mmあたりの細胞体の平均数としてグラフにした、プルキンエ細胞の定量(平均値±標準誤差、1つの遺伝子型あたり4匹のマウス)。(F)代表的な染色画像。スケールバー、200μm。(図7G及び図7H)12週齢のマウス由来の小脳皮質切片を、抗ユビキチン抗体を用いて染色し、そしてヘマトキシリンを用いて対比染色した。(図7G)凝集物を含むプルキンエ細胞の比率(平均値±標準誤差、1つの遺伝子型あたり3匹のマウス)。(図7H)代表的な免疫組織化学的染色画像。矢頭は、プルキンエ細胞体内のユビキチン陽性凝集物を示す。スケールバー、50μm。Atxn1tg/−を含まないマウスのプルキンエ細胞においてユビキチン陽性凝集物は全く観察されなかった(図14D参照)。(図7I)PML−RNF4系によるPQCのモデル。PMLは、SRSを通してミスフォールドタンパク質を認識し、そしてそれらをそのSUMO E3リガーゼ活性を通してポリ−SUMO2/3鎖とコンジュゲートさせる(a)。RNF4は、SUMO化ミスフォールドタンパク質をユビキチン化し(b)、そしてプロテアソームによる分解のためにそれらを標的化する(c)。
図7は、図7Aから図7Iを含むが、これはPMLの欠損が、SCA1マウスモデルの行動表現型及び病理学的的表現型を悪化させることを実証する実験例の結果を示す。(図7A及び図7B)7週齢(図7A)及び11週齢(図7B)における加速式ロータロッド上での保持時間(平均値+標準誤差)であり、動物数が括弧内に示されている。(図7C及び図7D)12週齢の動物の小脳切片をヘマトキシリンを用いて染色した。(図7C)分子層の厚さの定量(平均値±標準誤差、1つの遺伝子型あたり3匹のマウス)。(図7D)代表的な染色画像。スケールバー、200μm。(図7E及び7F)1才齢の動物の小脳切片を、抗カルビンディン抗体を用いて染色した。(E)長さ1mmあたりの細胞体の平均数としてグラフにした、プルキンエ細胞の定量(平均値±標準誤差、1つの遺伝子型あたり4匹のマウス)。(F)代表的な染色画像。スケールバー、200μm。(図7G及び図7H)12週齢のマウス由来の小脳皮質切片を、抗ユビキチン抗体を用いて染色し、そしてヘマトキシリンを用いて対比染色した。(図7G)凝集物を含むプルキンエ細胞の比率(平均値±標準誤差、1つの遺伝子型あたり3匹のマウス)。(図7H)代表的な免疫組織化学的染色画像。矢頭は、プルキンエ細胞体内のユビキチン陽性凝集物を示す。スケールバー、50μm。Atxn1tg/−を含まないマウスのプルキンエ細胞においてユビキチン陽性凝集物は全く観察されなかった(図14D参照)。(図7I)PML−RNF4系によるPQCのモデル。PMLは、SRSを通してミスフォールドタンパク質を認識し、そしてそれらをそのSUMO E3リガーゼ活性を通してポリ−SUMO2/3鎖とコンジュゲートさせる(a)。RNF4は、SUMO化ミスフォールドタンパク質をユビキチン化し(b)、そしてプロテアソームによる分解のためにそれらを標的化する(c)。
図7は、図7Aから図7Iを含むが、これはPMLの欠損が、SCA1マウスモデルの行動表現型及び病理学的的表現型を悪化させることを実証する実験例の結果を示す。(図7A及び図7B)7週齢(図7A)及び11週齢(図7B)における加速式ロータロッド上での保持時間(平均値+標準誤差)であり、動物数が括弧内に示されている。(図7C及び図7D)12週齢の動物の小脳切片をヘマトキシリンを用いて染色した。(図7C)分子層の厚さの定量(平均値±標準誤差、1つの遺伝子型あたり3匹のマウス)。(図7D)代表的な染色画像。スケールバー、200μm。(図7E及び7F)1才齢の動物の小脳切片を、抗カルビンディン抗体を用いて染色した。(E)長さ1mmあたりの細胞体の平均数としてグラフにした、プルキンエ細胞の定量(平均値±標準誤差、1つの遺伝子型あたり4匹のマウス)。(F)代表的な染色画像。スケールバー、200μm。(図7G及び図7H)12週齢のマウス由来の小脳皮質切片を、抗ユビキチン抗体を用いて染色し、そしてヘマトキシリンを用いて対比染色した。(図7G)凝集物を含むプルキンエ細胞の比率(平均値±標準誤差、1つの遺伝子型あたり3匹のマウス)。(図7H)代表的な免疫組織化学的染色画像。矢頭は、プルキンエ細胞体内のユビキチン陽性凝集物を示す。スケールバー、50μm。Atxn1tg/−を含まないマウスのプルキンエ細胞においてユビキチン陽性凝集物は全く観察されなかった(図14D参照)。(図7I)PML−RNF4系によるPQCのモデル。PMLは、SRSを通してミスフォールドタンパク質を認識し、そしてそれらをそのSUMO E3リガーゼ活性を通してポリ−SUMO2/3鎖とコンジュゲートさせる(a)。RNF4は、SUMO化ミスフォールドタンパク質をユビキチン化し(b)、そしてプロテアソームによる分解のためにそれらを標的化する(c)。
図7は、図7Aから図7Iを含むが、これはPMLの欠損が、SCA1マウスモデルの行動表現型及び病理学的的表現型を悪化させることを実証する実験例の結果を示す。(図7A及び図7B)7週齢(図7A)及び11週齢(図7B)における加速式ロータロッド上での保持時間(平均値+標準誤差)であり、動物数が括弧内に示されている。(図7C及び図7D)12週齢の動物の小脳切片をヘマトキシリンを用いて染色した。(図7C)分子層の厚さの定量(平均値±標準誤差、1つの遺伝子型あたり3匹のマウス)。(図7D)代表的な染色画像。スケールバー、200μm。(図7E及び7F)1才齢の動物の小脳切片を、抗カルビンディン抗体を用いて染色した。(E)長さ1mmあたりの細胞体の平均数としてグラフにした、プルキンエ細胞の定量(平均値±標準誤差、1つの遺伝子型あたり4匹のマウス)。(F)代表的な染色画像。スケールバー、200μm。(図7G及び図7H)12週齢のマウス由来の小脳皮質切片を、抗ユビキチン抗体を用いて染色し、そしてヘマトキシリンを用いて対比染色した。(図7G)凝集物を含むプルキンエ細胞の比率(平均値±標準誤差、1つの遺伝子型あたり3匹のマウス)。(図7H)代表的な免疫組織化学的染色画像。矢頭は、プルキンエ細胞体内のユビキチン陽性凝集物を示す。スケールバー、50μm。Atxn1tg/−を含まないマウスのプルキンエ細胞においてユビキチン陽性凝集物は全く観察されなかった(図14D参照)。(図7I)PML−RNF4系によるPQCのモデル。PMLは、SRSを通してミスフォールドタンパク質を認識し、そしてそれらをそのSUMO E3リガーゼ活性を通してポリ−SUMO2/3鎖とコンジュゲートさせる(a)。RNF4は、SUMO化ミスフォールドタンパク質をユビキチン化し(b)、そしてプロテアソームによる分解のためにそれらを標的化する(c)。
図7は、図7Aから図7Iを含むが、これはPMLの欠損が、SCA1マウスモデルの行動表現型及び病理学的的表現型を悪化させることを実証する実験例の結果を示す。(図7A及び図7B)7週齢(図7A)及び11週齢(図7B)における加速式ロータロッド上での保持時間(平均値+標準誤差)であり、動物数が括弧内に示されている。(図7C及び図7D)12週齢の動物の小脳切片をヘマトキシリンを用いて染色した。(図7C)分子層の厚さの定量(平均値±標準誤差、1つの遺伝子型あたり3匹のマウス)。(図7D)代表的な染色画像。スケールバー、200μm。(図7E及び7F)1才齢の動物の小脳切片を、抗カルビンディン抗体を用いて染色した。(E)長さ1mmあたりの細胞体の平均数としてグラフにした、プルキンエ細胞の定量(平均値±標準誤差、1つの遺伝子型あたり4匹のマウス)。(F)代表的な染色画像。スケールバー、200μm。(図7G及び図7H)12週齢のマウス由来の小脳皮質切片を、抗ユビキチン抗体を用いて染色し、そしてヘマトキシリンを用いて対比染色した。(図7G)凝集物を含むプルキンエ細胞の比率(平均値±標準誤差、1つの遺伝子型あたり3匹のマウス)。(図7H)代表的な免疫組織化学的染色画像。矢頭は、プルキンエ細胞体内のユビキチン陽性凝集物を示す。スケールバー、50μm。Atxn1tg/−を含まないマウスのプルキンエ細胞においてユビキチン陽性凝集物は全く観察されなかった(図14D参照)。(図7I)PML−RNF4系によるPQCのモデル。PMLは、SRSを通してミスフォールドタンパク質を認識し、そしてそれらをそのSUMO E3リガーゼ活性を通してポリ−SUMO2/3鎖とコンジュゲートさせる(a)。RNF4は、SUMO化ミスフォールドタンパク質をユビキチン化し(b)、そしてプロテアソームによる分解のためにそれらを標的化する(c)。
図7は、図7Aから図7Iを含むが、これはPMLの欠損が、SCA1マウスモデルの行動表現型及び病理学的的表現型を悪化させることを実証する実験例の結果を示す。(図7A及び図7B)7週齢(図7A)及び11週齢(図7B)における加速式ロータロッド上での保持時間(平均値+標準誤差)であり、動物数が括弧内に示されている。(図7C及び図7D)12週齢の動物の小脳切片をヘマトキシリンを用いて染色した。(図7C)分子層の厚さの定量(平均値±標準誤差、1つの遺伝子型あたり3匹のマウス)。(図7D)代表的な染色画像。スケールバー、200μm。(図7E及び7F)1才齢の動物の小脳切片を、抗カルビンディン抗体を用いて染色した。(E)長さ1mmあたりの細胞体の平均数としてグラフにした、プルキンエ細胞の定量(平均値±標準誤差、1つの遺伝子型あたり4匹のマウス)。(F)代表的な染色画像。スケールバー、200μm。(図7G及び図7H)12週齢のマウス由来の小脳皮質切片を、抗ユビキチン抗体を用いて染色し、そしてヘマトキシリンを用いて対比染色した。(図7G)凝集物を含むプルキンエ細胞の比率(平均値±標準誤差、1つの遺伝子型あたり3匹のマウス)。(図7H)代表的な免疫組織化学的染色画像。矢頭は、プルキンエ細胞体内のユビキチン陽性凝集物を示す。スケールバー、50μm。Atxn1tg/−を含まないマウスのプルキンエ細胞においてユビキチン陽性凝集物は全く観察されなかった(図14D参照)。(図7I)PML−RNF4系によるPQCのモデル。PMLは、SRSを通してミスフォールドタンパク質を認識し、そしてそれらをそのSUMO E3リガーゼ活性を通してポリ−SUMO2/3鎖とコンジュゲートさせる(a)。RNF4は、SUMO化ミスフォールドタンパク質をユビキチン化し(b)、そしてプロテアソームによる分解のためにそれらを標的化する(c)。
図8は、図8Aから図8Gを含むが、これはPMLが、Atxn1 82Q凝集物と共局在し、そして不溶性Atxn1 82Qを減少させることを実証した実験例の結果を示す。(図8A)Atxn1 82Q−GFPを、各々の示されたPMLアイソフォームと一緒に、PML欠損(PML−/−)マウス胚性線維芽細胞(MEF)において発現させた。細胞を抗PML抗体(赤色)及びDAPI(青色)を用いて染色した。(図8B)対照siRNA(−)、PML siRNA4番、又はPML siRNA#9を用いて処置されたHeLa細胞内のFLAG−Atxn1 82Qのレベル。細胞溶解液をウェスタンブロット及びフィルター位相差アッセイによって分析した。対照に対して正規化された、アクチンに対するSS画分中のAtxn1 82Qの比が示されている。(図8C)HeLa細胞を対照siRNA、PML siRNA#4(PML mRNAの5’UTRに標的化した)、又はPML siRNA#4とPMLのオープンリーディングフレームを発現しているプラスミド(したがってsiRNAに対して抵抗性)を用いてトランスフェクトした。様々な画分中のAtxn1 82Q−GFPのレベルを分析した。(図8D)HeLa細胞を、対照siRNA、PML siRNA#4、及びPML siRNA#9を用いて処置し、その後、FLAG−Atxn1 82Qを用いてトランスフェクトした。FLAG−Atxn1 82Q転写物レベルを、18S rRNAのレベルに正規化された定量RT−PCRによって決定した。(図8E)Atxn1 30Q−GFPを、PMLの非存在下又は存在下においてHeLa細胞において発現させた。その後、細胞を指定された時間かけてCHXを用いて処置した。(図8F)HeLa細胞を、nFlucDM−GFP及び対応する野生型ルシフェラーゼ(WT)タンパク質を用いてトランスフェクトした。内因性PMLは抗PML抗体(赤色)によって検出され、そしてDNAはDAPI(青色)によって検出された。スケールバー:10μm。(図8G)PMLノックダウンにより、不溶性の突然変異ルシフェラーゼが蓄積される。HeLa細胞を対照又はPML siRNAを用いてトランスフェクトし、その後、nFluc−GFP又はnFlucDM−GFPを用いてトランスフェクトした。SR画分は非常に少量のnFlucDM−GFPを含有していた。
図8は、図8Aから図8Gを含むが、これはPMLが、Atxn1 82Q凝集物と共局在し、そして不溶性Atxn1 82Qを減少させることを実証した実験例の結果を示す。(図8A)Atxn1 82Q−GFPを、各々の示されたPMLアイソフォームと一緒に、PML欠損(PML−/−)マウス胚性線維芽細胞(MEF)において発現させた。細胞を抗PML抗体(赤色)及びDAPI(青色)を用いて染色した。(図8B)対照siRNA(−)、PML siRNA4番、又はPML siRNA#9を用いて処置されたHeLa細胞内のFLAG−Atxn1 82Qのレベル。細胞溶解液をウェスタンブロット及びフィルター位相差アッセイによって分析した。対照に対して正規化された、アクチンに対するSS画分中のAtxn1 82Qの比が示されている。(図8C)HeLa細胞を対照siRNA、PML siRNA#4(PML mRNAの5’UTRに標的化した)、又はPML siRNA#4とPMLのオープンリーディングフレームを発現しているプラスミド(したがってsiRNAに対して抵抗性)を用いてトランスフェクトした。様々な画分中のAtxn1 82Q−GFPのレベルを分析した。(図8D)HeLa細胞を、対照siRNA、PML siRNA#4、及びPML siRNA#9を用いて処置し、その後、FLAG−Atxn1 82Qを用いてトランスフェクトした。FLAG−Atxn1 82Q転写物レベルを、18S rRNAのレベルに正規化された定量RT−PCRによって決定した。(図8E)Atxn1 30Q−GFPを、PMLの非存在下又は存在下においてHeLa細胞において発現させた。その後、細胞を指定された時間かけてCHXを用いて処置した。(図8F)HeLa細胞を、nFlucDM−GFP及び対応する野生型ルシフェラーゼ(WT)タンパク質を用いてトランスフェクトした。内因性PMLは抗PML抗体(赤色)によって検出され、そしてDNAはDAPI(青色)によって検出された。スケールバー:10μm。(図8G)PMLノックダウンにより、不溶性の突然変異ルシフェラーゼが蓄積される。HeLa細胞を対照又はPML siRNAを用いてトランスフェクトし、その後、nFluc−GFP又はnFlucDM−GFPを用いてトランスフェクトした。SR画分は非常に少量のnFlucDM−GFPを含有していた。
図8は、図8Aから図8Gを含むが、これはPMLが、Atxn1 82Q凝集物と共局在し、そして不溶性Atxn1 82Qを減少させることを実証した実験例の結果を示す。(図8A)Atxn1 82Q−GFPを、各々の示されたPMLアイソフォームと一緒に、PML欠損(PML−/−)マウス胚性線維芽細胞(MEF)において発現させた。細胞を抗PML抗体(赤色)及びDAPI(青色)を用いて染色した。(図8B)対照siRNA(−)、PML siRNA4番、又はPML siRNA#9を用いて処置されたHeLa細胞内のFLAG−Atxn1 82Qのレベル。細胞溶解液をウェスタンブロット及びフィルター位相差アッセイによって分析した。対照に対して正規化された、アクチンに対するSS画分中のAtxn1 82Qの比が示されている。(図8C)HeLa細胞を対照siRNA、PML siRNA#4(PML mRNAの5’UTRに標的化した)、又はPML siRNA#4とPMLのオープンリーディングフレームを発現しているプラスミド(したがってsiRNAに対して抵抗性)を用いてトランスフェクトした。様々な画分中のAtxn1 82Q−GFPのレベルを分析した。(図8D)HeLa細胞を、対照siRNA、PML siRNA#4、及びPML siRNA#9を用いて処置し、その後、FLAG−Atxn1 82Qを用いてトランスフェクトした。FLAG−Atxn1 82Q転写物レベルを、18S rRNAのレベルに正規化された定量RT−PCRによって決定した。(図8E)Atxn1 30Q−GFPを、PMLの非存在下又は存在下においてHeLa細胞において発現させた。その後、細胞を指定された時間かけてCHXを用いて処置した。(図8F)HeLa細胞を、nFlucDM−GFP及び対応する野生型ルシフェラーゼ(WT)タンパク質を用いてトランスフェクトした。内因性PMLは抗PML抗体(赤色)によって検出され、そしてDNAはDAPI(青色)によって検出された。スケールバー:10μm。(図8G)PMLノックダウンにより、不溶性の突然変異ルシフェラーゼが蓄積される。HeLa細胞を対照又はPML siRNAを用いてトランスフェクトし、その後、nFluc−GFP又はnFlucDM−GFPを用いてトランスフェクトした。SR画分は非常に少量のnFlucDM−GFPを含有していた。
図8は、図8Aから図8Gを含むが、これはPMLが、Atxn1 82Q凝集物と共局在し、そして不溶性Atxn1 82Qを減少させることを実証した実験例の結果を示す。(図8A)Atxn1 82Q−GFPを、各々の示されたPMLアイソフォームと一緒に、PML欠損(PML−/−)マウス胚性線維芽細胞(MEF)において発現させた。細胞を抗PML抗体(赤色)及びDAPI(青色)を用いて染色した。(図8B)対照siRNA(−)、PML siRNA4番、又はPML siRNA#9を用いて処置されたHeLa細胞内のFLAG−Atxn1 82Qのレベル。細胞溶解液をウェスタンブロット及びフィルター位相差アッセイによって分析した。対照に対して正規化された、アクチンに対するSS画分中のAtxn1 82Qの比が示されている。(図8C)HeLa細胞を対照siRNA、PML siRNA#4(PML mRNAの5’UTRに標的化した)、又はPML siRNA#4とPMLのオープンリーディングフレームを発現しているプラスミド(したがってsiRNAに対して抵抗性)を用いてトランスフェクトした。様々な画分中のAtxn1 82Q−GFPのレベルを分析した。(図8D)HeLa細胞を、対照siRNA、PML siRNA#4、及びPML siRNA#9を用いて処置し、その後、FLAG−Atxn1 82Qを用いてトランスフェクトした。FLAG−Atxn1 82Q転写物レベルを、18S rRNAのレベルに正規化された定量RT−PCRによって決定した。(図8E)Atxn1 30Q−GFPを、PMLの非存在下又は存在下においてHeLa細胞において発現させた。その後、細胞を指定された時間かけてCHXを用いて処置した。(図8F)HeLa細胞を、nFlucDM−GFP及び対応する野生型ルシフェラーゼ(WT)タンパク質を用いてトランスフェクトした。内因性PMLは抗PML抗体(赤色)によって検出され、そしてDNAはDAPI(青色)によって検出された。スケールバー:10μm。(図8G)PMLノックダウンにより、不溶性の突然変異ルシフェラーゼが蓄積される。HeLa細胞を対照又はPML siRNAを用いてトランスフェクトし、その後、nFluc−GFP又はnFlucDM−GFPを用いてトランスフェクトした。SR画分は非常に少量のnFlucDM−GFPを含有していた。
図8は、図8Aから図8Gを含むが、これはPMLが、Atxn1 82Q凝集物と共局在し、そして不溶性Atxn1 82Qを減少させることを実証した実験例の結果を示す。(図8A)Atxn1 82Q−GFPを、各々の示されたPMLアイソフォームと一緒に、PML欠損(PML−/−)マウス胚性線維芽細胞(MEF)において発現させた。細胞を抗PML抗体(赤色)及びDAPI(青色)を用いて染色した。(図8B)対照siRNA(−)、PML siRNA4番、又はPML siRNA#9を用いて処置されたHeLa細胞内のFLAG−Atxn1 82Qのレベル。細胞溶解液をウェスタンブロット及びフィルター位相差アッセイによって分析した。対照に対して正規化された、アクチンに対するSS画分中のAtxn1 82Qの比が示されている。(図8C)HeLa細胞を対照siRNA、PML siRNA#4(PML mRNAの5’UTRに標的化した)、又はPML siRNA#4とPMLのオープンリーディングフレームを発現しているプラスミド(したがってsiRNAに対して抵抗性)を用いてトランスフェクトした。様々な画分中のAtxn1 82Q−GFPのレベルを分析した。(図8D)HeLa細胞を、対照siRNA、PML siRNA#4、及びPML siRNA#9を用いて処置し、その後、FLAG−Atxn1 82Qを用いてトランスフェクトした。FLAG−Atxn1 82Q転写物レベルを、18S rRNAのレベルに正規化された定量RT−PCRによって決定した。(図8E)Atxn1 30Q−GFPを、PMLの非存在下又は存在下においてHeLa細胞において発現させた。その後、細胞を指定された時間かけてCHXを用いて処置した。(図8F)HeLa細胞を、nFlucDM−GFP及び対応する野生型ルシフェラーゼ(WT)タンパク質を用いてトランスフェクトした。内因性PMLは抗PML抗体(赤色)によって検出され、そしてDNAはDAPI(青色)によって検出された。スケールバー:10μm。(図8G)PMLノックダウンにより、不溶性の突然変異ルシフェラーゼが蓄積される。HeLa細胞を対照又はPML siRNAを用いてトランスフェクトし、その後、nFluc−GFP又はnFlucDM−GFPを用いてトランスフェクトした。SR画分は非常に少量のnFlucDM−GFPを含有していた。
図8は、図8Aから図8Gを含むが、これはPMLが、Atxn1 82Q凝集物と共局在し、そして不溶性Atxn1 82Qを減少させることを実証した実験例の結果を示す。(図8A)Atxn1 82Q−GFPを、各々の示されたPMLアイソフォームと一緒に、PML欠損(PML−/−)マウス胚性線維芽細胞(MEF)において発現させた。細胞を抗PML抗体(赤色)及びDAPI(青色)を用いて染色した。(図8B)対照siRNA(−)、PML siRNA4番、又はPML siRNA#9を用いて処置されたHeLa細胞内のFLAG−Atxn1 82Qのレベル。細胞溶解液をウェスタンブロット及びフィルター位相差アッセイによって分析した。対照に対して正規化された、アクチンに対するSS画分中のAtxn1 82Qの比が示されている。(図8C)HeLa細胞を対照siRNA、PML siRNA#4(PML mRNAの5’UTRに標的化した)、又はPML siRNA#4とPMLのオープンリーディングフレームを発現しているプラスミド(したがってsiRNAに対して抵抗性)を用いてトランスフェクトした。様々な画分中のAtxn1 82Q−GFPのレベルを分析した。(図8D)HeLa細胞を、対照siRNA、PML siRNA#4、及びPML siRNA#9を用いて処置し、その後、FLAG−Atxn1 82Qを用いてトランスフェクトした。FLAG−Atxn1 82Q転写物レベルを、18S rRNAのレベルに正規化された定量RT−PCRによって決定した。(図8E)Atxn1 30Q−GFPを、PMLの非存在下又は存在下においてHeLa細胞において発現させた。その後、細胞を指定された時間かけてCHXを用いて処置した。(図8F)HeLa細胞を、nFlucDM−GFP及び対応する野生型ルシフェラーゼ(WT)タンパク質を用いてトランスフェクトした。内因性PMLは抗PML抗体(赤色)によって検出され、そしてDNAはDAPI(青色)によって検出された。スケールバー:10μm。(図8G)PMLノックダウンにより、不溶性の突然変異ルシフェラーゼが蓄積される。HeLa細胞を対照又はPML siRNAを用いてトランスフェクトし、その後、nFluc−GFP又はnFlucDM−GFPを用いてトランスフェクトした。SR画分は非常に少量のnFlucDM−GFPを含有していた。
図8は、図8Aから図8Gを含むが、これはPMLが、Atxn1 82Q凝集物と共局在し、そして不溶性Atxn1 82Qを減少させることを実証した実験例の結果を示す。(図8A)Atxn1 82Q−GFPを、各々の示されたPMLアイソフォームと一緒に、PML欠損(PML−/−)マウス胚性線維芽細胞(MEF)において発現させた。細胞を抗PML抗体(赤色)及びDAPI(青色)を用いて染色した。(図8B)対照siRNA(−)、PML siRNA4番、又はPML siRNA#9を用いて処置されたHeLa細胞内のFLAG−Atxn1 82Qのレベル。細胞溶解液をウェスタンブロット及びフィルター位相差アッセイによって分析した。対照に対して正規化された、アクチンに対するSS画分中のAtxn1 82Qの比が示されている。(図8C)HeLa細胞を対照siRNA、PML siRNA#4(PML mRNAの5’UTRに標的化した)、又はPML siRNA#4とPMLのオープンリーディングフレームを発現しているプラスミド(したがってsiRNAに対して抵抗性)を用いてトランスフェクトした。様々な画分中のAtxn1 82Q−GFPのレベルを分析した。(図8D)HeLa細胞を、対照siRNA、PML siRNA#4、及びPML siRNA#9を用いて処置し、その後、FLAG−Atxn1 82Qを用いてトランスフェクトした。FLAG−Atxn1 82Q転写物レベルを、18S rRNAのレベルに正規化された定量RT−PCRによって決定した。(図8E)Atxn1 30Q−GFPを、PMLの非存在下又は存在下においてHeLa細胞において発現させた。その後、細胞を指定された時間かけてCHXを用いて処置した。(図8F)HeLa細胞を、nFlucDM−GFP及び対応する野生型ルシフェラーゼ(WT)タンパク質を用いてトランスフェクトした。内因性PMLは抗PML抗体(赤色)によって検出され、そしてDNAはDAPI(青色)によって検出された。スケールバー:10μm。(図8G)PMLノックダウンにより、不溶性の突然変異ルシフェラーゼが蓄積される。HeLa細胞を対照又はPML siRNAを用いてトランスフェクトし、その後、nFluc−GFP又はnFlucDM−GFPを用いてトランスフェクトした。SR画分は非常に少量のnFlucDM−GFPを含有していた。
図9は、図9Aから図9Eを含むが、これはPMLと病原性Httタンパク質の相互作用を実証した実験例の結果を示す。(図9A)PMLは、病原性Httと優先的に相互作用する。FLAG−GFP又はFLAG−PMLを発現している293T細胞の溶解液を、グルタチオンビーズ上に固定されたGST−Htt25Q若しくはGST−Htt103Q(レーン1〜3及び5〜7)と共に、又は対照グルタチオンビーズ(レーン4及び8)と共にインキュベートした。インプット画分及びプルダウン画分をウェスタンブロットによって分析した。(図9B)野生型PMLアイソフォームIV(アミノ酸1〜633)(本研究ではPMLと呼ばれる)及び様々な欠失断片(F1〜F10)の図解。RINGドメイン(R)、B1ボックス、B2ボックス、及びコイルドコイル領域(CC)は標識されている。基質認識部位SRS1及びSRS2は線によって示されている。PMLと病原性Httタンパク質(Htt103Q又は52Q)及び変性ルシフェラーゼとの相互作用が示されている。ND:実施されず。(図9C)完全長PML及びPML欠失突然変異体とHttの相互作用。PMLタンパク質は、[35S]Metの存在下において共役させたインビトロでの転写/翻訳によって生成され、そしてグルタチオンビーズ上に固定された精製されたGST−Htt103Q、GST−Htt25Q、又はGSTと共にインキュベートした。インプット試料及びプルダウン試料中の[35S]Met標識タンパク質をオートラジオグラフィーによって分析し、そしてプルダウン試料中のGSTタンパク質をクーマシー染色によって分析した。3つのプルダウン試料セットを同時にかつ同じように(試料の量及びオートラジオグラフィーへの露光時間を含む)で分析した。インプット試料をより短い時間かけて露光させた。(図9D)Htt52Q及びCC脱安定化(cc−)突然変異体の配列。Htt52Qcc−においてProに変化させたHtt52Q内のアミノ酸が赤色で示されている。(図9E)精製されたPML CC領域(右に示されている)とセルロースに結合させたルシフェラーゼペプチド走査の相互作用を図2Dのようにアッセイした。*TEVプロテアーゼ。
図9は、図9Aから図9Eを含むが、これはPMLと病原性Httタンパク質の相互作用を実証した実験例の結果を示す。(図9A)PMLは、病原性Httと優先的に相互作用する。FLAG−GFP又はFLAG−PMLを発現している293T細胞の溶解液を、グルタチオンビーズ上に固定されたGST−Htt25Q若しくはGST−Htt103Q(レーン1〜3及び5〜7)と共に、又は対照グルタチオンビーズ(レーン4及び8)と共にインキュベートした。インプット画分及びプルダウン画分をウェスタンブロットによって分析した。(図9B)野生型PMLアイソフォームIV(アミノ酸1〜633)(本研究ではPMLと呼ばれる)及び様々な欠失断片(F1〜F10)の図解。RINGドメイン(R)、B1ボックス、B2ボックス、及びコイルドコイル領域(CC)は標識されている。基質認識部位SRS1及びSRS2は線によって示されている。PMLと病原性Httタンパク質(Htt103Q又は52Q)及び変性ルシフェラーゼとの相互作用が示されている。ND:実施されず。(図9C)完全長PML及びPML欠失突然変異体とHttの相互作用。PMLタンパク質は、[35S]Metの存在下において共役させたインビトロでの転写/翻訳によって生成され、そしてグルタチオンビーズ上に固定された精製されたGST−Htt103Q、GST−Htt25Q、又はGSTと共にインキュベートした。インプット試料及びプルダウン試料中の[35S]Met標識タンパク質をオートラジオグラフィーによって分析し、そしてプルダウン試料中のGSTタンパク質をクーマシー染色によって分析した。3つのプルダウン試料セットを同時にかつ同じように(試料の量及びオートラジオグラフィーへの露光時間を含む)で分析した。インプット試料をより短い時間かけて露光させた。(図9D)Htt52Q及びCC脱安定化(cc−)突然変異体の配列。Htt52Qcc−においてProに変化させたHtt52Q内のアミノ酸が赤色で示されている。(図9E)精製されたPML CC領域(右に示されている)とセルロースに結合させたルシフェラーゼペプチド走査の相互作用を図2Dのようにアッセイした。*TEVプロテアーゼ。
図9は、図9Aから図9Eを含むが、これはPMLと病原性Httタンパク質の相互作用を実証した実験例の結果を示す。(図9A)PMLは、病原性Httと優先的に相互作用する。FLAG−GFP又はFLAG−PMLを発現している293T細胞の溶解液を、グルタチオンビーズ上に固定されたGST−Htt25Q若しくはGST−Htt103Q(レーン1〜3及び5〜7)と共に、又は対照グルタチオンビーズ(レーン4及び8)と共にインキュベートした。インプット画分及びプルダウン画分をウェスタンブロットによって分析した。(図9B)野生型PMLアイソフォームIV(アミノ酸1〜633)(本研究ではPMLと呼ばれる)及び様々な欠失断片(F1〜F10)の図解。RINGドメイン(R)、B1ボックス、B2ボックス、及びコイルドコイル領域(CC)は標識されている。基質認識部位SRS1及びSRS2は線によって示されている。PMLと病原性Httタンパク質(Htt103Q又は52Q)及び変性ルシフェラーゼとの相互作用が示されている。ND:実施されず。(図9C)完全長PML及びPML欠失突然変異体とHttの相互作用。PMLタンパク質は、[35S]Metの存在下において共役させたインビトロでの転写/翻訳によって生成され、そしてグルタチオンビーズ上に固定された精製されたGST−Htt103Q、GST−Htt25Q、又はGSTと共にインキュベートした。インプット試料及びプルダウン試料中の[35S]Met標識タンパク質をオートラジオグラフィーによって分析し、そしてプルダウン試料中のGSTタンパク質をクーマシー染色によって分析した。3つのプルダウン試料セットを同時にかつ同じように(試料の量及びオートラジオグラフィーへの露光時間を含む)で分析した。インプット試料をより短い時間かけて露光させた。(図9D)Htt52Q及びCC脱安定化(cc−)突然変異体の配列。Htt52Qcc−においてProに変化させたHtt52Q内のアミノ酸が赤色で示されている。(図9E)精製されたPML CC領域(右に示されている)とセルロースに結合させたルシフェラーゼペプチド走査の相互作用を図2Dのようにアッセイした。*TEVプロテアーゼ。
図9は、図9Aから図9Eを含むが、これはPMLと病原性Httタンパク質の相互作用を実証した実験例の結果を示す。(図9A)PMLは、病原性Httと優先的に相互作用する。FLAG−GFP又はFLAG−PMLを発現している293T細胞の溶解液を、グルタチオンビーズ上に固定されたGST−Htt25Q若しくはGST−Htt103Q(レーン1〜3及び5〜7)と共に、又は対照グルタチオンビーズ(レーン4及び8)と共にインキュベートした。インプット画分及びプルダウン画分をウェスタンブロットによって分析した。(図9B)野生型PMLアイソフォームIV(アミノ酸1〜633)(本研究ではPMLと呼ばれる)及び様々な欠失断片(F1〜F10)の図解。RINGドメイン(R)、B1ボックス、B2ボックス、及びコイルドコイル領域(CC)は標識されている。基質認識部位SRS1及びSRS2は線によって示されている。PMLと病原性Httタンパク質(Htt103Q又は52Q)及び変性ルシフェラーゼとの相互作用が示されている。ND:実施されず。(図9C)完全長PML及びPML欠失突然変異体とHttの相互作用。PMLタンパク質は、[35S]Metの存在下において共役させたインビトロでの転写/翻訳によって生成され、そしてグルタチオンビーズ上に固定された精製されたGST−Htt103Q、GST−Htt25Q、又はGSTと共にインキュベートした。インプット試料及びプルダウン試料中の[35S]Met標識タンパク質をオートラジオグラフィーによって分析し、そしてプルダウン試料中のGSTタンパク質をクーマシー染色によって分析した。3つのプルダウン試料セットを同時にかつ同じように(試料の量及びオートラジオグラフィーへの露光時間を含む)で分析した。インプット試料をより短い時間かけて露光させた。(図9D)Htt52Q及びCC脱安定化(cc−)突然変異体の配列。Htt52Qcc−においてProに変化させたHtt52Q内のアミノ酸が赤色で示されている。(図9E)精製されたPML CC領域(右に示されている)とセルロースに結合させたルシフェラーゼペプチド走査の相互作用を図2Dのようにアッセイした。*TEVプロテアーゼ。
図9は、図9Aから図9Eを含むが、これはPMLと病原性Httタンパク質の相互作用を実証した実験例の結果を示す。(図9A)PMLは、病原性Httと優先的に相互作用する。FLAG−GFP又はFLAG−PMLを発現している293T細胞の溶解液を、グルタチオンビーズ上に固定されたGST−Htt25Q若しくはGST−Htt103Q(レーン1〜3及び5〜7)と共に、又は対照グルタチオンビーズ(レーン4及び8)と共にインキュベートした。インプット画分及びプルダウン画分をウェスタンブロットによって分析した。(図9B)野生型PMLアイソフォームIV(アミノ酸1〜633)(本研究ではPMLと呼ばれる)及び様々な欠失断片(F1〜F10)の図解。RINGドメイン(R)、B1ボックス、B2ボックス、及びコイルドコイル領域(CC)は標識されている。基質認識部位SRS1及びSRS2は線によって示されている。PMLと病原性Httタンパク質(Htt103Q又は52Q)及び変性ルシフェラーゼとの相互作用が示されている。ND:実施されず。(図9C)完全長PML及びPML欠失突然変異体とHttの相互作用。PMLタンパク質は、[35S]Metの存在下において共役させたインビトロでの転写/翻訳によって生成され、そしてグルタチオンビーズ上に固定された精製されたGST−Htt103Q、GST−Htt25Q、又はGSTと共にインキュベートした。インプット試料及びプルダウン試料中の[35S]Met標識タンパク質をオートラジオグラフィーによって分析し、そしてプルダウン試料中のGSTタンパク質をクーマシー染色によって分析した。3つのプルダウン試料セットを同時にかつ同じように(試料の量及びオートラジオグラフィーへの露光時間を含む)で分析した。インプット試料をより短い時間かけて露光させた。(図9D)Htt52Q及びCC脱安定化(cc−)突然変異体の配列。Htt52Qcc−においてProに変化させたHtt52Q内のアミノ酸が赤色で示されている。(図9E)精製されたPML CC領域(右に示されている)とセルロースに結合させたルシフェラーゼペプチド走査の相互作用を図2Dのようにアッセイした。*TEVプロテアーゼ。
図10は、図10Aから図10Cを含むが、これはPMLと変性ルシフェラーゼの相互作用を実証した実験例の結果を示す。(図10A)PML断片と変性ルシフェラーゼの相互作用。インビトロで翻訳され[35S]で標識された完全長FLAG−PML及びFLAG−PML欠失突然変異体を、ビーズ上に固定させた天然若しくは変性ルシフェラーゼ、又は対照ビーズと共にインキュベートした。インプット及びビーズに結合させたPMLタンパク質をオートラジオグラフィーによって分析し、そしてルシフェラーゼをクーマシーブルー染色によって分析した。*、非特異的バンド。3つのプルダウン試料セットを同時にかつ同じように(試料の量及びオートラジオグラフィーへの露光時間を含む)で分析した。インプット試料をより短い時間かけて露光させた。(図10B及び図10C)PML上の第二の基質認識部位(SRS2)の同定。(図10B)C末端にアミノ酸を包含しているPML欠失突然変異体、及び変性ルシフェラーゼとのその相互作用の要約。(図10C)インビトロで翻訳され[35S]で標識されたPML断片のGST融合物又はGSTを、(図10A)に記載のようにルシフェラーゼとの相互作用について試験した。
図10は、図10Aから図10Cを含むが、これはPMLと変性ルシフェラーゼの相互作用を実証した実験例の結果を示す。(図10A)PML断片と変性ルシフェラーゼの相互作用。インビトロで翻訳され[35S]で標識された完全長FLAG−PML及びFLAG−PML欠失突然変異体を、ビーズ上に固定させた天然若しくは変性ルシフェラーゼ、又は対照ビーズと共にインキュベートした。インプット及びビーズに結合させたPMLタンパク質をオートラジオグラフィーによって分析し、そしてルシフェラーゼをクーマシーブルー染色によって分析した。*、非特異的バンド。3つのプルダウン試料セットを同時にかつ同じように(試料の量及びオートラジオグラフィーへの露光時間を含む)で分析した。インプット試料をより短い時間かけて露光させた。(図10B及び図10C)PML上の第二の基質認識部位(SRS2)の同定。(図10B)C末端にアミノ酸を包含しているPML欠失突然変異体、及び変性ルシフェラーゼとのその相互作用の要約。(図10C)インビトロで翻訳され[35S]で標識されたPML断片のGST融合物又はGSTを、(図10A)に記載のようにルシフェラーゼとの相互作用について試験した。
図10は、図10Aから図10Cを含むが、これはPMLと変性ルシフェラーゼの相互作用を実証した実験例の結果を示す。(図10A)PML断片と変性ルシフェラーゼの相互作用。インビトロで翻訳され[35S]で標識された完全長FLAG−PML及びFLAG−PML欠失突然変異体を、ビーズ上に固定させた天然若しくは変性ルシフェラーゼ、又は対照ビーズと共にインキュベートした。インプット及びビーズに結合させたPMLタンパク質をオートラジオグラフィーによって分析し、そしてルシフェラーゼをクーマシーブルー染色によって分析した。*、非特異的バンド。3つのプルダウン試料セットを同時にかつ同じように(試料の量及びオートラジオグラフィーへの露光時間を含む)で分析した。インプット試料をより短い時間かけて露光させた。(図10B及び図10C)PML上の第二の基質認識部位(SRS2)の同定。(図10B)C末端にアミノ酸を包含しているPML欠失突然変異体、及び変性ルシフェラーゼとのその相互作用の要約。(図10C)インビトロで翻訳され[35S]で標識されたPML断片のGST融合物又はGSTを、(図10A)に記載のようにルシフェラーゼとの相互作用について試験した。
図11は、図11Aから図11Gを含むが、これはSUMO2/3によるミスフォールドタンパク質の修飾を実証した実験例の結果を示す。(図11A)HeLa細胞を、FLAG−Atxn1 82Q又はFLAG−Atxn1 82Q(5KR)を用いてトランスフェクトし、そしてMG132を用いて又は用いずに処置した。FLAG−Atxn1 82Q及びFLAG−Atxn1 82Q(5KR)をd−IPによって単離し、そしてそれらのSUMO2/3修飾をウェスタンブロットによって分析した。(図11B)HeLa細胞を、GFP−TDP−43を用いずに又は用いてトランスフェクトし、そしてビヒクル(DMSO)(−)又はMG132(+)を用いて処置した。d−IPは、抗GFP抗体又は対照抗体を使用して実施された。d−IP産物はウェスタンブロットによって分析された。(図11C)HeLa細胞を、nFluc−GFP、nFlucSM−GFP、及びnFlucSM−GFPを用いてトランスフェクトし(各々はまた、FLAGエピトープを用いてN末端がタグ化された)、そしてMG132を用いて又は用いずに処置した。nFlucタンパク質をd−IPによって単離した。全細胞溶解液(WCL)及びIP産物をウェスタンブロットによって分析した。WTルシフェラーゼ対SM/DMルシフェラーゼのSUMO2/3による修飾の間の差異(上、レーン1〜3)は、WCLにおける全体的なSUMO2/3コンジュゲーションの変化に起因しなかったことに留意されたい(下)。(図11D)Atxn1 82Q−GFPを、対照(Ctrl)、SUMO2/3、又はSUMO1 siRNAを用いて前処置されたHeLa細胞において発現させた。細胞溶解液をウェスタンブロットによって分析した。(図11E及び図11F)HeLa細胞を、対照(Ctrl)siRNA、SUMO2/3siRNA、若しくはSUMO1 siRNAを用いて処置したか(図11E)、又はこれらのsiRNAを用いて処置し、そしてその後、GFPを用いてトランスフェクトした(図11F)。細胞溶解液をウェスタンブロットによって分析した。(図11G)インビトロでのSUMO化アッセイのために使用されたPML及びPML M6タンパク質。FLAG−PML及びFLAG−PML M6を293T細胞において発現させ、そして抗FLAG(M2)ビーズによって精製した。タンパク質をBSA標準物質と共にクーマシー染色(左)によって及びウェスタンブロット(右)によって分析した。PML及びPML M6レーンの両方(左)に提示された2本の追加のバンド(矢頭)は、ウェスタンブロット(右)及び質量分析の両方に基づいてPML断片であると決定された。M6突然変異体の図解が下に示されている。*:点突然変異が本明細書の何処かに記載されている。
図11は、図11Aから図11Gを含むが、これはSUMO2/3によるミスフォールドタンパク質の修飾を実証した実験例の結果を示す。(図11A)HeLa細胞を、FLAG−Atxn1 82Q又はFLAG−Atxn1 82Q(5KR)を用いてトランスフェクトし、そしてMG132を用いて又は用いずに処置した。FLAG−Atxn1 82Q及びFLAG−Atxn1 82Q(5KR)をd−IPによって単離し、そしてそれらのSUMO2/3修飾をウェスタンブロットによって分析した。(図11B)HeLa細胞を、GFP−TDP−43を用いずに又は用いてトランスフェクトし、そしてビヒクル(DMSO)(−)又はMG132(+)を用いて処置した。d−IPは、抗GFP抗体又は対照抗体を使用して実施された。d−IP産物はウェスタンブロットによって分析された。(図11C)HeLa細胞を、nFluc−GFP、nFlucSM−GFP、及びnFlucSM−GFPを用いてトランスフェクトし(各々はまた、FLAGエピトープを用いてN末端がタグ化された)、そしてMG132を用いて又は用いずに処置した。nFlucタンパク質をd−IPによって単離した。全細胞溶解液(WCL)及びIP産物をウェスタンブロットによって分析した。WTルシフェラーゼ対SM/DMルシフェラーゼのSUMO2/3による修飾の間の差異(上、レーン1〜3)は、WCLにおける全体的なSUMO2/3コンジュゲーションの変化に起因しなかったことに留意されたい(下)。(図11D)Atxn1 82Q−GFPを、対照(Ctrl)、SUMO2/3、又はSUMO1 siRNAを用いて前処置されたHeLa細胞において発現させた。細胞溶解液をウェスタンブロットによって分析した。(図11E及び図11F)HeLa細胞を、対照(Ctrl)siRNA、SUMO2/3siRNA、若しくはSUMO1 siRNAを用いて処置したか(図11E)、又はこれらのsiRNAを用いて処置し、そしてその後、GFPを用いてトランスフェクトした(図11F)。細胞溶解液をウェスタンブロットによって分析した。(図11G)インビトロでのSUMO化アッセイのために使用されたPML及びPML M6タンパク質。FLAG−PML及びFLAG−PML M6を293T細胞において発現させ、そして抗FLAG(M2)ビーズによって精製した。タンパク質をBSA標準物質と共にクーマシー染色(左)によって及びウェスタンブロット(右)によって分析した。PML及びPML M6レーンの両方(左)に提示された2本の追加のバンド(矢頭)は、ウェスタンブロット(右)及び質量分析の両方に基づいてPML断片であると決定された。M6突然変異体の図解が下に示されている。*:点突然変異が本明細書の何処かに記載されている。
図11は、図11Aから図11Gを含むが、これはSUMO2/3によるミスフォールドタンパク質の修飾を実証した実験例の結果を示す。(図11A)HeLa細胞を、FLAG−Atxn1 82Q又はFLAG−Atxn1 82Q(5KR)を用いてトランスフェクトし、そしてMG132を用いて又は用いずに処置した。FLAG−Atxn1 82Q及びFLAG−Atxn1 82Q(5KR)をd−IPによって単離し、そしてそれらのSUMO2/3修飾をウェスタンブロットによって分析した。(図11B)HeLa細胞を、GFP−TDP−43を用いずに又は用いてトランスフェクトし、そしてビヒクル(DMSO)(−)又はMG132(+)を用いて処置した。d−IPは、抗GFP抗体又は対照抗体を使用して実施された。d−IP産物はウェスタンブロットによって分析された。(図11C)HeLa細胞を、nFluc−GFP、nFlucSM−GFP、及びnFlucSM−GFPを用いてトランスフェクトし(各々はまた、FLAGエピトープを用いてN末端がタグ化された)、そしてMG132を用いて又は用いずに処置した。nFlucタンパク質をd−IPによって単離した。全細胞溶解液(WCL)及びIP産物をウェスタンブロットによって分析した。WTルシフェラーゼ対SM/DMルシフェラーゼのSUMO2/3による修飾の間の差異(上、レーン1〜3)は、WCLにおける全体的なSUMO2/3コンジュゲーションの変化に起因しなかったことに留意されたい(下)。(図11D)Atxn1 82Q−GFPを、対照(Ctrl)、SUMO2/3、又はSUMO1 siRNAを用いて前処置されたHeLa細胞において発現させた。細胞溶解液をウェスタンブロットによって分析した。(図11E及び図11F)HeLa細胞を、対照(Ctrl)siRNA、SUMO2/3siRNA、若しくはSUMO1 siRNAを用いて処置したか(図11E)、又はこれらのsiRNAを用いて処置し、そしてその後、GFPを用いてトランスフェクトした(図11F)。細胞溶解液をウェスタンブロットによって分析した。(図11G)インビトロでのSUMO化アッセイのために使用されたPML及びPML M6タンパク質。FLAG−PML及びFLAG−PML M6を293T細胞において発現させ、そして抗FLAG(M2)ビーズによって精製した。タンパク質をBSA標準物質と共にクーマシー染色(左)によって及びウェスタンブロット(右)によって分析した。PML及びPML M6レーンの両方(左)に提示された2本の追加のバンド(矢頭)は、ウェスタンブロット(右)及び質量分析の両方に基づいてPML断片であると決定された。M6突然変異体の図解が下に示されている。*:点突然変異が本明細書の何処かに記載されている。
図11は、図11Aから図11Gを含むが、これはSUMO2/3によるミスフォールドタンパク質の修飾を実証した実験例の結果を示す。(図11A)HeLa細胞を、FLAG−Atxn1 82Q又はFLAG−Atxn1 82Q(5KR)を用いてトランスフェクトし、そしてMG132を用いて又は用いずに処置した。FLAG−Atxn1 82Q及びFLAG−Atxn1 82Q(5KR)をd−IPによって単離し、そしてそれらのSUMO2/3修飾をウェスタンブロットによって分析した。(図11B)HeLa細胞を、GFP−TDP−43を用いずに又は用いてトランスフェクトし、そしてビヒクル(DMSO)(−)又はMG132(+)を用いて処置した。d−IPは、抗GFP抗体又は対照抗体を使用して実施された。d−IP産物はウェスタンブロットによって分析された。(図11C)HeLa細胞を、nFluc−GFP、nFlucSM−GFP、及びnFlucSM−GFPを用いてトランスフェクトし(各々はまた、FLAGエピトープを用いてN末端がタグ化された)、そしてMG132を用いて又は用いずに処置した。nFlucタンパク質をd−IPによって単離した。全細胞溶解液(WCL)及びIP産物をウェスタンブロットによって分析した。WTルシフェラーゼ対SM/DMルシフェラーゼのSUMO2/3による修飾の間の差異(上、レーン1〜3)は、WCLにおける全体的なSUMO2/3コンジュゲーションの変化に起因しなかったことに留意されたい(下)。(図11D)Atxn1 82Q−GFPを、対照(Ctrl)、SUMO2/3、又はSUMO1 siRNAを用いて前処置されたHeLa細胞において発現させた。細胞溶解液をウェスタンブロットによって分析した。(図11E及び図11F)HeLa細胞を、対照(Ctrl)siRNA、SUMO2/3siRNA、若しくはSUMO1 siRNAを用いて処置したか(図11E)、又はこれらのsiRNAを用いて処置し、そしてその後、GFPを用いてトランスフェクトした(図11F)。細胞溶解液をウェスタンブロットによって分析した。(図11G)インビトロでのSUMO化アッセイのために使用されたPML及びPML M6タンパク質。FLAG−PML及びFLAG−PML M6を293T細胞において発現させ、そして抗FLAG(M2)ビーズによって精製した。タンパク質をBSA標準物質と共にクーマシー染色(左)によって及びウェスタンブロット(右)によって分析した。PML及びPML M6レーンの両方(左)に提示された2本の追加のバンド(矢頭)は、ウェスタンブロット(右)及び質量分析の両方に基づいてPML断片であると決定された。M6突然変異体の図解が下に示されている。*:点突然変異が本明細書の何処かに記載されている。
図11は、図11Aから図11Gを含むが、これはSUMO2/3によるミスフォールドタンパク質の修飾を実証した実験例の結果を示す。(図11A)HeLa細胞を、FLAG−Atxn1 82Q又はFLAG−Atxn1 82Q(5KR)を用いてトランスフェクトし、そしてMG132を用いて又は用いずに処置した。FLAG−Atxn1 82Q及びFLAG−Atxn1 82Q(5KR)をd−IPによって単離し、そしてそれらのSUMO2/3修飾をウェスタンブロットによって分析した。(図11B)HeLa細胞を、GFP−TDP−43を用いずに又は用いてトランスフェクトし、そしてビヒクル(DMSO)(−)又はMG132(+)を用いて処置した。d−IPは、抗GFP抗体又は対照抗体を使用して実施された。d−IP産物はウェスタンブロットによって分析された。(図11C)HeLa細胞を、nFluc−GFP、nFlucSM−GFP、及びnFlucSM−GFPを用いてトランスフェクトし(各々はまた、FLAGエピトープを用いてN末端がタグ化された)、そしてMG132を用いて又は用いずに処置した。nFlucタンパク質をd−IPによって単離した。全細胞溶解液(WCL)及びIP産物をウェスタンブロットによって分析した。WTルシフェラーゼ対SM/DMルシフェラーゼのSUMO2/3による修飾の間の差異(上、レーン1〜3)は、WCLにおける全体的なSUMO2/3コンジュゲーションの変化に起因しなかったことに留意されたい(下)。(図11D)Atxn1 82Q−GFPを、対照(Ctrl)、SUMO2/3、又はSUMO1 siRNAを用いて前処置されたHeLa細胞において発現させた。細胞溶解液をウェスタンブロットによって分析した。(図11E及び図11F)HeLa細胞を、対照(Ctrl)siRNA、SUMO2/3siRNA、若しくはSUMO1 siRNAを用いて処置したか(図11E)、又はこれらのsiRNAを用いて処置し、そしてその後、GFPを用いてトランスフェクトした(図11F)。細胞溶解液をウェスタンブロットによって分析した。(図11G)インビトロでのSUMO化アッセイのために使用されたPML及びPML M6タンパク質。FLAG−PML及びFLAG−PML M6を293T細胞において発現させ、そして抗FLAG(M2)ビーズによって精製した。タンパク質をBSA標準物質と共にクーマシー染色(左)によって及びウェスタンブロット(右)によって分析した。PML及びPML M6レーンの両方(左)に提示された2本の追加のバンド(矢頭)は、ウェスタンブロット(右)及び質量分析の両方に基づいてPML断片であると決定された。M6突然変異体の図解が下に示されている。*:点突然変異が本明細書の何処かに記載されている。
図11は、図11Aから図11Gを含むが、これはSUMO2/3によるミスフォールドタンパク質の修飾を実証した実験例の結果を示す。(図11A)HeLa細胞を、FLAG−Atxn1 82Q又はFLAG−Atxn1 82Q(5KR)を用いてトランスフェクトし、そしてMG132を用いて又は用いずに処置した。FLAG−Atxn1 82Q及びFLAG−Atxn1 82Q(5KR)をd−IPによって単離し、そしてそれらのSUMO2/3修飾をウェスタンブロットによって分析した。(図11B)HeLa細胞を、GFP−TDP−43を用いずに又は用いてトランスフェクトし、そしてビヒクル(DMSO)(−)又はMG132(+)を用いて処置した。d−IPは、抗GFP抗体又は対照抗体を使用して実施された。d−IP産物はウェスタンブロットによって分析された。(図11C)HeLa細胞を、nFluc−GFP、nFlucSM−GFP、及びnFlucSM−GFPを用いてトランスフェクトし(各々はまた、FLAGエピトープを用いてN末端がタグ化された)、そしてMG132を用いて又は用いずに処置した。nFlucタンパク質をd−IPによって単離した。全細胞溶解液(WCL)及びIP産物をウェスタンブロットによって分析した。WTルシフェラーゼ対SM/DMルシフェラーゼのSUMO2/3による修飾の間の差異(上、レーン1〜3)は、WCLにおける全体的なSUMO2/3コンジュゲーションの変化に起因しなかったことに留意されたい(下)。(図11D)Atxn1 82Q−GFPを、対照(Ctrl)、SUMO2/3、又はSUMO1 siRNAを用いて前処置されたHeLa細胞において発現させた。細胞溶解液をウェスタンブロットによって分析した。(図11E及び図11F)HeLa細胞を、対照(Ctrl)siRNA、SUMO2/3siRNA、若しくはSUMO1 siRNAを用いて処置したか(図11E)、又はこれらのsiRNAを用いて処置し、そしてその後、GFPを用いてトランスフェクトした(図11F)。細胞溶解液をウェスタンブロットによって分析した。(図11G)インビトロでのSUMO化アッセイのために使用されたPML及びPML M6タンパク質。FLAG−PML及びFLAG−PML M6を293T細胞において発現させ、そして抗FLAG(M2)ビーズによって精製した。タンパク質をBSA標準物質と共にクーマシー染色(左)によって及びウェスタンブロット(右)によって分析した。PML及びPML M6レーンの両方(左)に提示された2本の追加のバンド(矢頭)は、ウェスタンブロット(右)及び質量分析の両方に基づいてPML断片であると決定された。M6突然変異体の図解が下に示されている。*:点突然変異が本明細書の何処かに記載されている。
図11は、図11Aから図11Gを含むが、これはSUMO2/3によるミスフォールドタンパク質の修飾を実証した実験例の結果を示す。(図11A)HeLa細胞を、FLAG−Atxn1 82Q又はFLAG−Atxn1 82Q(5KR)を用いてトランスフェクトし、そしてMG132を用いて又は用いずに処置した。FLAG−Atxn1 82Q及びFLAG−Atxn1 82Q(5KR)をd−IPによって単離し、そしてそれらのSUMO2/3修飾をウェスタンブロットによって分析した。(図11B)HeLa細胞を、GFP−TDP−43を用いずに又は用いてトランスフェクトし、そしてビヒクル(DMSO)(−)又はMG132(+)を用いて処置した。d−IPは、抗GFP抗体又は対照抗体を使用して実施された。d−IP産物はウェスタンブロットによって分析された。(図11C)HeLa細胞を、nFluc−GFP、nFlucSM−GFP、及びnFlucSM−GFPを用いてトランスフェクトし(各々はまた、FLAGエピトープを用いてN末端がタグ化された)、そしてMG132を用いて又は用いずに処置した。nFlucタンパク質をd−IPによって単離した。全細胞溶解液(WCL)及びIP産物をウェスタンブロットによって分析した。WTルシフェラーゼ対SM/DMルシフェラーゼのSUMO2/3による修飾の間の差異(上、レーン1〜3)は、WCLにおける全体的なSUMO2/3コンジュゲーションの変化に起因しなかったことに留意されたい(下)。(図11D)Atxn1 82Q−GFPを、対照(Ctrl)、SUMO2/3、又はSUMO1 siRNAを用いて前処置されたHeLa細胞において発現させた。細胞溶解液をウェスタンブロットによって分析した。(図11E及び図11F)HeLa細胞を、対照(Ctrl)siRNA、SUMO2/3siRNA、若しくはSUMO1 siRNAを用いて処置したか(図11E)、又はこれらのsiRNAを用いて処置し、そしてその後、GFPを用いてトランスフェクトした(図11F)。細胞溶解液をウェスタンブロットによって分析した。(図11G)インビトロでのSUMO化アッセイのために使用されたPML及びPML M6タンパク質。FLAG−PML及びFLAG−PML M6を293T細胞において発現させ、そして抗FLAG(M2)ビーズによって精製した。タンパク質をBSA標準物質と共にクーマシー染色(左)によって及びウェスタンブロット(右)によって分析した。PML及びPML M6レーンの両方(左)に提示された2本の追加のバンド(矢頭)は、ウェスタンブロット(右)及び質量分析の両方に基づいてPML断片であると決定された。M6突然変異体の図解が下に示されている。*:点突然変異が本明細書の何処かに記載されている。
図12は、図12Aから図12Iを含むが、これはRNF4が、ミスフォールドタンパク質の分解を促進することを実証した実験例の結果を示す。(図12A)Atxn 82Q−GFPを単独で又はRNF4と一緒に発現しているHeLa細胞の代表的な蛍光画像。スケールバー:20μm。画像は、図1Bに示されているのと同じ実験に由来するものである。(図12B)RNF4過剰発現を伴う及び伴わないHeLa細胞内のAtxn 82Q−GFPの半減期。試料は、図1Fに示されたのと同じ実験に由来するものである。(図12C)HeLa細胞を、対照siRNA(−)、RNF4 siRNAのみ、又はRNF4 siRNAとsiRNA抵抗性RNF4を用いてトランスフェクトした。細胞溶解液をウェスタンブロットによって分析した。(図12D)FLAG−Atxn1 82Qを、対照siRNA及び示されたRNF4 siRNAを用いて前処置されたHeLa細胞において発現させた。FLAG−Atxn1 82Qを、抗FLAG M2ビーズを用いてd−IPによって単離した。WCL及びIP産物を、示された抗体を用いてウェスタンブロットによって分析した。(図12E)Atxn 82Q−GFP及びFLAG−RNF4の両方を発現しているHeLa細胞をビヒクル(DMSO)又はMG132を用いて処置した。外因性(Exo.)RNF4を抗FLAG抗体を用いて検出した。DMSOを用いて処置された対照細胞では、外因性RNF4は、Atxn1 82Q−GFP凝集物と部分的な共局在を示した。MG132による処置時に、外因性RNF4とAtxn1 82Q凝集物の完全な共局在化が、細胞の100%において観察された。スケールバー:10μm。(図12F)GFP−TDP−43を単独で用いて又は漸増量のRNF4と一緒に用いてトランスフェクトされたHeLa細胞のウェスタンブロット分析。(図12G)GFP−TDP−43を、対照siRNA(−)又は示されたRNF4 siRNAを用いて前処置された細胞内で発現させた。500個の細胞が各実験において計数された。GFP−TDP−43フォーカスを有する細胞の比率が示されている。(図12H)RNF4 siRNAを用いて処置されたHeLa細胞をGFP−TDP−43を用いてトランスフェクトした。細胞を抗RNF4抗体(赤色)及びDAPI(青色)を用いて染色した。TDP−43は、RNF4がノックダウンされた細胞内で凝集物を形成したが(塗りつぶされた矢頭)、対照細胞においては拡散されていたことに留意されたい(白抜きの矢頭)。(図12I)HeLa細胞をGFP−TDP−43を用いてトランスフェクトし、そしてMG132を用いて処置した。内因性RNF4を、抗RNF4抗体を用いて染色した(赤色)。RNF4はまた、TDP−43が全く含まれない細胞内で核内フォーカスを形成したことに留意されたい(図12E〜図12H)。
図12は、図12Aから図12Iを含むが、これはRNF4が、ミスフォールドタンパク質の分解を促進することを実証した実験例の結果を示す。(図12A)Atxn 82Q−GFPを単独で又はRNF4と一緒に発現しているHeLa細胞の代表的な蛍光画像。スケールバー:20μm。画像は、図1Bに示されているのと同じ実験に由来するものである。(図12B)RNF4過剰発現を伴う及び伴わないHeLa細胞内のAtxn 82Q−GFPの半減期。試料は、図1Fに示されたのと同じ実験に由来するものである。(図12C)HeLa細胞を、対照siRNA(−)、RNF4 siRNAのみ、又はRNF4 siRNAとsiRNA抵抗性RNF4を用いてトランスフェクトした。細胞溶解液をウェスタンブロットによって分析した。(図12D)FLAG−Atxn1 82Qを、対照siRNA及び示されたRNF4 siRNAを用いて前処置されたHeLa細胞において発現させた。FLAG−Atxn1 82Qを、抗FLAG M2ビーズを用いてd−IPによって単離した。WCL及びIP産物を、示された抗体を用いてウェスタンブロットによって分析した。(図12E)Atxn 82Q−GFP及びFLAG−RNF4の両方を発現しているHeLa細胞をビヒクル(DMSO)又はMG132を用いて処置した。外因性(Exo.)RNF4を抗FLAG抗体を用いて検出した。DMSOを用いて処置された対照細胞では、外因性RNF4は、Atxn1 82Q−GFP凝集物と部分的な共局在を示した。MG132による処置時に、外因性RNF4とAtxn1 82Q凝集物の完全な共局在化が、細胞の100%において観察された。スケールバー:10μm。(図12F)GFP−TDP−43を単独で用いて又は漸増量のRNF4と一緒に用いてトランスフェクトされたHeLa細胞のウェスタンブロット分析。(図12G)GFP−TDP−43を、対照siRNA(−)又は示されたRNF4 siRNAを用いて前処置された細胞内で発現させた。500個の細胞が各実験において計数された。GFP−TDP−43フォーカスを有する細胞の比率が示されている。(図12H)RNF4 siRNAを用いて処置されたHeLa細胞をGFP−TDP−43を用いてトランスフェクトした。細胞を抗RNF4抗体(赤色)及びDAPI(青色)を用いて染色した。TDP−43は、RNF4がノックダウンされた細胞内で凝集物を形成したが(塗りつぶされた矢頭)、対照細胞においては拡散されていたことに留意されたい(白抜きの矢頭)。(図12I)HeLa細胞をGFP−TDP−43を用いてトランスフェクトし、そしてMG132を用いて処置した。内因性RNF4を、抗RNF4抗体を用いて染色した(赤色)。RNF4はまた、TDP−43が全く含まれない細胞内で核内フォーカスを形成したことに留意されたい(図12E〜図12H)。
図12は、図12Aから図12Iを含むが、これはRNF4が、ミスフォールドタンパク質の分解を促進することを実証した実験例の結果を示す。(図12A)Atxn 82Q−GFPを単独で又はRNF4と一緒に発現しているHeLa細胞の代表的な蛍光画像。スケールバー:20μm。画像は、図1Bに示されているのと同じ実験に由来するものである。(図12B)RNF4過剰発現を伴う及び伴わないHeLa細胞内のAtxn 82Q−GFPの半減期。試料は、図1Fに示されたのと同じ実験に由来するものである。(図12C)HeLa細胞を、対照siRNA(−)、RNF4 siRNAのみ、又はRNF4 siRNAとsiRNA抵抗性RNF4を用いてトランスフェクトした。細胞溶解液をウェスタンブロットによって分析した。(図12D)FLAG−Atxn1 82Qを、対照siRNA及び示されたRNF4 siRNAを用いて前処置されたHeLa細胞において発現させた。FLAG−Atxn1 82Qを、抗FLAG M2ビーズを用いてd−IPによって単離した。WCL及びIP産物を、示された抗体を用いてウェスタンブロットによって分析した。(図12E)Atxn 82Q−GFP及びFLAG−RNF4の両方を発現しているHeLa細胞をビヒクル(DMSO)又はMG132を用いて処置した。外因性(Exo.)RNF4を抗FLAG抗体を用いて検出した。DMSOを用いて処置された対照細胞では、外因性RNF4は、Atxn1 82Q−GFP凝集物と部分的な共局在を示した。MG132による処置時に、外因性RNF4とAtxn1 82Q凝集物の完全な共局在化が、細胞の100%において観察された。スケールバー:10μm。(図12F)GFP−TDP−43を単独で用いて又は漸増量のRNF4と一緒に用いてトランスフェクトされたHeLa細胞のウェスタンブロット分析。(図12G)GFP−TDP−43を、対照siRNA(−)又は示されたRNF4 siRNAを用いて前処置された細胞内で発現させた。500個の細胞が各実験において計数された。GFP−TDP−43フォーカスを有する細胞の比率が示されている。(図12H)RNF4 siRNAを用いて処置されたHeLa細胞をGFP−TDP−43を用いてトランスフェクトした。細胞を抗RNF4抗体(赤色)及びDAPI(青色)を用いて染色した。TDP−43は、RNF4がノックダウンされた細胞内で凝集物を形成したが(塗りつぶされた矢頭)、対照細胞においては拡散されていたことに留意されたい(白抜きの矢頭)。(図12I)HeLa細胞をGFP−TDP−43を用いてトランスフェクトし、そしてMG132を用いて処置した。内因性RNF4を、抗RNF4抗体を用いて染色した(赤色)。RNF4はまた、TDP−43が全く含まれない細胞内で核内フォーカスを形成したことに留意されたい(図12E〜図12H)。
図12は、図12Aから図12Iを含むが、これはRNF4が、ミスフォールドタンパク質の分解を促進することを実証した実験例の結果を示す。(図12A)Atxn 82Q−GFPを単独で又はRNF4と一緒に発現しているHeLa細胞の代表的な蛍光画像。スケールバー:20μm。画像は、図1Bに示されているのと同じ実験に由来するものである。(図12B)RNF4過剰発現を伴う及び伴わないHeLa細胞内のAtxn 82Q−GFPの半減期。試料は、図1Fに示されたのと同じ実験に由来するものである。(図12C)HeLa細胞を、対照siRNA(−)、RNF4 siRNAのみ、又はRNF4 siRNAとsiRNA抵抗性RNF4を用いてトランスフェクトした。細胞溶解液をウェスタンブロットによって分析した。(図12D)FLAG−Atxn1 82Qを、対照siRNA及び示されたRNF4 siRNAを用いて前処置されたHeLa細胞において発現させた。FLAG−Atxn1 82Qを、抗FLAG M2ビーズを用いてd−IPによって単離した。WCL及びIP産物を、示された抗体を用いてウェスタンブロットによって分析した。(図12E)Atxn 82Q−GFP及びFLAG−RNF4の両方を発現しているHeLa細胞をビヒクル(DMSO)又はMG132を用いて処置した。外因性(Exo.)RNF4を抗FLAG抗体を用いて検出した。DMSOを用いて処置された対照細胞では、外因性RNF4は、Atxn1 82Q−GFP凝集物と部分的な共局在を示した。MG132による処置時に、外因性RNF4とAtxn1 82Q凝集物の完全な共局在化が、細胞の100%において観察された。スケールバー:10μm。(図12F)GFP−TDP−43を単独で用いて又は漸増量のRNF4と一緒に用いてトランスフェクトされたHeLa細胞のウェスタンブロット分析。(図12G)GFP−TDP−43を、対照siRNA(−)又は示されたRNF4 siRNAを用いて前処置された細胞内で発現させた。500個の細胞が各実験において計数された。GFP−TDP−43フォーカスを有する細胞の比率が示されている。(図12H)RNF4 siRNAを用いて処置されたHeLa細胞をGFP−TDP−43を用いてトランスフェクトした。細胞を抗RNF4抗体(赤色)及びDAPI(青色)を用いて染色した。TDP−43は、RNF4がノックダウンされた細胞内で凝集物を形成したが(塗りつぶされた矢頭)、対照細胞においては拡散されていたことに留意されたい(白抜きの矢頭)。(図12I)HeLa細胞をGFP−TDP−43を用いてトランスフェクトし、そしてMG132を用いて処置した。内因性RNF4を、抗RNF4抗体を用いて染色した(赤色)。RNF4はまた、TDP−43が全く含まれない細胞内で核内フォーカスを形成したことに留意されたい(図12E〜図12H)。
図12は、図12Aから図12Iを含むが、これはRNF4が、ミスフォールドタンパク質の分解を促進することを実証した実験例の結果を示す。(図12A)Atxn 82Q−GFPを単独で又はRNF4と一緒に発現しているHeLa細胞の代表的な蛍光画像。スケールバー:20μm。画像は、図1Bに示されているのと同じ実験に由来するものである。(図12B)RNF4過剰発現を伴う及び伴わないHeLa細胞内のAtxn 82Q−GFPの半減期。試料は、図1Fに示されたのと同じ実験に由来するものである。(図12C)HeLa細胞を、対照siRNA(−)、RNF4 siRNAのみ、又はRNF4 siRNAとsiRNA抵抗性RNF4を用いてトランスフェクトした。細胞溶解液をウェスタンブロットによって分析した。(図12D)FLAG−Atxn1 82Qを、対照siRNA及び示されたRNF4 siRNAを用いて前処置されたHeLa細胞において発現させた。FLAG−Atxn1 82Qを、抗FLAG M2ビーズを用いてd−IPによって単離した。WCL及びIP産物を、示された抗体を用いてウェスタンブロットによって分析した。(図12E)Atxn 82Q−GFP及びFLAG−RNF4の両方を発現しているHeLa細胞をビヒクル(DMSO)又はMG132を用いて処置した。外因性(Exo.)RNF4を抗FLAG抗体を用いて検出した。DMSOを用いて処置された対照細胞では、外因性RNF4は、Atxn1 82Q−GFP凝集物と部分的な共局在を示した。MG132による処置時に、外因性RNF4とAtxn1 82Q凝集物の完全な共局在化が、細胞の100%において観察された。スケールバー:10μm。(図12F)GFP−TDP−43を単独で用いて又は漸増量のRNF4と一緒に用いてトランスフェクトされたHeLa細胞のウェスタンブロット分析。(図12G)GFP−TDP−43を、対照siRNA(−)又は示されたRNF4 siRNAを用いて前処置された細胞内で発現させた。500個の細胞が各実験において計数された。GFP−TDP−43フォーカスを有する細胞の比率が示されている。(図12H)RNF4 siRNAを用いて処置されたHeLa細胞をGFP−TDP−43を用いてトランスフェクトした。細胞を抗RNF4抗体(赤色)及びDAPI(青色)を用いて染色した。TDP−43は、RNF4がノックダウンされた細胞内で凝集物を形成したが(塗りつぶされた矢頭)、対照細胞においては拡散されていたことに留意されたい(白抜きの矢頭)。(図12I)HeLa細胞をGFP−TDP−43を用いてトランスフェクトし、そしてMG132を用いて処置した。内因性RNF4を、抗RNF4抗体を用いて染色した(赤色)。RNF4はまた、TDP−43が全く含まれない細胞内で核内フォーカスを形成したことに留意されたい(図12E〜図12H)。
図12は、図12Aから図12Iを含むが、これはRNF4が、ミスフォールドタンパク質の分解を促進することを実証した実験例の結果を示す。(図12A)Atxn 82Q−GFPを単独で又はRNF4と一緒に発現しているHeLa細胞の代表的な蛍光画像。スケールバー:20μm。画像は、図1Bに示されているのと同じ実験に由来するものである。(図12B)RNF4過剰発現を伴う及び伴わないHeLa細胞内のAtxn 82Q−GFPの半減期。試料は、図1Fに示されたのと同じ実験に由来するものである。(図12C)HeLa細胞を、対照siRNA(−)、RNF4 siRNAのみ、又はRNF4 siRNAとsiRNA抵抗性RNF4を用いてトランスフェクトした。細胞溶解液をウェスタンブロットによって分析した。(図12D)FLAG−Atxn1 82Qを、対照siRNA及び示されたRNF4 siRNAを用いて前処置されたHeLa細胞において発現させた。FLAG−Atxn1 82Qを、抗FLAG M2ビーズを用いてd−IPによって単離した。WCL及びIP産物を、示された抗体を用いてウェスタンブロットによって分析した。(図12E)Atxn 82Q−GFP及びFLAG−RNF4の両方を発現しているHeLa細胞をビヒクル(DMSO)又はMG132を用いて処置した。外因性(Exo.)RNF4を抗FLAG抗体を用いて検出した。DMSOを用いて処置された対照細胞では、外因性RNF4は、Atxn1 82Q−GFP凝集物と部分的な共局在を示した。MG132による処置時に、外因性RNF4とAtxn1 82Q凝集物の完全な共局在化が、細胞の100%において観察された。スケールバー:10μm。(図12F)GFP−TDP−43を単独で用いて又は漸増量のRNF4と一緒に用いてトランスフェクトされたHeLa細胞のウェスタンブロット分析。(図12G)GFP−TDP−43を、対照siRNA(−)又は示されたRNF4 siRNAを用いて前処置された細胞内で発現させた。500個の細胞が各実験において計数された。GFP−TDP−43フォーカスを有する細胞の比率が示されている。(図12H)RNF4 siRNAを用いて処置されたHeLa細胞をGFP−TDP−43を用いてトランスフェクトした。細胞を抗RNF4抗体(赤色)及びDAPI(青色)を用いて染色した。TDP−43は、RNF4がノックダウンされた細胞内で凝集物を形成したが(塗りつぶされた矢頭)、対照細胞においては拡散されていたことに留意されたい(白抜きの矢頭)。(図12I)HeLa細胞をGFP−TDP−43を用いてトランスフェクトし、そしてMG132を用いて処置した。内因性RNF4を、抗RNF4抗体を用いて染色した(赤色)。RNF4はまた、TDP−43が全く含まれない細胞内で核内フォーカスを形成したことに留意されたい(図12E〜図12H)。
図12は、図12Aから図12Iを含むが、これはRNF4が、ミスフォールドタンパク質の分解を促進することを実証した実験例の結果を示す。(図12A)Atxn 82Q−GFPを単独で又はRNF4と一緒に発現しているHeLa細胞の代表的な蛍光画像。スケールバー:20μm。画像は、図1Bに示されているのと同じ実験に由来するものである。(図12B)RNF4過剰発現を伴う及び伴わないHeLa細胞内のAtxn 82Q−GFPの半減期。試料は、図1Fに示されたのと同じ実験に由来するものである。(図12C)HeLa細胞を、対照siRNA(−)、RNF4 siRNAのみ、又はRNF4 siRNAとsiRNA抵抗性RNF4を用いてトランスフェクトした。細胞溶解液をウェスタンブロットによって分析した。(図12D)FLAG−Atxn1 82Qを、対照siRNA及び示されたRNF4 siRNAを用いて前処置されたHeLa細胞において発現させた。FLAG−Atxn1 82Qを、抗FLAG M2ビーズを用いてd−IPによって単離した。WCL及びIP産物を、示された抗体を用いてウェスタンブロットによって分析した。(図12E)Atxn 82Q−GFP及びFLAG−RNF4の両方を発現しているHeLa細胞をビヒクル(DMSO)又はMG132を用いて処置した。外因性(Exo.)RNF4を抗FLAG抗体を用いて検出した。DMSOを用いて処置された対照細胞では、外因性RNF4は、Atxn1 82Q−GFP凝集物と部分的な共局在を示した。MG132による処置時に、外因性RNF4とAtxn1 82Q凝集物の完全な共局在化が、細胞の100%において観察された。スケールバー:10μm。(図12F)GFP−TDP−43を単独で用いて又は漸増量のRNF4と一緒に用いてトランスフェクトされたHeLa細胞のウェスタンブロット分析。(図12G)GFP−TDP−43を、対照siRNA(−)又は示されたRNF4 siRNAを用いて前処置された細胞内で発現させた。500個の細胞が各実験において計数された。GFP−TDP−43フォーカスを有する細胞の比率が示されている。(図12H)RNF4 siRNAを用いて処置されたHeLa細胞をGFP−TDP−43を用いてトランスフェクトした。細胞を抗RNF4抗体(赤色)及びDAPI(青色)を用いて染色した。TDP−43は、RNF4がノックダウンされた細胞内で凝集物を形成したが(塗りつぶされた矢頭)、対照細胞においては拡散されていたことに留意されたい(白抜きの矢頭)。(図12I)HeLa細胞をGFP−TDP−43を用いてトランスフェクトし、そしてMG132を用いて処置した。内因性RNF4を、抗RNF4抗体を用いて染色した(赤色)。RNF4はまた、TDP−43が全く含まれない細胞内で核内フォーカスを形成したことに留意されたい(図12E〜図12H)。
図12は、図12Aから図12Iを含むが、これはRNF4が、ミスフォールドタンパク質の分解を促進することを実証した実験例の結果を示す。(図12A)Atxn 82Q−GFPを単独で又はRNF4と一緒に発現しているHeLa細胞の代表的な蛍光画像。スケールバー:20μm。画像は、図1Bに示されているのと同じ実験に由来するものである。(図12B)RNF4過剰発現を伴う及び伴わないHeLa細胞内のAtxn 82Q−GFPの半減期。試料は、図1Fに示されたのと同じ実験に由来するものである。(図12C)HeLa細胞を、対照siRNA(−)、RNF4 siRNAのみ、又はRNF4 siRNAとsiRNA抵抗性RNF4を用いてトランスフェクトした。細胞溶解液をウェスタンブロットによって分析した。(図12D)FLAG−Atxn1 82Qを、対照siRNA及び示されたRNF4 siRNAを用いて前処置されたHeLa細胞において発現させた。FLAG−Atxn1 82Qを、抗FLAG M2ビーズを用いてd−IPによって単離した。WCL及びIP産物を、示された抗体を用いてウェスタンブロットによって分析した。(図12E)Atxn 82Q−GFP及びFLAG−RNF4の両方を発現しているHeLa細胞をビヒクル(DMSO)又はMG132を用いて処置した。外因性(Exo.)RNF4を抗FLAG抗体を用いて検出した。DMSOを用いて処置された対照細胞では、外因性RNF4は、Atxn1 82Q−GFP凝集物と部分的な共局在を示した。MG132による処置時に、外因性RNF4とAtxn1 82Q凝集物の完全な共局在化が、細胞の100%において観察された。スケールバー:10μm。(図12F)GFP−TDP−43を単独で用いて又は漸増量のRNF4と一緒に用いてトランスフェクトされたHeLa細胞のウェスタンブロット分析。(図12G)GFP−TDP−43を、対照siRNA(−)又は示されたRNF4 siRNAを用いて前処置された細胞内で発現させた。500個の細胞が各実験において計数された。GFP−TDP−43フォーカスを有する細胞の比率が示されている。(図12H)RNF4 siRNAを用いて処置されたHeLa細胞をGFP−TDP−43を用いてトランスフェクトした。細胞を抗RNF4抗体(赤色)及びDAPI(青色)を用いて染色した。TDP−43は、RNF4がノックダウンされた細胞内で凝集物を形成したが(塗りつぶされた矢頭)、対照細胞においては拡散されていたことに留意されたい(白抜きの矢頭)。(図12I)HeLa細胞をGFP−TDP−43を用いてトランスフェクトし、そしてMG132を用いて処置した。内因性RNF4を、抗RNF4抗体を用いて染色した(赤色)。RNF4はまた、TDP−43が全く含まれない細胞内で核内フォーカスを形成したことに留意されたい(図12E〜図12H)。
図12は、図12Aから図12Iを含むが、これはRNF4が、ミスフォールドタンパク質の分解を促進することを実証した実験例の結果を示す。(図12A)Atxn 82Q−GFPを単独で又はRNF4と一緒に発現しているHeLa細胞の代表的な蛍光画像。スケールバー:20μm。画像は、図1Bに示されているのと同じ実験に由来するものである。(図12B)RNF4過剰発現を伴う及び伴わないHeLa細胞内のAtxn 82Q−GFPの半減期。試料は、図1Fに示されたのと同じ実験に由来するものである。(図12C)HeLa細胞を、対照siRNA(−)、RNF4 siRNAのみ、又はRNF4 siRNAとsiRNA抵抗性RNF4を用いてトランスフェクトした。細胞溶解液をウェスタンブロットによって分析した。(図12D)FLAG−Atxn1 82Qを、対照siRNA及び示されたRNF4 siRNAを用いて前処置されたHeLa細胞において発現させた。FLAG−Atxn1 82Qを、抗FLAG M2ビーズを用いてd−IPによって単離した。WCL及びIP産物を、示された抗体を用いてウェスタンブロットによって分析した。(図12E)Atxn 82Q−GFP及びFLAG−RNF4の両方を発現しているHeLa細胞をビヒクル(DMSO)又はMG132を用いて処置した。外因性(Exo.)RNF4を抗FLAG抗体を用いて検出した。DMSOを用いて処置された対照細胞では、外因性RNF4は、Atxn1 82Q−GFP凝集物と部分的な共局在を示した。MG132による処置時に、外因性RNF4とAtxn1 82Q凝集物の完全な共局在化が、細胞の100%において観察された。スケールバー:10μm。(図12F)GFP−TDP−43を単独で用いて又は漸増量のRNF4と一緒に用いてトランスフェクトされたHeLa細胞のウェスタンブロット分析。(図12G)GFP−TDP−43を、対照siRNA(−)又は示されたRNF4 siRNAを用いて前処置された細胞内で発現させた。500個の細胞が各実験において計数された。GFP−TDP−43フォーカスを有する細胞の比率が示されている。(図12H)RNF4 siRNAを用いて処置されたHeLa細胞をGFP−TDP−43を用いてトランスフェクトした。細胞を抗RNF4抗体(赤色)及びDAPI(青色)を用いて染色した。TDP−43は、RNF4がノックダウンされた細胞内で凝集物を形成したが(塗りつぶされた矢頭)、対照細胞においては拡散されていたことに留意されたい(白抜きの矢頭)。(図12I)HeLa細胞をGFP−TDP−43を用いてトランスフェクトし、そしてMG132を用いて処置した。内因性RNF4を、抗RNF4抗体を用いて染色した(赤色)。RNF4はまた、TDP−43が全く含まれない細胞内で核内フォーカスを形成したことに留意されたい(図12E〜図12H)。
図13は、図13Aから図13Fを含むが、これはSUMO2/3が、RNF4により媒介されるAtxn1 82Qの分解に関与することを実証した実験例の結果を示す。(図13A)Atxn1 82Q−GFP及び/又はRNF4を、対照siRNA、SUMO2/3siRNA、及びSUMO1 siRNAを用いて前処置されたHeLa細胞において発現させた。細胞溶解液をウェスタンブロットによって分析した。(図13B)GFP−SUMO2を安定に発現しているU2OS細胞をまず、示されたRNF4 siRNA又は対照siRNA(−)を用いて、その後、FLAG−Atxn1 82Qを用いてトランスフェクトした。GFP−SUMO2陽性Atxn1 82Q凝集物を含むトランスフェクト細胞の比率が示されている(平均値+標準偏差、n=3)。各実験において、200個の細胞が計数された。トランスフェクト細胞の代表画像が右に示されている。GFP−SUMO2は、Atxn1 82Qの発現を伴わない細胞において凝集した構造を形成しない。(図13C)野生型及び突然変異RNF4タンパク質の図解。SUMO相互作用モチーフ(SIM)1〜4及びRINGドメインが示されている。*:点突然変異は本明細書の何処かに記載されている。(図13D及び図13E)ラット(r)RNF4及びRNF4 CS1(図13D)又はヒトRNF4及びRNF4 SIMm(図13E)の精製された組換えGST融合物を、示されているようなユビキチンE1、E2(UbcH5a)、及びユビキチン(Ub)とMg2+−ATPと共にインキュベートした。反応混合物をウェスタンブロットによって抗GST抗体を使用して分析した。(図13F)示されているような対照、PML、及びRNF4 siRNAの示された組合せを用いて処置された細胞におけるAtxn1 82Q−GFPの発現。細胞溶解液をウェスタンブロットによって分析した。
図13は、図13Aから図13Fを含むが、これはSUMO2/3が、RNF4により媒介されるAtxn1 82Qの分解に関与することを実証した実験例の結果を示す。(図13A)Atxn1 82Q−GFP及び/又はRNF4を、対照siRNA、SUMO2/3siRNA、及びSUMO1 siRNAを用いて前処置されたHeLa細胞において発現させた。細胞溶解液をウェスタンブロットによって分析した。(図13B)GFP−SUMO2を安定に発現しているU2OS細胞をまず、示されたRNF4 siRNA又は対照siRNA(−)を用いて、その後、FLAG−Atxn1 82Qを用いてトランスフェクトした。GFP−SUMO2陽性Atxn1 82Q凝集物を含むトランスフェクト細胞の比率が示されている(平均値+標準偏差、n=3)。各実験において、200個の細胞が計数された。トランスフェクト細胞の代表画像が右に示されている。GFP−SUMO2は、Atxn1 82Qの発現を伴わない細胞において凝集した構造を形成しない。(図13C)野生型及び突然変異RNF4タンパク質の図解。SUMO相互作用モチーフ(SIM)1〜4及びRINGドメインが示されている。*:点突然変異は本明細書の何処かに記載されている。(図13D及び図13E)ラット(r)RNF4及びRNF4 CS1(図13D)又はヒトRNF4及びRNF4 SIMm(図13E)の精製された組換えGST融合物を、示されているようなユビキチンE1、E2(UbcH5a)、及びユビキチン(Ub)とMg2+−ATPと共にインキュベートした。反応混合物をウェスタンブロットによって抗GST抗体を使用して分析した。(図13F)示されているような対照、PML、及びRNF4 siRNAの示された組合せを用いて処置された細胞におけるAtxn1 82Q−GFPの発現。細胞溶解液をウェスタンブロットによって分析した。
図13は、図13Aから図13Fを含むが、これはSUMO2/3が、RNF4により媒介されるAtxn1 82Qの分解に関与することを実証した実験例の結果を示す。(図13A)Atxn1 82Q−GFP及び/又はRNF4を、対照siRNA、SUMO2/3siRNA、及びSUMO1 siRNAを用いて前処置されたHeLa細胞において発現させた。細胞溶解液をウェスタンブロットによって分析した。(図13B)GFP−SUMO2を安定に発現しているU2OS細胞をまず、示されたRNF4 siRNA又は対照siRNA(−)を用いて、その後、FLAG−Atxn1 82Qを用いてトランスフェクトした。GFP−SUMO2陽性Atxn1 82Q凝集物を含むトランスフェクト細胞の比率が示されている(平均値+標準偏差、n=3)。各実験において、200個の細胞が計数された。トランスフェクト細胞の代表画像が右に示されている。GFP−SUMO2は、Atxn1 82Qの発現を伴わない細胞において凝集した構造を形成しない。(図13C)野生型及び突然変異RNF4タンパク質の図解。SUMO相互作用モチーフ(SIM)1〜4及びRINGドメインが示されている。*:点突然変異は本明細書の何処かに記載されている。(図13D及び図13E)ラット(r)RNF4及びRNF4 CS1(図13D)又はヒトRNF4及びRNF4 SIMm(図13E)の精製された組換えGST融合物を、示されているようなユビキチンE1、E2(UbcH5a)、及びユビキチン(Ub)とMg2+−ATPと共にインキュベートした。反応混合物をウェスタンブロットによって抗GST抗体を使用して分析した。(図13F)示されているような対照、PML、及びRNF4 siRNAの示された組合せを用いて処置された細胞におけるAtxn1 82Q−GFPの発現。細胞溶解液をウェスタンブロットによって分析した。
図13は、図13Aから図13Fを含むが、これはSUMO2/3が、RNF4により媒介されるAtxn1 82Qの分解に関与することを実証した実験例の結果を示す。(図13A)Atxn1 82Q−GFP及び/又はRNF4を、対照siRNA、SUMO2/3siRNA、及びSUMO1 siRNAを用いて前処置されたHeLa細胞において発現させた。細胞溶解液をウェスタンブロットによって分析した。(図13B)GFP−SUMO2を安定に発現しているU2OS細胞をまず、示されたRNF4 siRNA又は対照siRNA(−)を用いて、その後、FLAG−Atxn1 82Qを用いてトランスフェクトした。GFP−SUMO2陽性Atxn1 82Q凝集物を含むトランスフェクト細胞の比率が示されている(平均値+標準偏差、n=3)。各実験において、200個の細胞が計数された。トランスフェクト細胞の代表画像が右に示されている。GFP−SUMO2は、Atxn1 82Qの発現を伴わない細胞において凝集した構造を形成しない。(図13C)野生型及び突然変異RNF4タンパク質の図解。SUMO相互作用モチーフ(SIM)1〜4及びRINGドメインが示されている。*:点突然変異は本明細書の何処かに記載されている。(図13D及び図13E)ラット(r)RNF4及びRNF4 CS1(図13D)又はヒトRNF4及びRNF4 SIMm(図13E)の精製された組換えGST融合物を、示されているようなユビキチンE1、E2(UbcH5a)、及びユビキチン(Ub)とMg2+−ATPと共にインキュベートした。反応混合物をウェスタンブロットによって抗GST抗体を使用して分析した。(図13F)示されているような対照、PML、及びRNF4 siRNAの示された組合せを用いて処置された細胞におけるAtxn1 82Q−GFPの発現。細胞溶解液をウェスタンブロットによって分析した。
図13は、図13Aから図13Fを含むが、これはSUMO2/3が、RNF4により媒介されるAtxn1 82Qの分解に関与することを実証した実験例の結果を示す。(図13A)Atxn1 82Q−GFP及び/又はRNF4を、対照siRNA、SUMO2/3siRNA、及びSUMO1 siRNAを用いて前処置されたHeLa細胞において発現させた。細胞溶解液をウェスタンブロットによって分析した。(図13B)GFP−SUMO2を安定に発現しているU2OS細胞をまず、示されたRNF4 siRNA又は対照siRNA(−)を用いて、その後、FLAG−Atxn1 82Qを用いてトランスフェクトした。GFP−SUMO2陽性Atxn1 82Q凝集物を含むトランスフェクト細胞の比率が示されている(平均値+標準偏差、n=3)。各実験において、200個の細胞が計数された。トランスフェクト細胞の代表画像が右に示されている。GFP−SUMO2は、Atxn1 82Qの発現を伴わない細胞において凝集した構造を形成しない。(図13C)野生型及び突然変異RNF4タンパク質の図解。SUMO相互作用モチーフ(SIM)1〜4及びRINGドメインが示されている。*:点突然変異は本明細書の何処かに記載されている。(図13D及び図13E)ラット(r)RNF4及びRNF4 CS1(図13D)又はヒトRNF4及びRNF4 SIMm(図13E)の精製された組換えGST融合物を、示されているようなユビキチンE1、E2(UbcH5a)、及びユビキチン(Ub)とMg2+−ATPと共にインキュベートした。反応混合物をウェスタンブロットによって抗GST抗体を使用して分析した。(図13F)示されているような対照、PML、及びRNF4 siRNAの示された組合せを用いて処置された細胞におけるAtxn1 82Q−GFPの発現。細胞溶解液をウェスタンブロットによって分析した。
図13は、図13Aから図13Fを含むが、これはSUMO2/3が、RNF4により媒介されるAtxn1 82Qの分解に関与することを実証した実験例の結果を示す。(図13A)Atxn1 82Q−GFP及び/又はRNF4を、対照siRNA、SUMO2/3siRNA、及びSUMO1 siRNAを用いて前処置されたHeLa細胞において発現させた。細胞溶解液をウェスタンブロットによって分析した。(図13B)GFP−SUMO2を安定に発現しているU2OS細胞をまず、示されたRNF4 siRNA又は対照siRNA(−)を用いて、その後、FLAG−Atxn1 82Qを用いてトランスフェクトした。GFP−SUMO2陽性Atxn1 82Q凝集物を含むトランスフェクト細胞の比率が示されている(平均値+標準偏差、n=3)。各実験において、200個の細胞が計数された。トランスフェクト細胞の代表画像が右に示されている。GFP−SUMO2は、Atxn1 82Qの発現を伴わない細胞において凝集した構造を形成しない。(図13C)野生型及び突然変異RNF4タンパク質の図解。SUMO相互作用モチーフ(SIM)1〜4及びRINGドメインが示されている。*:点突然変異は本明細書の何処かに記載されている。(図13D及び図13E)ラット(r)RNF4及びRNF4 CS1(図13D)又はヒトRNF4及びRNF4 SIMm(図13E)の精製された組換えGST融合物を、示されているようなユビキチンE1、E2(UbcH5a)、及びユビキチン(Ub)とMg2+−ATPと共にインキュベートした。反応混合物をウェスタンブロットによって抗GST抗体を使用して分析した。(図13F)示されているような対照、PML、及びRNF4 siRNAの示された組合せを用いて処置された細胞におけるAtxn1 82Q−GFPの発現。細胞溶解液をウェスタンブロットによって分析した。
図14は、図14Aから図14Dを含むが、これはPMLの欠損が、プルキンエ細胞樹状突起の分岐を減少させるが、プルキンエ細胞内に凝集物を生じないことを実証する実験の結果を示す。(図14A)12週齢のマウスの正中矢状小脳切片を、プルキンエ細胞特異的タンパク質のカルビンディンに対する抗体を用いて染色した。山頂前裂からの矩形領域の蛍光強度がプロットされた(PML+/+についてはn=2匹のマウス、全ての他の遺伝子型についてはn=3匹のマウス)。PML−/−マウスは、PML+/+マウスと比較して樹状突起分岐の有意な減少を示した(分散分析、p=0.031)。(図14B)代表的なカルビンディン免疫蛍光共焦点画像。スケールバー:100μm。(図14C)長さ1mmあたりの体細胞の平均数としてグラフ化された、Atxn1tg/−を含む及び含まない12週齢のPML+/+、PML+/−、及びPML−/−マウスにおけるプルキンエ細胞密度の定量(平均値+標準誤差、1つの遺伝子型あたり3匹のマウス)。(図14D)Atxn1tg/−を含まない12週齢のPML+/+及びPML−/−マウス由来の小脳皮質切片の免疫組織化学的染色。切片を、抗ユビキチン抗体を用いて染色し、そしてヘマトキシリンを用いて対比染色した。スケールバー:50μm。そうした切片においてはユビキチン陽性凝集物は全く検出されなかったことに留意されたい。PML+/+:Atxn1tg/−及びPML−/−:Atxn1tg/−マウスの染色切片が図7Gに示されている。
図14は、図14Aから図14Dを含むが、これはPMLの欠損が、プルキンエ細胞樹状突起の分岐を減少させるが、プルキンエ細胞内に凝集物を生じないことを実証する実験の結果を示す。(図14A)12週齢のマウスの正中矢状小脳切片を、プルキンエ細胞特異的タンパク質のカルビンディンに対する抗体を用いて染色した。山頂前裂からの矩形領域の蛍光強度がプロットされた(PML+/+についてはn=2匹のマウス、全ての他の遺伝子型についてはn=3匹のマウス)。PML−/−マウスは、PML+/+マウスと比較して樹状突起分岐の有意な減少を示した(分散分析、p=0.031)。(図14B)代表的なカルビンディン免疫蛍光共焦点画像。スケールバー:100μm。(図14C)長さ1mmあたりの体細胞の平均数としてグラフ化された、Atxn1tg/−を含む及び含まない12週齢のPML+/+、PML+/−、及びPML−/−マウスにおけるプルキンエ細胞密度の定量(平均値+標準誤差、1つの遺伝子型あたり3匹のマウス)。(図14D)Atxn1tg/−を含まない12週齢のPML+/+及びPML−/−マウス由来の小脳皮質切片の免疫組織化学的染色。切片を、抗ユビキチン抗体を用いて染色し、そしてヘマトキシリンを用いて対比染色した。スケールバー:50μm。そうした切片においてはユビキチン陽性凝集物は全く検出されなかったことに留意されたい。PML+/+:Atxn1tg/−及びPML−/−:Atxn1tg/−マウスの染色切片が図7Gに示されている。
図14は、図14Aから図14Dを含むが、これはPMLの欠損が、プルキンエ細胞樹状突起の分岐を減少させるが、プルキンエ細胞内に凝集物を生じないことを実証する実験の結果を示す。(図14A)12週齢のマウスの正中矢状小脳切片を、プルキンエ細胞特異的タンパク質のカルビンディンに対する抗体を用いて染色した。山頂前裂からの矩形領域の蛍光強度がプロットされた(PML+/+についてはn=2匹のマウス、全ての他の遺伝子型についてはn=3匹のマウス)。PML−/−マウスは、PML+/+マウスと比較して樹状突起分岐の有意な減少を示した(分散分析、p=0.031)。(図14B)代表的なカルビンディン免疫蛍光共焦点画像。スケールバー:100μm。(図14C)長さ1mmあたりの体細胞の平均数としてグラフ化された、Atxn1tg/−を含む及び含まない12週齢のPML+/+、PML+/−、及びPML−/−マウスにおけるプルキンエ細胞密度の定量(平均値+標準誤差、1つの遺伝子型あたり3匹のマウス)。(図14D)Atxn1tg/−を含まない12週齢のPML+/+及びPML−/−マウス由来の小脳皮質切片の免疫組織化学的染色。切片を、抗ユビキチン抗体を用いて染色し、そしてヘマトキシリンを用いて対比染色した。スケールバー:50μm。そうした切片においてはユビキチン陽性凝集物は全く検出されなかったことに留意されたい。PML+/+:Atxn1tg/−及びPML−/−:Atxn1tg/−マウスの染色切片が図7Gに示されている。
図14は、図14Aから図14Dを含むが、これはPMLの欠損が、プルキンエ細胞樹状突起の分岐を減少させるが、プルキンエ細胞内に凝集物を生じないことを実証する実験の結果を示す。(図14A)12週齢のマウスの正中矢状小脳切片を、プルキンエ細胞特異的タンパク質のカルビンディンに対する抗体を用いて染色した。山頂前裂からの矩形領域の蛍光強度がプロットされた(PML+/+についてはn=2匹のマウス、全ての他の遺伝子型についてはn=3匹のマウス)。PML−/−マウスは、PML+/+マウスと比較して樹状突起分岐の有意な減少を示した(分散分析、p=0.031)。(図14B)代表的なカルビンディン免疫蛍光共焦点画像。スケールバー:100μm。(図14C)長さ1mmあたりの体細胞の平均数としてグラフ化された、Atxn1tg/−を含む及び含まない12週齢のPML+/+、PML+/−、及びPML−/−マウスにおけるプルキンエ細胞密度の定量(平均値+標準誤差、1つの遺伝子型あたり3匹のマウス)。(図14D)Atxn1tg/−を含まない12週齢のPML+/+及びPML−/−マウス由来の小脳皮質切片の免疫組織化学的染色。切片を、抗ユビキチン抗体を用いて染色し、そしてヘマトキシリンを用いて対比染色した。スケールバー:50μm。そうした切片においてはユビキチン陽性凝集物は全く検出されなかったことに留意されたい。PML+/+:Atxn1tg/−及びPML−/−:Atxn1tg/−マウスの染色切片が図7Gに示されている。
図15は、図15Aから図15Dを含むが、これはTRIM27、TRIM32及びTRIM5δと、EGFP−Atxn1 82Q及びHttex1p 97QPの共局在を実証した実験例の結果を示す。(図15A)Atxn1 82Q−GFPを、示されたFLAGでタグ化されたTRIMタンパク質と一緒にHeLa細胞において発現させた。細胞を抗FLAG抗体(赤色)及びDAPI(青色)を用いて染色した。スケールバー:10μm。(図15B及び15C)Httex1p 97QPを、FLAGでタグ化されたTRIM5δ、TRIM27(図15B)、及びTRIM32(図15C)と一緒にHeLa細胞において発現させた。細胞を、抗ハンチンチン抗体(緑色)及び抗FLAG抗体(赤色)を用いて免疫染色した。TRIM32は、Httex1p 97QPの細胞内局在にも関わらず、Httex1p 97QPと共局在したことに留意されたい。(図15D)HeLa細胞を、Atxn1 82QP−GFPを用いてトランスフェクトした。内因性TRIM27を、抗TRIM27抗体(赤色)によって検出した。矢頭は、Atxn1 82Q凝集物と共局在した内因性TRIM27構造体を示す。スケールバー:10μm。
図15は、図15Aから図15Dを含むが、これはTRIM27、TRIM32及びTRIM5δと、EGFP−Atxn1 82Q及びHttex1p 97QPの共局在を実証した実験例の結果を示す。(図15A)Atxn1 82Q−GFPを、示されたFLAGでタグ化されたTRIMタンパク質と一緒にHeLa細胞において発現させた。細胞を抗FLAG抗体(赤色)及びDAPI(青色)を用いて染色した。スケールバー:10μm。(図15B及び15C)Httex1p 97QPを、FLAGでタグ化されたTRIM5δ、TRIM27(図15B)、及びTRIM32(図15C)と一緒にHeLa細胞において発現させた。細胞を、抗ハンチンチン抗体(緑色)及び抗FLAG抗体(赤色)を用いて免疫染色した。TRIM32は、Httex1p 97QPの細胞内局在にも関わらず、Httex1p 97QPと共局在したことに留意されたい。(図15D)HeLa細胞を、Atxn1 82QP−GFPを用いてトランスフェクトした。内因性TRIM27を、抗TRIM27抗体(赤色)によって検出した。矢頭は、Atxn1 82Q凝集物と共局在した内因性TRIM27構造体を示す。スケールバー:10μm。
図15は、図15Aから図15Dを含むが、これはTRIM27、TRIM32及びTRIM5δと、EGFP−Atxn1 82Q及びHttex1p 97QPの共局在を実証した実験例の結果を示す。(図15A)Atxn1 82Q−GFPを、示されたFLAGでタグ化されたTRIMタンパク質と一緒にHeLa細胞において発現させた。細胞を抗FLAG抗体(赤色)及びDAPI(青色)を用いて染色した。スケールバー:10μm。(図15B及び15C)Httex1p 97QPを、FLAGでタグ化されたTRIM5δ、TRIM27(図15B)、及びTRIM32(図15C)と一緒にHeLa細胞において発現させた。細胞を、抗ハンチンチン抗体(緑色)及び抗FLAG抗体(赤色)を用いて免疫染色した。TRIM32は、Httex1p 97QPの細胞内局在にも関わらず、Httex1p 97QPと共局在したことに留意されたい。(図15D)HeLa細胞を、Atxn1 82QP−GFPを用いてトランスフェクトした。内因性TRIM27を、抗TRIM27抗体(赤色)によって検出した。矢頭は、Atxn1 82Q凝集物と共局在した内因性TRIM27構造体を示す。スケールバー:10μm。
図15は、図15Aから図15Dを含むが、これはTRIM27、TRIM32及びTRIM5δと、EGFP−Atxn1 82Q及びHttex1p 97QPの共局在を実証した実験例の結果を示す。(図15A)Atxn1 82Q−GFPを、示されたFLAGでタグ化されたTRIMタンパク質と一緒にHeLa細胞において発現させた。細胞を抗FLAG抗体(赤色)及びDAPI(青色)を用いて染色した。スケールバー:10μm。(図15B及び15C)Httex1p 97QPを、FLAGでタグ化されたTRIM5δ、TRIM27(図15B)、及びTRIM32(図15C)と一緒にHeLa細胞において発現させた。細胞を、抗ハンチンチン抗体(緑色)及び抗FLAG抗体(赤色)を用いて免疫染色した。TRIM32は、Httex1p 97QPの細胞内局在にも関わらず、Httex1p 97QPと共局在したことに留意されたい。(図15D)HeLa細胞を、Atxn1 82QP−GFPを用いてトランスフェクトした。内因性TRIM27を、抗TRIM27抗体(赤色)によって検出した。矢頭は、Atxn1 82Q凝集物と共局在した内因性TRIM27構造体を示す。スケールバー:10μm。
図16は、図16Aから図16Dを含むが、これはTRIM27、TRIM32、及びTRIM5δによる凝集したAtxn1 82Qの低減を実証した実験例の結果を示す。(図16A及び図16B)HeLa細胞において単独で(−)又は示されたFLAGでタグ化されたTRIMタンパク質と一緒に発現させた場合のAtxn1 82Q−GFPのレベル。細胞溶解液をウェスタンブロットによって分析した。(図16A)の左パネルでは、アクチンに対するSS画分中のAtxn1 82Qの比が示され、そしてTRIM11の発現は、長時間の曝露後に検出され得る。(図16C)対照(−)又はTRIM27 siRNAを用いて処置されたHeLa細胞内のAtxn1 82Qの発現レベル。*、非特異的バンド。(図16D)PIASyは、Atxn1 82Qタンパク質のレベルを阻害しない。示されているようなAtxn1 82Q−GFP、PIASy、及びPMLを用いてトランスフェクトされたHeLa細胞のウェスタンブロット分析。
図16は、図16Aから図16Dを含むが、これはTRIM27、TRIM32、及びTRIM5δによる凝集したAtxn1 82Qの低減を実証した実験例の結果を示す。(図16A及び図16B)HeLa細胞において単独で(−)又は示されたFLAGでタグ化されたTRIMタンパク質と一緒に発現させた場合のAtxn1 82Q−GFPのレベル。細胞溶解液をウェスタンブロットによって分析した。(図16A)の左パネルでは、アクチンに対するSS画分中のAtxn1 82Qの比が示され、そしてTRIM11の発現は、長時間の曝露後に検出され得る。(図16C)対照(−)又はTRIM27 siRNAを用いて処置されたHeLa細胞内のAtxn1 82Qの発現レベル。*、非特異的バンド。(図16D)PIASyは、Atxn1 82Qタンパク質のレベルを阻害しない。示されているようなAtxn1 82Q−GFP、PIASy、及びPMLを用いてトランスフェクトされたHeLa細胞のウェスタンブロット分析。
図16は、図16Aから図16Dを含むが、これはTRIM27、TRIM32、及びTRIM5δによる凝集したAtxn1 82Qの低減を実証した実験例の結果を示す。(図16A及び図16B)HeLa細胞において単独で(−)又は示されたFLAGでタグ化されたTRIMタンパク質と一緒に発現させた場合のAtxn1 82Q−GFPのレベル。細胞溶解液をウェスタンブロットによって分析した。(図16A)の左パネルでは、アクチンに対するSS画分中のAtxn1 82Qの比が示され、そしてTRIM11の発現は、長時間の曝露後に検出され得る。(図16C)対照(−)又はTRIM27 siRNAを用いて処置されたHeLa細胞内のAtxn1 82Qの発現レベル。*、非特異的バンド。(図16D)PIASyは、Atxn1 82Qタンパク質のレベルを阻害しない。示されているようなAtxn1 82Q−GFP、PIASy、及びPMLを用いてトランスフェクトされたHeLa細胞のウェスタンブロット分析。
図16は、図16Aから図16Dを含むが、これはTRIM27、TRIM32、及びTRIM5δによる凝集したAtxn1 82Qの低減を実証した実験例の結果を示す。(図16A及び図16B)HeLa細胞において単独で(−)又は示されたFLAGでタグ化されたTRIMタンパク質と一緒に発現させた場合のAtxn1 82Q−GFPのレベル。細胞溶解液をウェスタンブロットによって分析した。(図16A)の左パネルでは、アクチンに対するSS画分中のAtxn1 82Qの比が示され、そしてTRIM11の発現は、長時間の曝露後に検出され得る。(図16C)対照(−)又はTRIM27 siRNAを用いて処置されたHeLa細胞内のAtxn1 82Qの発現レベル。*、非特異的バンド。(図16D)PIASyは、Atxn1 82Qタンパク質のレベルを阻害しない。示されているようなAtxn1 82Q−GFP、PIASy、及びPMLを用いてトランスフェクトされたHeLa細胞のウェスタンブロット分析。
図17は、図17Aから図17Cを含むが、これはTRIM27及びTRIM32が、PMLとは独立して、凝集したAtxn1 82Qを低減させたことを実証した実験例の結果を示す。(図17A)TRIM27とPMLの部分的な共局在。FLAG−TRIM27を用いてトランスフェクトされたHeLa細胞を、抗FLAG抗体(緑色)及び抗PML抗体(赤色)を用いて免疫染色した。(図17B)PML+/+及びPML−/−MEF内のTRIM27とAtxn1 82Q−GFP凝集物の共局在化。FLAG−TRIM27を、抗FLAG抗体(赤色)によって染色した。(図17C)Atxn1 82Q−GFPを、単独で又は示されたTRIMタンパク質と一緒にPML+/+及びPML−/−MEFにおいて発現させた。抽出物をフィルター位相差アッセイによって分析した。凝集物に対するTRIMタンパク質の効果をより良く比較するために、右パネルにおいてより明るい露光が示されている。
図17は、図17Aから図17Cを含むが、これはTRIM27及びTRIM32が、PMLとは独立して、凝集したAtxn1 82Qを低減させたことを実証した実験例の結果を示す。(図17A)TRIM27とPMLの部分的な共局在。FLAG−TRIM27を用いてトランスフェクトされたHeLa細胞を、抗FLAG抗体(緑色)及び抗PML抗体(赤色)を用いて免疫染色した。(図17B)PML+/+及びPML−/−MEF内のTRIM27とAtxn1 82Q−GFP凝集物の共局在化。FLAG−TRIM27を、抗FLAG抗体(赤色)によって染色した。(図17C)Atxn1 82Q−GFPを、単独で又は示されたTRIMタンパク質と一緒にPML+/+及びPML−/−MEFにおいて発現させた。抽出物をフィルター位相差アッセイによって分析した。凝集物に対するTRIMタンパク質の効果をより良く比較するために、右パネルにおいてより明るい露光が示されている。
図17は、図17Aから図17Cを含むが、これはTRIM27及びTRIM32が、PMLとは独立して、凝集したAtxn1 82Qを低減させたことを実証した実験例の結果を示す。(図17A)TRIM27とPMLの部分的な共局在。FLAG−TRIM27を用いてトランスフェクトされたHeLa細胞を、抗FLAG抗体(緑色)及び抗PML抗体(赤色)を用いて免疫染色した。(図17B)PML+/+及びPML−/−MEF内のTRIM27とAtxn1 82Q−GFP凝集物の共局在化。FLAG−TRIM27を、抗FLAG抗体(赤色)によって染色した。(図17C)Atxn1 82Q−GFPを、単独で又は示されたTRIMタンパク質と一緒にPML+/+及びPML−/−MEFにおいて発現させた。抽出物をフィルター位相差アッセイによって分析した。凝集物に対するTRIMタンパク質の効果をより良く比較するために、右パネルにおいてより明るい露光が示されている。
図18は、図18Aから図18Gを含むが、これはTRIMタンパク質が不溶性のAtxn1 82Qを除去するために、SUMO2/3及びプロテアソームに依存することを実証した実験例の結果を示す。(図18A〜図18F)Atxn1 82Q−GFPを、単独で又はTRIM5δ、TRIM27、及びTRIM32と一緒に、MG132を用いずに若しくは用いて処置された細胞において(図18A〜図18C)、又は対照若しくはSUMO2/3ノックダウン細胞(図18D〜図18F)において発現させた。細胞溶解液をウェスタンブロットによって分析した。(図18G)精製されたHA−Atxn1 82Q−FLAGのSUMO化を、示されたような組換えFLAG−TRIM11及びSUMO2の存在下で実施した。HA−Atxn1 82Q−FLAGを変性免疫沈降法を使用して単離した。反応混合物及びIP試料をウェスタンブロットによって分析した。
図18は、図18Aから図18Gを含むが、これはTRIMタンパク質が不溶性のAtxn1 82Qを除去するために、SUMO2/3及びプロテアソームに依存することを実証した実験例の結果を示す。(図18A〜図18F)Atxn1 82Q−GFPを、単独で又はTRIM5δ、TRIM27、及びTRIM32と一緒に、MG132を用いずに若しくは用いて処置された細胞において(図18A〜図18C)、又は対照若しくはSUMO2/3ノックダウン細胞(図18D〜図18F)において発現させた。細胞溶解液をウェスタンブロットによって分析した。(図18G)精製されたHA−Atxn1 82Q−FLAGのSUMO化を、示されたような組換えFLAG−TRIM11及びSUMO2の存在下で実施した。HA−Atxn1 82Q−FLAGを変性免疫沈降法を使用して単離した。反応混合物及びIP試料をウェスタンブロットによって分析した。
図18は、図18Aから図18Gを含むが、これはTRIMタンパク質が不溶性のAtxn1 82Qを除去するために、SUMO2/3及びプロテアソームに依存することを実証した実験例の結果を示す。(図18A〜図18F)Atxn1 82Q−GFPを、単独で又はTRIM5δ、TRIM27、及びTRIM32と一緒に、MG132を用いずに若しくは用いて処置された細胞において(図18A〜図18C)、又は対照若しくはSUMO2/3ノックダウン細胞(図18D〜図18F)において発現させた。細胞溶解液をウェスタンブロットによって分析した。(図18G)精製されたHA−Atxn1 82Q−FLAGのSUMO化を、示されたような組換えFLAG−TRIM11及びSUMO2の存在下で実施した。HA−Atxn1 82Q−FLAGを変性免疫沈降法を使用して単離した。反応混合物及びIP試料をウェスタンブロットによって分析した。
図18は、図18Aから図18Gを含むが、これはTRIMタンパク質が不溶性のAtxn1 82Qを除去するために、SUMO2/3及びプロテアソームに依存することを実証した実験例の結果を示す。(図18A〜図18F)Atxn1 82Q−GFPを、単独で又はTRIM5δ、TRIM27、及びTRIM32と一緒に、MG132を用いずに若しくは用いて処置された細胞において(図18A〜図18C)、又は対照若しくはSUMO2/3ノックダウン細胞(図18D〜図18F)において発現させた。細胞溶解液をウェスタンブロットによって分析した。(図18G)精製されたHA−Atxn1 82Q−FLAGのSUMO化を、示されたような組換えFLAG−TRIM11及びSUMO2の存在下で実施した。HA−Atxn1 82Q−FLAGを変性免疫沈降法を使用して単離した。反応混合物及びIP試料をウェスタンブロットによって分析した。
図18は、図18Aから図18Gを含むが、これはTRIMタンパク質が不溶性のAtxn1 82Qを除去するために、SUMO2/3及びプロテアソームに依存することを実証した実験例の結果を示す。(図18A〜図18F)Atxn1 82Q−GFPを、単独で又はTRIM5δ、TRIM27、及びTRIM32と一緒に、MG132を用いずに若しくは用いて処置された細胞において(図18A〜図18C)、又は対照若しくはSUMO2/3ノックダウン細胞(図18D〜図18F)において発現させた。細胞溶解液をウェスタンブロットによって分析した。(図18G)精製されたHA−Atxn1 82Q−FLAGのSUMO化を、示されたような組換えFLAG−TRIM11及びSUMO2の存在下で実施した。HA−Atxn1 82Q−FLAGを変性免疫沈降法を使用して単離した。反応混合物及びIP試料をウェスタンブロットによって分析した。
図18は、図18Aから図18Gを含むが、これはTRIMタンパク質が不溶性のAtxn1 82Qを除去するために、SUMO2/3及びプロテアソームに依存することを実証した実験例の結果を示す。(図18A〜図18F)Atxn1 82Q−GFPを、単独で又はTRIM5δ、TRIM27、及びTRIM32と一緒に、MG132を用いずに若しくは用いて処置された細胞において(図18A〜図18C)、又は対照若しくはSUMO2/3ノックダウン細胞(図18D〜図18F)において発現させた。細胞溶解液をウェスタンブロットによって分析した。(図18G)精製されたHA−Atxn1 82Q−FLAGのSUMO化を、示されたような組換えFLAG−TRIM11及びSUMO2の存在下で実施した。HA−Atxn1 82Q−FLAGを変性免疫沈降法を使用して単離した。反応混合物及びIP試料をウェスタンブロットによって分析した。
図18は、図18Aから図18Gを含むが、これはTRIMタンパク質が不溶性のAtxn1 82Qを除去するために、SUMO2/3及びプロテアソームに依存することを実証した実験例の結果を示す。(図18A〜図18F)Atxn1 82Q−GFPを、単独で又はTRIM5δ、TRIM27、及びTRIM32と一緒に、MG132を用いずに若しくは用いて処置された細胞において(図18A〜図18C)、又は対照若しくはSUMO2/3ノックダウン細胞(図18D〜図18F)において発現させた。細胞溶解液をウェスタンブロットによって分析した。(図18G)精製されたHA−Atxn1 82Q−FLAGのSUMO化を、示されたような組換えFLAG−TRIM11及びSUMO2の存在下で実施した。HA−Atxn1 82Q−FLAGを変性免疫沈降法を使用して単離した。反応混合物及びIP試料をウェスタンブロットによって分析した。
図19は、図19Aから図19Fを含むが、これはAtxn1 82Qに関連したTRIMタンパク質の局在化を実証した実験例の結果を示す。Atxn1 82Q−GFP(緑色)を、示されたHAでタグ化されたTRIMタンパク質と一緒にHeLa細胞において発現させた。細胞を、抗HA抗体(赤色)を用いて免疫染色した。各TRIMタンパク質についての代表的な局在化パターンが示されている。(図19A)TRIM1〜TRIM16の代表的な局在化パターン。(図19B)TRIM17〜TRIM32の代表的な局在化パターン。(図19C)TRIM33〜TRIM41及びTRIM44〜TRIM41の代表的な局在化パターン。(図19D)TRIM52、TRIM54〜TRIM58、TRIM62〜TRIM66、TRIM73〜TRIM74、及びTRIM76の代表的な局在化パターン。かなりの数の細胞においてAtxn1 82Q−GFPと共局在を示したTRIMタンパク質が黄色で示されている。スケールバー:10μm。
図19は、図19Aから図19Fを含むが、これはAtxn1 82Qに関連したTRIMタンパク質の局在化を実証した実験例の結果を示す。Atxn1 82Q−GFP(緑色)を、示されたHAでタグ化されたTRIMタンパク質と一緒にHeLa細胞において発現させた。細胞を、抗HA抗体(赤色)を用いて免疫染色した。各TRIMタンパク質についての代表的な局在化パターンが示されている。(図19A)TRIM1〜TRIM16の代表的な局在化パターン。(図19B)TRIM17〜TRIM32の代表的な局在化パターン。(図19C)TRIM33〜TRIM41及びTRIM44〜TRIM41の代表的な局在化パターン。(図19D)TRIM52、TRIM54〜TRIM58、TRIM62〜TRIM66、TRIM73〜TRIM74、及びTRIM76の代表的な局在化パターン。かなりの数の細胞においてAtxn1 82Q−GFPと共局在を示したTRIMタンパク質が黄色で示されている。スケールバー:10μm。
図19は、図19Aから図19Fを含むが、これはAtxn1 82Qに関連したTRIMタンパク質の局在化を実証した実験例の結果を示す。Atxn1 82Q−GFP(緑色)を、示されたHAでタグ化されたTRIMタンパク質と一緒にHeLa細胞において発現させた。細胞を、抗HA抗体(赤色)を用いて免疫染色した。各TRIMタンパク質についての代表的な局在化パターンが示されている。(図19A)TRIM1〜TRIM16の代表的な局在化パターン。(図19B)TRIM17〜TRIM32の代表的な局在化パターン。(図19C)TRIM33〜TRIM41及びTRIM44〜TRIM41の代表的な局在化パターン。(図19D)TRIM52、TRIM54〜TRIM58、TRIM62〜TRIM66、TRIM73〜TRIM74、及びTRIM76の代表的な局在化パターン。かなりの数の細胞においてAtxn1 82Q−GFPと共局在を示したTRIMタンパク質が黄色で示されている。スケールバー:10μm。
図19は、図19Aから図19Fを含むが、これはAtxn1 82Qに関連したTRIMタンパク質の局在化を実証した実験例の結果を示す。Atxn1 82Q−GFP(緑色)を、示されたHAでタグ化されたTRIMタンパク質と一緒にHeLa細胞において発現させた。細胞を、抗HA抗体(赤色)を用いて免疫染色した。各TRIMタンパク質についての代表的な局在化パターンが示されている。(図19A)TRIM1〜TRIM16の代表的な局在化パターン。(図19B)TRIM17〜TRIM32の代表的な局在化パターン。(図19C)TRIM33〜TRIM41及びTRIM44〜TRIM41の代表的な局在化パターン。(図19D)TRIM52、TRIM54〜TRIM58、TRIM62〜TRIM66、TRIM73〜TRIM74、及びTRIM76の代表的な局在化パターン。かなりの数の細胞においてAtxn1 82Q−GFPと共局在を示したTRIMタンパク質が黄色で示されている。スケールバー:10μm。
図19は、図19Aから図19Fを含むが、これはAtxn1 82Qに関連したTRIMタンパク質の局在化を実証した実験例の結果を示す。Atxn1 82Q−GFP(緑色)を、示されたHAでタグ化されたTRIMタンパク質と一緒にHeLa細胞において発現させた。細胞を、抗HA抗体(赤色)を用いて免疫染色した。各TRIMタンパク質についての代表的な局在化パターンが示されている。(図19A)TRIM1〜TRIM16の代表的な局在化パターン。(図19B)TRIM17〜TRIM32の代表的な局在化パターン。(図19C)TRIM33〜TRIM41及びTRIM44〜TRIM41の代表的な局在化パターン。(図19D)TRIM52、TRIM54〜TRIM58、TRIM62〜TRIM66、TRIM73〜TRIM74、及びTRIM76の代表的な局在化パターン。かなりの数の細胞においてAtxn1 82Q−GFPと共局在を示したTRIMタンパク質が黄色で示されている。スケールバー:10μm。
図19は、図19Aから図19Fを含むが、これはAtxn1 82Qに関連したTRIMタンパク質の局在化を実証した実験例の結果を示す。Atxn1 82Q−GFP(緑色)を、示されたHAでタグ化されたTRIMタンパク質と一緒にHeLa細胞において発現させた。細胞を、抗HA抗体(赤色)を用いて免疫染色した。各TRIMタンパク質についての代表的な局在化パターンが示されている。(図19A)TRIM1〜TRIM16の代表的な局在化パターン。(図19B)TRIM17〜TRIM32の代表的な局在化パターン。(図19C)TRIM33〜TRIM41及びTRIM44〜TRIM41の代表的な局在化パターン。(図19D)TRIM52、TRIM54〜TRIM58、TRIM62〜TRIM66、TRIM73〜TRIM74、及びTRIM76の代表的な局在化パターン。かなりの数の細胞においてAtxn1 82Q−GFPと共局在を示したTRIMタンパク質が黄色で示されている。スケールバー:10μm。
図20は、図20A及び図20Bを含むが、これはAtxn1 82Q及びHttex1p 97QPに対するTRIMタンパク質の体系的な分析の結果を示す。Atxn1 82Q−GFP(図20A)又はHttex1p 97QP(図20B)を、HeLa細胞において示されたTRIMタンパク質と共発現させた。細胞溶解液をウェスタンブロットによって分析した。赤色及び緑色で標識されたTRIMタンパク質は、ポリQタンパク質のレベルをそれぞれ減少及び増加させたものであるが、黒色で標識されたTRIMタンパク質は、観察できる効果を全く有さなかった。TRIMタンパク質の効果は、本明細書の何処かで記載されているように、それらの発現レベルによって影響を受ける可能性があることに留意されたい。
図20は、図20A及び図20Bを含むが、これはAtxn1 82Q及びHttex1p 97QPに対するTRIMタンパク質の体系的な分析の結果を示す。Atxn1 82Q−GFP(図20A)又はHttex1p 97QP(図20B)を、HeLa細胞において示されたTRIMタンパク質と共発現させた。細胞溶解液をウェスタンブロットによって分析した。赤色及び緑色で標識されたTRIMタンパク質は、ポリQタンパク質のレベルをそれぞれ減少及び増加させたものであるが、黒色で標識されたTRIMタンパク質は、観察できる効果を全く有さなかった。TRIMタンパク質の効果は、本明細書の何処かで記載されているように、それらの発現レベルによって影響を受ける可能性があることに留意されたい。
図21は、図21Aから図21Cを含むが、これは組換えTAT−TRIM11が、ミスフォールドタンパク質のレベルを低減することを実証した実験例の結果を示す。HeLa細胞を、Atxn1 82Q−GFP、Atxn1 30Q、又はHtt97Q−GFPを用いてトランスフェクトし、そして続いて組換えTRIM11又はSUMO2タンパク質と共にインキュベートした。(図21A)HeLa細胞をTRIM11を用いて処置することにより、Atxn1 82Qのレベルは強く減少した。(図21B)HeLa細胞をTRIM11を用いて処置することにより、Htt97Qのレベルも強く減少した。(図21C)SUMO2は、Atxn1 82Qのレベルに対して最小限の効果しか及ぼさなかった。
図21は、図21Aから図21Cを含むが、これは組換えTAT−TRIM11が、ミスフォールドタンパク質のレベルを低減することを実証した実験例の結果を示す。HeLa細胞を、Atxn1 82Q−GFP、Atxn1 30Q、又はHtt97Q−GFPを用いてトランスフェクトし、そして続いて組換えTRIM11又はSUMO2タンパク質と共にインキュベートした。(図21A)HeLa細胞をTRIM11を用いて処置することにより、Atxn1 82Qのレベルは強く減少した。(図21B)HeLa細胞をTRIM11を用いて処置することにより、Htt97Qのレベルも強く減少した。(図21C)SUMO2は、Atxn1 82Qのレベルに対して最小限の効果しか及ぼさなかった。
図21は、図21Aから図21Cを含むが、これは組換えTAT−TRIM11が、ミスフォールドタンパク質のレベルを低減することを実証した実験例の結果を示す。HeLa細胞を、Atxn1 82Q−GFP、Atxn1 30Q、又はHtt97Q−GFPを用いてトランスフェクトし、そして続いて組換えTRIM11又はSUMO2タンパク質と共にインキュベートした。(図21A)HeLa細胞をTRIM11を用いて処置することにより、Atxn1 82Qのレベルは強く減少した。(図21B)HeLa細胞をTRIM11を用いて処置することにより、Htt97Qのレベルも強く減少した。(図21C)SUMO2は、Atxn1 82Qのレベルに対して最小限の効果しか及ぼさなかった。
図22は、実験例に使用されたTat−TRIM11のアミノ酸配列を示す。
図23は、図23Aから図23Fを含むが、これはヒト脳試料のRNF4の染色を実証した実験の結果を示す。抗RNF4(緑色)によるハンチントン病脳組織の免疫染色。RNF4は、拡散した核内局在化を示したか(図23A〜図23C)又はフォーカスを形成した(図23D〜図23F)(矢頭によって示される)。スケールバー:10μm。
図24は、図24Aから図24Hを含むが、これはSCA1患者の神経細胞内封入体とRNF4の共局在化を実証した実験の結果を示す。抗ポリQ抗体(1C2)及び抗RNF4抗体を用いてのSCA1脳組織の免疫染色。スケールバー:10μm。
図25は、図25Aから図25Lを含むが、これはSCA1患者の神経細胞内封入体とRNF4の共局在化を実証した実験の結果を示す。図25は、抗Htt抗体、抗ユビキチン抗体、及び2つの別々のRNF4抗体を用いてのHD脳組織の免疫染色を示す。Htt及びユビキチンは、中心にRNF4シグナルを有する、環状の構造(図25A〜図25H)又は均一に分布した封入体(図25I〜図25L)を形成することに留意されたい。
図26は、図26Aから図26Hを含むが、これはHD患者の神経細胞内の封入体とRNF4の共局在化を実証した実験の結果を示す。HD脳組織のHtt及びRNF4の免疫染色が示されている。2つの異なるRNF4抗体(1番及び2番)が使用された。スケールバー:10μm。
図27は、図27Aから図27Dを含むが、これはAtxn1 82Q、p53及びα−シヌクレインのSUMO化を実証した実験の結果を示す。図27Aは、TRIM11 WT、TRIM11 MUT、又はPMLを共発現させた場合の、Atxn1 82QのSUMO化が分析された実験を示す。溶解前に、10μMのMG132を4時間かけて加えた。図27Bは、E1、E2及びSUMO2の存在下、TRIM11 WT又はTRIM11 MUTと共にインキュベートされた精製Atxn1 82QのインビトロでのSUMO化を示す。図27Cは、E1、E2及びSUMO2の存在下、TRIM11又はPMLと共にインキュベートされた精製Flag−p53のインビトロでのSUMO化を示す。図27Dは、E1、E2及びSUMO2の存在下又は非存在下、TRIM11 WTと共にインキュベートされたα−シヌクレインのインビトロでのSUMO化を示す。
図27は、図27Aから図27Dを含むが、これはAtxn1 82Q、p53及びα−シヌクレインのSUMO化を実証した実験の結果を示す。図27Aは、TRIM11 WT、TRIM11 MUT、又はPMLを共発現させた場合の、Atxn1 82QのSUMO化が分析された実験を示す。溶解前に、10μMのMG132を4時間かけて加えた。図27Bは、E1、E2及びSUMO2の存在下、TRIM11 WT又はTRIM11 MUTと共にインキュベートされた精製Atxn1 82QのインビトロでのSUMO化を示す。図27Cは、E1、E2及びSUMO2の存在下、TRIM11又はPMLと共にインキュベートされた精製Flag−p53のインビトロでのSUMO化を示す。図27Dは、E1、E2及びSUMO2の存在下又は非存在下、TRIM11 WTと共にインキュベートされたα−シヌクレインのインビトロでのSUMO化を示す。
図27は、図27Aから図27Dを含むが、これはAtxn1 82Q、p53及びα−シヌクレインのSUMO化を実証した実験の結果を示す。図27Aは、TRIM11 WT、TRIM11 MUT、又はPMLを共発現させた場合の、Atxn1 82QのSUMO化が分析された実験を示す。溶解前に、10μMのMG132を4時間かけて加えた。図27Bは、E1、E2及びSUMO2の存在下、TRIM11 WT又はTRIM11 MUTと共にインキュベートされた精製Atxn1 82QのインビトロでのSUMO化を示す。図27Cは、E1、E2及びSUMO2の存在下、TRIM11又はPMLと共にインキュベートされた精製Flag−p53のインビトロでのSUMO化を示す。図27Dは、E1、E2及びSUMO2の存在下又は非存在下、TRIM11 WTと共にインキュベートされたα−シヌクレインのインビトロでのSUMO化を示す。
図27は、図27Aから図27Dを含むが、これはAtxn1 82Q、p53及びα−シヌクレインのSUMO化を実証した実験の結果を示す。図27Aは、TRIM11 WT、TRIM11 MUT、又はPMLを共発現させた場合の、Atxn1 82QのSUMO化が分析された実験を示す。溶解前に、10μMのMG132を4時間かけて加えた。図27Bは、E1、E2及びSUMO2の存在下、TRIM11 WT又はTRIM11 MUTと共にインキュベートされた精製Atxn1 82QのインビトロでのSUMO化を示す。図27Cは、E1、E2及びSUMO2の存在下、TRIM11又はPMLと共にインキュベートされた精製Flag−p53のインビトロでのSUMO化を示す。図27Dは、E1、E2及びSUMO2の存在下又は非存在下、TRIM11 WTと共にインキュベートされたα−シヌクレインのインビトロでのSUMO化を示す。
図28は、図28Aから図28Gを含むが、これはTRIM11がAtxn1 82Q凝集物に補充されることを実証した実験の結果を示す。図28Aは、293T細胞においてトランスフェクトされたGFP−Hsp70の免疫蛍光分析を示す。図28Bは、293T細胞においてトランスフェクトされたGFP−TRIM11の免疫蛍光分析を示す。図28Cは、Hsp70がAtxn1 82Qの凝集物に補充され得ることを示す免疫蛍光分析を示す。図28Dは、TRIM11がAtxn1 82Qの凝集物に補充され得ることを示す免疫蛍光分析を示す。図28Eは、Atxn1 82Q、TRIM11又はHsp70を用いてトランスフェクトされた細胞の洗浄剤可溶性及び不溶性の画分のイムノブロット分析を示す。指示がある場合、10μM MG132を3時間かけて加える。図28Fは、Atxn1 82Q、TRIM11 WT(野生型)又はTRIM11 MUT(突然変異)を用いてトランスフェクトされた細胞の洗浄剤可溶性及び不溶性の画分のイムノブロット分析を示す。指示がある場合、10μM MG132を3時間かけて加える。図28Gは、HCT116を示されたプラスミドを用いてトランスフェクトする場合のイムノブロットを示す。48時間後、細胞を溶解し、そしてその後、20μM チオフラビン−T(ThT)を用いて染色した。
図28は、図28Aから図28Gを含むが、これはTRIM11がAtxn1 82Q凝集物に補充されることを実証した実験の結果を示す。図28Aは、293T細胞においてトランスフェクトされたGFP−Hsp70の免疫蛍光分析を示す。図28Bは、293T細胞においてトランスフェクトされたGFP−TRIM11の免疫蛍光分析を示す。図28Cは、Hsp70がAtxn1 82Qの凝集物に補充され得ることを示す免疫蛍光分析を示す。図28Dは、TRIM11がAtxn1 82Qの凝集物に補充され得ることを示す免疫蛍光分析を示す。図28Eは、Atxn1 82Q、TRIM11又はHsp70を用いてトランスフェクトされた細胞の洗浄剤可溶性及び不溶性の画分のイムノブロット分析を示す。指示がある場合、10μM MG132を3時間かけて加える。図28Fは、Atxn1 82Q、TRIM11 WT(野生型)又はTRIM11 MUT(突然変異)を用いてトランスフェクトされた細胞の洗浄剤可溶性及び不溶性の画分のイムノブロット分析を示す。指示がある場合、10μM MG132を3時間かけて加える。図28Gは、HCT116を示されたプラスミドを用いてトランスフェクトする場合のイムノブロットを示す。48時間後、細胞を溶解し、そしてその後、20μM チオフラビン−T(ThT)を用いて染色した。
図28は、図28Aから図28Gを含むが、これはTRIM11がAtxn1 82Q凝集物に補充されることを実証した実験の結果を示す。図28Aは、293T細胞においてトランスフェクトされたGFP−Hsp70の免疫蛍光分析を示す。図28Bは、293T細胞においてトランスフェクトされたGFP−TRIM11の免疫蛍光分析を示す。図28Cは、Hsp70がAtxn1 82Qの凝集物に補充され得ることを示す免疫蛍光分析を示す。図28Dは、TRIM11がAtxn1 82Qの凝集物に補充され得ることを示す免疫蛍光分析を示す。図28Eは、Atxn1 82Q、TRIM11又はHsp70を用いてトランスフェクトされた細胞の洗浄剤可溶性及び不溶性の画分のイムノブロット分析を示す。指示がある場合、10μM MG132を3時間かけて加える。図28Fは、Atxn1 82Q、TRIM11 WT(野生型)又はTRIM11 MUT(突然変異)を用いてトランスフェクトされた細胞の洗浄剤可溶性及び不溶性の画分のイムノブロット分析を示す。指示がある場合、10μM MG132を3時間かけて加える。図28Gは、HCT116を示されたプラスミドを用いてトランスフェクトする場合のイムノブロットを示す。48時間後、細胞を溶解し、そしてその後、20μM チオフラビン−T(ThT)を用いて染色した。
図28は、図28Aから図28Gを含むが、これはTRIM11がAtxn1 82Q凝集物に補充されることを実証した実験の結果を示す。図28Aは、293T細胞においてトランスフェクトされたGFP−Hsp70の免疫蛍光分析を示す。図28Bは、293T細胞においてトランスフェクトされたGFP−TRIM11の免疫蛍光分析を示す。図28Cは、Hsp70がAtxn1 82Qの凝集物に補充され得ることを示す免疫蛍光分析を示す。図28Dは、TRIM11がAtxn1 82Qの凝集物に補充され得ることを示す免疫蛍光分析を示す。図28Eは、Atxn1 82Q、TRIM11又はHsp70を用いてトランスフェクトされた細胞の洗浄剤可溶性及び不溶性の画分のイムノブロット分析を示す。指示がある場合、10μM MG132を3時間かけて加える。図28Fは、Atxn1 82Q、TRIM11 WT(野生型)又はTRIM11 MUT(突然変異)を用いてトランスフェクトされた細胞の洗浄剤可溶性及び不溶性の画分のイムノブロット分析を示す。指示がある場合、10μM MG132を3時間かけて加える。図28Gは、HCT116を示されたプラスミドを用いてトランスフェクトする場合のイムノブロットを示す。48時間後、細胞を溶解し、そしてその後、20μM チオフラビン−T(ThT)を用いて染色した。
図28は、図28Aから図28Gを含むが、これはTRIM11がAtxn1 82Q凝集物に補充されることを実証した実験の結果を示す。図28Aは、293T細胞においてトランスフェクトされたGFP−Hsp70の免疫蛍光分析を示す。図28Bは、293T細胞においてトランスフェクトされたGFP−TRIM11の免疫蛍光分析を示す。図28Cは、Hsp70がAtxn1 82Qの凝集物に補充され得ることを示す免疫蛍光分析を示す。図28Dは、TRIM11がAtxn1 82Qの凝集物に補充され得ることを示す免疫蛍光分析を示す。図28Eは、Atxn1 82Q、TRIM11又はHsp70を用いてトランスフェクトされた細胞の洗浄剤可溶性及び不溶性の画分のイムノブロット分析を示す。指示がある場合、10μM MG132を3時間かけて加える。図28Fは、Atxn1 82Q、TRIM11 WT(野生型)又はTRIM11 MUT(突然変異)を用いてトランスフェクトされた細胞の洗浄剤可溶性及び不溶性の画分のイムノブロット分析を示す。指示がある場合、10μM MG132を3時間かけて加える。図28Gは、HCT116を示されたプラスミドを用いてトランスフェクトする場合のイムノブロットを示す。48時間後、細胞を溶解し、そしてその後、20μM チオフラビン−T(ThT)を用いて染色した。
図28は、図28Aから図28Gを含むが、これはTRIM11がAtxn1 82Q凝集物に補充されることを実証した実験の結果を示す。図28Aは、293T細胞においてトランスフェクトされたGFP−Hsp70の免疫蛍光分析を示す。図28Bは、293T細胞においてトランスフェクトされたGFP−TRIM11の免疫蛍光分析を示す。図28Cは、Hsp70がAtxn1 82Qの凝集物に補充され得ることを示す免疫蛍光分析を示す。図28Dは、TRIM11がAtxn1 82Qの凝集物に補充され得ることを示す免疫蛍光分析を示す。図28Eは、Atxn1 82Q、TRIM11又はHsp70を用いてトランスフェクトされた細胞の洗浄剤可溶性及び不溶性の画分のイムノブロット分析を示す。指示がある場合、10μM MG132を3時間かけて加える。図28Fは、Atxn1 82Q、TRIM11 WT(野生型)又はTRIM11 MUT(突然変異)を用いてトランスフェクトされた細胞の洗浄剤可溶性及び不溶性の画分のイムノブロット分析を示す。指示がある場合、10μM MG132を3時間かけて加える。図28Gは、HCT116を示されたプラスミドを用いてトランスフェクトする場合のイムノブロットを示す。48時間後、細胞を溶解し、そしてその後、20μM チオフラビン−T(ThT)を用いて染色した。
図28は、図28Aから図28Gを含むが、これはTRIM11がAtxn1 82Q凝集物に補充されることを実証した実験の結果を示す。図28Aは、293T細胞においてトランスフェクトされたGFP−Hsp70の免疫蛍光分析を示す。図28Bは、293T細胞においてトランスフェクトされたGFP−TRIM11の免疫蛍光分析を示す。図28Cは、Hsp70がAtxn1 82Qの凝集物に補充され得ることを示す免疫蛍光分析を示す。図28Dは、TRIM11がAtxn1 82Qの凝集物に補充され得ることを示す免疫蛍光分析を示す。図28Eは、Atxn1 82Q、TRIM11又はHsp70を用いてトランスフェクトされた細胞の洗浄剤可溶性及び不溶性の画分のイムノブロット分析を示す。指示がある場合、10μM MG132を3時間かけて加える。図28Fは、Atxn1 82Q、TRIM11 WT(野生型)又はTRIM11 MUT(突然変異)を用いてトランスフェクトされた細胞の洗浄剤可溶性及び不溶性の画分のイムノブロット分析を示す。指示がある場合、10μM MG132を3時間かけて加える。図28Gは、HCT116を示されたプラスミドを用いてトランスフェクトする場合のイムノブロットを示す。48時間後、細胞を溶解し、そしてその後、20μM チオフラビン−T(ThT)を用いて染色した。
図29は、図29Aから図29Cを含むが、これはAtxn1 82QへのTRIM11の結合を実証した実験の結果を示す。図29Aは、ビーズ上に固定された精製されたFlag−Atxn1 82QをGST又はGST−TRIM11と共にインキュベートした実験を示す。図29Bは、ビーズ上に固定された精製されたFlag−Atxn1 82Q又はFlag−Atxn1 30QをGST又はGST−TRIM11と共にインキュベートした実験を示す。図29Cは、Ni−NTAビーズ上に固定された天然(N)及び尿素で変性させた(D)ルシフェラーゼ(luc)に対するGST−TRIM11及びGSTタンパク質の結合を示す。
図29は、図29Aから図29Cを含むが、これはAtxn1 82QへのTRIM11の結合を実証した実験の結果を示す。図29Aは、ビーズ上に固定された精製されたFlag−Atxn1 82QをGST又はGST−TRIM11と共にインキュベートした実験を示す。図29Bは、ビーズ上に固定された精製されたFlag−Atxn1 82Q又はFlag−Atxn1 30QをGST又はGST−TRIM11と共にインキュベートした実験を示す。図29Cは、Ni−NTAビーズ上に固定された天然(N)及び尿素で変性させた(D)ルシフェラーゼ(luc)に対するGST−TRIM11及びGSTタンパク質の結合を示す。
図29は、図29Aから図29Cを含むが、これはAtxn1 82QへのTRIM11の結合を実証した実験の結果を示す。図29Aは、ビーズ上に固定された精製されたFlag−Atxn1 82QをGST又はGST−TRIM11と共にインキュベートした実験を示す。図29Bは、ビーズ上に固定された精製されたFlag−Atxn1 82Q又はFlag−Atxn1 30QをGST又はGST−TRIM11と共にインキュベートした実験を示す。図29Cは、Ni−NTAビーズ上に固定された天然(N)及び尿素で変性させた(D)ルシフェラーゼ(luc)に対するGST−TRIM11及びGSTタンパク質の結合を示す。
図30は、図30Aから図30Dを含むが、これはTRIM11が細胞内凝集物を低減させることを実証した実験の結果を示す。図30Aは、GFP−Atxn1 82Qを安定に発現しているHCT116細胞を溶解し、そしてその後、20μM チオフラビン−T(ThT)を用いて染色した実験を示す。図30Bは、TRIM11を用いてトランスフェクトされたGFP−Atxn1 82Q−HCT116細胞の沈降分析を示す。図30Cは、GFP−Atxn1 82Qを安定に発現しているHCT116細胞をTRIM11 WT又はTRIM11 MUTを用いてトランスフェクトした実験を示す。48時間後、細胞を溶解し、そして20μM ThTを用いて染色した。図30Dは、TRIM11 WT又はTRIM11 MUTを用いてトランスフェクトされたGFP−Atxn1 82Q−HCT116細胞の沈降分析を示す。
図30は、図30Aから図30Dを含むが、これはTRIM11が細胞内凝集物を低減させることを実証した実験の結果を示す。図30Aは、GFP−Atxn1 82Qを安定に発現しているHCT116細胞を溶解し、そしてその後、20μM チオフラビン−T(ThT)を用いて染色した実験を示す。図30Bは、TRIM11を用いてトランスフェクトされたGFP−Atxn1 82Q−HCT116細胞の沈降分析を示す。図30Cは、GFP−Atxn1 82Qを安定に発現しているHCT116細胞をTRIM11 WT又はTRIM11 MUTを用いてトランスフェクトした実験を示す。48時間後、細胞を溶解し、そして20μM ThTを用いて染色した。図30Dは、TRIM11 WT又はTRIM11 MUTを用いてトランスフェクトされたGFP−Atxn1 82Q−HCT116細胞の沈降分析を示す。
図30は、図30Aから図30Dを含むが、これはTRIM11が細胞内凝集物を低減させることを実証した実験の結果を示す。図30Aは、GFP−Atxn1 82Qを安定に発現しているHCT116細胞を溶解し、そしてその後、20μM チオフラビン−T(ThT)を用いて染色した実験を示す。図30Bは、TRIM11を用いてトランスフェクトされたGFP−Atxn1 82Q−HCT116細胞の沈降分析を示す。図30Cは、GFP−Atxn1 82Qを安定に発現しているHCT116細胞をTRIM11 WT又はTRIM11 MUTを用いてトランスフェクトした実験を示す。48時間後、細胞を溶解し、そして20μM ThTを用いて染色した。図30Dは、TRIM11 WT又はTRIM11 MUTを用いてトランスフェクトされたGFP−Atxn1 82Q−HCT116細胞の沈降分析を示す。
図30は、図30Aから図30Dを含むが、これはTRIM11が細胞内凝集物を低減させることを実証した実験の結果を示す。図30Aは、GFP−Atxn1 82Qを安定に発現しているHCT116細胞を溶解し、そしてその後、20μM チオフラビン−T(ThT)を用いて染色した実験を示す。図30Bは、TRIM11を用いてトランスフェクトされたGFP−Atxn1 82Q−HCT116細胞の沈降分析を示す。図30Cは、GFP−Atxn1 82Qを安定に発現しているHCT116細胞をTRIM11 WT又はTRIM11 MUTを用いてトランスフェクトした実験を示す。48時間後、細胞を溶解し、そして20μM ThTを用いて染色した。図30Dは、TRIM11 WT又はTRIM11 MUTを用いてトランスフェクトされたGFP−Atxn1 82Q−HCT116細胞の沈降分析を示す。
図31は、図31Aから図31Hを含むが、これはTRIM11が、凝集物の形成を防ぐ分子シャペロンとして作用することを実証した実験の結果を示す。図31Aは、ルシフェラーゼ(10nM)を、200nM GST、200nM GST−TRIM11又は200nM Hsp70と共に45℃で指定された時間インキュベートした実験を示す。天然ルシフェラーゼ活性を100%と設定した。N=3。図31Bは、GFP(0.45uM)を200nM GST、200nM GST−TRIM11又は200nM Hsp70と共に45℃で指定された時間インキュベートした実験を示す。天然GFP蛍光を100%と設定した。N=3。図31Cは、対照としての熱ショックを与えずに測定されたHCT116におけるトランスフェクトされたルシフェラーゼの活性を示す。45℃で30分間の熱ショック後、又はインキュベーターで3時間回復させた後、ルシフェラーゼ活性は対照と相対的であった。図31Dは、対照としての熱ショックを与えずに測定されたHCT116におけるトランスフェクトされたルシフェラーゼの活性を示す。45℃で60分間の熱ショック後、又はインキュベーターで1.5時間若しくは3時間回復させた後、ルシフェラーゼ活性は対照と相対的であった。図31Eは、対照ベクター又はFlag−TRIM11を安定に発現しているHCT116細胞のイムノブロット分析を示す。図31Fは、GST、TRIM11又はHsp70によるβ−アミロイド線維形成の防止を示したThT分析を示す。図31Gは、リゾチーム、GST又はTRIM11によるAtxn1 82Q凝集物の形成の防止を示した沈降アッセイを示す。結果は、イムノブロット及びドットブロットアッセイによって示された。図31Hは、LTRIM11によるp53凝集物の形成の防止を示した沈降アッセイを示す。指示されている場合、E1、E2、SUMO2又はATPを適用した。結果は、イムノブロット及びドットブロットアッセイによって示された。
図31は、図31Aから図31Hを含むが、これはTRIM11が、凝集物の形成を防ぐ分子シャペロンとして作用することを実証した実験の結果を示す。図31Aは、ルシフェラーゼ(10nM)を、200nM GST、200nM GST−TRIM11又は200nM Hsp70と共に45℃で指定された時間インキュベートした実験を示す。天然ルシフェラーゼ活性を100%と設定した。N=3。図31Bは、GFP(0.45uM)を200nM GST、200nM GST−TRIM11又は200nM Hsp70と共に45℃で指定された時間インキュベートした実験を示す。天然GFP蛍光を100%と設定した。N=3。図31Cは、対照としての熱ショックを与えずに測定されたHCT116におけるトランスフェクトされたルシフェラーゼの活性を示す。45℃で30分間の熱ショック後、又はインキュベーターで3時間回復させた後、ルシフェラーゼ活性は対照と相対的であった。図31Dは、対照としての熱ショックを与えずに測定されたHCT116におけるトランスフェクトされたルシフェラーゼの活性を示す。45℃で60分間の熱ショック後、又はインキュベーターで1.5時間若しくは3時間回復させた後、ルシフェラーゼ活性は対照と相対的であった。図31Eは、対照ベクター又はFlag−TRIM11を安定に発現しているHCT116細胞のイムノブロット分析を示す。図31Fは、GST、TRIM11又はHsp70によるβ−アミロイド線維形成の防止を示したThT分析を示す。図31Gは、リゾチーム、GST又はTRIM11によるAtxn1 82Q凝集物の形成の防止を示した沈降アッセイを示す。結果は、イムノブロット及びドットブロットアッセイによって示された。図31Hは、LTRIM11によるp53凝集物の形成の防止を示した沈降アッセイを示す。指示されている場合、E1、E2、SUMO2又はATPを適用した。結果は、イムノブロット及びドットブロットアッセイによって示された。
図31は、図31Aから図31Hを含むが、これはTRIM11が、凝集物の形成を防ぐ分子シャペロンとして作用することを実証した実験の結果を示す。図31Aは、ルシフェラーゼ(10nM)を、200nM GST、200nM GST−TRIM11又は200nM Hsp70と共に45℃で指定された時間インキュベートした実験を示す。天然ルシフェラーゼ活性を100%と設定した。N=3。図31Bは、GFP(0.45uM)を200nM GST、200nM GST−TRIM11又は200nM Hsp70と共に45℃で指定された時間インキュベートした実験を示す。天然GFP蛍光を100%と設定した。N=3。図31Cは、対照としての熱ショックを与えずに測定されたHCT116におけるトランスフェクトされたルシフェラーゼの活性を示す。45℃で30分間の熱ショック後、又はインキュベーターで3時間回復させた後、ルシフェラーゼ活性は対照と相対的であった。図31Dは、対照としての熱ショックを与えずに測定されたHCT116におけるトランスフェクトされたルシフェラーゼの活性を示す。45℃で60分間の熱ショック後、又はインキュベーターで1.5時間若しくは3時間回復させた後、ルシフェラーゼ活性は対照と相対的であった。図31Eは、対照ベクター又はFlag−TRIM11を安定に発現しているHCT116細胞のイムノブロット分析を示す。図31Fは、GST、TRIM11又はHsp70によるβ−アミロイド線維形成の防止を示したThT分析を示す。図31Gは、リゾチーム、GST又はTRIM11によるAtxn1 82Q凝集物の形成の防止を示した沈降アッセイを示す。結果は、イムノブロット及びドットブロットアッセイによって示された。図31Hは、LTRIM11によるp53凝集物の形成の防止を示した沈降アッセイを示す。指示されている場合、E1、E2、SUMO2又はATPを適用した。結果は、イムノブロット及びドットブロットアッセイによって示された。
図31は、図31Aから図31Hを含むが、これはTRIM11が、凝集物の形成を防ぐ分子シャペロンとして作用することを実証した実験の結果を示す。図31Aは、ルシフェラーゼ(10nM)を、200nM GST、200nM GST−TRIM11又は200nM Hsp70と共に45℃で指定された時間インキュベートした実験を示す。天然ルシフェラーゼ活性を100%と設定した。N=3。図31Bは、GFP(0.45uM)を200nM GST、200nM GST−TRIM11又は200nM Hsp70と共に45℃で指定された時間インキュベートした実験を示す。天然GFP蛍光を100%と設定した。N=3。図31Cは、対照としての熱ショックを与えずに測定されたHCT116におけるトランスフェクトされたルシフェラーゼの活性を示す。45℃で30分間の熱ショック後、又はインキュベーターで3時間回復させた後、ルシフェラーゼ活性は対照と相対的であった。図31Dは、対照としての熱ショックを与えずに測定されたHCT116におけるトランスフェクトされたルシフェラーゼの活性を示す。45℃で60分間の熱ショック後、又はインキュベーターで1.5時間若しくは3時間回復させた後、ルシフェラーゼ活性は対照と相対的であった。図31Eは、対照ベクター又はFlag−TRIM11を安定に発現しているHCT116細胞のイムノブロット分析を示す。図31Fは、GST、TRIM11又はHsp70によるβ−アミロイド線維形成の防止を示したThT分析を示す。図31Gは、リゾチーム、GST又はTRIM11によるAtxn1 82Q凝集物の形成の防止を示した沈降アッセイを示す。結果は、イムノブロット及びドットブロットアッセイによって示された。図31Hは、LTRIM11によるp53凝集物の形成の防止を示した沈降アッセイを示す。指示されている場合、E1、E2、SUMO2又はATPを適用した。結果は、イムノブロット及びドットブロットアッセイによって示された。
図31は、図31Aから図31Hを含むが、これはTRIM11が、凝集物の形成を防ぐ分子シャペロンとして作用することを実証した実験の結果を示す。図31Aは、ルシフェラーゼ(10nM)を、200nM GST、200nM GST−TRIM11又は200nM Hsp70と共に45℃で指定された時間インキュベートした実験を示す。天然ルシフェラーゼ活性を100%と設定した。N=3。図31Bは、GFP(0.45uM)を200nM GST、200nM GST−TRIM11又は200nM Hsp70と共に45℃で指定された時間インキュベートした実験を示す。天然GFP蛍光を100%と設定した。N=3。図31Cは、対照としての熱ショックを与えずに測定されたHCT116におけるトランスフェクトされたルシフェラーゼの活性を示す。45℃で30分間の熱ショック後、又はインキュベーターで3時間回復させた後、ルシフェラーゼ活性は対照と相対的であった。図31Dは、対照としての熱ショックを与えずに測定されたHCT116におけるトランスフェクトされたルシフェラーゼの活性を示す。45℃で60分間の熱ショック後、又はインキュベーターで1.5時間若しくは3時間回復させた後、ルシフェラーゼ活性は対照と相対的であった。図31Eは、対照ベクター又はFlag−TRIM11を安定に発現しているHCT116細胞のイムノブロット分析を示す。図31Fは、GST、TRIM11又はHsp70によるβ−アミロイド線維形成の防止を示したThT分析を示す。図31Gは、リゾチーム、GST又はTRIM11によるAtxn1 82Q凝集物の形成の防止を示した沈降アッセイを示す。結果は、イムノブロット及びドットブロットアッセイによって示された。図31Hは、LTRIM11によるp53凝集物の形成の防止を示した沈降アッセイを示す。指示されている場合、E1、E2、SUMO2又はATPを適用した。結果は、イムノブロット及びドットブロットアッセイによって示された。
図31は、図31Aから図31Hを含むが、これはTRIM11が、凝集物の形成を防ぐ分子シャペロンとして作用することを実証した実験の結果を示す。図31Aは、ルシフェラーゼ(10nM)を、200nM GST、200nM GST−TRIM11又は200nM Hsp70と共に45℃で指定された時間インキュベートした実験を示す。天然ルシフェラーゼ活性を100%と設定した。N=3。図31Bは、GFP(0.45uM)を200nM GST、200nM GST−TRIM11又は200nM Hsp70と共に45℃で指定された時間インキュベートした実験を示す。天然GFP蛍光を100%と設定した。N=3。図31Cは、対照としての熱ショックを与えずに測定されたHCT116におけるトランスフェクトされたルシフェラーゼの活性を示す。45℃で30分間の熱ショック後、又はインキュベーターで3時間回復させた後、ルシフェラーゼ活性は対照と相対的であった。図31Dは、対照としての熱ショックを与えずに測定されたHCT116におけるトランスフェクトされたルシフェラーゼの活性を示す。45℃で60分間の熱ショック後、又はインキュベーターで1.5時間若しくは3時間回復させた後、ルシフェラーゼ活性は対照と相対的であった。図31Eは、対照ベクター又はFlag−TRIM11を安定に発現しているHCT116細胞のイムノブロット分析を示す。図31Fは、GST、TRIM11又はHsp70によるβ−アミロイド線維形成の防止を示したThT分析を示す。図31Gは、リゾチーム、GST又はTRIM11によるAtxn1 82Q凝集物の形成の防止を示した沈降アッセイを示す。結果は、イムノブロット及びドットブロットアッセイによって示された。図31Hは、LTRIM11によるp53凝集物の形成の防止を示した沈降アッセイを示す。指示されている場合、E1、E2、SUMO2又はATPを適用した。結果は、イムノブロット及びドットブロットアッセイによって示された。
図31は、図31Aから図31Hを含むが、これはTRIM11が、凝集物の形成を防ぐ分子シャペロンとして作用することを実証した実験の結果を示す。図31Aは、ルシフェラーゼ(10nM)を、200nM GST、200nM GST−TRIM11又は200nM Hsp70と共に45℃で指定された時間インキュベートした実験を示す。天然ルシフェラーゼ活性を100%と設定した。N=3。図31Bは、GFP(0.45uM)を200nM GST、200nM GST−TRIM11又は200nM Hsp70と共に45℃で指定された時間インキュベートした実験を示す。天然GFP蛍光を100%と設定した。N=3。図31Cは、対照としての熱ショックを与えずに測定されたHCT116におけるトランスフェクトされたルシフェラーゼの活性を示す。45℃で30分間の熱ショック後、又はインキュベーターで3時間回復させた後、ルシフェラーゼ活性は対照と相対的であった。図31Dは、対照としての熱ショックを与えずに測定されたHCT116におけるトランスフェクトされたルシフェラーゼの活性を示す。45℃で60分間の熱ショック後、又はインキュベーターで1.5時間若しくは3時間回復させた後、ルシフェラーゼ活性は対照と相対的であった。図31Eは、対照ベクター又はFlag−TRIM11を安定に発現しているHCT116細胞のイムノブロット分析を示す。図31Fは、GST、TRIM11又はHsp70によるβ−アミロイド線維形成の防止を示したThT分析を示す。図31Gは、リゾチーム、GST又はTRIM11によるAtxn1 82Q凝集物の形成の防止を示した沈降アッセイを示す。結果は、イムノブロット及びドットブロットアッセイによって示された。図31Hは、LTRIM11によるp53凝集物の形成の防止を示した沈降アッセイを示す。指示されている場合、E1、E2、SUMO2又はATPを適用した。結果は、イムノブロット及びドットブロットアッセイによって示された。
図31は、図31Aから図31Hを含むが、これはTRIM11が、凝集物の形成を防ぐ分子シャペロンとして作用することを実証した実験の結果を示す。図31Aは、ルシフェラーゼ(10nM)を、200nM GST、200nM GST−TRIM11又は200nM Hsp70と共に45℃で指定された時間インキュベートした実験を示す。天然ルシフェラーゼ活性を100%と設定した。N=3。図31Bは、GFP(0.45uM)を200nM GST、200nM GST−TRIM11又は200nM Hsp70と共に45℃で指定された時間インキュベートした実験を示す。天然GFP蛍光を100%と設定した。N=3。図31Cは、対照としての熱ショックを与えずに測定されたHCT116におけるトランスフェクトされたルシフェラーゼの活性を示す。45℃で30分間の熱ショック後、又はインキュベーターで3時間回復させた後、ルシフェラーゼ活性は対照と相対的であった。図31Dは、対照としての熱ショックを与えずに測定されたHCT116におけるトランスフェクトされたルシフェラーゼの活性を示す。45℃で60分間の熱ショック後、又はインキュベーターで1.5時間若しくは3時間回復させた後、ルシフェラーゼ活性は対照と相対的であった。図31Eは、対照ベクター又はFlag−TRIM11を安定に発現しているHCT116細胞のイムノブロット分析を示す。図31Fは、GST、TRIM11又はHsp70によるβ−アミロイド線維形成の防止を示したThT分析を示す。図31Gは、リゾチーム、GST又はTRIM11によるAtxn1 82Q凝集物の形成の防止を示した沈降アッセイを示す。結果は、イムノブロット及びドットブロットアッセイによって示された。図31Hは、LTRIM11によるp53凝集物の形成の防止を示した沈降アッセイを示す。指示されている場合、E1、E2、SUMO2又はATPを適用した。結果は、イムノブロット及びドットブロットアッセイによって示された。
図32は、図32Aから図32Gを含むが、これはHSF1が、TRIM11の転写の調節に必要とされないことを実証した実験の結果を示す。図32Aは、HCT116細胞を熱ショック(42℃)を用いて又は用いずに1時間処置し、その後、様々な時間かけて回復させた実験を示す。全細胞溶解液を、示された抗体を用いてのイムノブロットにかけた。図32Bは、Flag−TRIM11を安定に発現しているHCT116細胞を、熱ショック(42℃)を用いて又は用いずに1時間処置し、その後、様々な時間かけて回復させた実験を示す。全細胞溶解液を、示された抗体を用いてのイムノブロットにかけた。図32Cは、HeLa細胞を熱ショック(42℃)を用いて又は用いずに1時間処置し、その後、様々な時間かけて回復させた実験を示す。全細胞溶解液を、示された抗体を用いてのイムノブロットにかけた。図32Dは、A549細胞をAs2O3を用いて又は用いずに30分間処置し、その後、様々な時間かけて回復させた実験を示す。全細胞溶解液を、示された抗体を用いてのイムノブロットにかけた。図32Eは、A549細胞をH2O2を用いて又は用いずに100分間処置し、その後、様々な時間かけて回復させた実験を示す。全細胞溶解液を、示された抗体を用いてのイムノブロットにかけた。図32Fは、熱ショックに応答したTRIM11、HSP70、HSP90、及びGAPDHの半定量PCR分析を示す。図32Gは、ベクター又はHSF1を安定に発現しているA549細胞を熱ショックを用いて又は用いずに処置し、そして3時間かけて回復させた実験を示す。イムノブロット及び半定量PCRを分析した。
図32は、図32Aから図32Gを含むが、これはHSF1が、TRIM11の転写の調節に必要とされないことを実証した実験の結果を示す。図32Aは、HCT116細胞を熱ショック(42℃)を用いて又は用いずに1時間処置し、その後、様々な時間かけて回復させた実験を示す。全細胞溶解液を、示された抗体を用いてのイムノブロットにかけた。図32Bは、Flag−TRIM11を安定に発現しているHCT116細胞を、熱ショック(42℃)を用いて又は用いずに1時間処置し、その後、様々な時間かけて回復させた実験を示す。全細胞溶解液を、示された抗体を用いてのイムノブロットにかけた。図32Cは、HeLa細胞を熱ショック(42℃)を用いて又は用いずに1時間処置し、その後、様々な時間かけて回復させた実験を示す。全細胞溶解液を、示された抗体を用いてのイムノブロットにかけた。図32Dは、A549細胞をAs2O3を用いて又は用いずに30分間処置し、その後、様々な時間かけて回復させた実験を示す。全細胞溶解液を、示された抗体を用いてのイムノブロットにかけた。図32Eは、A549細胞をH2O2を用いて又は用いずに100分間処置し、その後、様々な時間かけて回復させた実験を示す。全細胞溶解液を、示された抗体を用いてのイムノブロットにかけた。図32Fは、熱ショックに応答したTRIM11、HSP70、HSP90、及びGAPDHの半定量PCR分析を示す。図32Gは、ベクター又はHSF1を安定に発現しているA549細胞を熱ショックを用いて又は用いずに処置し、そして3時間かけて回復させた実験を示す。イムノブロット及び半定量PCRを分析した。
図32は、図32Aから図32Gを含むが、これはHSF1が、TRIM11の転写の調節に必要とされないことを実証した実験の結果を示す。図32Aは、HCT116細胞を熱ショック(42℃)を用いて又は用いずに1時間処置し、その後、様々な時間かけて回復させた実験を示す。全細胞溶解液を、示された抗体を用いてのイムノブロットにかけた。図32Bは、Flag−TRIM11を安定に発現しているHCT116細胞を、熱ショック(42℃)を用いて又は用いずに1時間処置し、その後、様々な時間かけて回復させた実験を示す。全細胞溶解液を、示された抗体を用いてのイムノブロットにかけた。図32Cは、HeLa細胞を熱ショック(42℃)を用いて又は用いずに1時間処置し、その後、様々な時間かけて回復させた実験を示す。全細胞溶解液を、示された抗体を用いてのイムノブロットにかけた。図32Dは、A549細胞をAs2O3を用いて又は用いずに30分間処置し、その後、様々な時間かけて回復させた実験を示す。全細胞溶解液を、示された抗体を用いてのイムノブロットにかけた。図32Eは、A549細胞をH2O2を用いて又は用いずに100分間処置し、その後、様々な時間かけて回復させた実験を示す。全細胞溶解液を、示された抗体を用いてのイムノブロットにかけた。図32Fは、熱ショックに応答したTRIM11、HSP70、HSP90、及びGAPDHの半定量PCR分析を示す。図32Gは、ベクター又はHSF1を安定に発現しているA549細胞を熱ショックを用いて又は用いずに処置し、そして3時間かけて回復させた実験を示す。イムノブロット及び半定量PCRを分析した。
図32は、図32Aから図32Gを含むが、これはHSF1が、TRIM11の転写の調節に必要とされないことを実証した実験の結果を示す。図32Aは、HCT116細胞を熱ショック(42℃)を用いて又は用いずに1時間処置し、その後、様々な時間かけて回復させた実験を示す。全細胞溶解液を、示された抗体を用いてのイムノブロットにかけた。図32Bは、Flag−TRIM11を安定に発現しているHCT116細胞を、熱ショック(42℃)を用いて又は用いずに1時間処置し、その後、様々な時間かけて回復させた実験を示す。全細胞溶解液を、示された抗体を用いてのイムノブロットにかけた。図32Cは、HeLa細胞を熱ショック(42℃)を用いて又は用いずに1時間処置し、その後、様々な時間かけて回復させた実験を示す。全細胞溶解液を、示された抗体を用いてのイムノブロットにかけた。図32Dは、A549細胞をAs2O3を用いて又は用いずに30分間処置し、その後、様々な時間かけて回復させた実験を示す。全細胞溶解液を、示された抗体を用いてのイムノブロットにかけた。図32Eは、A549細胞をH2O2を用いて又は用いずに100分間処置し、その後、様々な時間かけて回復させた実験を示す。全細胞溶解液を、示された抗体を用いてのイムノブロットにかけた。図32Fは、熱ショックに応答したTRIM11、HSP70、HSP90、及びGAPDHの半定量PCR分析を示す。図32Gは、ベクター又はHSF1を安定に発現しているA549細胞を熱ショックを用いて又は用いずに処置し、そして3時間かけて回復させた実験を示す。イムノブロット及び半定量PCRを分析した。
図32は、図32Aから図32Gを含むが、これはHSF1が、TRIM11の転写の調節に必要とされないことを実証した実験の結果を示す。図32Aは、HCT116細胞を熱ショック(42℃)を用いて又は用いずに1時間処置し、その後、様々な時間かけて回復させた実験を示す。全細胞溶解液を、示された抗体を用いてのイムノブロットにかけた。図32Bは、Flag−TRIM11を安定に発現しているHCT116細胞を、熱ショック(42℃)を用いて又は用いずに1時間処置し、その後、様々な時間かけて回復させた実験を示す。全細胞溶解液を、示された抗体を用いてのイムノブロットにかけた。図32Cは、HeLa細胞を熱ショック(42℃)を用いて又は用いずに1時間処置し、その後、様々な時間かけて回復させた実験を示す。全細胞溶解液を、示された抗体を用いてのイムノブロットにかけた。図32Dは、A549細胞をAs2O3を用いて又は用いずに30分間処置し、その後、様々な時間かけて回復させた実験を示す。全細胞溶解液を、示された抗体を用いてのイムノブロットにかけた。図32Eは、A549細胞をH2O2を用いて又は用いずに100分間処置し、その後、様々な時間かけて回復させた実験を示す。全細胞溶解液を、示された抗体を用いてのイムノブロットにかけた。図32Fは、熱ショックに応答したTRIM11、HSP70、HSP90、及びGAPDHの半定量PCR分析を示す。図32Gは、ベクター又はHSF1を安定に発現しているA549細胞を熱ショックを用いて又は用いずに処置し、そして3時間かけて回復させた実験を示す。イムノブロット及び半定量PCRを分析した。
図32は、図32Aから図32Gを含むが、これはHSF1が、TRIM11の転写の調節に必要とされないことを実証した実験の結果を示す。図32Aは、HCT116細胞を熱ショック(42℃)を用いて又は用いずに1時間処置し、その後、様々な時間かけて回復させた実験を示す。全細胞溶解液を、示された抗体を用いてのイムノブロットにかけた。図32Bは、Flag−TRIM11を安定に発現しているHCT116細胞を、熱ショック(42℃)を用いて又は用いずに1時間処置し、その後、様々な時間かけて回復させた実験を示す。全細胞溶解液を、示された抗体を用いてのイムノブロットにかけた。図32Cは、HeLa細胞を熱ショック(42℃)を用いて又は用いずに1時間処置し、その後、様々な時間かけて回復させた実験を示す。全細胞溶解液を、示された抗体を用いてのイムノブロットにかけた。図32Dは、A549細胞をAs2O3を用いて又は用いずに30分間処置し、その後、様々な時間かけて回復させた実験を示す。全細胞溶解液を、示された抗体を用いてのイムノブロットにかけた。図32Eは、A549細胞をH2O2を用いて又は用いずに100分間処置し、その後、様々な時間かけて回復させた実験を示す。全細胞溶解液を、示された抗体を用いてのイムノブロットにかけた。図32Fは、熱ショックに応答したTRIM11、HSP70、HSP90、及びGAPDHの半定量PCR分析を示す。図32Gは、ベクター又はHSF1を安定に発現しているA549細胞を熱ショックを用いて又は用いずに処置し、そして3時間かけて回復させた実験を示す。イムノブロット及び半定量PCRを分析した。
図32は、図32Aから図32Gを含むが、これはHSF1が、TRIM11の転写の調節に必要とされないことを実証した実験の結果を示す。図32Aは、HCT116細胞を熱ショック(42℃)を用いて又は用いずに1時間処置し、その後、様々な時間かけて回復させた実験を示す。全細胞溶解液を、示された抗体を用いてのイムノブロットにかけた。図32Bは、Flag−TRIM11を安定に発現しているHCT116細胞を、熱ショック(42℃)を用いて又は用いずに1時間処置し、その後、様々な時間かけて回復させた実験を示す。全細胞溶解液を、示された抗体を用いてのイムノブロットにかけた。図32Cは、HeLa細胞を熱ショック(42℃)を用いて又は用いずに1時間処置し、その後、様々な時間かけて回復させた実験を示す。全細胞溶解液を、示された抗体を用いてのイムノブロットにかけた。図32Dは、A549細胞をAs2O3を用いて又は用いずに30分間処置し、その後、様々な時間かけて回復させた実験を示す。全細胞溶解液を、示された抗体を用いてのイムノブロットにかけた。図32Eは、A549細胞をH2O2を用いて又は用いずに100分間処置し、その後、様々な時間かけて回復させた実験を示す。全細胞溶解液を、示された抗体を用いてのイムノブロットにかけた。図32Fは、熱ショックに応答したTRIM11、HSP70、HSP90、及びGAPDHの半定量PCR分析を示す。図32Gは、ベクター又はHSF1を安定に発現しているA549細胞を熱ショックを用いて又は用いずに処置し、そして3時間かけて回復させた実験を示す。イムノブロット及び半定量PCRを分析した。
図33は、図33Aから図33Fを含むが、これはp53が熱ショック応答においてTRIM11をアップレギュレートする際の因子であることを実証した実験の結果を示す。図33Aは、熱ショックを用いて処置されそして回復させたHCT116p53野生型又はp53ヌル細胞のイムノブロットを示す。図33Bは、熱ショックを用いて処置されそして回復させたHCT116p53野生型又はp53ヌル細胞におけるTRIM11mRNAレベルのqPCR分析を示す。図33Cは、熱ショックを用いて又は用いずに処置されそして3時間かけて回復させた対照(Ctrl)又はp53shRNAを安定に発現しているA549細胞のイムノブロット及び半定量PCR分析を示す。図33Dは、熱ショックを用いて又は用いずに処置されそして3時間かけて回復させたCtrl又はp53siRNAを用いてトランスフェクトされたHCT116細胞のイムノブロット及び半定量PCR分析を示す。図33Eは、加熱されそして24時間かけて回復させたHCT116細胞の生存率のクリスタルバイオレットによる分析を示す。指示されている場合、KRIBB11を加えた。図33Fは、OD490によって分析された図33Eに提示された相対的細胞数の結果を示す。
図33は、図33Aから図33Fを含むが、これはp53が熱ショック応答においてTRIM11をアップレギュレートする際の因子であることを実証した実験の結果を示す。図33Aは、熱ショックを用いて処置されそして回復させたHCT116p53野生型又はp53ヌル細胞のイムノブロットを示す。図33Bは、熱ショックを用いて処置されそして回復させたHCT116p53野生型又はp53ヌル細胞におけるTRIM11mRNAレベルのqPCR分析を示す。図33Cは、熱ショックを用いて又は用いずに処置されそして3時間かけて回復させた対照(Ctrl)又はp53shRNAを安定に発現しているA549細胞のイムノブロット及び半定量PCR分析を示す。図33Dは、熱ショックを用いて又は用いずに処置されそして3時間かけて回復させたCtrl又はp53siRNAを用いてトランスフェクトされたHCT116細胞のイムノブロット及び半定量PCR分析を示す。図33Eは、加熱されそして24時間かけて回復させたHCT116細胞の生存率のクリスタルバイオレットによる分析を示す。指示されている場合、KRIBB11を加えた。図33Fは、OD490によって分析された図33Eに提示された相対的細胞数の結果を示す。
図33は、図33Aから図33Fを含むが、これはp53が熱ショック応答においてTRIM11をアップレギュレートする際の因子であることを実証した実験の結果を示す。図33Aは、熱ショックを用いて処置されそして回復させたHCT116p53野生型又はp53ヌル細胞のイムノブロットを示す。図33Bは、熱ショックを用いて処置されそして回復させたHCT116p53野生型又はp53ヌル細胞におけるTRIM11mRNAレベルのqPCR分析を示す。図33Cは、熱ショックを用いて又は用いずに処置されそして3時間かけて回復させた対照(Ctrl)又はp53shRNAを安定に発現しているA549細胞のイムノブロット及び半定量PCR分析を示す。図33Dは、熱ショックを用いて又は用いずに処置されそして3時間かけて回復させたCtrl又はp53siRNAを用いてトランスフェクトされたHCT116細胞のイムノブロット及び半定量PCR分析を示す。図33Eは、加熱されそして24時間かけて回復させたHCT116細胞の生存率のクリスタルバイオレットによる分析を示す。指示されている場合、KRIBB11を加えた。図33Fは、OD490によって分析された図33Eに提示された相対的細胞数の結果を示す。
図33は、図33Aから図33Fを含むが、これはp53が熱ショック応答においてTRIM11をアップレギュレートする際の因子であることを実証した実験の結果を示す。図33Aは、熱ショックを用いて処置されそして回復させたHCT116p53野生型又はp53ヌル細胞のイムノブロットを示す。図33Bは、熱ショックを用いて処置されそして回復させたHCT116p53野生型又はp53ヌル細胞におけるTRIM11mRNAレベルのqPCR分析を示す。図33Cは、熱ショックを用いて又は用いずに処置されそして3時間かけて回復させた対照(Ctrl)又はp53shRNAを安定に発現しているA549細胞のイムノブロット及び半定量PCR分析を示す。図33Dは、熱ショックを用いて又は用いずに処置されそして3時間かけて回復させたCtrl又はp53siRNAを用いてトランスフェクトされたHCT116細胞のイムノブロット及び半定量PCR分析を示す。図33Eは、加熱されそして24時間かけて回復させたHCT116細胞の生存率のクリスタルバイオレットによる分析を示す。指示されている場合、KRIBB11を加えた。図33Fは、OD490によって分析された図33Eに提示された相対的細胞数の結果を示す。
図33は、図33Aから図33Fを含むが、これはp53が熱ショック応答においてTRIM11をアップレギュレートする際の因子であることを実証した実験の結果を示す。図33Aは、熱ショックを用いて処置されそして回復させたHCT116p53野生型又はp53ヌル細胞のイムノブロットを示す。図33Bは、熱ショックを用いて処置されそして回復させたHCT116p53野生型又はp53ヌル細胞におけるTRIM11mRNAレベルのqPCR分析を示す。図33Cは、熱ショックを用いて又は用いずに処置されそして3時間かけて回復させた対照(Ctrl)又はp53shRNAを安定に発現しているA549細胞のイムノブロット及び半定量PCR分析を示す。図33Dは、熱ショックを用いて又は用いずに処置されそして3時間かけて回復させたCtrl又はp53siRNAを用いてトランスフェクトされたHCT116細胞のイムノブロット及び半定量PCR分析を示す。図33Eは、加熱されそして24時間かけて回復させたHCT116細胞の生存率のクリスタルバイオレットによる分析を示す。指示されている場合、KRIBB11を加えた。図33Fは、OD490によって分析された図33Eに提示された相対的細胞数の結果を示す。
図33は、図33Aから図33Fを含むが、これはp53が熱ショック応答においてTRIM11をアップレギュレートする際の因子であることを実証した実験の結果を示す。図33Aは、熱ショックを用いて処置されそして回復させたHCT116p53野生型又はp53ヌル細胞のイムノブロットを示す。図33Bは、熱ショックを用いて処置されそして回復させたHCT116p53野生型又はp53ヌル細胞におけるTRIM11mRNAレベルのqPCR分析を示す。図33Cは、熱ショックを用いて又は用いずに処置されそして3時間かけて回復させた対照(Ctrl)又はp53shRNAを安定に発現しているA549細胞のイムノブロット及び半定量PCR分析を示す。図33Dは、熱ショックを用いて又は用いずに処置されそして3時間かけて回復させたCtrl又はp53siRNAを用いてトランスフェクトされたHCT116細胞のイムノブロット及び半定量PCR分析を示す。図33Eは、加熱されそして24時間かけて回復させたHCT116細胞の生存率のクリスタルバイオレットによる分析を示す。指示されている場合、KRIBB11を加えた。図33Fは、OD490によって分析された図33Eに提示された相対的細胞数の結果を示す。
図34は、図34Aから図34Gを含むが、これはTRIM11が予め形成された凝集物を分離するための脱凝集剤として作用することを実証した実験の結果を示す。図34Aは、漸増濃度のリゾチーム、GST又はGST−TRIM11(n=3)を使用した、予め形成されたルシフェラーゼ凝集物の脱凝集及び再活性化を示す。図34Bは、GST又はGST−TRIM11によって分離した加熱により凝集したルシフェラーゼを示す沈降アッセイを示す。結果は、イムノブロットによって示された。図34Cは、漸増濃度のリゾチーム、GST又はGST−TRIM11(n=3)を使用した、予め形成されたGFP凝集物の脱凝集及び再活性化を示す。図34Dは、GST又はGST−TRIM11によって分離した加熱により凝集したGFPを示す沈降アッセイを示す。結果は、イムノブロットによって示された。図34Eは、予め形成されたAtxn1 82Q凝集物はリゾチーム、GST又はGST−TRIM11によって分離したことを示す沈降アッセイを示す。結果は、イムノブロットによって示された。図34Fは、1μM Hsp70及び0.5μM Hsp40によって脱凝集した予め形成されたAtxn1 82Q凝集物(左)及びp53凝集物(右)を示す沈降アッセイを示す。図34Gは、0.5μM GST、0.5μM TRIM11、1μM Hsp70、0.5μM Hsp40又は1μM Hsp104によって脱凝集した予め形成されたAtxn1 82Q凝集物、を示す沈降アッセイを示す。
図34は、図34Aから図34Gを含むが、これはTRIM11が予め形成された凝集物を分離するための脱凝集剤として作用することを実証した実験の結果を示す。図34Aは、漸増濃度のリゾチーム、GST又はGST−TRIM11(n=3)を使用した、予め形成されたルシフェラーゼ凝集物の脱凝集及び再活性化を示す。図34Bは、GST又はGST−TRIM11によって分離した加熱により凝集したルシフェラーゼを示す沈降アッセイを示す。結果は、イムノブロットによって示された。図34Cは、漸増濃度のリゾチーム、GST又はGST−TRIM11(n=3)を使用した、予め形成されたGFP凝集物の脱凝集及び再活性化を示す。図34Dは、GST又はGST−TRIM11によって分離した加熱により凝集したGFPを示す沈降アッセイを示す。結果は、イムノブロットによって示された。図34Eは、予め形成されたAtxn1 82Q凝集物はリゾチーム、GST又はGST−TRIM11によって分離したことを示す沈降アッセイを示す。結果は、イムノブロットによって示された。図34Fは、1μM Hsp70及び0.5μM Hsp40によって脱凝集した予め形成されたAtxn1 82Q凝集物(左)及びp53凝集物(右)を示す沈降アッセイを示す。図34Gは、0.5μM GST、0.5μM TRIM11、1μM Hsp70、0.5μM Hsp40又は1μM Hsp104によって脱凝集した予め形成されたAtxn1 82Q凝集物、を示す沈降アッセイを示す。
図34は、図34Aから図34Gを含むが、これはTRIM11が予め形成された凝集物を分離するための脱凝集剤として作用することを実証した実験の結果を示す。図34Aは、漸増濃度のリゾチーム、GST又はGST−TRIM11(n=3)を使用した、予め形成されたルシフェラーゼ凝集物の脱凝集及び再活性化を示す。図34Bは、GST又はGST−TRIM11によって分離した加熱により凝集したルシフェラーゼを示す沈降アッセイを示す。結果は、イムノブロットによって示された。図34Cは、漸増濃度のリゾチーム、GST又はGST−TRIM11(n=3)を使用した、予め形成されたGFP凝集物の脱凝集及び再活性化を示す。図34Dは、GST又はGST−TRIM11によって分離した加熱により凝集したGFPを示す沈降アッセイを示す。結果は、イムノブロットによって示された。図34Eは、予め形成されたAtxn1 82Q凝集物はリゾチーム、GST又はGST−TRIM11によって分離したことを示す沈降アッセイを示す。結果は、イムノブロットによって示された。図34Fは、1μM Hsp70及び0.5μM Hsp40によって脱凝集した予め形成されたAtxn1 82Q凝集物(左)及びp53凝集物(右)を示す沈降アッセイを示す。図34Gは、0.5μM GST、0.5μM TRIM11、1μM Hsp70、0.5μM Hsp40又は1μM Hsp104によって脱凝集した予め形成されたAtxn1 82Q凝集物、を示す沈降アッセイを示す。
図34は、図34Aから図34Gを含むが、これはTRIM11が予め形成された凝集物を分離するための脱凝集剤として作用することを実証した実験の結果を示す。図34Aは、漸増濃度のリゾチーム、GST又はGST−TRIM11(n=3)を使用した、予め形成されたルシフェラーゼ凝集物の脱凝集及び再活性化を示す。図34Bは、GST又はGST−TRIM11によって分離した加熱により凝集したルシフェラーゼを示す沈降アッセイを示す。結果は、イムノブロットによって示された。図34Cは、漸増濃度のリゾチーム、GST又はGST−TRIM11(n=3)を使用した、予め形成されたGFP凝集物の脱凝集及び再活性化を示す。図34Dは、GST又はGST−TRIM11によって分離した加熱により凝集したGFPを示す沈降アッセイを示す。結果は、イムノブロットによって示された。図34Eは、予め形成されたAtxn1 82Q凝集物はリゾチーム、GST又はGST−TRIM11によって分離したことを示す沈降アッセイを示す。結果は、イムノブロットによって示された。図34Fは、1μM Hsp70及び0.5μM Hsp40によって脱凝集した予め形成されたAtxn1 82Q凝集物(左)及びp53凝集物(右)を示す沈降アッセイを示す。図34Gは、0.5μM GST、0.5μM TRIM11、1μM Hsp70、0.5μM Hsp40又は1μM Hsp104によって脱凝集した予め形成されたAtxn1 82Q凝集物、を示す沈降アッセイを示す。
図34は、図34Aから図34Gを含むが、これはTRIM11が予め形成された凝集物を分離するための脱凝集剤として作用することを実証した実験の結果を示す。図34Aは、漸増濃度のリゾチーム、GST又はGST−TRIM11(n=3)を使用した、予め形成されたルシフェラーゼ凝集物の脱凝集及び再活性化を示す。図34Bは、GST又はGST−TRIM11によって分離した加熱により凝集したルシフェラーゼを示す沈降アッセイを示す。結果は、イムノブロットによって示された。図34Cは、漸増濃度のリゾチーム、GST又はGST−TRIM11(n=3)を使用した、予め形成されたGFP凝集物の脱凝集及び再活性化を示す。図34Dは、GST又はGST−TRIM11によって分離した加熱により凝集したGFPを示す沈降アッセイを示す。結果は、イムノブロットによって示された。図34Eは、予め形成されたAtxn1 82Q凝集物はリゾチーム、GST又はGST−TRIM11によって分離したことを示す沈降アッセイを示す。結果は、イムノブロットによって示された。図34Fは、1μM Hsp70及び0.5μM Hsp40によって脱凝集した予め形成されたAtxn1 82Q凝集物(左)及びp53凝集物(右)を示す沈降アッセイを示す。図34Gは、0.5μM GST、0.5μM TRIM11、1μM Hsp70、0.5μM Hsp40又は1μM Hsp104によって脱凝集した予め形成されたAtxn1 82Q凝集物、を示す沈降アッセイを示す。
図34は、図34Aから図34Gを含むが、これはTRIM11が予め形成された凝集物を分離するための脱凝集剤として作用することを実証した実験の結果を示す。図34Aは、漸増濃度のリゾチーム、GST又はGST−TRIM11(n=3)を使用した、予め形成されたルシフェラーゼ凝集物の脱凝集及び再活性化を示す。図34Bは、GST又はGST−TRIM11によって分離した加熱により凝集したルシフェラーゼを示す沈降アッセイを示す。結果は、イムノブロットによって示された。図34Cは、漸増濃度のリゾチーム、GST又はGST−TRIM11(n=3)を使用した、予め形成されたGFP凝集物の脱凝集及び再活性化を示す。図34Dは、GST又はGST−TRIM11によって分離した加熱により凝集したGFPを示す沈降アッセイを示す。結果は、イムノブロットによって示された。図34Eは、予め形成されたAtxn1 82Q凝集物はリゾチーム、GST又はGST−TRIM11によって分離したことを示す沈降アッセイを示す。結果は、イムノブロットによって示された。図34Fは、1μM Hsp70及び0.5μM Hsp40によって脱凝集した予め形成されたAtxn1 82Q凝集物(左)及びp53凝集物(右)を示す沈降アッセイを示す。図34Gは、0.5μM GST、0.5μM TRIM11、1μM Hsp70、0.5μM Hsp40又は1μM Hsp104によって脱凝集した予め形成されたAtxn1 82Q凝集物、を示す沈降アッセイを示す。
図34は、図34Aから図34Gを含むが、これはTRIM11が予め形成された凝集物を分離するための脱凝集剤として作用することを実証した実験の結果を示す。図34Aは、漸増濃度のリゾチーム、GST又はGST−TRIM11(n=3)を使用した、予め形成されたルシフェラーゼ凝集物の脱凝集及び再活性化を示す。図34Bは、GST又はGST−TRIM11によって分離した加熱により凝集したルシフェラーゼを示す沈降アッセイを示す。結果は、イムノブロットによって示された。図34Cは、漸増濃度のリゾチーム、GST又はGST−TRIM11(n=3)を使用した、予め形成されたGFP凝集物の脱凝集及び再活性化を示す。図34Dは、GST又はGST−TRIM11によって分離した加熱により凝集したGFPを示す沈降アッセイを示す。結果は、イムノブロットによって示された。図34Eは、予め形成されたAtxn1 82Q凝集物はリゾチーム、GST又はGST−TRIM11によって分離したことを示す沈降アッセイを示す。結果は、イムノブロットによって示された。図34Fは、1μM Hsp70及び0.5μM Hsp40によって脱凝集した予め形成されたAtxn1 82Q凝集物(左)及びp53凝集物(右)を示す沈降アッセイを示す。図34Gは、0.5μM GST、0.5μM TRIM11、1μM Hsp70、0.5μM Hsp40又は1μM Hsp104によって脱凝集した予め形成されたAtxn1 82Q凝集物、を示す沈降アッセイを示す。
図35は、図35Aから図35Dを含むが、これは完全長TRIM11がリフォールディング活性に必要とされることを実証した実験の結果を示す。図35Aは、TRIM11構造の図解を示す。図35Bは、漸増濃度の示されたタンパク質(n=3)を使用した、予め形成されたルシフェラーゼ凝集物の脱凝集及び再活性化を示す。図35Cは、GST、TRIM11、RBC、又はB30.2によって脱凝集した加熱されたルシフェラーゼ凝集物を示した沈降アッセイを示す。図35Dは、示されたタンパク質(n=3)を使用した、予め形成されたルシフェラーゼ凝集物の脱凝集及び再活性化を示す。
図35は、図35Aから図35Dを含むが、これは完全長TRIM11がリフォールディング活性に必要とされることを実証した実験の結果を示す。図35Aは、TRIM11構造の図解を示す。図35Bは、漸増濃度の示されたタンパク質(n=3)を使用した、予め形成されたルシフェラーゼ凝集物の脱凝集及び再活性化を示す。図35Cは、GST、TRIM11、RBC、又はB30.2によって脱凝集した加熱されたルシフェラーゼ凝集物を示した沈降アッセイを示す。図35Dは、示されたタンパク質(n=3)を使用した、予め形成されたルシフェラーゼ凝集物の脱凝集及び再活性化を示す。
図35は、図35Aから図35Dを含むが、これは完全長TRIM11がリフォールディング活性に必要とされることを実証した実験の結果を示す。図35Aは、TRIM11構造の図解を示す。図35Bは、漸増濃度の示されたタンパク質(n=3)を使用した、予め形成されたルシフェラーゼ凝集物の脱凝集及び再活性化を示す。図35Cは、GST、TRIM11、RBC、又はB30.2によって脱凝集した加熱されたルシフェラーゼ凝集物を示した沈降アッセイを示す。図35Dは、示されたタンパク質(n=3)を使用した、予め形成されたルシフェラーゼ凝集物の脱凝集及び再活性化を示す。
図35は、図35Aから図35Dを含むが、これは完全長TRIM11がリフォールディング活性に必要とされることを実証した実験の結果を示す。図35Aは、TRIM11構造の図解を示す。図35Bは、漸増濃度の示されたタンパク質(n=3)を使用した、予め形成されたルシフェラーゼ凝集物の脱凝集及び再活性化を示す。図35Cは、GST、TRIM11、RBC、又はB30.2によって脱凝集した加熱されたルシフェラーゼ凝集物を示した沈降アッセイを示す。図35Dは、示されたタンパク質(n=3)を使用した、予め形成されたルシフェラーゼ凝集物の脱凝集及び再活性化を示す。
図36は、図36Aから図36Bを含むが、これは基質へのTRIM11の結合が、TRIM11の脱凝集機能にとって必要とされることを実証した実験の結果を示す。図36Aは、ビーズ上に固定された精製されたFlag−Atxn1 82Qを、GST、GST−TRIM11、GST−RBC、又はGST−B30.2と共にインキュベートしたことを示す。図36Bは、ビーズ上に固定された精製されたFlag−Atxn1 82Qを、GST、GST−TRIM11又は他のTRIM11断片と共にインキュベートしたことを示す。
図36は、図36Aから図36Bを含むが、これは基質へのTRIM11の結合が、TRIM11の脱凝集機能にとって必要とされることを実証した実験の結果を示す。図36Aは、ビーズ上に固定された精製されたFlag−Atxn1 82Qを、GST、GST−TRIM11、GST−RBC、又はGST−B30.2と共にインキュベートしたことを示す。図36Bは、ビーズ上に固定された精製されたFlag−Atxn1 82Qを、GST、GST−TRIM11又は他のTRIM11断片と共にインキュベートしたことを示す。
図37は、図37Aから図37Eを含むが、これはTRIM11が、そのSUMO E3リガーゼ活性とは独立して脱凝集を遂行することを実証した実験の結果を示す。図37Aは、ルシフェラーゼ(10nM)を、200nM GST、200nM GST−TRIM11 WT又はMUTと共に45℃で指定された時間インキュベートした実験を示す。天然ルシフェラーゼ活性は100%に設定された。N=3。図37Bは、200nM GST、200nM GST−TRIM11 WT又はMUTによる、予め形成されたルシフェラーゼ凝集物の脱凝集及び再活性化を示す。図37Cは、Ni−NTAビーズ上に固定された天然(N)及び尿素変性(D)ルシフェラーゼ(luc)に対する、GST、GST−TRIM11 WT又はMUTの結合を示す。図37Dは、293T細胞におけるトランスフェクトされたGFP−TRIM11 MUTの免疫蛍光分析を示す。図37Eは、TRIM11 MUTはAtxn1 82Qの凝集物に補充され得ることを示す免疫蛍光分析を示す。
図37は、図37Aから図37Eを含むが、これはTRIM11が、そのSUMO E3リガーゼ活性とは独立して脱凝集を遂行することを実証した実験の結果を示す。図37Aは、ルシフェラーゼ(10nM)を、200nM GST、200nM GST−TRIM11 WT又はMUTと共に45℃で指定された時間インキュベートした実験を示す。天然ルシフェラーゼ活性は100%に設定された。N=3。図37Bは、200nM GST、200nM GST−TRIM11 WT又はMUTによる、予め形成されたルシフェラーゼ凝集物の脱凝集及び再活性化を示す。図37Cは、Ni−NTAビーズ上に固定された天然(N)及び尿素変性(D)ルシフェラーゼ(luc)に対する、GST、GST−TRIM11 WT又はMUTの結合を示す。図37Dは、293T細胞におけるトランスフェクトされたGFP−TRIM11 MUTの免疫蛍光分析を示す。図37Eは、TRIM11 MUTはAtxn1 82Qの凝集物に補充され得ることを示す免疫蛍光分析を示す。
図37は、図37Aから図37Eを含むが、これはTRIM11が、そのSUMO E3リガーゼ活性とは独立して脱凝集を遂行することを実証した実験の結果を示す。図37Aは、ルシフェラーゼ(10nM)を、200nM GST、200nM GST−TRIM11 WT又はMUTと共に45℃で指定された時間インキュベートした実験を示す。天然ルシフェラーゼ活性は100%に設定された。N=3。図37Bは、200nM GST、200nM GST−TRIM11 WT又はMUTによる、予め形成されたルシフェラーゼ凝集物の脱凝集及び再活性化を示す。図37Cは、Ni−NTAビーズ上に固定された天然(N)及び尿素変性(D)ルシフェラーゼ(luc)に対する、GST、GST−TRIM11 WT又はMUTの結合を示す。図37Dは、293T細胞におけるトランスフェクトされたGFP−TRIM11 MUTの免疫蛍光分析を示す。図37Eは、TRIM11 MUTはAtxn1 82Qの凝集物に補充され得ることを示す免疫蛍光分析を示す。
図37は、図37Aから図37Eを含むが、これはTRIM11が、そのSUMO E3リガーゼ活性とは独立して脱凝集を遂行することを実証した実験の結果を示す。図37Aは、ルシフェラーゼ(10nM)を、200nM GST、200nM GST−TRIM11 WT又はMUTと共に45℃で指定された時間インキュベートした実験を示す。天然ルシフェラーゼ活性は100%に設定された。N=3。図37Bは、200nM GST、200nM GST−TRIM11 WT又はMUTによる、予め形成されたルシフェラーゼ凝集物の脱凝集及び再活性化を示す。図37Cは、Ni−NTAビーズ上に固定された天然(N)及び尿素変性(D)ルシフェラーゼ(luc)に対する、GST、GST−TRIM11 WT又はMUTの結合を示す。図37Dは、293T細胞におけるトランスフェクトされたGFP−TRIM11 MUTの免疫蛍光分析を示す。図37Eは、TRIM11 MUTはAtxn1 82Qの凝集物に補充され得ることを示す免疫蛍光分析を示す。
図37は、図37Aから図37Eを含むが、これはTRIM11が、そのSUMO E3リガーゼ活性とは独立して脱凝集を遂行することを実証した実験の結果を示す。図37Aは、ルシフェラーゼ(10nM)を、200nM GST、200nM GST−TRIM11 WT又はMUTと共に45℃で指定された時間インキュベートした実験を示す。天然ルシフェラーゼ活性は100%に設定された。N=3。図37Bは、200nM GST、200nM GST−TRIM11 WT又はMUTによる、予め形成されたルシフェラーゼ凝集物の脱凝集及び再活性化を示す。図37Cは、Ni−NTAビーズ上に固定された天然(N)及び尿素変性(D)ルシフェラーゼ(luc)に対する、GST、GST−TRIM11 WT又はMUTの結合を示す。図37Dは、293T細胞におけるトランスフェクトされたGFP−TRIM11 MUTの免疫蛍光分析を示す。図37Eは、TRIM11 MUTはAtxn1 82Qの凝集物に補充され得ることを示す免疫蛍光分析を示す。
図38は、図38Aから図38Eを含むが、これはTRIM11はα−シヌクレインアミロイド線維形成を予め形成することができかつ予め形成されたα−シヌクレイン線維を脱凝集することもできることを実証した実験の結果を示す。図38Aは、GST、TRIM11、Hsp70、Hsp40、又はHsp104によるα−Syn線維形成の防止を示したThT分析を示す。図38Bは、TRIM11による用量依存的なα−Syn線維形成の防止を示したThT分析を示す。図38Cは、GST又はGST−TRIM11と共にインキュベートしたα−Syn単量体の線維形成のEM画像を示す。図38Dは、TRIM11及びHsp104 A503Sによって脱凝集した予め形成されたα−Syn線維を示した沈降アッセイを示す。図38Eは、GST、TRIM11、又はHsp104による予め形成されたα−Syn線維の脱凝集を示したThT分析を示す。
図38は、図38Aから図38Eを含むが、これはTRIM11はα−シヌクレインアミロイド線維形成を予め形成することができかつ予め形成されたα−シヌクレイン線維を脱凝集することもできることを実証した実験の結果を示す。図38Aは、GST、TRIM11、Hsp70、Hsp40、又はHsp104によるα−Syn線維形成の防止を示したThT分析を示す。図38Bは、TRIM11による用量依存的なα−Syn線維形成の防止を示したThT分析を示す。図38Cは、GST又はGST−TRIM11と共にインキュベートしたα−Syn単量体の線維形成のEM画像を示す。図38Dは、TRIM11及びHsp104 A503Sによって脱凝集した予め形成されたα−Syn線維を示した沈降アッセイを示す。図38Eは、GST、TRIM11、又はHsp104による予め形成されたα−Syn線維の脱凝集を示したThT分析を示す。
図38は、図38Aから図38Eを含むが、これはTRIM11はα−シヌクレインアミロイド線維形成を予め形成することができかつ予め形成されたα−シヌクレイン線維を脱凝集することもできることを実証した実験の結果を示す。図38Aは、GST、TRIM11、Hsp70、Hsp40、又はHsp104によるα−Syn線維形成の防止を示したThT分析を示す。図38Bは、TRIM11による用量依存的なα−Syn線維形成の防止を示したThT分析を示す。図38Cは、GST又はGST−TRIM11と共にインキュベートしたα−Syn単量体の線維形成のEM画像を示す。図38Dは、TRIM11及びHsp104 A503Sによって脱凝集した予め形成されたα−Syn線維を示した沈降アッセイを示す。図38Eは、GST、TRIM11、又はHsp104による予め形成されたα−Syn線維の脱凝集を示したThT分析を示す。
図38は、図38Aから図38Eを含むが、これはTRIM11はα−シヌクレインアミロイド線維形成を予め形成することができかつ予め形成されたα−シヌクレイン線維を脱凝集することもできることを実証した実験の結果を示す。図38Aは、GST、TRIM11、Hsp70、Hsp40、又はHsp104によるα−Syn線維形成の防止を示したThT分析を示す。図38Bは、TRIM11による用量依存的なα−Syn線維形成の防止を示したThT分析を示す。図38Cは、GST又はGST−TRIM11と共にインキュベートしたα−Syn単量体の線維形成のEM画像を示す。図38Dは、TRIM11及びHsp104 A503Sによって脱凝集した予め形成されたα−Syn線維を示した沈降アッセイを示す。図38Eは、GST、TRIM11、又はHsp104による予め形成されたα−Syn線維の脱凝集を示したThT分析を示す。
図38は、図38Aから図38Eを含むが、これはTRIM11はα−シヌクレインアミロイド線維形成を予め形成することができかつ予め形成されたα−シヌクレイン線維を脱凝集することもできることを実証した実験の結果を示す。図38Aは、GST、TRIM11、Hsp70、Hsp40、又はHsp104によるα−Syn線維形成の防止を示したThT分析を示す。図38Bは、TRIM11による用量依存的なα−Syn線維形成の防止を示したThT分析を示す。図38Cは、GST又はGST−TRIM11と共にインキュベートしたα−Syn単量体の線維形成のEM画像を示す。図38Dは、TRIM11及びHsp104 A503Sによって脱凝集した予め形成されたα−Syn線維を示した沈降アッセイを示す。図38Eは、GST、TRIM11、又はHsp104による予め形成されたα−Syn線維の脱凝集を示したThT分析を示す。
図39は、図39Aから図39Dを含むが、これはTRIM21がTRIM11と類似した脱凝集機能を有することを実証した実験の結果を示す。図39Aは、Ni−NTAビーズ上に固定された天然(N)及び尿素変性(D)ルシフェラーゼ(luc)に対する、GST、GST−TRIM11 WT又はMUTの結合を示す。図39Bは、GST又はGST−TRIM21によって分離した加熱により凝集したルシフェラーゼを示した沈降アッセイを示す。図39Cは、漸増濃度のGST又はGST−TRIM21(n=3)を使用した、予め形成されたルシフェラーゼ凝集物の脱凝集及び再活性化を示す。図39Dは、ルシフェラーゼ(10nM)を200nM GST又は200nM GST−TRIM21と共に45℃で1分間インキュベートしたルシフェラーゼアッセイを示す。天然ルシフェラーゼアッセイは100%に設定された。N=3。
図39は、図39Aから図39Dを含むが、これはTRIM21がTRIM11と類似した脱凝集機能を有することを実証した実験の結果を示す。図39Aは、Ni−NTAビーズ上に固定された天然(N)及び尿素変性(D)ルシフェラーゼ(luc)に対する、GST、GST−TRIM11 WT又はMUTの結合を示す。図39Bは、GST又はGST−TRIM21によって分離した加熱により凝集したルシフェラーゼを示した沈降アッセイを示す。図39Cは、漸増濃度のGST又はGST−TRIM21(n=3)を使用した、予め形成されたルシフェラーゼ凝集物の脱凝集及び再活性化を示す。図39Dは、ルシフェラーゼ(10nM)を200nM GST又は200nM GST−TRIM21と共に45℃で1分間インキュベートしたルシフェラーゼアッセイを示す。天然ルシフェラーゼアッセイは100%に設定された。N=3。
図39は、図39Aから図39Dを含むが、これはTRIM21がTRIM11と類似した脱凝集機能を有することを実証した実験の結果を示す。図39Aは、Ni−NTAビーズ上に固定された天然(N)及び尿素変性(D)ルシフェラーゼ(luc)に対する、GST、GST−TRIM11 WT又はMUTの結合を示す。図39Bは、GST又はGST−TRIM21によって分離した加熱により凝集したルシフェラーゼを示した沈降アッセイを示す。図39Cは、漸増濃度のGST又はGST−TRIM21(n=3)を使用した、予め形成されたルシフェラーゼ凝集物の脱凝集及び再活性化を示す。図39Dは、ルシフェラーゼ(10nM)を200nM GST又は200nM GST−TRIM21と共に45℃で1分間インキュベートしたルシフェラーゼアッセイを示す。天然ルシフェラーゼアッセイは100%に設定された。N=3。
図39は、図39Aから図39Dを含むが、これはTRIM21がTRIM11と類似した脱凝集機能を有することを実証した実験の結果を示す。図39Aは、Ni−NTAビーズ上に固定された天然(N)及び尿素変性(D)ルシフェラーゼ(luc)に対する、GST、GST−TRIM11 WT又はMUTの結合を示す。図39Bは、GST又はGST−TRIM21によって分離した加熱により凝集したルシフェラーゼを示した沈降アッセイを示す。図39Cは、漸増濃度のGST又はGST−TRIM21(n=3)を使用した、予め形成されたルシフェラーゼ凝集物の脱凝集及び再活性化を示す。図39Dは、ルシフェラーゼ(10nM)を200nM GST又は200nM GST−TRIM21と共に45℃で1分間インキュベートしたルシフェラーゼアッセイを示す。天然ルシフェラーゼアッセイは100%に設定された。N=3。
図40は、図40Aから図40Eを含むが、これはPML及びAtxn1 82Qの脱凝集を実証した実験の結果を示す。図40Aは、293T細胞由来の精製されたFlag−PML6のクーマシーブルー染色を示す。図40Bは、漸増濃度のリゾチーム又はFlag−PML6(n=3)を使用した、予め形成されたGFP凝集物の脱凝集及び再活性化を示す。図40Cは、リゾチーム、Flag−PML6又はGST−TRIM11(n=3)を使用した、予め形成されたGFP凝集物の脱凝集及び再活性化を示す。図40Dは、293T細胞由来の精製されたFlag−PML4断片のクーマシーブルー染色を示す。図40Eは、様々なPML4断片(n=3)を使用した、予め形成されたGFP凝集物の脱凝集及び再活性化を示す。
図40は、図40Aから図40Eを含むが、これはPML及びAtxn1 82Qの脱凝集を実証した実験の結果を示す。図40Aは、293T細胞由来の精製されたFlag−PML6のクーマシーブルー染色を示す。図40Bは、漸増濃度のリゾチーム又はFlag−PML6(n=3)を使用した、予め形成されたGFP凝集物の脱凝集及び再活性化を示す。図40Cは、リゾチーム、Flag−PML6又はGST−TRIM11(n=3)を使用した、予め形成されたGFP凝集物の脱凝集及び再活性化を示す。図40Dは、293T細胞由来の精製されたFlag−PML4断片のクーマシーブルー染色を示す。図40Eは、様々なPML4断片(n=3)を使用した、予め形成されたGFP凝集物の脱凝集及び再活性化を示す。
図40は、図40Aから図40Eを含むが、これはPML及びAtxn1 82Qの脱凝集を実証した実験の結果を示す。図40Aは、293T細胞由来の精製されたFlag−PML6のクーマシーブルー染色を示す。図40Bは、漸増濃度のリゾチーム又はFlag−PML6(n=3)を使用した、予め形成されたGFP凝集物の脱凝集及び再活性化を示す。図40Cは、リゾチーム、Flag−PML6又はGST−TRIM11(n=3)を使用した、予め形成されたGFP凝集物の脱凝集及び再活性化を示す。図40Dは、293T細胞由来の精製されたFlag−PML4断片のクーマシーブルー染色を示す。図40Eは、様々なPML4断片(n=3)を使用した、予め形成されたGFP凝集物の脱凝集及び再活性化を示す。
図40は、図40Aから図40Eを含むが、これはPML及びAtxn1 82Qの脱凝集を実証した実験の結果を示す。図40Aは、293T細胞由来の精製されたFlag−PML6のクーマシーブルー染色を示す。図40Bは、漸増濃度のリゾチーム又はFlag−PML6(n=3)を使用した、予め形成されたGFP凝集物の脱凝集及び再活性化を示す。図40Cは、リゾチーム、Flag−PML6又はGST−TRIM11(n=3)を使用した、予め形成されたGFP凝集物の脱凝集及び再活性化を示す。図40Dは、293T細胞由来の精製されたFlag−PML4断片のクーマシーブルー染色を示す。図40Eは、様々なPML4断片(n=3)を使用した、予め形成されたGFP凝集物の脱凝集及び再活性化を示す。
図40は、図40Aから図40Eを含むが、これはPML及びAtxn1 82Qの脱凝集を実証した実験の結果を示す。図40Aは、293T細胞由来の精製されたFlag−PML6のクーマシーブルー染色を示す。図40Bは、漸増濃度のリゾチーム又はFlag−PML6(n=3)を使用した、予め形成されたGFP凝集物の脱凝集及び再活性化を示す。図40Cは、リゾチーム、Flag−PML6又はGST−TRIM11(n=3)を使用した、予め形成されたGFP凝集物の脱凝集及び再活性化を示す。図40Dは、293T細胞由来の精製されたFlag−PML4断片のクーマシーブルー染色を示す。図40Eは、様々なPML4断片(n=3)を使用した、予め形成されたGFP凝集物の脱凝集及び再活性化を示す。
図41は、図41Aから図41Bを含むが、これはマウス一次海馬神経細胞におけるTRIM11を実証した実験の結果を示す。図41Aは、GST又はTRIM11が、α−Synにより誘発された細胞死をインキュベートしたことを示すMTT分析を示す。図41Bは、α−Syn線維により処置された海馬神経細胞におけるp−α−Syn又はp62の免疫蛍光分析を示す。
図41は、図41Aから図41Bを含むが、これはマウス一次海馬神経細胞におけるTRIM11を実証した実験の結果を示す。図41Aは、GST又はTRIM11が、α−Synにより誘発された細胞死をインキュベートしたことを示すMTT分析を示す。図41Bは、α−Syn線維により処置された海馬神経細胞におけるp−α−Syn又はp62の免疫蛍光分析を示す。
図42は、図42Aから図42Cを含むが、これはTRIM11が、皮質神経細胞及び海馬神経細胞において熱ショックに応答してアップレギュレートされることを実証した実験の結果を示す。図42Aは、42℃の熱ショックを用いて30分間処置されそして3時間かけて回復させたマウス一次皮質神経細胞のイムノブロットを示す。図42Bは、42℃の熱ショックを用いて30分間処置されそして3時間かけて回復させたマウス一次海馬神経細胞のイムノブロットを示す。図42Cは、海馬神経細胞における熱ショックに応答した、TRIM11、HSP70、HSP90、及びGAPDHの半定量PCR分析を示す。
図42は、図42Aから図42Cを含むが、これはTRIM11が、皮質神経細胞及び海馬神経細胞において熱ショックに応答してアップレギュレートされることを実証した実験の結果を示す。図42Aは、42℃の熱ショックを用いて30分間処置されそして3時間かけて回復させたマウス一次皮質神経細胞のイムノブロットを示す。図42Bは、42℃の熱ショックを用いて30分間処置されそして3時間かけて回復させたマウス一次海馬神経細胞のイムノブロットを示す。図42Cは、海馬神経細胞における熱ショックに応答した、TRIM11、HSP70、HSP90、及びGAPDHの半定量PCR分析を示す。
図42は、図42Aから図42Cを含むが、これはTRIM11が、皮質神経細胞及び海馬神経細胞において熱ショックに応答してアップレギュレートされることを実証した実験の結果を示す。図42Aは、42℃の熱ショックを用いて30分間処置されそして3時間かけて回復させたマウス一次皮質神経細胞のイムノブロットを示す。図42Bは、42℃の熱ショックを用いて30分間処置されそして3時間かけて回復させたマウス一次海馬神経細胞のイムノブロットを示す。図42Cは、海馬神経細胞における熱ショックに応答した、TRIM11、HSP70、HSP90、及びGAPDHの半定量PCR分析を示す。
詳細な説明
本発明は、様々な神経変性障害の病態において役割を果たしているミスフォールドタンパク質の認識及び分解における、トリパータイトモチーフ(TRIM)タンパク質ファミリーメンバー及びSUMO依存性ユビキチンリガーゼRNF4の役割の発見に関する。
1つの態様では、本発明は、ミスフォールドタンパク質又はタンパク質凝集物に関連した疾患又は障害を治療又は予防するための組成物及び方法を提供する。TRIMタンパク質は、シャペロンタンパク質として、プロテアソームによる分解のためにミスフォールドタンパク質を標的化する際に、及びタンパク質凝集物又は封入体を脱凝集する際に役割を果たすことが本明細書において実証されている。したがって、特定の態様では、本発明を使用して、細胞内又は細胞外ミスフォールドタンパク質、タンパク質凝集物、又はタンパク質封入体を排除することができる。
例えば、特定の実施態様では、本発明は、必要とする被験者における神経変性障害を治療又は予防するための組成物及び方法を提供する。例えば、特定の実施態様では、本発明は、ポリ−グルタミン(ポリQ)障害(CAGコドン反復配列が、ミスフォールドタンパク質凝集物をもたらす可能性のあるポリグルタミン鎖を有するタンパク質をコードしている)である神経変性障害の治療又は予防のための組成物及び方法を提供する。例示的なポリQ障害としては、脊髄小脳失調症(SCA)1型(SCA1)、SCA2、SCA3、SCA6、SCA7、SCA17、ハンチントン病、及び歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症(DRPLA)が挙げられるがこれらに限定されない。特定の実施態様では、本発明は、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症(ALS)、伝染性海綿状脳症(プリオン病)、タウオパチー、及び前頭側頭葉変性症(FTLD)を含むがこれらに限定されない、ミスフォールドタンパク質又はタンパク質凝集物に関連した神経変性障害の処置のための組成物及び方法を提供する。しかしながら、本発明は、神経変性障害の治療又は予防に限定されない。むしろ、本発明は、ミスフォールドタンパク質又はタンパク質凝集物に関連したあらゆる疾患又は障害の治療又は予防を包含する。他のこのような疾患及び障害としては、ALアミロイド症、AAアミロイド症、家族性地中海熱、老人性全身性アミロイド症、家族性アミロイド性多発神経炎、血液透析に関連したアミロイド症、アポリポタンパク質AIアミロイド症、アポリポタンパク質AIIアミロイド症、アポリポタンパク質AIVアミロイド症、フィンランド型遺伝性アミロイド症、リゾチームアミロイド症、フィブリノーゲンアミロイド症、アイスランド型遺伝性脳アミロイド血管症、II型糖尿病、甲状腺髄様癌、心房アミロイド症、アミロイド症を伴う遺伝性脳出血、下垂体プロラクチノーマ、注射部位に限局したアミロイド症、大動脈中膜アミロイド症、遺伝性格子状角膜ジストロフィー、睫毛乱生に関連した角膜アミロイド症、白内障、石灰化上皮性歯原性腫瘍、肺胞蛋白症、封入体筋炎、及び皮膚苔癬アミロイド症が挙げられるがこれらに限定されない。特定の実施態様では、本発明は、膀胱癌、星状細胞腫、咽頭癌、リンパ腫、及び腺癌を含むがこれらに限定されない、p53突然変異体の凝集物に関連した癌の治療又は予防を包含する。
1つの態様では、本発明は、ミスフォールドタンパク質を安定化させるための1つ以上のTRIMタンパク質の使用を包含する。特定の態様では、本明細書に記載の1つ以上のTRIMタンパク質を介した機能的なミスフォールドタンパク質の安定化は、ミスフォールドタンパク質に関連した疾患又は障害を治療又は予防することができる。例えば、1つの実施態様では、本明細書に記載の1つ以上のTRIMタンパク質を介した、嚢胞性線維症膜貫通コンダクタンス調節因子(CFTR)突然変異体の安定化により、突然変異CFTRは、分解される代わりに機能することが可能となるだろう。ミスフォールドタンパク質を安定化させるためのTRIMタンパク質の使用は、部分的に機能的なタンパク質の分解に関連した嚢胞性線維症及び他の疾患を処置するために使用され得ることが想定される。本明細書に記載の1つ以上のTRIMタンパク質を介した、タンパク質の安定化を使用して、嚢胞性線維症及びリソソーム蓄積病、例えばゴーシェ病及びファブリー病を含むがこれらに限定されない、機能的な突然変異タンパク質の分解に関連したあらゆる疾患又は障害を処置することができる。
1つの態様では、本発明は、TRIMタンパク質の発現、活性、又はその両方を増加させるための組成物及び方法を提供する。特定の実施態様では、該組成物は、1つ以上のTRIMタンパク質の発現、活性、又はその両方を増加させる、核酸分子、発現ベクター、タンパク質、ペプチド、低分子などを含む。
1つの態様では、本発明は、1つ以上のSUMO標的化ユビキチンリガーゼ(STUbL)の発現、活性、又はその両方を増加させるための組成物及び方法を提供する。特定の実施態様では、該組成物は、1つ以上のSTUbLの発現、活性、又はその両方を増加させる、核酸分子、発現ベクター、タンパク質、ペプチド、低分子などを含む。
定義
特記しない限り、本明細書において使用する全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の専門家によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載のものと類似した又は等価な任意の方法及び材料を本発明の実施又は試験に使用することができるが、好ましい方法及び材料が記載されている。
本明細書において使用する以下の各用語は、この章内の用語に関連した意味を有する。
「1つの(a)」及び「1つの(an)」という冠詞は、本明細書において1つの又は1つを超える(すなわち少なくとも1つの)文法上の冠詞の目的語を指すために使用される。例えば、「1つの要素」は、1つの要素又は1つを超える要素を意味する。
本明細書において使用する「約」は、測定可能な数値、例えば量、時間範囲などを指す場合には、明記された数値からの±20%、±10%、±5%、±1%、又は±0.1%の変動を包含することを意味する。なぜなら、このような変動は、開示された方法を実施するのに適切であるからである。
生物、組織、細胞、又はその成分の脈絡において使用される場合の「異常」という用語は、「正常な」(予想される)それぞれの特徴を示すそうした生物、組織、細胞、又はその成分とは少なくとも1つの観察可能な又は検出可能な特徴(例えば年齢、処置、時刻など)が異なるそうした生物、組織、細胞、又はその成分を指す。ある細胞型又は組織型にとっては正常又は予想される特徴は、異なる細胞型又は組織型にとっては異常である場合がある。
「疾患」は、動物が恒常性を維持することができずそして該疾患が寛解しなければ悪化し続ける、動物の健康状態である。
これに対し、動物の「障害」は、動物が恒常性を維持することができるが、該障害が存在しない場合よりも好ましくない、健康状態である。処置されずに放置されても、障害は、動物の健康状態のさらなる低下を必ずしも引き起こさない。
疾患又は障害は、疾患又は障害の兆候又は症状の重度、このような兆候又は症状が患者に起こる頻度、あるいはその両方が低減される場合に「軽減」する。
化合物の「有効量」又は「治療有効量」は、該化合物が投与される被験者に有益な効果を提供するに十分な化合物の量である。送達ビヒクルの「有効量」は、化合物と効果的に結合するか又は化合物を送達するに十分な量である。
本明細書において使用する「説明用資料」は、本明細書に列挙された様々な疾患又は障害の軽減を奏功するためのキット内の本発明の化合物、組成物、ベクター、又は送達システムの有用性を伝えるために使用され得る、出版物、記録、図解、又は任意の他の表現媒体を含む。場合により、又は代替的に、説明用資料は、哺乳動物の細胞又は組織における疾患又は障害を軽減する1つ以上の方法を記載し得る。本発明のキットの説明用資料は、例えば、本発明の同定された化合物、組成物、ベクター、若しくは送達システムを含有している容器に貼りつけられていても、又は同定された化合物、組成物、ベクター、若しくは送達システムを含有している容器と一緒に出荷されてもよい。あるいは、説明用資料は、説明用資料及び化合物がレシピエントによって共同で使用されることを意図して、容器とは別に出荷されてもよい。
「患者」、「被験者」、「個体」などの用語は本明細書において同義語として使用され、そしてインビトロであろうがインビボであろうが本明細書に記載の方法を受けることのできる任意の動物又はその細胞を指す。特定の非限定的な実施態様では、患者、被験者、又は個体はヒトである。
「治療的」処置は、兆候又は症状を減少又は排除する目的で、疾患又は障害のそうした兆候又は症状を示す被験者に投与される処置である。
本明細書において使用する「疾患又は障害を処置する」は、患者に起こる疾患又は障害の兆候又は症状の重度及び/又は頻度を低減することを意味する。
本明細書において使用する「生物学的試料」という語句は、核酸又はポリペプチドの発現が存在するか又は検出され得る細胞、組織、又は体液を含むあらゆる試料を含むことを意図する。液体の性質である試料は、本明細書において「体液」と称される。生物学的試料は、例えば、被験者の領域を掻爬若しくはふきとることによって、又は体液を得るために針を使用することによってなどの、様々な技術によって患者から得ることができる。様々な生体試料を回収するための方法は当技術分野において周知である。
本明細書において使用する「イムノアッセイ」は、標的分子に特異的に結合して標的分子を検出及び定量することのできる抗体を使用するあらゆる結合アッセイを指す。
抗体に関して本明細書において使用する「特異的に結合する」という用語とは、特異的な抗原を認識するが、試料中の他の分子を実質的に認識しないか又は結合しない、抗体を意味する。例えば、ある種に由来する抗原に特異的に結合する抗体は、1つ以上の種に由来する抗原にも結合し得る。しかし、このような種間交差反応性はそれ自体、特異的であるとする抗体の分類を変化させない。別の例では、抗原に特異的に結合する抗体は、該抗原の異なる対立遺伝子型にも結合し得る。しかしながら、このような交差反応性はそれ自体、特異的であるとする抗体の分類を変化させない。
場合によっては、「特異的な結合」又は「特異的に結合」という用語は、抗体、タンパク質、又はペプチドと第二の化学種との相互作用に関して使用され得、該相互作用は、化学種上の特定の構造(例えば抗原決定基すなわちエピトープ)の存在に依存し;例えば、抗体は、タンパク質全体ではなく特定のタンパク質構造を認識しそしてそれに結合することを意味する。抗体がエピトープ「A」に対して特異的である場合、標識された「A」と抗体とを含有している反応における、エピトープAを含有している分子の存在(すなわち遊離した標識されていないA)は、抗体に結合する標識されたAの量を減少させるだろう。
遺伝子の「コード領域」は、遺伝子の転写によって産生されるmRNA分子のコード領域に対してそれぞれ相同であるか又は相補的である、遺伝子のコード鎖のヌクレオチド残基及び遺伝子の非コード鎖のヌクレオチドからなる。
mRNA分子の「コード領域」は、mRNA分子の翻訳中に転移RNA分子のアンチコドン領域と適合するか又は終止コドンをコードしている、mRNA分子のヌクレオチド残基からなる。したがって、コード領域は、mRNA分子によってコードされる成熟タンパク質には存在しないアミノ酸残基(例えば、タンパク質輸送シグナル配列内のアミノ酸残基)のコドンを含むヌクレオチド残基を含み得る。
核酸を指すために本明細書において使用する「相補的」は、2本の核酸鎖の領域間又は同じ核酸鎖の2つの領域間の広い概念の配列相補性を指す。第一の核酸領域のアデニン残基は、第一の領域に対して逆平行である第二の核酸領域の残基と、該残基がチミン又はウラシルである場合には、特異的な水素結合を形成(「塩基対形成」)することができることが知られている。同様に、第一の核酸鎖のシトシン残基は、第一の鎖に対して逆平行である第二の核酸鎖の残基と、該残基がグアニンである場合には、塩基対を形成することができることが知られている。2つの領域が逆平行に並べられた場合、第一の領域の少なくとも1つのヌクレオチド残基が第二の領域の残基と塩基対を形成することができる場合、核酸の第一の領域は、同じ又は異なる核酸の第二の領域に対して相補的である。好ましくは、第一の領域は第一の部分を含み、そして第二の領域は第二の部分を含み、これにより、第一及び第二の部分を逆平行に並べた場合、第一の部分のヌクレオチド残基の少なくとも約50%、好ましくは少なくとも約75%、少なくとも約90%、又は少なくとも約95%が、第二の部分のヌクレオチド残基と塩基対を形成することができる。より好ましくは、第一の部分の全てのヌクレオチド残基が、第二の部分のヌクレオチド残基と塩基対を形成することができる。
「単離された」は、天然状態から変化させた又は取り出されたことを意味する。例えば、生存動物内にその通常の態様で天然に存在している核酸又はペプチドは「単離」されていないが、その天然の態様の共存物質から部分的に又は完全に分離された同核酸又はペプチドは「単離」されている。単離された核酸若しくはタンパク質は実質的に精製された形態で存在し得るか、又は例えば宿主細胞などの非天然環境に存在し得る。
「単離された核酸」は、天然の状態でフランキングしている配列から分離された核酸セグメント又は断片、すなわち、該断片に通常は隣接している配列、すなわちそれが天然に存在するゲノム内の断片に隣接する配列から取り出されたDNA断片を指す。該用語はまた、天然には核酸に伴う他の成分、すなわち天然では細胞内でそれに伴うRNA又はDNA又はタンパク質から実質的に精製された核酸に適用する。それ故、該用語は、例えば、ベクターに、自己複製プラスミド若しくはウイルスに、又は原核生物若しくは真核生物のゲノムDNAに組み込まれているか、あるいは他の配列とは独立して別々の分子として(すなわちPCR又は制限酵素による消化によって生成されたcDNA又はゲノム断片又はcDNA断片として)存在する、組換えDNAを含む。それはまた、追加のポリペプチド配列をコードしているハイブリッド遺伝子の一部である組換えDNAも含む。
本発明の脈絡において、一般的に存在している核酸塩基のために以下の略称を使用する。「A」はアデノシンを指し、「C」はシトシンを指し、「G」はグアノシンを指し、「T」はチミジンを指し、そして「U」はウリジンを指す。
本明細書において使用する「ポリヌクレオチド」という用語は、ヌクレオチド鎖として定義される。さらに、核酸はヌクレオチドのポリマーである。したがって、本明細書において使用する核酸及びポリヌクレオチドは同義語である。当業者は、核酸は、単量体「ヌクレオチド」へと加水分解され得るポリヌクレオチドであるという一般的な知識を有する。単量体ヌクレオチドは、ヌクレオシドへと加水分解され得る。本明細書において使用するようにポリヌクレオチドは、組換え手段、すなわち通常のクローニング技術及びPCRなどを使用した組換えライブラリー又は細胞ゲノムからの核酸配列のクローニングを含むがこれらに限定されない、当技術分野において利用可能な任意の手段によって、及び合成手段によって得られる全ての核酸配列を含むがこれらに限定されない。
本明細書において使用する「ペプチド」、「ポリペプチド」及び「タンパク質」という用語は同義語として使用され、そしてペプチド結合によって共有結合したアミノ酸残基を含む化合物を指す。タンパク質又はペプチドは少なくとも2つのアミノ酸を含まなければならず、そしてタンパク質又はペプチドの配列を含み得るアミノ酸の最大数には制限を課されない。ポリペプチドは、ペプチド結合によって互いに接続された2つ以上のアミノ酸を含む任意のペプチド又はタンパク質を含む。本明細書において使用する該用語は、当技術分野において例えばペプチド、オリゴペプチド及びオリゴマーとも一般的に称される短い鎖、並びに、多くのタイプがあるタンパク質と当技術分野において一般的に称されるより長い鎖の両方を指す。「ポリペプチド」は、例えば、生物学的に活性な断片、実質的に相同なポリペプチド、オリゴペプチド、ホモ二量体、ヘテロ二量体、ポリペプチドの変異体、修飾されたポリペプチド、誘導体、類似体、融合タンパク質をとりわけ含む。ポリペプチドは、天然ペプチド、組換えペプチド、合成ペプチド、又はその組合せを含む。
本明細書において使用する「コンジュゲートした」は、ある分子の第二の分子への共有結合による付着を指す。
「変異体」は該用語が本明細書において使用される場合、それぞれ基準核酸配列又はペプチド配列とは配列が異なるが、基準分子の必須な生物学的特性を保持している核酸配列又はペプチド配列である。核酸変異体の配列の変化は、基準核酸によってコードされるペプチドのアミノ酸配列を変化させ得ないか、又はアミノ酸の置換、付加、欠失、融合、及び切断短縮がもたらされ得る。ペプチド変異体の配列の変化は、典型的には制限されているか又は保存的であるので、よって基準ペプチド及び変異体の配列は全体的に密接に類似し、そして多くの領域において同一である。変異体及び基準ペプチドのアミノ酸配列は、1つ以上の置換、付加、欠失の任意の組合せによって異なり得る。核酸又はペプチドの変異体は対立遺伝子変異体などの天然に起こるものであり得るか、又は天然に起こることが知られていない変異体であり得る。核酸及びペプチドの天然には起こらない変異体は、突然変異誘発技術によって又は直接合成によって作製され得る。
本明細書において使用する「1つ以上のTRIMタンパク質のモジュレーター」は、モジュレーターの非存在下におけるTRIMタンパク質の発現、活性、又は生物学的機能と比較して、TRIMタンパク質の発現、活性、又は生物学的機能を改変する化合物である。
本明細書において使用する「RNF4のモジュレーター」は、モジュレーターの非存在下におけるRNF4の発現、活性、又は生物学的機能と比較して、RNF4の発現、活性、又は生物学的機能を改変する化合物である。
範囲:本開示全体を通して、本発明の様々な態様は範囲の形式で提示され得る。範囲の形式の記載は単に簡便性及び簡潔さのためであり、そして本発明の範囲に対する融通の利かない制限として捉えられるべきではないことが理解されるべきである。したがって、範囲の記載は、全ての可能な部分範囲、並びに、その範囲内の個々の数値を具体的に開示したと考えられるべきである。例えば、1〜6などの範囲の記載は、1〜3、1〜4、1〜5、2〜4、2〜6、3〜6などの部分範囲、並びに、その範囲内の個々の数、例えば1、2、2.7、3、4、5、5.3、及び6を具体的に開示したと考えられるべきである。これは範囲の広さに関係なく適用される。
説明
1つの態様では、本発明は、ミスフォールドタンパク質又はタンパク質凝集物に関連した疾患又は障害を治療又は予防するための組成物及び方法を提供する。例えば、本発明は、ミスフォールドタンパク質の認識及び排除を増加させるための組成物及び方法を提供する。特定の実施態様では、本発明は、ミスフォールドタンパク質のSUMOにより媒介されるユビキチン化及び最終的な分解を提供する。特定の実施態様では、本発明は、タンパク質凝集物又は封入体の脱凝集を提供する。したがって、本発明は、細胞内又は細胞外の両方のミスフォールドタンパク質、タンパク質凝集物、又はタンパク質封入体を排除するために使用され得る。
本発明は、多くの神経変性疾患及び障害をはじめとする、様々な疾患及び障害の病態において役割を果たしているミスフォールドタンパク質の認識及び分解における、トリパータイトモチーフ(TRIM)タンパク質ファミリーメンバー及びSUMO標的化ユビキチンリガーゼ(STUbL)であるRNF4の役割の発見に関する。
本明細書に提示されたデータは、TRIMタンパク質ファミリーメンバーがミスフォールドタンパク質と共局在し、そしてミスフォールドタンパク質の分解を媒介することを実証する。さらに、RNF4は、ミスフォールドタンパク質のユビキチン化及び分解を媒介するユビキチンリガーゼであることが本明細書に記載されている。したがって、本発明は、1つ以上のTRIMタンパク質、1つ以上のSTUbL、又はその組合せの発現、活性、又は両方を増加させる組成物を提供する。例えば、TRIMタンパク質及び組換えTRIMタンパク質をコードしている核酸分子はミスフォールドタンパク質の分解を促進することが実証されている。
1つの実施態様では、前記組成物は、1つ以上のTRIMタンパク質の発現又は活性のモジュレーターを含む。例えば、1つの実施態様では、該モジュレーターは、1つ以上のTRIMタンパク質の発現又は活性を増加させる。1つ以上のTRIMタンパク質は、例えば哺乳動物及び非哺乳動物メンバーを含むTRIMタンパク質ファミリーの任意のメンバーを含む。特定の実施態様では、該モジュレーターは、ヒトTRIM3、TRIM4、TRIM5、TRIM6、TRIM7、TRIM9、TRIM11、TRIM13、TRIM14、TRIM15、TRIM16、TRIM17、TRIM19(本明細書では「PML」とも称される)、TRIM20、TRIM21、TRIM24、TRIM25、TRIM27、TRIM28、TRIM29、TRIM32、TRIM34、TRIM39、TRIM43、TRIM44、TRIM45、TRIM46、TRIM49、TRIM50、TRIM52、TRIM58、TRIM59、TRIM65、TRIM67、TRIM69、TRIM70、TRIM74、及びTRIM75;並びにマウスTRIM30の1つ以上の発現又は活性を増加させる。
1つの実施態様では、前記組成物は、1つ以上のSTUbLのモジュレーターを含む。例えば、1つの実施態様では、該モジュレーターは、1つ以上のSTUbLの発現又は活性を増加させる。例示的なSTUbLとしては、RNF4及びRNF111(アルカディアとしても知られる)が挙げられるがこれらに限定されない。
1つの実施態様では、前記組成物は、1つ以上のTRIMタンパク質のモジュレーター及び1つ以上のSTUbLのモジュレーターを含む。
本発明は、必要とする被験者における、ミスフォールドタンパク質又はタンパク質凝集物に関連した疾患又は障害を治療又は予防するための方法を提供する。TRIMタンパク質又はSTUbLの発現又は活性のレベルを増加させることにより、ミスフォールドタンパク質の分解を促進することができ、これにより被験者における疾患又は障害を処置することができることが本明細書において判明する。
本発明の組成物及び方法によって治療又は予防され得る神経変性疾患又は障害の例としては、ポリQ障害、例えばSCA1、SCA2、SCA3、SCA6、SCA7、SCA17、ハンチントン病、歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症(DRPLA)、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症(ALS)、伝染性海綿状脳症(プリオン病)、タウオパチー、及び前頭側頭葉変性症(FTLD)が挙げられるがこれらに限定されない。しかしながら、本発明は、神経変性障害の治療又は予防に限定されない。むしろ、本発明は、ミスフォールドタンパク質又はタンパク質凝集物に関連したあらゆる疾患又は障害の治療又は予防を包含する。他のこのような疾患及び障害としては、ALアミロイド症、AAアミロイド症、家族性地中海熱、老人性全身性アミロイド症、家族性アミロイド性多発神経炎、血液透析に関連したアミロイド症、アポリポタンパク質AIアミロイド症、アポリポタンパク質AIIアミロイド症、アポリポタンパク質AIVアミロイド症、フィンランド型遺伝性アミロイド症、リゾチームアミロイド症、フィブリノーゲンアミロイド症、アイスランド型遺伝性脳アミロイド血管症、II型糖尿病、甲状腺髄様癌、心房アミロイド症、アミロイド症を伴う遺伝性脳出血、下垂体プロラクチノーマ、注射部位に限局したアミロイド症、大動脈中膜アミロイド症、遺伝性格子状角膜ジストロフィー、睫毛乱生に関連した角膜アミロイド症、白内障、石灰化上皮性歯原性腫瘍、肺胞蛋白症、封入体筋炎、及び皮膚苔癬アミロイド症が挙げられるがこれらに限定されない。特定の実施態様では、本発明は、膀胱癌、星状細胞腫、咽頭癌、リンパ腫、及び腺癌を含むがこれらに限定されない、p53突然変異体の凝集物に関連した癌の治療又は予防を包含する。
1つの態様では、本発明は、ミスフォールドタンパク質を安定化させるための1つ以上のTRIMタンパク質の使用を包含する。特定の態様では、本明細書に記載の1つ以上のTRIMタンパク質を介した機能的ミスフォールドタンパク質の安定化は、嚢胞性線維症及びリソソーム蓄積病、例えばゴーシェ病及びファブリー病を含むがこれらに限定されない、ミスフォールドタンパク質に関連した疾患又は障害を治療又は予防することができる。
1つの態様では、本発明は、ミスフォールドタンパク質又はタンパク質凝集物に関連した疾患又は障害を診断するための方法を提供する。例えば、1つの実施態様では、1つ以上のTRIMタンパク質又は1つ以上のSTUbLは、診断マーカーとして使用される。
1つの態様では、本発明は、関心対象の組換えタンパク質の製造のための組成物及び方法に指向される。例えば、特定の実施態様では、1つ以上のTRIMタンパク質及び1つ以上のSTUbLを使用して、関心対象の組換えタンパク質のタンパク質凝集物を脱凝集することができる。
組成物
様々な実施態様では、本発明は、ミスフォールドタンパク質又はタンパク質凝集物に関連した疾患又は障害を予防又は治療するモジュレーター組成物、及び、方法を含む。様々な実施態様では、本発明のモジュレーター組成物及び予防法又は治療法は、遺伝子又は遺伝子産物のレベル又は活性を調節する。いくつかの実施態様では、本発明のモジュレーター組成物は、遺伝子又は遺伝子産物のレベル又は活性を増加させるアクチベーターである。
本明細書に提供された開示に基づいて、遺伝子又は遺伝子産物の調節は、転写、翻訳、スプライシング、分解、酵素活性、結合活性、又はその組合せの調節を含むがこれらに限定されない、遺伝子又は遺伝子産物のレベル又は活性の調節を包含することが当業者によって理解されるだろう。したがって、遺伝子又は遺伝子産物のレベル又は活性の調節は、核酸の転写、翻訳、分解、スプライシング、又はその組合せの調節を含むがこれらに限定されず;そしてそれはまた、同様にポリペプチド遺伝子産物の任意の活性の調節も含む。
1つの実施態様では、前記モジュレーターは、遺伝子又は遺伝子産物の産生を増加させることによって、例えば遺伝子の転写又は遺伝子産物の翻訳を調節することによって、遺伝子又は遺伝子産物の発現又は活性を増加させる。1つの実施態様では、該モジュレーターは、外来性遺伝子又は遺伝子産物を提供することによって、遺伝子又は遺伝子産物の発現又は活性を増加させる。例えば、特定の実施態様では、該モジュレーターは、1つ以上のTRIMタンパク質又は1つ以上のSTUbLをコードしている、単離された核酸を含む。1つの実施態様では、該モジュレーターは、1つ以上のTRIMタンパク質及び1つ以上のSTUbLをコードしている、単離された核酸を含む。特定の実施態様では、該モジュレーターは、1つ以上のTRIMタンパク質又は1つ以上のSTUbLを含む、単離されたペプチドを含む。1つの実施態様では、該モジュレーターは、1つ以上のTRIMタンパク質及び1つ以上のSTUbLを含む、単離されたペプチドを含む。1つの実施態様では、該モジュレーターは、遺伝子又は遺伝子産物の分解を阻害することによって、遺伝子又は遺伝子産物の発現又は活性を増加させる。例えば、1つの実施態様では、該モジュレーターは、1つ以上のTRIMタンパク質又は1つ以上のSTUbLのユビキチン化、プロテアソームによる分解、又はタンパク質分解を減少させる。1つの実施態様では、該モジュレーターは、遺伝子産物の安定性又は半減期を増加させる。
様々な実施態様では、調節される遺伝子又は遺伝子産物は、1つ以上のTRIMタンパク質である。例えば、TRIMタンパク質は、ミスフォールドタンパク質を認識し、そしてミスフォールドタンパク質及びタンパク質凝集物の分解を媒介することが本明細書に記載されている。1つの実施態様では、遺伝子又は遺伝子産物は、1つ以上のSTUbLである。例えば、STUbLタンパク質ファミリーのメンバーであるRNF4は、ミスフォールドタンパク質及びタンパク質凝集物の分解を媒介することが本明細書に記載されている。
遺伝子又は遺伝子産物の調節は、本明細書に開示されているような方法をはじめとする多種多様な方法、並びに、当技術分野において公知であるか又は将来開発される予定の方法を使用して評価され得る。すなわち、日常実務者は、本明細書に提供された開示に基づいて、遺伝子又は遺伝子産物のレベル又は活性の調節が、遺伝子産物(例えばmRNA)をコードしている核酸のレベル、生物学的試料中に存在するポリペプチド遺伝子産物のレベル、生物学的試料中に存在するポリペプチド遺伝子産物の活性、又はその組合せを評価する方法を使用して容易に評価され得ることを理解するだろう。
遺伝子又は遺伝子産物のレベル又は活性を調節する本発明のモジュレーター組成物及び方法は、化合物、タンパク質、ペプチド、ペプチド模倣体、抗体、リボザイム、低分子化合物、核酸、ベクター、アンチセンス核酸(例えばsiRNA、miRNAなど)又はその組合せを含むがこれらに限定されると捉えられるべきではない。当業者は、本明細書に提供された開示に基づいて、モジュレーター組成物が遺伝子又は遺伝子産物のレベル又は活性を調節する化合物を包含することを容易に理解するだろう。さらに、モジュレーター組成物は、化学分野の技術者には周知であるように、化学的に修飾された化合物及び誘導体も包含する。
1つの実施態様では、本発明のモジュレーター組成物は、遺伝子又は遺伝子産物の発現、活性、又は生物学的機能を増加させるアゴニストである。例えば、特定の実施態様では、本発明のモジュレーターは、1つ以上のTRIMタンパク質又は1つ以上のSTUbLのアゴニストである。
さらに、当業者は、本開示及び本明細書に例示された方法を備えれば、モジュレーターは、将来発見されるような、遺伝子及び遺伝子産物の調節の生理学的結果などの薬理学の分野における周知の基準によって同定され得るような、本明細書で詳述されているような、及び/又は当技術分野において公知であるようなそのようなモジュレーターを含むことを理解するだろう。それ故、本発明は、いずれにしても、本明細書に例示又は開示されているようないずれかの特定のモジュレーター組成物に限定されず;むしろ、本発明は、当技術分野において公知であるような及び将来発見されるような、日常実務者によって有用であると理解されるであろうそのようなモジュレーター組成物を包含する。
モジュレーター組成物を同定及び生成するさらなる方法は当業者には周知である。あるいは、モジュレーターは、化学合成され得る。さらに、日常実務者は、本明細書に提供された教義に基づいて、モジュレーター組成物が組換え生物から得ることができることを理解するだろう。モジュレーターを化学合成するための及びそれらを天然源から得るための組成物及び方法は、当技術分野において周知であり、そして当技術分野において記載されている。
当業者は、モジュレーターが、低分子化学物質、ポリペプチド、ペプチド、抗体、タンパク質をコードしている核酸構築物、アンチセンス核酸、アンチセンス核酸をコードしている核酸構築物、又はその組合せとして投与され得ることを理解するだろう。タンパク質又はタンパク質をコードしている核酸構築物を細胞又は組織に投与するための数多くのベクター及び他の組成物及び方法は周知である。それ故、本発明は、遺伝子又は遺伝子産物のモジュレーターである、ペプチド又はペプチドをコードしている核酸を含む。例えば、本発明は、1つ以上のTRIMタンパク質、1つ以上のSTUbL、又はその組合せを含む、ペプチド又はペプチドをコードしている核酸を含む(Sambrook et al., 2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York; Ausubel et al., 1997, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York)。
ペプチド
1つの実施態様では、本発明の組成物は、1つ以上のペプチドを含む。例えば、1つの実施態様では、該組成物のペプチドは、1つ以上のTRIMタンパク質のアミノ酸配列を含む。例えば、1つの実施態様では、該ペプチドは、TRIM5δ、TRIM11、TRIM19、TRIM21、TRIM27、及びTRIM32の1つ以上を含む。特定の実施態様では、該ペプチドは、1つ以上のSTUbLのアミノ酸配列を含む。例えば、1つの実施態様では、該ペプチドは、RNF4及びRNF111(アルカディア)の1つ以上を含む。
TRIMタンパク質の例示的なアミノ酸配列、及びTRIMタンパク質をコードしているcDNAヌクレオチド配列が以下の表1に提供されている。
本発明はまた、本明細書に開示されたペプチドに対してかなり相同性を有する任意の形態のペプチドを含むと捉えられるべきである。好ましくは、「かなり相同性」であるペプチドは、本明細書に開示されたペプチドのアミノ酸配列に対して、約50%相同性、より好ましくは約70%相同性、さらにより好ましくは約80%相同性、より好ましくは約90%相同性、さらにより好ましくは約95%相同性、さらにより好ましくは約99%相同性である。
1つの実施態様では、本発明の組成物は、本明細書に記載のペプチド、ペプチド断片、相同体、変異体、ペプチドの誘導体又は塩を含む。例えば、特定の実施態様では、該組成物は、1つ以上のTRIMタンパク質、1つ以上のTRIMタンパク質の断片、1つ以上のTRIMタンパク質の相同体、1つ以上のTRIMタンパク質の変異体、1つ以上のTRIMタンパク質の誘導体、又は1つ以上のTRIMタンパク質の塩を含む、ペプチドを含む。特定の実施態様では、該組成物は、1つ以上のSTUbL、1つ以上のSTUbLの断片、1つ以上のSTUbLの相同体、1つ以上のSTUbLの変異体、1つ以上のSTUbLの誘導体、又は1つ以上のSTUbLの塩を含む、ペプチドを含む。
1つの実施態様では、前記組成物は、本明細書に記載のペプチドの組合せを含む。例えば、特定の実施態様では、該組成物は、1つ以上のTRIMタンパク質を含むペプチドと、1つ以上のSTUbLを含むペプチドとを含む。1つの実施態様では、該組成物は、1つ以上のTRIMタンパク質と1つ以上のSTUbLとを含むペプチドを含む。
特定の実施態様では、前記ペプチドは、該ペプチドを所望の場所へと標的化する標的化ドメインを含む。例えば、特定の実施態様では、標的化ドメインは、標的化された細胞、タンパク質、又はタンパク質凝集物に結合し、これにより、治療用ペプチドを所望の場所に送達する。例えば、1つの実施態様では、標的化ドメインは、アミロイドβ、α−シヌクレイン、タウ、プリオン、SOD1、TDP−43、FUS、p53突然変異体、及びハンチンチン、アタキシンなどのポリグルタミン反復配列を伴うタンパク質のタンパク質及びタンパク質凝集物を含むがこれらに限定されない、疾患又は障害に関連したタンパク質及びタンパク質凝集物に結合するよう方向付けられる。
特定の実施態様では、標的化ドメインは、標的化された細胞、タンパク質、又はタンパク質凝集物への結合能を有する、ペプチド、核酸、低分子などを含む。例えば、1つの実施態様では、標的化ドメインは、標的化された細胞、タンパク質、又はタンパク質凝集物に結合する、抗体又は抗体断片を含む。
本発明のペプチドは、化学的方法を使用して作製され得る。例えば、ペプチドは、固相技術(Roberge J Y et al (1995) Science 269: 202-204)によって合成され得、樹脂から切断され得、そして分取高速液体クロマトグラフィーによって精製され得る。自動合成は、例えば、ABI431Aペプチド合成装置(パーキンエルマー社)を使用して製造業者によって提供された説明書に従って達成され得る。
ペプチドは、代替的には、組換え手段によって、又はより長いポリペプチドからの切断によって作製され得る。ペプチドの組成は、アミノ酸分析又はシークエンスによって確認され得る。
本発明に記載のペプチドの変異体は、(i)1つ以上のアミノ酸残基が、保存的又は非保存的アミノ酸残基(好ましくは保存的アミノ酸残基)で置換され、そしてこのような置換されたアミノ酸残基は、遺伝子コードによってコードされたものであってもそうでなくてもよいもの、(ii)1つ以上の修飾されたアミノ酸残基、例えば置換基の付着によって修飾されている残基が存在しているもの、(iii)ペプチドが本発明のペプチドの選択的スプライシング変異体であるもの、(iv)ペプチドの断片、及び/又は(v)ペプチドが別のペプチド、例えばリーダー配列若しくは分泌配列、又は精製(例えばHis−タグ)若しくは検出(例えばSv5エピトープタグ)のために使用される配列に融合されているものであり得る。断片は、元来の配列のタンパク質分解による切断(複数の部位のタンパク質分解を含む)を介して生成されたペプチドを含む。変異体は翻訳後修飾又は化学的修飾を受け得る。このような変異体は、本明細書の教義から当業者の技能範囲内であると想定される。
本発明のペプチドは、翻訳後修飾され得る。例えば、本発明の範囲内に該当する翻訳後修飾は、シグナルペプチド切断、グリコシル化、アセチル化、イソプレニル化、タンパク質分解、ミリストイル化、タンパク質フォールディング、及びタンパク質分解プロセシングなどを含む。いくつかの修飾又はプロセシング事象は、追加の生物学的マシーナリーの導入を必要とする。例えば、プロセシング事象、例えばシグナルペプチド切断及びコアグリコシル化は、イヌミクロソーム膜又はツメガエル卵抽出物を標準的な翻訳反応に添加することによって調べられる(米国特許第6,103,489号)。
本発明のペプチドは、翻訳後修飾によって又は翻訳中に非天然アミノ酸を導入することによって形成された非天然アミノ酸を含み得る。タンパク質翻訳中に非天然アミノ酸を導入するために様々なアプローチが利用可能である。例えば、特殊なtRNA、例えばサプレッサー特性を有するtRNAであるサプレッサーtRNAが、部位特異的非天然アミノ酸置換(SNAAR)のプロセスに使用されている。SNAARでは、タンパク質合成中に非天然アミノ酸を特有の部位へと標的化するように作用する、特有のコドンがmRNA及びサプレッサーtRNA上に必要とされる(国際公開公報第90/05785号に記載)。しかしながら、サプレッサーtRNAは、タンパク質翻訳系に存在するアミノアシルtRNAシンターゼによって認識可能であってはならない。特定の場合では、天然アミノ酸を特異的に修飾しかつアミノアシル化されたtRNAの機能的活性を有意に変化させない化学反応を使用して、tRNA分子をアミノアシル化した後に、非天然アミノ酸が形成され得る。これらの反応は、アミノアシル化後の修飾と称される。例えば、その同族のtRNAに連結されたリジンのε−アミノ基(tRNALYS)は、アミン特異的光親和性標識を用いて修飾され得る。
本発明のペプチドを、他の分子、例えばタンパク質にコンジュゲートさせることにより、融合タンパク質を調製し得る。これは、例えば、N末端又はC末端融合タンパク質の合成によって達成され得るが、ただし、得られた融合タンパク質は、本発明のペプチドの機能を保持しているものとする。
本発明のペプチドの環状誘導体もまた、本発明の一部である。環状化は、他の分子との会合のためにより好ましいコンフォメーションをペプチドが取ることを可能とし得る。環状化は、当技術分野において公知の技術を使用して達成され得る。例えば、ジスルフィド結合が、遊離スルフヒドリル基を有する2つの適切な間隔を置いた成分間で形成され得るか、又は、アミド結合が、一方の成分のアミノ基と他方の成分のカルボキシル基との間で形成され得る。環状化はまた、Ulysse, L., et al., J. Am. Chem. Soc. 1995, 117, 8466-8467に記載のように、アゾベンゼン含有アミノ酸を使用して達成され得る。結合を形成する成分は、アミノ酸の側鎖、非アミノ酸成分、又は2つの組合せであり得る。本発明の1つの実施態様では、環状ペプチドは、右の位置にβ−ターンを含み得る。β−ターンは、本発明のペプチド中に、右の位置にアミノ酸Pro−Glyを付加することによって導入され得る。
上記のようなペプチド結合を含有している環状ペプチドよりも可動性の環状ペプチドを生成することが望ましくあり得る。より可動性のペプチドは、ペプチドの右及び左の位置にシステインを導入し、そして2つのシステイン間にジスルフィド橋を形成することによって調製され得る。2つのシステインは、β−シート及びターンを変形させないように並べられる。該ペプチドは、ジスルフィド結合の長さ、及びβ−シート部分における水素結合の数がより少ないことの結果としてより可動性である。環状ペプチドの相対的可動性は、分子動態シミュレーションによって決定され得る。
本発明のペプチドは、塩酸、硫酸、臭化水素酸、リン酸などの無機酸、又はギ酸、酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、乳酸、ピルビン酸、シュウ酸、コハク酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸、安息香酸、サリチル酸、ベンゼンスルホン酸、及びトルエンスルホン酸などの有機酸との反応によって薬学的塩へと変換され得る。
本発明のペプチドはまた修飾を有し得る。修飾(通常は一次配列を変化させない)は、ポリペプチドのインビボ又はインビトロでの化学的誘導体化、例えばアセチル化又はカルボキシル化を含む。また、グリコシル化の修飾、例えば、その合成及びプロセシング中の又はさらに他のプロセシング工程におけるポリペプチドのグリコシル化パターンを修飾することによって;例えば、グリコシル化に影響を及ぼす酵素、例えば哺乳動物グルコシル化酵素又は脱グルコシル化酵素に該ポリペプチドを曝すことによって作製されたものが含まれる。リン酸化アミノ酸残基、例えばホスホチロシン、ホスホセリン、又はホスホトレオニンを有する配列も包含される。
タンパク質分解に対するその抵抗性を向上するために、又は溶解特性を最適化するために、又はそれらを治療剤としてより適切なものとするために、通常の分子生物学的技術を使用して修飾されているペプチドも含まれる。このような変異体は、天然のL−アミノ酸以外の残基、例えばD−アミノ酸又は非天然合成アミノ酸を含有しているものを含む。本発明のペプチドはさらに、それらの治療的適用において有用である非アミノ酸部分にコンジュゲートされていてもよい。特に、該ペプチドの安定性、生物学的半減期、水溶性、及び/又は免疫学的特徴を向上させる部分が有用である。このような部分の非限定的な例は、ポリエチレングリコール(PEG)である。
水溶性ポリマーへの生物学的に活性な化合物の共有結合による付着は、これらの化合物の体内分布、薬物動態、及びしばしば毒性を改変及び制御するための1つの方法である(Duncan et al., 1984, Adv. Polym. Sci. 57:53-101)。これらの効果を達成するために多くの水溶性ポリマーが使用され、例えばポリ(シアル酸)、デキストラン、ポリ(N−(2−ヒドロキシプロピル)メタクリルアミド)(PHPMA)、ポリ(N−ビニルピロリドン)(PVP)、ポリ(ビニルアルコール)(PVA)、ポリ(エチレングリコール−コ−プロピレングリコール)、ポリ(N−アクリロイルモルホリン(PAcM)、及びポリ(エチレングリコール)(PEG)である(Powell, 1980, Polyethylene glycol. In R. L. Davidson (Ed.) Handbook of Water Soluble Gums and Resins. McGraw-Hill, New York, chapter 18)。PEGは理想的な一連の特性を有する:非常に低い毒性(Pang, 1993, J. Am. Coll. Toxicol. 12: 429-456)、水溶液中での優れた溶解度(Powell、上記)、低い免疫原性及び抗原性(Dreborg et al., 1990, Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst. 6: 315-365)。タンパク質上に単一又は複数のポリエチレングリコール鎖を含有している、PEGのコンジュゲートした又は「PEG化」タンパク質治療薬が科学文献に記載されている(Clark et al., 1996, J. Biol. Chem. 271: 21969-21977; Hershfield, 1997, Biochemistry and immunology of poly(ethylene glycol)-modified adenosine deaminase (PEG-ADA). In J. M. Harris and S. Zalipsky (Eds) Poly(ethylene glycol): Chemistry and Biological Applications. American Chemical Society, Washington, D.C., p 145-154; Olson et al., 1997, Preparation and characterization of poly(ethylene glycol)ylated human growth hormone antagonist. In J. M. Harris and S. Zalipsky (Eds) Poly(ethylene glycol): Chemistry and Biological Applications. American Chemical Society, Washington, D.C., p 170-181)。
本発明のペプチドは、慣用的な技術によって合成され得る。例えば、本発明のペプチドは、固相ペプチド合成を使用した化学合成によって合成され得る。これらの方法は、固相又は液相合成法のいずれかを使用する(例えば、固相合成技術についてはJ. M. Stewart, and J. D. Young, Solid Phase Peptide Synthesis, 2ndEd., Pierce Chemical Co., Rockford Ill.(1984)及びG. Barany and R. B. Merrifield, The Peptides: Analysis Synthesis, Biology editors E. Gross and J. Meienhofer Vol. 2 Academic Press, New York, 1980, pp. 3-254:並びに古典的な液相合成についてはM Bodansky, Principles of Peptide Synthesis, Springer-Verlag, Berlin 1984、及びE. Gross and J. Meienhofer, Eds., The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology, suprs, Vol 1を参照)。
ペプチドは、メリーフィールド型固相ペプチド合成によって化学合成され得る。この方法は、約60〜70残基長までのペプチドを生成するために日常的に実施され得、そして場合によっては、約100アミノ酸長までのペプチドを作製するために利用され得る。より長いペプチドもまた、断片縮合又は自然な化学的ライゲーションを介して合成的に作製され得る(Dawson et al., 2000, Ann. Rev. Biochem. 69:923-960)。合成ペプチド経路を利用する利点は、大量のペプチドを、天然には稀にしか存在しないペプチドでさえ、比較的高い純度で、すなわち、研究、診断又は治療の目的にとって十分な純度で生成できることである。
固相ペプチド合成は、Stewart et al. in Solid Phase Peptide Synthesis, 2nd Edition, 1984, Pierce Chemical Company, Rockford, Ill.;及びBodanszky and Bodanszky in The Practice of Peptide Synthesis, 1984, Springer-Verlag, New Yorkによって記載されている。初めに、適切に保護されたアミノ酸残基を、そのカルボキシル基を通して、誘導体化された不溶性のポリマー支持体、例えば架橋ポリスチレン又はポリアミド樹脂に付着する。「適切に保護された」は、アミノ酸のα−アミノ基及び任意の側鎖の官能基の両方の上の保護基の存在を指す。側鎖保護基は、一般的に、合成中に使用される溶媒、試薬、及び反応条件に対して安定であり、そして最終ペプチド産物に影響を及ぼさないであろう条件下で除去可能である。オリゴペプチドの段階的合成は、最初のアミノ酸からN−保護基を除去し、そしてそこに所望のペプチドの配列内の次のアミノ酸のカルボキシル末端をカップリングすることによって行なわれる。このアミノ酸もまた適切に保護される。入って来るアミノ酸のカルボキシルを活性化させることにより、反応性の基への形成、例えばカルボジイミド、対称的な酸無水物、又は「活性エステル」基、例えばヒドロキシベンゾトリアゾール又はペンタフルオロフェニルエステルへの形成によって、支持体に結合させたアミノ酸のN末端と反応させることができる。
固相ペプチド合成法の例としては、α−アミノ保護基としてtert−ブチルオキシカルボニルを利用するBOC法、及びアミノ酸残基のα−アミノを保護するための9−フルオレニルメチルオキシカルボニルを利用するFMOC法が挙げられ、どちらの方法も、当業者には周知である。
N末端及び/又はC末端の遮断基の組み込みはまた、固相ペプチド合成法には慣用的なプロトコールを使用して達成され得る。C末端遮断基の取り込みのために、例えば、所望のペプチドの合成は典型的には、固相として、樹脂からの切断により所望のC末端遮断基を有するペプチドが得られるように化学的に修飾されている支持体樹脂を使用して実施される。C末端が一級アミノ遮断基を有するペプチドを提供するために、例えば、合成は、p−メチルベンズヒドリルアミン(MBHA)樹脂を使用して実施され、よって、ペプチド合成が完了すれば、フッ化水素酸による処理により、所望のC末端のアミド化されたペプチドが遊離される。同様に、C末端へのN−メチルアミン遮断基の組み込みは、N−メチルアミノエチルで誘導体化されたDVB樹脂を使用して達成され、HFによる処理により、N−メチルアミド化C末端を有するペプチドが遊離される。エステル化によるC末端の遮断もまた、慣用的な手順を使用して達成され得る。これは、樹脂から側鎖ペプチドの遊離を許容する樹脂/遮断基の組合せの使用を必要とし、これにより、所望のアルコールとの続く反応が可能となり、これによりエステル官能基が形成される。FMOC保護基を、メトキシアルコキシベンジルアルコール又は等価なリンカーを用いて誘導体化されたDVB樹脂と組み合わせて、この目的のために使用し得、支持体からの切断は、ジクロロメタン中のTFAによって行なわれる。次いで、例えばDCCを用いての、適切に活性化されたカルボキシル官能基のエステル化は、所望のアルコールの添加、続いて脱保護及びエステル化ペプチド生成物の単離によって進行し得る。
本発明のペプチドは、標準的な化学的又は生物学的なペプチド合成手段によって調製され得る。生物学的方法としては、宿主細胞又はインビトロでの翻訳系におけるペプチドをコードしている核酸の発現が挙げられるがこれらに限定されない。
本発明には、本発明のペプチドをコードする核酸配列が含まれる。1つの実施態様では、本発明は、1つ以上のTRIMタンパク質又は1つ以上のSTUbLのアミノ酸配列をコードしている核酸配列を含む。したがって、本発明のペプチドをコードしている核酸配列のサブクローンは、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Springs Laboratory, Cold Springs Harbor, New York (2012)、及びAusubel et al. (ed.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (New York, NY) (1999及び前の版)(各々のその全体が参照により本明細書に組み入れられる)に記載のように、遺伝子断片をサブクローニングするための慣用的な分子遺伝子的操作を使用して生成され得る。その後、サブクローンをインビトロ又はインビボで細菌細胞において発現させることにより、小さなタンパク質又はポリペプチドが得られ、これを特定の活性について試験することができる。
特定の製剤と組み合わせると、このようなペプチドは効果的な細胞内薬剤であり得る。しかしながら、このようなペプチドの効力を高めるために、本発明の1つ以上のペプチドは、「経細胞輸送」、例えば細胞によるペプチドの取り込みを促進する第二のペプチドとの融合ペプチドとして提供され得る。例えば、1つの実施態様では、ペプチドは、細胞透過性ドメイン、例えば細胞透過性ペプチド(CPP)を含み得、これにより、ペプチドは細胞に侵入することが可能となる。1つの実施態様では、CPPはHIV Tatに由来する。
説明するために、本発明の1つ以上のペプチドは、経細胞輸送を促進することのできるHIVタンパク質TatのN末端ドメインの全部又は断片、例えばTatの残基1〜72又はより小さなその断片との融合ポリペプチドの一部として提供され得る。1つの実施態様では、該ペプチドは、HIV Tatのタンパク質形質導入ドメイン(YGRKKRRQRRR;配列番号163))を含む。他の実施態様では、1つ以上のペプチドは、アンティナペディアIIIタンパク質の全部又は一部との融合ポリペプチドとして提供され得る。ペプチドの取り込みを媒介する他の細胞透過性ドメインは当技術分野において公知であり、そして本発明の融合ペプチドへの使用のために等しく適用可能である。
核酸
1つの実施態様では、本発明の組成物は、1つ以上の単離された核酸を含む。例えば、1つの実施態様では、1つ以上の単離された核酸は、1つ以上のTRIMタンパク質をコードする。例えば、1つの実施態様では、1つ以上の単離された核酸は、ヒトTRIM3、TRIM4、TRIM5、TRIM6、TRIM7、TRIM9、TRIM11、TRIM13、TRIM14、TRIM15、TRIM16、TRIM17、TRIM19(本明細書では「PML」とも称される)、TRIM20、TRIM21、TRIM24、TRIM25、TRIM27、TRIM28、TRIM29、TRIM32、TRIM34、TRIM39、TRIM43、TRIM44、TRIM45、TRIM46、TRIM49、TRIM50、TRIM52、TRIM58、TRIM59、TRIM65、TRIM67、TRIM69、TRIM70、TRIM74、及びTRIM75;並びにマウスTRIM30の1つ以上をコードする。特定の実施態様では、1つ以上の単離された核酸は、1つ以上のSTUbLをコードする。例えば、1つの実施態様では、1つ以上の単離された核酸は、RNF4及びRNF111(アルカディア)の1つ以上をコードする。
TRIMタンパク質をコードしている例示的なヌクレオチド配列は表1に見られる。
特定の実施態様では、1つ以上のTRIMタンパク質又は1つ以上のSTUbLに対応するペプチドは、公知の技術を使用して細胞内でインビボ又はインビトロで1つ以上の核酸から発現される。
単離された核酸のヌクレオチド配列は、RNAに転写されるDNA配列と、ポリペプチドに翻訳されるRNA配列の両方を含む。他の実施態様によると、ヌクレオチド配列は、本発明のペプチドのアミノ酸配列から推測される。当技術分野においては公知であるように、いくつかの代替的なヌクレオチド配列が、翻訳されたペプチドの生物学的活性を保持しながら、重複コドンに因り可能である。
さらに、本発明は、本明細書に開示されたコードしているヌクレオチド配列に対してかなりの相同性を有するヌクレオチド配列を含む単離された核酸を包含する。好ましくは、単離された核酸のヌクレオチド配列は「かなり相同」であり、すなわち、本発明のペプチドをコードしている単離された核酸のヌクレオチド配列に対して約60%相同性、より好ましくは約70%相同性、さらにより好ましくは約80%相同性、より好ましくは約90%相同性、さらにより好ましくは約95%相同性、さらにより好ましくは約99%相同性である。
1つの実施態様では、前記組成物は、本明細書に記載の核酸分子の組合せを含む。例えば、特定の実施態様では、該組成物は、1つ以上のTRIMタンパク質をコードしている単離された核酸分子と、1つ以上のSTUbLをコードしている単離された核酸分子とを含む。1つの実施態様では、該組成物は、1つ以上のTRIMタンパク質と1つ以上のSTUbLをコードしている、単離された核酸分子を含む。
したがって、本発明は、例えば、Sambrook et al.(2012, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York)及びAusubel et al.(1997, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York)に記載のものなどのような、外来性DNAを細胞に導入し、同時に細胞内で外来性DNAを発現するための発現ベクター及び方法を包含する。
1つ以上のTRIMタンパク質又は1つ以上のSTUbLをコードしている所望の核酸を、多くのタイプのベクターにクローニングすることができる。しかしながら、本発明は、いずれかの特定のベクターに限定されると捉えられるべきではない。その代わりに、本発明は、容易に入手可能であり及び/又は当技術分野において周知である多種多様なベクターを包含すると捉えられるべきである。例えば、本発明の所望のポリヌクレオチドは、プラスミド、ファージミド、ファージ誘導体、動物ウイルス、及びコスミドを含むがこれらに限定されないベクターにクローニングすることができる。特に関心の高いベクターとしては、発現ベクター、複製ベクター、プローブ生成ベクター、及びシークエンス用ベクターが挙げられる。
具体的な実施態様では、発現ベクターは、ウイルスベクター、細菌ベクター、及び哺乳動物細胞ベクターからなる群より選択される。上記に考察された組成物の少なくとも一部又は全部を含む、数多くの発現ベクター系が存在する。原核細胞及び/又は真核細胞ベクターに基づいた系を、本発明での用途に使用することができ、これによりポリヌクレオチド又はその同族のポリペプチドを生成することができる。多くのこのような系が商業的にいろいろな場所で入手可能である。
さらに、発現ベクターは、ウイルスベクターの形態で細胞に提供され得る。ウイルスベクター技術は当技術分野において周知であり、そして例えばSambrook et al.(2012)及びAusubel et al.(1997)並びに他のウイルス学及び分子生物学マニュアルに記載されている。ベクターとして有用なウイルスとしては、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、及びレンチウイルスが挙げられるがこれらに限定されない。一般的に、適切なベクターは、少なくとも1つの生物内で機能的な複製起点、プロモーター配列、慣用的な制限酵素部位、及び1つ以上の選択マーカーを含有している(例えば、国際公開公報第01/96584号;国際公開公報第01/29058号;及び米国特許第6,326,193号参照)。
哺乳動物細胞への遺伝子導入のために、多くのウイルスに基づいた系が開発されている。例えば、レトロウイルスは、遺伝子送達システムのための簡便な構築基盤を提供する。選択された遺伝子を、当技術分野において公知である技術を使用して、ベクターに挿入し、そしてレトロウイルス粒子にパッケージングすることができる。次いで、組換えウイルスを単離し、そしてインビボ又はエクスビボのいずれかで被験者の細胞に送達することができる。多くのレトロウイルス系が当技術分野において公知である。いくつかの実施態様では、アデノウイルスベクターが使用される。多くのアデノウイルスベクターが当技術分野において公知である。1つの実施態様では、レンチウイルスベクターが使用される。
例えば、レンチウイルスなどのレトロウイルスに由来するベクターは、長期の遺伝子導入を達成するのに適したツールである。なぜなら、それらは、導入遺伝子の長期で安定な組込み及び娘細胞におけるその増殖を可能にするからである。レンチウイルスベクターは、肝細胞などの非増殖性の細胞を形質導入することができるという点で、マウス白血病ウイルスなどの発癌レトロウイルスに由来するベクターを上回る追加の利点を有する。それらはまた、低い免疫原性という追加の利点も有する。好ましい実施態様では、該組成物は、アデノ随伴ウイルス(AAV)に由来するベクターを含む。アデノ随伴ウイルス(AAV)ベクターは、様々な障害の処置のための強力な遺伝子送達ツールとなっている。AAVベクターは、これらを病原性がないこと、最小限の免疫原性、及び安定かつ効率的に有糸分裂後の細胞に形質導入することができることを含む、遺伝子療法にとって理想的に適したものにする多くの特色を有する。AAVベクター内に含有される特定の遺伝子の発現を、AAV血清型、プロモーター及び送達法の適切な組合せを選択することによって、1つ以上の細胞型に特異的に標的化することができる。
1つの実施態様では、コード配列は、AAVベクター内に含有される。30個を超える天然血清型のAAVが利用可能である。AAVカプシドの多くの天然変異体が存在し、骨格筋に特に適した特性を有するAAVの同定及び使用が可能である。AAVウイルスは、慣用的な分子生物学的技術を使用して工学操作され得、この技術より、核酸配列の細胞特異的送達のために、免疫原性を最小限とするために、安定性及び粒子の寿命を調整するために、効率的な分解のために、核への正確な送達などのために、これらの粒子を最適化することが可能となる。
したがって、1つ以上のTRIMタンパク質又は1つ以上のSTUbLの発現は、1つ以上のコード配列を含有している組換え工学操作AAV又は人工的AAVを送達することによって達成され得る。AAVの使用は、DNAの外来性送達の一般的な形態である。なぜなら、それは比較的無毒性であり、効率的な遺伝子導入を提供し、そして具体的な目的のために容易に最適化され得るからである。例示的なAAV血清型としては、AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、及びAAV9が挙げられるがこれらに限定されない。
ベクターへの会合に望ましいAAV断片としては、capタンパク質(vp1、vp2、vp3及び超可変領域を含む)、repタンパク質(rep78、rep68、rep52、及びrep40を含む)、及びこれらのタンパク質をコードしている配列が挙げられる。これらの断片は、様々なベクター系及び宿主細胞に容易に利用され得る。このような断片は、単独で、他のAAV血清型の配列若しくは断片と組み合わせて、又は他のAAV若しくは非AAVウイルス配列由来のエレメントと組み合わせて使用され得る。本明細書において使用する人工的なAAV血清型としては、非天然のキャプシドタンパク質を有するAAVが挙げられるがこれらに限定されない。このような人工キャプシドは、任意の適切な技術によって、異なる選択されたAAV血清型から、同じAAV血清型の非連続部分から、AAV以外のウイルス源から、又は非ウイルス源から得ることのできる異種配列と組み合わせて、選択されたAAV配列(例えばvp1キャプシドタンパク質の断片)を使用して生成され得る。人工的なAAV血清型は、キメラAAVキャプシド、組換えAAVキャプシド、又は「ヒト化」AAVキャプシドであり得るがこれらに限定されない。したがって、1つ以上のTRIMタンパク質又は1つ以上のSTUbLの発現に適した、例示的なAAV又は人工的なAAVとしてはとりわけ、AAV2/8(米国特許第7,282,199号参照)、AAV2/5(米国国立衛生研究所から入手可能)、AAV2/9(国際公開公報第2005/033321号)、AAV2/6(米国特許第6,156,303号)、及びAAVrh8(国際公開公報第2003/042397号)が挙げられる。
所望のポリヌクレオチドの発現のために、各プロモーター内の少なくとも1つのモジュールが、RNA合成のための開始点を位置付けるように機能する。この最も良く知られている例はTATAボックスであるが、哺乳動物末端デオキシヌクレオチドトランスフェラーゼ遺伝子用のプロモーター及びSV40遺伝子用のプロモーターなどのTATAボックスを欠失しているいくつかのプロモーターでは、開始点それ自体に横たわる個別のエレメントが、開始場所を固定することを助ける。
追加のプロモーターエレメント、すなわちエンハンサーは、転写開始頻度を調節する。典型的には、これらは、開始点の30〜110bp上流の領域に位置するが、多くのプロモーターが近年、同様に開始点の下流に機能的エレメントを含有することが示されている。プロモーターエレメントの間隔は頻繁に可動性であるので、プロモーターの機能は、エレメントが互いに対して反転するか又は移動した場合にも保存される。チミジンキナーゼ(tk)プロモーターでは、プロモーターエレメントの間隔は、活性が下降する前に、50bp離れるまで増加し得る。プロモーターに依存して、個々のエレメントは、協同的に又は独立してのいずれかで機能して、転写を活性化することができるようである。
プロモーターは、コードセグメント及び/又はエキソンの上流に位置する5’非コード配列を単離することによって得ることができるような、遺伝子又はポリヌクレオチド配列に天然に会合しているものであり得る。このようなプロモーターは、「内因性」と称され得る。同様に、エンハンサーは、その配列の下流又は上流のいずれかに位置する、ポリヌクレオチド配列と天然に会合しているものであり得る。あるいは、組換え又は異種プロモーター(これはその天然の環境ではポリヌクレオチド配列と通常は会合していないプロモーターを指す)の制御下にコーディングポリヌクレオチドセグメントを配置することによって一定の利点が得られるであろう。組換え又は異種エンハンサーもまた、その天然環境ではポリヌクレオチド配列と通常は会合していないエンハンサーを指す。このようなプロモーター又はエンハンサーは、他の遺伝子のプロモーター又はエンハンサー、並びに任意の他の原核生物、ウイルス、又は真核細胞から単離されたプロモーター又はエンハンサー、並びに「天然に存在」していない、すなわち、異なる転写調節領域の異なるエレメント、及び/又は発現を改変させる突然変異を含有しているプロモーター若しくはエンハンサーを含み得る。プロモーター及びエンハンサーの核酸配列を合成的に生成することに加えて、配列は、本明細書に開示された組成物に関連した(米国特許第4,683,202号、米国特許第5,928,906号)、PCR(商標)をはじめとする、組換えクローニング技術及び/又は核酸増幅技術を使用して生成され得る。さらに、ミトコンドリア、葉緑体などの核以外の細胞小器官内の配列の転写及び/又は発現を指齢する制御配列も同様に使用され得ることが考えられる。
当然、発現のために選択された細胞型、細胞小器官、及び生物内でのDNAセグメントの発現を効率的に指齢するプロモーター及び/又はエンハンサーを使用することが重要であろう。分子生物学の技術分野の専門家は、一般的に、タンパク質の発現のためのプロモーター、エンハンサー、及び細胞型の組合せの使用法を知っている。例えばSambrook et al.(2012)を参照されたい。使用されるプロモーターは、組換えタンパク質及び/又はペプチドの大規模生産において有利であるように、構成性、組織特異性、誘導性、及び/又は適切な条件下において導入されたDNAセグメントの高い発現レベルを指齢するのに有用であり得る。プロモーターは、異種であっても、内因性であってもよい。
1つの実施態様では、プロモーター又はエンハンサーは、腸上皮内の神経組織内において1つ以上のTRIMタンパク質又は1つ以上のSTUbLの発現を特異的に指齢する。例えば、特定の実施態様では、プロモーター又はエンハンサーは、神経細胞、星状細胞腫、オリゴデンドロサイト、プルキンエ細胞、錐体細胞などにおける1つ以上のTRIMタンパク質又は1つ以上のSTUbLの発現を特異的に指齢する。
所望のポリヌクレオチドの発現を評価するために、細胞内に導入しようとする発現ベクターはまた、ウイルスベクターを通してトランスフェクト又は感染させようと探究されている細胞個体群からの発現している細胞の同定及び選択を容易にするための、選択マーカー遺伝子若しくはレポーター遺伝子のいずれか又はその両方を含有することができる。他の実施態様では、選択マーカーは、別のDNA片上に担持され、そして共トランスフェクション手順に使用されてもよい。選択マーカー及びリポーター遺伝子は両方共に、適切な調節配列とフランキングすることにより、宿主細胞内での発現が可能となり得る。有用な選択マーカーは当技術分野において公知であり、そしてこれには例えば抗生物質耐性遺伝子、例えばneoなどが挙げられる。
レポーター遺伝子は、トランスフェクトされた可能性のある細胞を同定し、そして調節配列の機能を評価するために使用される。容易にアッセイ可能なタンパク質をコードしているレポーター遺伝子は当技術分野において周知である。一般的に、レポーター遺伝子は、レシピエント生物若しくは組織に存在しないか又はそれによって発現されておらず、かつ、その発現がいくつかの容易に検出可能な特性、例えば酵素活性によって顕現するタンパク質をコードしている、遺伝子である。レポーター遺伝子の発現は、DNAがレシピエント細胞に導入された後の適切な時期にアッセイされる。
適切なレポーター遺伝子は、ルシフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、分泌アルカリホスファターゼをコードしている遺伝子、又は緑色蛍光タンパク質遺伝子を含み得る(例えばUi-Tei et al., 2000 FEBS Lett. 479:79-82参照)。適切な発現系は周知であり、そして周知の技術を使用して調製され得るか、又は商業的に入手することができる。内部欠失構築物は、特有な内部制限酵素部位を使用して、又は特有ではない制限酵素部位の部分的消化によって生成され得る。次いで、構築物を、高いレベルのsiRNAポリヌクレオチド及び/又はポリペプチド発現を示す細胞にトランスフェクトし得る。一般的に、最も高い発現レベルのレポーター遺伝子を示す、最小の5’フランキング領域を有する構築物がプロモーターとして同定される。このようなプロモーター領域をレポーター遺伝子に連結させ得、そしてこれを使用して、プロモーターにより駆動される転写を調節する能力について薬剤を評価し得る。
発現ベクターの脈絡において、ベクターは、当技術分野における任意の方法によって、宿主細胞、例えば哺乳動物細胞、細菌細胞、酵母細胞、又は昆虫細胞に容易に導入され得る。例えば、発現ベクターは、物理的、化学的、又は生物学的手段によって宿主細胞に導入され得る。
ポリヌクレオチドを宿主細胞に導入するための物理的方法としては、リン酸カルシウム沈降法、リポフェクション、微粒子銃、マイクロインジェクション、電気穿孔法などが挙げられる。ベクター及び/又は外来性核酸を含む細胞を生成するための方法は当技術分野において周知である。例えば、Sambrook et al.(2012, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York)及びAusubel et al.(1997, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York)を参照されたい。
関心対象のポリヌクレオチドを宿主細胞に導入するための生物学的方法は、DNAベクター及びRNAベクターの使用を含む。ウイルスベクター、特にレトロウイルスベクターは、遺伝子を哺乳動物に、例えばヒト細胞に挿入するための最も広く使用されている方法となっている。他のウイルスベクターは、レンチウイルス、ポックスウイルス、単純ヘルペスウイルスI型、アデノウイルス、及びアデノ随伴ウイルスなどから導かれ得る。例えば、米国特許第5,350,674号及び第5,585,362号を参照されたい。
ポリヌクレオチドを宿主細胞に導入するための化学的手段としては、コロイド分散系、例えば巨大分子複合体、ナノカプセル、ミクロスフィア、ビーズ、及び脂質を基剤とした系、(例えば水中油滴型エマルション、ミセル、混合ミセル、及びリポソームを含む)が挙げられる。インビトロ及びインビボでの送達ビヒクルとしての使用のために好ましいコロイド系は、リポソーム(すなわち人工膜小胞)である。このような系の調製及び使用は、当技術分野において周知である。
外来性核酸を宿主細胞に導入するために使用される方法に関わらず、宿主細胞内での組換えDNA配列の存在を確認するために、様々なアッセイが実施され得る。このようなアッセイとしては、例えば、当業者には周知である「分子生物学的」アッセイ、例えばサザン及びノザンブロット、RT−PCR、並びにPCR;例えば免疫学的手段(ELISA及びウェスタンブロット)によって又は本明細書に記載のアッセイによって特定のペプチドの有無を検出することにより、本発明の範囲内に該当する薬剤を同定する「生化学的」アッセイが挙げられる。
任意のDNAベクター又は送達ビヒクルを利用して、所望のポリヌクレオチドをインビトロ又はインビボで細胞に導入することができる。ウイルス以外の送達システムが利用される場合には、好ましい送達ビヒクルはリポソームである。それ故、上記の送達システム及びプロトコールは、Gene Targeting Protocols, 2ed., pp 1-35(2002)及びGene Transfer and Expression Protocols, Vol. 7, Murray ed., pp 81-89(1991)に認められ得る。
「リポソーム」は、封入された脂質二重層又は凝集物の生成によって形成された様々な単層及び多重層脂質小胞を包含している一般用語である。リポソームは、リン脂質二重層膜と内部の水性媒体とを有する小胞構造を有するとして特徴付けられ得る。多重層リポソームは、水性媒体によって隔てられた多重脂質層を有する。それらは、リン脂質が過剰の水溶液中に懸濁されると自然発生的に形成される。脂質成分は自己再編成を受け、その後、閉じた構造が形成され、そして水と溶解した溶質を脂質二重層の間に封入する。しかしながら、本発明はまた、通常の小胞構造とは異なる構造を溶液中に有する組成物も包含する。例えば、脂質はミセル構造を取り得るか、又は単に脂質分子の不均一な凝集物として存在し得る。また、リポフェクタミン−核酸複合体も考えられる。
1つの実施態様では、本発明の組成物は、1つ以上のTRIMタンパク質又は1つ以上のSTUbLの1つ以上の成分をコードしているインビトロで転写される(IVT)RNAを含む。1つの実施態様では、IVT RNAは、一過性トランスフェクションの形態として細胞に導入され得る。RNAは、合成で作製されたプラスミドDNA鋳型を使用してインビトロでの転写によって生成される。任意の供給源由来の関心対象のDNAを、適切なプライマー及びRNAポリメラーゼを使用して、PCRによって、インビトロでのmRNA合成のための鋳型へと直接変換することができる。DNAの供給源は、例えば、ゲノムDNA、プラスミドDNA、ファージDNA、cDNA、合成DNA配列、又は任意の他の適切なDNA供給源であり得る。インビトロでの転写のために望ましい鋳型は、1つ以上のTRIMタンパク質又は1つ以上のSTUbLである。
1つの実施態様では、PCRのために使用しようとするDNAは、オープンリーディングフレームを含有している。DNAは、生物のゲノムに由来する天然のDNA配列に由来し得る。1つの実施態様では、DNAは、関心対象の完全長の遺伝子又は遺伝子の一部である。遺伝子は、5’及び/又は3’非翻訳領域(UTR)のいくつか又は全部を含み得る。遺伝子は、エキソン及びイントロンを含み得る。1つの実施態様では、PCRのために使用しようとするDNAは、ヒト遺伝子である。別の実施態様では、PCRのために使用しようとするDNAは、5’及び3’UTRを含むヒト遺伝子である。DNAは、代替的には、天然の生物には通常発現されない人工DNA配列であってもよい。例示的な人工DNA配列は、一緒に連結された遺伝子の部分を含有し、これにより融合タンパク質をコードしているオープンリーディングフレームを形成しているものである。一緒に連結されているDNAの部分は単一の生物に由来しても、又は1つを超える生物に由来してもよい。
1つの実施態様では、本発明の組成物は、本明細書に記載の1つ以上のTRIMタンパク質又はRNF4をコードしている修飾された核酸を含む。例えば、1つの実施態様では、該組成物は、ヌクレオチドの修飾されたRNAを含む。1つの実施態様では、該組成物は、ヌクレオシドの修飾されたmRNAを含む。ヌクレオシドの修飾されたmRNAは、修飾されていないmRNAを上回る特定の利点(例えば、向上した安定性、低い免疫原性、及び増強された翻訳を含む)を有する。本発明において有用であるヌクレオシドの修飾されたmRNAはさらに、米国特許第8,278,036号に記載され、これはその全体が参照により本明細書に組み入れられる。
改変された細胞
本発明は、1つ以上のTRIMタンパク質、1つ以上のSTUbL、1つ以上のTRIMタンパク質をコードしている核酸、1つ以上のSTUbLをコードしている核酸、又はその組合せを含む細胞を含む組成物を含む。1つの実施態様では、細胞は、本発明のタンパク質及び/又は核酸を発現するように遺伝子的に改変されている。特定の実施態様では、遺伝子的に改変された細胞は、本発明の組成物を用いて処置される被験者に対して自己である。あるいは、該細胞は、被験者に対して同種、同系、又は異種であってもよい。特定の実施態様では、該細胞は、発現されたタンパク質を細胞外空間に分泌又は遊離することにより、該ペプチドを1つ以上の他の細胞に送達することができる。
遺伝子的に改変された細胞は、インビボ又はエクスビボにおいて当技術分野における標準的な技術を使用して改変され得る。細胞の遺伝子改変は、発現ベクターを使用して又は単離された裸核酸構築物を使用して実施され得る。
1つの実施態様では、前記細胞は、本明細書に記載の1つ以上のタンパク質をコードしている単離された核酸を使用してエクスビボで得られそして改変される。1つの実施態様では、該細胞は、被験者から得られ、タンパク質及び/又は核酸を発現するように遺伝子的に改変され、そして被験者に再投与される。特定の実施態様では、該細胞は、エクスビボ又はインビトロで増幅されて細胞個体群を生成し、ここで該個体群の少なくとも一部が必要とされる被験者に投与される。
1つの実施態様では、前記細胞は、タンパク質を安定に発現するように遺伝子的に改変されている。別の実施態様では、該細胞は、タンパク質を一過性に発現するように遺伝子的に改変されている。
基質
本発明は、本発明のタンパク質、本発明の単離された核酸、本発明のタンパク質を発現している細胞、又はその組合せを含む、足場組成物又は基質組成物を提供する。例えば、1つの実施態様では、本発明のタンパク質、本発明の単離された核酸、本発明のタンパク質を発現している細胞、又はその組合せは足場内に組み込まれる。別の実施態様では、本発明のタンパク質、本発明の単離された核酸、本発明のタンパク質を発現している細胞、又はその組合せは、足場の表面に適用される。本発明の足場は、当技術分野において公知である任意のタイプであり得る。このような足場の非限定的な例としては、ヒドロゲル、エレクトロスパン足場、泡、網、シート、パッチ、及びスポンジが挙げられる。
治療法
本発明はまた、タンパク質ミスフォールド、タンパク質凝集物、又はその組合せに関連した疾患又は障害のための治療法を提供する。
様々な実施態様では、本発明の方法によって処置可能な疾患及び障害としては、ポリQ障害、例えばSCA1、SCA2、SCA3、SCA6、SCA7、SCA17、ハンチントン病、歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症(DRPLA)、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症(ALS)、伝染性海綿状脳症(プリオン病)、タウオパチー、前頭側頭葉変性症(FTLD)、ALアミロイド症、AAアミロイド症、家族性地中海熱、老人性全身性アミロイド症、家族性アミロイド性多発神経炎、血液透析に関連したアミロイド症、アポリポタンパク質AIアミロイド症、アポリポタンパク質AIIアミロイド症、アポリポタンパク質AIVアミロイド症、フィンランド型遺伝性アミロイド症、リゾチームアミロイド症、フィブリノーゲンアミロイド症、アイスランド型遺伝性脳アミロイド血管症、II型糖尿病、甲状腺髄様癌、心房アミロイド症、アミロイド症を伴う遺伝性脳出血、下垂体プロラクチノーマ、注射部位に限局したアミロイド症、大動脈中膜アミロイド症、遺伝性格子状角膜ジストロフィー、睫毛乱生に関連した角膜アミロイド症、白内障、石灰化上皮性歯原性腫瘍、肺胞蛋白症、封入体筋炎、及び皮膚苔癬アミロイド症が挙げられるがこれらに限定されない。特定の実施態様では、該方法は、膀胱癌、星状細胞腫、咽頭癌、リンパ腫、及び腺癌を含むがこれらに限定されない、p53突然変異体の凝集物に関連した癌の治療又は予防を含む。
本明細書に詳述された方法を含む本開示を備えれば、本発明は、すでに確立されているタンパク質ミスフォールド又はタンパク質凝集物に関連した疾患の処置に限定されないことが当業者によって理解されるだろう。特に、疾患又は障害は、被験者にとって有害となるまで顕現されている必要はなく;実際に、疾患又は障害は、処置が投与される前に被験者において検出される必要はない。すなわち、疾患又は障害の有意な兆候又は症状が、本発明が恩恵を与え得る前に起こる必要がない。それ故、本発明は、タンパク質ミスフォールド又はタンパク質凝集物に関連した疾患又は障害を予防するための方法を含み、本明細書の何処かで以前に考察されているようなモジュレーター組成物は、疾患又は障害の発症する前に被験者に投与され得、これにより疾患又は障害を予防することができる。
当業者は、本明細書の開示を備えれば、タンパク質ミスフォールド又はタンパク質凝集物に関連した疾患の予防が、タンパク質ミスフォールド又はタンパク質凝集物に関連した疾患の発症又は進行に対する予防的措置としてモジュレーター組成物を被験者に投与する工程を包含することを理解するだろう。本明細書の何処かでより完全に考察されているように、遺伝子又は遺伝子産物のレベル又は活性を調節する方法は、ポリペプチド遺伝子産物のレベル及び活性を調節するだけでなく、転写、翻訳のいずれか又はその両方を含む核酸の発現も調節するための多種多様な技術を包含する。
さらに、本明細書で何処かに開示されているように、当業者は、一旦本明細書に提供された技術を備えれば、本発明は、タンパク質ミスフォールド又はタンパク質凝集物に関連した様々な疾患の治療法又は予防法を包含し、ここで遺伝子又は遺伝子産物のレベル又は活性を調節することにより疾患が治療又は予防されることを理解するだろう。疾患がタンパク質ミスフォールド又はタンパク質凝集物に関連しているかどうかを評価するための様々な方法が当技術分野において公知である。さらに、本発明は、将来発見されるこのような疾患の治療又は予防を包含する。
1つの態様では、該方法は、ミスフォールドタンパク質を安定化させるための1つ以上のTRIMタンパク質の使用を含む。特定の態様では、本明細書に記載の1つ以上のTRIMタンパク質を介した機能的ミスフォールドタンパク質の安定化により、ミスフォールドタンパク質に関連した疾患又は障害を治療又は予防することができる。例えば、1つの実施態様では、本明細書に記載の1つ以上のTRIMタンパク質を介した、嚢胞性線維症膜貫通コンダクタンス調節因子(CFTR)突然変異体の安定化により、突然変異CFTRは、分解される代わりに機能することが可能となるだろう。ミスフォールドタンパク質を安定化させるためのTRIMタンパク質の使用は、部分的に機能的なタンパク質の分解に関連した嚢胞性線維症及び他の疾患を処置するために使用され得ることが想定される。本明細書に記載の1つ以上のTRIMタンパク質を介した、タンパク質の安定化を使用して、嚢胞性線維症及びリソソーム蓄積病、例えばゴーシェ病及びファブリー病を含むがこれらに限定されない、機能的な突然変異タンパク質の分解に関連したあらゆる疾患又は障害を処置することができる。
本発明は、遺伝子又は遺伝子産物のモジュレーターの投与を包含する。本発明の方法を実施するために、当業者は、本明細書に提供された開示に基づいて、適切なモジュレーター組成物を製剤化しそして被験者に投与する方法を理解するだろう。本発明は、いずれかの特定の投与法又は処置計画に限定されない。
1つの実施態様では、前記方法は、1つ以上のTRIMタンパク質又は1つ以上のSTUbLの発現又は活性を増加させる組成物の有効量を必要とする被験者に投与する工程を含む。
例えば、1つの実施態様では、前記方法は、ヒトTRIM3、TRIM4、TRIM5、TRIM6、TRIM7、TRIM9、TRIM11、TRIM13、TRIM14、TRIM15、TRIM16、TRIM17、TRIM19(本明細書では「PML」とも称される)、TRIM20、TRIM21、TRIM24、TRIM25、TRIM27、TRIM28、TRIM29、TRIM32、TRIM34、TRIM39、TRIM43、TRIM44、TRIM45、TRIM46、TRIM49、TRIM50、TRIM52、TRIM58、TRIM59、TRIM65、TRIM67、TRIM69、TRIM70、TRIM74、及びTRIM75;並びにマウスTRIM30の1つ以上の発現又は活性を増加させる組成物の有効量を必要とする被験者に投与する工程を含む。
1つの実施態様では、前記方法は、RNF4及びRNF111(アルカディア)の1つ以上の発現又は活性を増加させる組成物の有効量を必要とする被験者に投与する工程を含む。
1つの実施態様では、前記方法は、1つ以上のTRIMタンパク質及び1つ以上のSTUbLの発現又は活性を増加させる組成物の有効量を被験者に投与する工程を含む。
1つの実施態様では、前記方法は、被験者の少なくとも1つの神経細胞において、1つ以上のTRIMタンパク質又は1つ以上のSTUbLの発現又は活性を増加させる工程を含む。例えば、特定の実施態様では、該方法は、少なくとも1つの神経細胞、星状細胞腫、オリゴデンドロサイト、プルキンエ細胞、錐体細胞などにおいて、1つ以上のTRIMタンパク質又は1つ以上のSTUbLの発現又は活性を増加させる工程を含む。
1つの実施態様では、前記方法は、被験者の神経組織を、1つ以上のTRIMタンパク質又は1つ以上のSTUbLの1つ以上の成分の発現又は活性を増加させる組成物の有効量と接触させる工程を含む。例えば、特定の実施態様では、該方法は、被験者の神経細胞、星状細胞腫、オリゴデンドロサイト、プルキンエ細胞、錐体細胞などを、1つ以上のTRIMタンパク質又は1つ以上のSTUbLの発現又は活性を増加させる組成物の有効量と接触させる工程を含む。
当業者は、本発明のモジュレーターは単独で又は任意の組み合わせで投与され得ることを理解しているだろう。さらに、本発明のモジュレーターは、時間的な意味で、単独で又は任意の組合せで投与され得、それらは同時に、又は互いに前に及び/又は後に投与され得る。当業者は、本明細書に提供された開示に基づいて、本発明のモジュレーター組成物を使用して、ミスフォールドタンパク質又はタンパク質凝集物に関連した疾患又は障害を予防又は治療することができ、そしてモジュレーター組成物を単独で又は別のモジュレーターと任意に組み合わせて使用することにより、予防結果又は治療結果をもたらすことができることを理解しているだろう。
様々な実施態様では、本明細書に記載の本発明のいずれかのモジュレーターを、単独で、又はタンパク質ミスフォールド若しくはタンパク質凝集物に関連した疾患に関連した他の分子の他のモジュレーターと組み合わせて投与することができる。様々な実施態様では、本明細書に記載の本発明のいずれかのモジュレーターを、単独で、又はタンパク質ミスフォールド若しくはタンパク質凝集物に関連した疾患を治療若しくは予防するために使用され得る他の治療剤若しくは予防剤と組み合わせて投与することができる。本発明のモジュレーターと組み合わせて使用され得る例示的な治療剤としては、抗アミロイドβ抗体及び抗タウ抗体が挙げられるがこれらに限定されない。
遺伝子療法
被験者の細胞を、1つ以上のTRIMタンパク質又は1つ以上のSTUbLの発現又は活性を増加させるタンパク質をコードする核酸組成物と接触させることにより、タンパク質ミスフォールド又はタンパク質凝集物に関連した疾患又は障害の1つ以上の症状の発症を抑制又は遅延させることができる。
1つの実施態様では、本発明の核酸組成物は、1つ以上のペプチドをコードする。例えば、1つの実施態様では、核酸組成物は、1つ以上のTRIMタンパク質のアミノ酸配列を含むペプチドをコードし得る。例えば、1つの実施態様では、核酸組成物は、ヒトTRIM3、TRIM4、TRIM5、TRIM6、TRIM7、TRIM9、TRIM11、TRIM13、TRIM14、TRIM15、TRIM16、TRIM17、TRIM19(本明細書では「PML」とも称される)、TRIM20、TRIM21、TRIM24、TRIM25、TRIM27、TRIM28、TRIM29、TRIM32、TRIM34、TRIM39、TRIM43、TRIM44、TRIM45、TRIM46、TRIM49、TRIM50、TRIM52、TRIM58、TRIM59、TRIM65、TRIM67、TRIM69、TRIM70、TRIM74、及びTRIM75;並びにマウスTRIM30の1つ以上を含む、ペプチドをコードする。特定の実施態様では、核酸組成物は、1つ以上のSTUbLのアミノ酸配列を含むペプチドをコードする。例えば、1つの実施態様では、核酸組成物は、RNF4及びRNF111(アルカディア)の1つ以上を含むペプチドをコードする。
本発明はまた、本明細書に開示されたペプチドに対してかなりの相同性を有するペプチドをコードしている任意の形態の核酸を含むと捉えるべきである。好ましくは、「かなり相同」であるペプチドは、本明細書に開示されたペプチドのアミノ酸配列に対して、約50%相同性、より好ましくは約70%相同性、さらにより好ましくは約80%相同性、より好ましくは約90%相同性、さらにより好ましくは約95%相同性、さらにより好ましくは約99%相同性である。
1つの実施態様では、本発明の組成物は、ペプチド、ペプチド断片、相同体、変異体、本明細書に記載のペプチドの誘導体又は塩をコードしている核酸を含む。例えば、特定の実施態様では、該組成物は、1つ以上のTRIMタンパク質、1つ以上のTRIMタンパク質の断片、1つ以上のTRIMタンパク質の相同体、1つ以上のTRIMタンパク質の変異体、又は1つ以上のTRIMタンパク質の誘導体を含む、ペプチドをコードしている核酸を含む。特定の実施態様では、該組成物は、1つ以上のSTUbL、1つ以上のSTUbLの断片、1つ以上のSTUbLの相同体、1つ以上のSTUbLの変異体、又は1つ以上のSTUbLの誘導体を含む、ペプチドをコードしている核酸を含む。
本発明によると、1つ以上のTRIMタンパク質又は1つ以上のSTUbLの減少した活性又は不十分な活性を伴う正常な遺伝子又は突然変異遺伝子を有する細胞に、タンパク質を供給する方法も提供される。突然変異遺伝子を有する細胞にタンパク質を供給することにより、レシピエント細胞の正常な機能が可能となるはずである。ペプチドをコードしている核酸をベクターで細胞内に導入し得、これにより、核酸は染色体外に留まる。このような状況では、核酸は、染色体外の位置から細胞によって発現されるだろう。より好ましいのは、核酸又はその一部が、細胞のゲノムに組み込まれるか又は細胞内に存在する内因性突然変異遺伝子と組み換えるように細胞内に導入される状況である。組換え、組み込み、及び染色体外での維持の両方のために遺伝子を導入するためのベクターは当技術分野において公知であり、そして任意の適切なベクターが使用され得る。電気穿孔法、リン酸カルシウム共沈降法、及びウイルス形質導入法などのDNAを細胞に導入するための方法は当技術分野において公知であり、そして方法の選択は実践者の技量内である。
一般的に上記に考察されているように、核酸(適用可能な場合)を遺伝子療法に使用して、これにより野生型遺伝子が「正常な」レベルで発現されているが遺伝子産物が不十分にしか機能していない人においてさえ本発明のペプチドのレベル又は活性を増加させることができる。
「遺伝子療法」は、持続的な効果が1回の処置によって達成される慣用的な遺伝子療法と、治療的に有効なDNA又はmRNAの単回投与又は反復投与を含む遺伝子療法剤の投与の両方を含む。オリゴヌクレオチドを、例えばその負に荷電したホスホジエステル基を非荷電の基によって置換することによって修飾することにより、その取り込みを増強させ得る。本発明の1つ以上のTRIMタンパク質又は1つ以上のSTUbLを、遺伝子療法を使用して、例えば神経細胞若しくは神経組織に局所的に、又は全身的に(例えば、特定の組織型に選択的に標的化するベクター、例えば組織特異的アデノ随伴ウイルスベクターを介して)送達することができる。いくつかの実施態様では、個体から収集された一次細胞を、本発明のいずれかのペプチドをコードしている核酸を用いてエクスビボでトランスフェクトし、その後、トランスフェクトされた細胞を個体の体内に戻すことができる。
遺伝子療法は当技術分野において周知である。例えば、細胞内抗体を生成するための遺伝子療法の使用を開示した国際公開公報第96/07321号を参照されたい。遺伝子療法はまた、ヒト患者において成功したことが実証されている。例えば、Baumgartner et al., Circulation 97: 12, 1114-1123 (1998), Fatham, C.G. ‘A gene therapy approach to treatment of autoimmune diseases’, Immun. Res. 18:15-26 (2007);及び米国特許第7,378089号(両方共に参照により本明細書に組み入れられる)を参照されたい。また、Bainbridge JWB et al. “Effect of gene therapy on visual function in Leber’s congenital Amaurosis”. N Engl J Med 358:2231-2239, 2008;及びMaguire AM et al. “Safety and efficacy of gene transfer for Leber’s Congenital Amaurosis”. N Engl J Med 358:2240-8, 2008も参照されたい。
ペプチド又はタンパク質をコードしている核酸(場合によりベクターに含有されている)を患者の細胞にインビボ及びエクスビボで導入するための2つの主要なアプローチがある。インビボでの送達のために、特定の場合には、核酸を患者に、時にはタンパク質が最も必要とされる部位に直接注入する。エクスビボでの処置では、患者の細胞を取り出し、核酸を、これらの単離された細胞に導入し、そして改変された細胞を患者に直接投与するか、又は例えば多孔性の膜内に封入して、これを患者に埋め込む(例えば米国特許第4,892,538号及び第5,283,187号を参照)。核酸を生細胞に導入するために利用可能な様々な技術がある。技術は、核酸が、インビトロで培養された細胞に導入されるか、又はインビボで目的の宿主の細胞に導入されるかに応じて変更される。インビトロで哺乳動物細胞に核酸を導入するのに適した技術としては、リポソーム、電気穿孔法、マイクロインジェクション、細胞融合、DEAE−デキストラン、リン酸カルシウム沈降法などの使用が挙げられる。遺伝子のエクスビボでの送達のために一般的に使用されるベクターは、レトロウイルスベクター及びレンチウイルスベクターである。
遺伝子療法は、例えばFriedman et al., 1991, Cell 66:799-806又はCulver, 1996, Bone Marrow Transplant 3:S6-9; Culver, 1996, Mol. Med. Today 2:234-236に記載のような一般的に受け入れられている方法に従って実施されるだろう。1つの実施態様では、患者の細胞をまず、当技術分野において公知である診断法によって分析し、これにより、1つ以上のTRIMタンパク質又は1つ以上のSTUbLの発現又は活性を確認する。発現制御エレメントに連結された遺伝子又はその機能的等価体のコピーを含有し、かつ細胞内で複製することのできる、ウイルスベクター又はプラスミドベクターを調製する。ベクターは、細胞内で複製することができる。あるいは、ベクターは複製欠損でもよく、そして遺伝子療法に使用するためにヘルパー細胞において複製される。米国特許第5,252,479号及び国際公開公報第93/07282号及び米国特許第5,691,198号;第5,747,469号;第5,436,146号及び第5,753,500号に開示されているように、適切なベクターは公知である。次いで、ベクターを患者に注入する。トランスフェクトされた遺伝子が各々の標的化された細胞のゲノムに永久的に取り込まれない場合、処置を定期的に反復しなければならない可能性がある。
当技術分野において公知である遺伝子導入システムは、本発明の遺伝子療法の実践において有用であり得る。これらは、ウイルス性導入法及び非ウイルス性導入法を含む。多くのウイルスが、遺伝子導入ベクターとして、又は遺伝子導入ベクターを修復するための基盤として使用され、これには、パポバウイルス(例えばSV40、Madzak et al., 1992, J. Gen. Virol. 73:1533-1536)、アデノウイルス(Berkner, 1992;Curr. Topics Microbiol. Immunol. 158:39-66)、ワクシニアウイルス(Moss, 1992, Current Opin. Biotechnol. 3:518-522; Moss, 1996, PNAS 93:11341-11348)、アデノ随伴ウイルス(Russell and Hirata, 1998, Mol. Genetics 18:325-330)、HSV及びEBVをはじめとするヘルペスウイルス(Fink et al., 1996, Ann. Rev. Neurosci. 19:265-287)、レンチウイルス(Naldini et al., 1996, PNAS 93:11382-11388)、シンドビス及びセムリキ森林ウイルス(Berglund et al., 1993, Biotechnol. 11:916-920)、及びトリ起源のレトロウイルス(Petropoulos et al., 1992, J. Virol. 66:3391-3397)、マウス起源のレトロウイルス(Miller, 1992, Hum. Gene Ther. 3:619-624)及びヒト起源のレトロウイルス(Shimada et al., 1991; Helseth et al., 1990; Page et al., 1990; Buchschacher and Panganiban, 1992, J. Virol. 66:2731-2739)が含まれる。大半のヒト遺伝子療法プロトコールは、無効にしたマウスレトロウイルスに基づくが、アデノウイルス及びアデノ随伴ウイルスも使用されている。
当技術分野において公知である非ウイルス性遺伝子導入法としては、リン酸カルシウム共沈降法などの化学的技術;力学的技術、例えばマイクロインジェクション;リポソームを介した膜融合により媒介される導入;並びに直接的なDNAの取り込み及び受容体媒介DNA導入(Curiel et al., 1992, Am. J. Respir. Cell. Mol. Biol 6:247-252)が挙げられる。ウイルスにより媒介される遺伝子導入を、リポソームでの送達を使用した直接的なインビトロでの遺伝子導入と組み合わせることにより、ウイルスベクターを腫瘍細胞に指向させ、かつ周辺の分裂していない細胞には指向させないことが可能となる。次いで、産生株の細胞の注入は、連続的なベクター粒子の供給源を提供するだろう。この技術は、手術不可能な脳腫瘍を有するヒトへの使用に認可されている。
生物学的な遺伝子導入法と物理的な遺伝子導入法を組み合わせたアプローチでは、任意のサイズのプラスミドDNAを、アデノウイルスヘキソンタンパク質に対して特異的であるポリリジンにコンジュゲートさせた抗体と組み合わせ、そして得られた複合体をアデノウイルスベクターに結合させる。次いで、三分子複合体を使用して細胞に感染させる。アデノウイルスベクターは、結合したDNAが損傷される前にエンドソームの効率的な結合、内部移行、及び分解を可能とする。アデノウイルスに基づいたベクターの送達のための他の技術については、米国特許第5,691,198号;第5,747,469号;第5,436,146号及び第5,753,500号を参照されたい。
リポソーム/DNA複合体は、直接的なインビボでの遺伝子導入を媒介することができることが示された。標準的なリポソーム調製物では、遺伝子導入プロセスは非特異的であるが、腫瘍病巣に局在化したインビボでの取り込み及び発現が、例えば直接的なインサイツでの投与後に報告されている。
遺伝子療法の脈絡での発現ベクターは、その中にクローニングされたポリヌクレオチドを発現するのに十分な配列を含有している構築物を含むことを意味する。ウイルス発現ベクターでは、構築物は、構築物のパッケージングを支持するのに十分なウイルス配列を含有している。ポリヌクレオチドがタンパク質をコードしている場合、発現によりタンパク質が産生されるだろう。ポリヌクレオチドがアンチセンスポリヌクレオチド又はリボザイムをコードしている場合、発現によりアンチセンスポリヌクレオチド又はリボザイムが産生されるだろう。したがってこの脈絡では、発現は、タンパク質産物が合成されることを必要としていない。発現ベクターにクローニングされたポリヌクレオチドに加えて、ベクターはまた、真核細胞において機能するプロモーターも含有している。クローニングされたポリヌクレオチド配列は、このプロモーターの制御下にある。適切な真核生物プロモーターとしては、上記されたものが挙げられる。発現ベクターはまた、選択マーカー及び本明細書に記載の他の配列などの配列も含み得る。
特定の実施態様では、前記方法は、単離された核酸を神経組織に直接標的化する遺伝子導入技術の使用を含む。受容体媒介遺伝子導入は、例えば、核酸分子(通常、共有結合で閉環されたスーパーコイルドプラスミドの形態)をタンパク質リガンドにポリリジンを介してコンジュゲートさせることによって達成される。リガンドは、標的細胞/組織型の細胞表面上の対応するリガンド受容体の存在に基づいて選択される。これらのリガンド−DNAコンジュゲートは所望であれば血中に直接注入され得、そして標的組織に向かい、ここでDNA−タンパク質複合体と受容体との結合及びDNA−タンパク質複合体の内部移行が起こる。DNAの細胞内破壊の問題を克服するために、アデノウイルスとの共感染を含めることにより、エンドソーム機能を破壊することができる。
医薬組成物及び製剤
本発明はまた、本発明の方法を実施するために本発明の医薬組成物又はその塩の使用を包含する。このような医薬組成物は、被験者への投与に適した形態の本発明の少なくとも1つのモジュレーター組成物又はその塩からなり得るか、あるいは、医薬組成物は、本発明の少なくとも1つのモジュレーター組成物又はその塩、及び1つ以上の薬学的に許容される担体、1つ以上の追加の成分、又はこれらのいくつかの組合せを含み得る。本発明の化合物又はコンジュゲートは、当技術分野において周知であるように、医薬組成物中に生理学的に許容される塩の形態で、例えば生理的に許容される陽イオン又は陰イオンと組み合わせて存在し得る。
1つの実施態様では、本発明の方法を実施するのに有用な医薬組成物は、1ng/kg/日から100mg/kg/日の用量を送達するように投与され得る。別の実施態様では、本発明を実施するのに有用な医薬組成物は、1ng/kg/日から500mg/kg/日の用量を送達するように投与され得る。
本発明の医薬組成物中の活性成分、薬学的に許容される担体、及び任意の追加の成分の相対量は、処置される被験者のアイデンティティー、サイズ、及び容態に応じて、並びにさらには組成物を投与しようとする経路に応じて変更されるだろう。例えば、該組成物は、0.1%〜100%(w/w)の活性成分を含み得る。
本発明の方法において有用である医薬組成物は、経口、直腸、膣内、非経口、局所、肺内、鼻腔内、頬側、眼内、又は別の投与経路用に適切に開発され得る。本発明の方法の範囲で有用な組成物は、哺乳動物の皮膚、膣、又は任意の他の組織に直接投与され得る。他の考えられる製剤としては、リポソーム調製物、活性成分を含有している再封入された赤血球、及び免疫製剤が挙げられる。投与経路(群)は当業者には容易に理解され、そして処置される疾患の種類及び重度、処置される動物被験体又はヒト被験者のタイプ及び年齢などをはじめとする多数の数の因子に依存するだろう。
本明細書に記載の医薬組成物の製剤は、薬理学の分野において公知であるか又は以後開発される任意の方法によって調製され得る。一般的に、このような調製法は、活性成分を担体又は1つ以上の他の補助的成分と配合し、その後、必要であれば又は所望であれば、産物を所望の単回用量単位又は複数回用量単位へと成形又は梱包する工程を含む。
本明細書において使用する「単位用量」は、予め決定された量の活性成分を含む医薬組成物の個別の量である。活性成分の量は一般的に、被験者に投与されるであろう活性成分の用量に等しいか、又は、このような用量の好都合な分数、例えばこのような用量の半分又は三分の一に等しい。単位投与剤形は、1日1回用量又は1日複数回用量の1つ(例えば1日あたり約1〜4回以上)であり得る。1日複数回用量が使用される場合、単位投与剤形は各用量について同じであっても異なっていてもよい。
本明細書に提供された医薬組成物の記載は原則的に、ヒトへの倫理的な投与に適した医薬組成物に向けられているが、このような組成物は一般的に全ての種類の動物への投与に適していることが当業者によって理解されるだろう。様々な動物への投与に適した組成物とするための、ヒトへの投与に適した医薬組成物の改変は、よく理解されており、そして通常の技能を有する獣医学薬理学者は、(あるとしても)単に通常の実験を用いてこのような改変を設計及び実施し得る。本発明の医薬組成物の投与が考えられる被験者は、ヒト及び他の霊長類、哺乳動物(市販の妥当な哺乳動物、例えばウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ、ネコ、及びイヌを含む)が挙げられるがこれらに限定されない。
1つの実施態様では、本発明の組成物は、1つ以上の薬学的に許容される賦形剤又は担体を使用して製剤化される。1つの実施態様では、本発明の医薬組成物は、治療有効量の本発明の化合物又はコンジュゲート及び薬学的に許容される担体を含む。有用である薬学的に許容される担体としては、グリセロール、水、食塩水、エタノール、及び他の薬学的に許容される塩溶液、例えばリン酸塩及び有機酸の塩が挙げられるがこれらに限定されない。これら及び他の薬学的に許容される担体の例は、Remington’s Pharmaceutical Sciences(1991, Mack Publication Co.、ニュージャージー州)に記載されている。
担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール(例えばグリセロール、プロピレングリコール、及び液体ポリエチレングリコールなど)、その適切な混合物、及び植物油を含有している、溶媒又は分散媒体であり得る。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティング剤の使用によって、分散液の場合には必要とされる粒径の維持によって、及び界面活性剤の使用によって維持され得る。微生物の作用の防御は、様々な抗菌剤及び抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなどによって達成され得る。多くの場合、等張剤、例えば、糖、塩化ナトリウム、又はポリアルコール、例えばマンニトール及びソルビトールを組成物中に含めることが好ましいだろう。注射用組成物の延長吸収は、該組成物中に、吸収を遅延する薬剤、例えばモノステアリン酸アルミニウム又はゼラチンを含めることによってもたらされ得る。1つの実施態様では、薬学的に許容される担体はDMSOのみではない。
製剤は、経口、膣内、非経口、鼻腔内、静脈内、皮下、経腸、又は当技術分野において公知である任意の他の適切な投与形態に適した、慣用的な賦形剤、すなわち、薬学的に許容される有機又は無機担体物質と混合して使用され得る。医薬調製物は滅菌され得、そして所望であれば補助物質、例えば潤滑剤、保存剤、安定化剤、湿潤剤、乳化剤、浸透圧に影響を及ぼすための塩、緩衝剤、着色剤、香味剤及び/又は芳香物質などと混合し得る。それらはまた、所望であれば、他の活性物質、例えば他の鎮痛剤と配合してもよい。
本明細書において使用する「追加の成分」は、以下の1つ以上を含むがこれらに限定されない:賦形剤;表面活性剤;分散剤;不活性な希釈剤;造粒剤及び崩壊剤;結合剤;潤滑剤;甘味剤;香味剤;着色剤;保存剤;生理学的に分解可能な組成物、例えばゼラチン;水性ビヒクル及び溶媒;油性ビヒクル及び溶媒;懸濁化剤;分散剤又は湿潤剤;乳化剤;粘滑剤;緩衝剤;塩;増粘剤;充填剤;乳化剤;抗酸化剤;抗生物質;抗真菌剤;安定化剤;並びに薬学的に許容されるポリマー性材料又は疎水性材料。本発明の医薬組成物中に含まれ得る他の「追加の成分」は当技術分野において公知であり、そして例えばGenaro, ed.(1985, Remington’s Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, PA)(これは参照により本明細書に組み込まれる)に記載されている。
本発明の組成物は、前記組成物の全重量に対して約0.005%〜2.0%の保存剤を含み得る。保存剤は、環境中の汚染物質に曝露された場合に腐敗を防ぐために使用される。本発明に従って有用な保存剤の例としては、ベンジルアルコール、ソルビン酸、パラベン、イミド尿素及びその組合せからなる群より選択されるものが挙げられるがこれらに限定されない。特に好ましい保存剤は、約0.5%から2.0%のベンジルアルコール及び0.05%から0.5%のソルビン酸の組合せである。
前記組成物は好ましくは、化合物の分解を抑制する抗酸化剤及びキレート剤を含む。いくつかの化合物のために好ましい抗酸化剤は、該組成物の全重量に対して約0.01重量%から0.3重量%の好ましい範囲内のBHT、BHA、α−トコフェロール、及びアスコルビン酸、より好ましくは0.03重量%から0.1重量%の範囲内のBHTである。好ましくは、キレート剤は、該組成物の全重量に対して0.01重量%から0.5重量%の量で存在する。
特に好ましいキレート剤としては、前記組成物の全重量に対して約0.01重量%から0.20重量%の重量範囲内の、より好ましくは0.02重量%から0.01重量%の範囲内のエデト酸塩(例えばエデト酸二ナトリウム)及びクエン酸が挙げられる。キレート剤は、製剤の有効期間にとって有害であり得る組成物中の金属イオンをキレートするのに有用である。BHT及びエデト酸二ナトリウムは、いくつかの化合物にとってそれぞれ特に好ましい抗酸化剤及びキレート剤であるが、他の適切かつ等価な抗酸化剤及びキレート剤も、それ故、当業者に公知であろうように代用され得る。
液体懸濁液は、水性又は油性ビヒクル中に活性成分の懸濁を達成するための慣用的な方法を使用して調製され得る。水性ビヒクルとしては、例えば、水及び等張食塩水が挙げられる。油性ビヒクルとしては、例えば、アーモンド油、油性エステル、エチルアルコール、植物油、例えば落花生油、オリーブ油、ゴマ油、又はココナッツ油、分別植物油、及び鉱油、例えば流動パラフィンが挙げられる。液体懸濁液はさらに、懸濁化剤、分散剤、又は湿潤剤、乳化剤、粘滑剤、保存剤、緩衝剤、塩、香味剤、着色剤、及び甘味剤を含むがこれらに限定されない、1つ以上の追加の成分を含み得る。油性懸濁液はさらに増粘剤を含み得る。公知の懸濁化剤としては、ソルビトールシロップ、硬化食用脂、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリドン、トラガカントゴム、アカシアゴム、及びセルロース誘導体、例えばカルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースが挙げられるがこれらに限定されない。公知の分散剤又は湿潤剤としては、レシチンなどの天然のホスファチド、アルキレンオキシドと脂肪酸との、長鎖脂肪族アルコールとの、脂肪酸とヘキシトールから誘導された部分エステルとの、又は脂肪酸とヘキシトール無水物から誘導された部分エステルとの縮合生成物(例えばそれぞれポリオキシエチレンステアレート、ヘプタデカエチレンオキシセタノール、ポリオキシエチレンソルビトールモノオレエート、及びポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート)が挙げられるがこれらに限定されない。公知の乳化剤としては、レシチン及びアカシアが挙げられるがこれらに限定されない。公知の保存剤としては、メチル、エチル、又はn−プロピル−パラ−ヒドロキシベンゾアート、アスコルビン酸、及びソルビン酸が挙げられるがこれらに限定されない。公知の甘味剤としては、例えば、グリセロール、プロピレングリコール、ソルビトール、スクロース、及びサッカリンが挙げられる。油性懸濁液のための公知の増粘剤としては、例えば、蜜ろう、固形パラフィン、及びセチルアルコールが挙げられる。
水性又は油性溶媒中の活性成分の液体溶液は、液体懸濁液と実質的に同じような方法で調製され得、主な差は、活性成分を溶媒中に懸濁するのではなく溶解することである。本明細書において使用する「油性」液体は、炭素を含有している液体分子を含み、かつ水よりも極性が低いという特徴を示すものである。本発明の医薬組成物の液体溶液は、液体懸濁液に関して記載された各成分を含み得、懸濁化剤は、溶媒中の活性成分の溶解を必ずしも助けないであろうことが理解される。水性溶媒としては、例えば、水及び等張食塩水が挙げられる。油性溶媒としては、例えば、アーモンド油、油性エステル、エチルアルコール、植物油、例えば落花生油、オリーブ油、又はココナッツ油、分別植物油、及び鉱油、例えば流動パラフィンが挙げられる。
本発明の医薬調製物の粉末製剤及び顆粒製剤は、公知の方法を使用して調製され得る。例えば錠剤を形成するために、カプセル剤を充填するために、又は水性若しくは油性ビヒクルをそこに添加することによって水性若しくは油性懸濁液若しくは溶液を調製するために使用された、このような製剤は被験者に直接投与され得る。これらの各製剤はさらに、分散剤又は湿潤剤、懸濁化剤、及び保存剤の1つ以上を含み得る。追加の賦形剤、例えば充填剤及び甘味剤、香味剤、又は着色剤も、これらの製剤に含め得る。
本発明の医薬組成物はまた、水中油滴型エマルション又は油中水滴型エマルションの剤形で調製、梱包、又は販売され得る。油相は、オリーブ油若しくは落花生油などの植物油、流動パラフィンなどの鉱油、又はこれらの組合せであり得る。このような組成物はさらに、1つ以上の乳化剤、例えばアカシアゴム又はトラガカントゴムなどの天然ゴム、大豆又はレシチンホスファチドなどの天然ホスファチド、脂肪酸とヘキシトール無水物の組合せから誘導されたエステル又は部分エステル、例えばモノオレイン酸ソルビタン、及びこのような部分エステルとエチレンオキシドの縮合生成物、例えばモノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビタンを含み得る。これらのエマルションはまた、例えば甘味剤又は香味剤をはじめとする追加の成分を含有し得る。
材料を化学的組成物を用いて浸漬又はコーティングするための方法は当技術分野において公知であり、そしてこれには、化学的組成物を表面上に沈着又は結合させる方法、化学的組成物を材料(すなわち、例えば生分解性材料を用いて)の合成中に材料の構造中に組み込む方法、及び水性若しくは油性の溶液又は懸濁液を吸着材料に吸着させる方法(その後の乾燥を伴う又は伴わない)が挙げられるがこれらに限定されない。
投与計画は、有効量を構成するものに影響を及ぼし得る。治療用製剤は、疾患の診断前又は診断後のいずれかに被験者に投与され得る。さらに、数回の分割用量並びに互い違いの用量は1日1回若しくは順次投与され得るか、又は用量は持続的に点滴され得るか、又はボーラス注射であり得る。さらに、治療用製剤の用量は、治療状況又は予防状況の緊急性に応じて比例的に増加又は減少させ得る。
本発明の組成物の被験者への、好ましくは哺乳動物への、より好ましくはヒトへの投与は、公知の手順を使用して、疾患を予防又は治療するのに効果的な用量及び期間をかけて行なわれ得る。治療効果を達成するのに必要とされる治療用化合物の有効量は、使用される具体的な化合物の活性;投与時刻;該化合物の排泄速度;処置期間;該化合物と組み合わせて使用される他の薬物、化合物、又は材料;処置される被験者の疾患又は障害の状態、年齢、性別、体重、容態、全般的な健康状態、及び以前の病歴、並びに医学分野において周知な同様の因子などの因子に応じて変更され得る。用量計画は、最適な治療応答を提供するように調整され得る。例えば、数回の分割用量を1日1回投与しても、又は用量を、治療状況の緊急性に応じて比例的に減少させてもよい。本発明の治療用化合物についての有効用量範囲の非限定的な例は、約1〜5,000mg/kg(体重)/日である。当業者は関連する因子を研究することができ、そして過度な実験を行なうことなく治療用化合物の有効量に関して決定することができるだろう。
前記化合物は、1日数回など頻繁に被験者に投与されても、あるいは、例えば1日1回、1週間に1回、2週間毎に1回、1か月に1回、又はさらにより少ない頻度で、例えば数か月毎に1回、又はさらには1年に1回、又はそれより少ない頻度などの、より少ない頻度で投与されてもよい。1日あたりに投薬される化合物の量は、非限定的な例では、毎日、隔日に、2日間毎に、3日間毎に、4日間毎に、又は5日間毎に投与され得ることが理解される。例えば、隔日の投与では、5mg/日の用量を月曜日に開始し、最初の次の5mg/日の用量は水曜日に投与され、2回目の次の5mg/日の用量は金曜日に投与され得るなどである。投与頻度は当業者には容易に明らかであり、そして処置される疾患の種類及び重度、動物の種類及び年齢などであるがこれらに限定されない多数の因子に依存するだろう。
本発明の医薬組成物中の活性成分の実際の用量レベルは、被験者に毒性を生じることなく、特定の被験者、組成物、及び投与形態において所望の治療応答を達成するのに効果的である活性成分の量が得られるように変更され得る。
当技術分野における通常の技能を有する医者、例えば内科医又は獣医は、必要とされる医薬組成物の有効量を容易に決定かつ処方し得る。例えば、内科医又は獣医は、所望の治療効果を達成するために必要とされるよりも低いレベルで医薬組成物中に使用される本発明の化合物の用量を開始し、そして所望の効果が達成されるまで用量を次第に増加させることができる。
特定の実施態様では、投与の簡易さ及び用量を均一にするために、単位投与剤形で化合物を製剤化することが特に有利である。本明細書において使用する単位投与剤形は、処置されようとする被験者のための単位投与量として適した物理的に別個の単位を指し;各単位は、必要とされる薬学的ビヒクルと共に、所望の治療効果を生じるように計算された予め決定された量の治療用化合物を含有している。本発明の単位投与剤形は、(a)治療用化合物の特有の特徴及び達成しようとする具体的な治療効果、並びに(b)被験者における疾患の処置のためにこのような治療用化合物を配合/製剤化する技術分野に固有の限界によって左右されそしてそれに直接的に依存する。
1つの実施態様では、本発明の組成物は、1日1〜5回又はそれ以上の範囲の用量で被験者に投与される。別の実施態様では、本発明の組成物は、1日1回、2日間に1回、3日間に1回から1週間に1回、及び2週間毎に1回を含むがこれらに限定されない用量の範囲で被験者に投与される。本発明の様々な組合せ組成物の投与頻度は、年齢、処置しようとする疾患又は障害、性別、全般的な健康状態、及び他の因子を含むがこれらに限定されない多くの因子に依存して、被験者毎に変更されるであろうことが当業者には容易に理解されるだろう。したがって、本発明は、いずれかの特定の投薬計画に制限されると捉えられるべきではなく、任意の被験者に投与しようとする正確な用量及び組成物は、被験者に関する全ての他の因子を考慮して担当の内科医によって決定されるだろう。
投与のための本発明の化合物は、約1mgから約10,000mg、約20mgから約9,500mg、約40mgから約9,000mg、約75mgから約8,500mg、約150mgから約7,500mg、約200mgから約7,000mg、約3050mgから約6,000mg、約500mgから約5,000mg、約750mgから約4,000mg、約1mgから約3,000mg、約10mgから約2,500mg、約20mgから約2,000mg、約25mgから約1,500mg、約50mgから約1,000mg、約75mgから約900mg、約100mgから約800mg、約250mgから約750mg、約300mgから約600mg、約400mgから約500mg、並びにその間のいずれか及び全てが全体的に又は部分的に増加したものの範囲内であり得る。
いくつかの実施態様では、本発明の化合物の用量は、約1mgから約2,500mgである。いくつかの実施態様では、本明細書に記載の組成物中に使用される本発明の化合物の用量は、約10,000mg未満、又は約8,000mg未満、又は約6,000mg未満、又は約5,000mg未満、又は約3,000mg未満、又は約2,000mg未満、又は約1,000mg未満、又は約500mg未満、又は約200mg未満、又は約50mg未満である。同様に、いくつかの実施態様では、本明細書に記載のような第二の化合物(すなわち、本発明の組成物によって処置されるのと同じ又は別の疾患を処置するために使用される薬物)の用量は、約1,000mg未満、又は約800mg未満、又は約600mg未満、又は約500mg未満、又は約400mg未満、又は約300mg未満、又は約200mg未満、又は約100mg未満、又は約50mg未満、又は約40mg未満、又は約30mg未満、又は約25mg未満、又は約20mg未満、又は約15mg未満、又は約10mg未満、又は約5mg未満、又は約2mg未満、又は約1mg未満、又は約0.5mg未満、並びにそのいずれか及び全てが全体的に又は部分的に増加したものである。
1つの実施態様では、本発明は、治療有効量の本発明の化合物又はコンジュゲートを、単独で又は第二の医薬と組み合わせて保持する容器;及び、被験者における疾患の1つ以上の症状を治療、予防、又は低減するために該化合物又はコンジュゲートを使用するための説明書を含む、梱包された医薬組成物に向けられる。
「容器」という用語は、医薬組成物を保持するための任意の入れ物を含む。例えば、1つの実施態様では、容器は、医薬組成物を含有している包装である。他の実施態様では、容器は、医薬組成物を含有している包装ではない、すなわち、容器は、包装された医薬組成物又は未包装の医薬組成物と医薬組成物の使用説明書とを含有している、箱又はバイアルなどの入れ物である。さらに、包装技術は当技術分野において周知である。医薬組成物の使用説明書は、医薬組成物を含有している包装上に含有され得、従って、説明書は、包装された製品に対して機能的に高められた関係を形成することが理解されるべきである。しかしながら、説明書は、化合物がその目的とする機能(例えば被験者における疾患を治療若しくは予防すること、又は造影剤若しくは診断剤を被験者に送達すること)を遂行する能力に関しての情報を含有し得ることが理解されるべきである。
本発明のいずれかの組成物の投与経路としては、経口、鼻腔、直腸、非経口、舌下、経皮、経粘膜(例えば舌下、舌、(経)頬側、(経)尿道、膣内(例えば経膣及び膣周囲)、鼻腔(内)、及び(経)直腸)、膀胱内、肺内、脳内、硬膜外、脳室内、十二指腸内、胃内、くも膜下腔内、皮下、筋肉内、皮内、動脈内、静脈内、気管支内、吸入、及び局所投与が挙げられる。
適切な組成物及び剤形としては、例えば、錠剤、カプセル剤、カプレット剤、丸剤、ジェルカプセル剤、トローチ剤、分散剤、懸濁剤、液剤、シロップ剤、顆粒剤、ビーズ、経皮パッチ、ジェル剤、散剤、ペレット剤、泥膏剤、ロゼンジ剤、クリーム剤、ペースト剤、プラスター剤、ローション剤、ディスク、坐剤、鼻腔内又は経口投与用の液体噴霧剤、吸入用の乾燥粉末又はエアゾル化製剤、膀胱内投与用の組成物及び製剤などが挙げられる。本発明において有用であろう製剤及び組成物は、本明細書に記載の特定の製剤及び組成物に限定されないことが理解されるべきである。
診断法
本発明は、タンパク質ミスフォールド又はタンパク質凝集物に関連した疾患又は障害を有するか又は発症するリスクがある被験者を診断するための方法を提供する。例えば、1つの実施態様では、該方法は、診断マーカーとして1つ以上のTRIMタンパク質又は1つ以上のSTUbLの発現又は活性のレベルを使用する工程を含む。1つの実施態様では、該方法は、1つ以上のTRIMタンパク質又は1つ以上のSTUbLをコードしている核酸の遺伝子突然変異の存在を検出する工程を含む。
1つの実施態様では、前記方法を使用して、被験者が、タンパク質ミスフォールド又はタンパク質凝集物に関連した疾患又は障害を有すると診断する。1つの実施態様では、該方法を使用して、被験者が、タンパク質ミスフォールド又はタンパク質凝集物に関連した疾患又は障害を発症するリスクがあると診断する。1つの実施態様では、該方法を使用して、タンパク質ミスフォールド又はタンパク質凝集物に関連した神経変性疾患又は障害の治療法の有効性を評価する。
1つの実施態様では、前記方法は、被験者から生物学的試料を回収する工程を含む。例示的な試料としては、血液、尿、糞便、汗、胆汁、血清、血漿、組織生検材料などが挙げられるがこれらに限定されない。例えば、1つの実施態様では、試料は、神経組織の少なくとも1つの細胞を含む。1つの実施態様では、試料は、神経細胞、星状細胞腫、オリゴデンドロサイト、プルキンエ細胞、錐体細胞などを含む。
1つ以上のTRIMタンパク質又は1つ以上のSTUbLの減少した発現又は活性を検出するための方法は、遺伝子又はその産物を核酸レベル又はタンパク質レベルのいずれかで調べる任意の方法を含む。このような方法は当技術分野において周知であり、そしてこれには、核酸ハイブリダイゼーション技術、核酸逆転写法、及び核酸増幅法、ウェスタンブロット、ノザンブロット、サザンブロット、ELISA、免疫沈降法、免疫蛍光法、フローサイトメトリー、免疫細胞化学法が挙げられるがこれらに限定されない。特定の実施態様では、破壊された遺伝子の転写が、タンパク質レベルで、例えば特定のタンパク質に対して指向される抗体を使用して検出される。これらの抗体は、ウェスタンブロット、ELISA、免疫沈降法、フローサイトメトリー、又は免疫細胞化学技術などの様々な方法において使用され得る。
組換えタンパク質の製造法
特定の実施態様では、本発明は、関心対象の組換えタンパク質の産生において、1つ以上のTRIMタンパク質、1つ以上のSTUbL、又はその組合せを使用する方法を提供する。例えば、1つ以上のTRIMタンパク質、1つ以上のSTUbL、又はその組合せを使用して、関心対象の組換えタンパク質のタンパク質凝集物を脱凝集することができ、これにより、関心対象の組換えタンパク質の産生及び回収が可能となる。
特定の実施態様では、前記方法は、1つ以上のTRIMタンパク質、1つ以上のSTUbL、1つ以上のTRIMタンパク質をコードしている核酸分子、1つ以上のSTUbLをコードしている核酸分子、又はその組合せを細胞に投与する工程を含む。特定の実施態様では、該細胞は、関心対象の組換えタンパク質を発現するように改変されている。該細胞は、酵母発現系、細菌発現系、昆虫発現系、又は哺乳動物発現系を含むがこれらに限定されない任意の発現系のものであり得る。
実験例
本発明は、以下の実験例を参照にしてさらに詳細に記載される。これらの実施例は説明のためだけに提供され、特記されない限り制限する意図はない。したがって、本発明は、以下の実施例に限定されると決して捉えられるべきではなく、むしろ、本明細書に提供された教示の結果として明白となった任意の及び全ての変化形を包含するものと捉えられるべきである。
さらに説明しなくても、当業者は、前記及び以下の例示的実施例を使用して、本発明を作製及び利用し、そして特許請求された方法を実施することができると考えられる。それ故、以下の作業実施例は、本発明の好ましい実施態様を具体的に指摘するものであり、そしていずれにしても残りの開示を制限するものと捉えられるべきではない。
実施例1:ミスフォールドタンパク質を分解しそして神経変性症から保護する細胞系
ミスフォールドタンパク質は細胞機能を損ないそして疾患を引き起こす。これらのタンパク質がどのように検出されそして分解されるかはあまりよく解明されていない。本明細書に提示された実験は、PML(TRIM19としても知られる)及びSUMO依存性ユビキチンリガーゼRNF4が一緒に、哺乳動物細胞核内のミスフォールドタンパク質の分解を促進するように作用することを示す。PMLは個別の基質認識部位を通してミスフォールドタンパク質と選択的に相互作用し、そしてこれらのタンパク質をそのSUMOリガーゼ活性を通して低分子ユビキチン様修飾因子(SUMO)とコンジュゲートさせる。次いで、SUMO化ミスフォールドタンパク質はRNF4によって認識されそしてユビキチン化され、そして続いてプロテアソームによる分解のために標的化される。さらに、PMLの欠損は、脊髄小脳失調症1(SCA1)マウスモデルにおけるポリグルタミン(ポリQ)疾患を悪化させることが本明細書において実証されている。これらの所見は、連続的なSUMO化及びユビキチン化を通してミスフォールドタンパク質を除去する哺乳動物系を明らかとし、そしてタンパク質ミスフォールド疾患に対する保護におけるその役割を規定する。
前骨髄球性白血球タンパク質(PML;TRIM19としても知られる)は、N末端のTRIM/BRCC領域(RINGドメイン、1つ又は2つのBボックス、及びコイルドコイル(CC)モチーフからなる)、続いてC末端可変領域を含有している、トリパータイトモチーフ(TRIM)タンパク質ファミリーのメンバーである。PMLは主に核内タンパク質であり、そしてPML核内構造体の冠名の成分である。それは、アポトーシス、転写、DNA損傷シグナル伝達、及び抗ウイルス応答をはじめとする多種多様な細胞プロセスに関与している(Bernardi and Pandolfi, 2007, Nat Rev Mol Cell Biol, 8: 1006-1016)。とりわけ、PMLはまたSCAに関連したポリQタンパク質によって形成された凝集物と共局在し(Skinner et al., 1997, Nature, 389, 971-974; Takahashi et al., 2003, Neurobiol Dis, 13: 230-237)、そして過剰発現されると、それらの中の少なくとも1つ(アタキシン−7の突然変異体)の分解を促進する(Janer et al., 2006, J Cell Biol, 174: 65-76)。これらの観察が重要である可能性があるにも関わらず、ミスフォールドタンパク質の除去におけるPMLの役割はあまりよく解明されていない。特に、PMLが、核内ミスフォールドタンパク質の除去に広範な役割を果たしているかどうかは不明である。PMLがミスフォールドタンパク質を除去する分子機序の重要な問題は取り組まれていない。さらに、ミスフォールドタンパク質に対するPMLの効果の生理学的関連性も不明である。
これらの実験に使用された材料及び方法をこれから記載する。
プラスミド
全てのタンパク質は特記されない限りヒト起源である。哺乳動物細胞において以下のタンパク質を発現するためのプラスミドは、pRK5においてPCRによって作製され、そして各々を、NH2末端又はCOOH末端において、示されているようなHA、FLAG、又は6×Hisタグ、又はGST若しくはGFPタンパク質と融合させた:FLAG−PML突然変異体(特記されない限りアイソフォームIV);GST−PML;Atxn1 82Q−GFP、HA−Atxn1 82Q−FLAG、FLAG−Atxn1 82Q;HA−Httex1p 97QP、及びHA−Httex1p 97QP(KR);FLAG−nFluc−GFP、FLAG−nFlucSM−GFP、及びFLAG−nFlucDM−GFP;HA−RNF4、HA−RNF4 SIMm、HA−RNF4−FLAG、及びHA−RNF4 SIMm−FLAG;並びにHA−SUMO2 KR。Atxn1 82Qプラスミドは、H. Orr(Riley et al., 2005, J Biol Chem, 280: 21942-21948)によって提供されたFLAG−Atxn1 82Q/pcDNAプラスミドに基づいて作製され;Httex1p 97QP及びHttex1p 97QP(KR)(ここでK6、K9、及びK15はArgへと変化させた)はSteffan et al., 2004, Science, 304: 100-104に基づき;そしてnFlucプラスミドはGupta et al., 2011, Nat Methods, 8: 879-884に基づいている。各nFlucタンパク質を、NH2末端においてSV40核移行シグナル(PKKKRKV)(配列番号147)に融合させ、そしてCOOH末端においてGFPと融合させた。FlucDMでは、R188及びR261をGluへと変化させ;FlucSMでは、R188をGluへと変化させた(Gupta et al., 2011, Nat Methods, 8: 879-884)。RNF4のPCR増幅用鋳型は、オープンバイオシステムズ社(遺伝子アクセッション番号:NM002938)から購入した。RNF4 SIMmでは、SIM内の以下の残基をAlaへと変化させた:I36、L38、及びV39(SIM1);I46、V47、及びL49(SIM2);V57、V58、及びV59(SIM3);並びにV67、V68、I69、及びV70(SIM4)。SUMO2 KRでは、内部SUMO化共通部位のLys11をArgへと突然変異させた。
細菌における発現のために、Htt 25Q、Htt 103Q、Htt 52Q、Htt 52Qcc−、PML CC−FLAG、RNF4、及びRNF4 SIMmのGST融合物を、追加のクローニング部位を有するpGEX−1λTの誘導体であるpGEX−1ZTにおいて構築した。Htt 25Q、Htt 52Q、及びHtt 103Qは、Httアミノ酸1〜17、次いで長さの示されたポリQ伸長配列を含有していた(Krobitsch and Lindquist, 2000, Proc Natl Acad Sci USA, 97: 1589-1594)。Htt 52Q及びHtt 52Qcc−cDNAを、合成オリゴを接続することによって構築した。FLAG−PML F12(571−633)−6xHisをpET28aにおいて構築した。この研究のために作製された全てのプラスミドはDNAシークエンスによって確認された。
以下のプラスミドは以前に記載されていた:FLAG−PML、FLAG−PML M6(これは、C57S、C60S、C129A、C132A、C189A、及びH194A突然変異を有していた)、6×His−SUMO1、及び6×His−SUMO2(Chu and Yang, 2011, Oncogene, 30: 1108-1116);FLAG−Atxn1 82Q及びFLAGAtxn1 30Q(Riley et al., 2005, J Biol Chem, 280: 21942-21948);ルシフェラーゼ−6×His(フォティナス・ピラリス(Photinus pyralis)ルシフェラーゼ変異体)(Sharma et al., 2010, Nat Chem Biol, 6: 914-920);GST−rRNF4(ここで「r」はラット起源を示し、以下も同じである)、GSTrRNF4 CS1(ここでC136及びC139をSerに変化させた)、FLAG−rRNF4、及びFLAGrRNF4 CS(ここでC136、C139、C177、及びC180をSerに変化させた)(Hakli et al., 2004, FEBS Lett, 560: 56-62);及びPMLアイソフォームI、II、III、IV、及びVI(図8Aに使用される)(Xu et al., 2005, Mol Cel, 17: 721-732)。
siRNA
PML及びRNF4 siRNAはキアゲン社から購入し、そしてセンス鎖配列は以下であった:PML#4、CTCCAAGATCTAAACCGAGAA(配列番号148);PML#9、CACCCGCAAGACCAACAACAT(配列番号149);RNF4#5、CCCTGTTTCCTAAGAACGAAA(配列番号150);RNF4#6(TAGGCCGAGCTTTGCGGGAAA)(配列番号151);RNF4#8、AAGACTGTTTCGAAACCAACA(配列番号152)。RNF4を、siRNAを個々に用いて又は等モル比で組み合わせてのいずれかでノックダウンした。SUMO1 siRNA(サーモサイエンティフィック社、siGENOME SMARTpool M-016005-03-0005)は4つの標的特異的siRNA二本鎖のプールであった。センス鎖配列は以下であった:TCAAGAAACUCAAAGAATC(配列番号153)、GACAGGGTGTTCCAATGAA(配列番号154)、GGTTTCTCTTTGAGGGTCA(配列番号155)、及びGAATAAATGGGCATGCCAA(配列番号156)。SUMO2/3siRNA(サンタクルズ社、sc−37167)は、3つの異なるsiRNA二本鎖のプールであり、そしてセンス鎖配列はCCCAUUCCUUUAUUGUACA(配列番号157)、CAGAGAAUGACCACAUCAA(配列番号158)、及びCAGUUAUGUUGUCGUGUAU(配列番号159)であった。
細胞培養及びトランスフェクション
GFP−SUMO2又はGFP−SUMO3を発現しているHeLa細胞(ATCCから)及びU2OS細胞(Mukhopadhyay et al., 2006, J Cell Biol, 174: 939-949)を、標準的な培養条件で維持した。DNAプラスミドを、リポフェクタミン2000を使用して細胞にトランスフェクトした。PML及びAtxn1を共トランスフェクトした場合、FLAG−PMLとAtxn1 82Q/30Q−GFP、又はHA−PMLとFLAG−Atxn1 82Q/30Qを使用した。HA−RNF4及びHA−RNF4−FLAGプラスミドを、それぞれタンパク質発現及び細胞内局在化を試験するために使用した。
製造業者の説明書に従って、リポフェクタミン2000又はRNAiMAX(インビトロジェン社)を使用したsiRNA。ノックダウン実験のために、2回のsiRNAトランスフェクションを連日実施した。DNA及びsiRNAの両方をトランスフェクトした場合、DNAは、組み合わせたRNF4 siRNAを用いての処置から4〜6時間後、及び他のsiRNAを用いての処置の翌日にトランスフェクトされた。MG132(シグマ社)を、7.5〜10μM(最終濃度)で最後のトランスフェクションから24時間後に4〜5時間かけて加えた。
RNF4 shRNAの安定な細胞株の作製
pLKO.1にクローニングされたヒトRNF4に対するshRNAはサーモサイエンティフィック社から得られた。shRNA4のアンチセンス配列はTGGCGTTTCTGGGAGTATGGG(配列番号160)(TRCN0000017054)である。レンチウイルスでの産生のために、293T細胞を、レンチウイルスベクター、Gagヘルパープラスミド、Revヘルパープラスミド、及びVSVGヘルパープラスミドを用いてトランスフェクトした。ウイルス含有培地を48時間目及び72時間目に回収し、そして100gで5分間遠心分離にかけた。HeLa細胞を、ポリブレンと共にウイルス含有上清を使用して形質導入し、そしてピューロマイシンを用いて選択した。pLKO.1ベクターを使用して安定な対照細胞を作り出した。
細胞溶解液の分画、フィルター位相差アッセイ、及びウェスタンブロット
細胞溶解液をNP−40含有緩衝液中で作製し、そして遠心分離によって上清(NS)及びペレットへと分画した。両方の画分を、2%SDSを含有している緩衝液中で煮沸し、そしてウェスタンブロットによって分析した。ペレットの一部をSR種についてフィルター位相差アッセイによって分析した。
試料は、改変を加えて記載の通りに調製された(Janer et al., 2006, J Cell Biol, 174: 65-76)。細胞を収集し、そして50mMトリス、pH8.8、100mM NaCl、5mM MgCl2、0.5%NP−40、2mM DTT、250IU/mlのベンゾナーゼ(シグマ社)、1mM PMSF、1×完全プロテアーゼ混液(ロシュ社)、及び20mM N−エチルマレイミド(NEM;シグマ社)を含有している緩衝液中で氷上で30分間かけて溶解した。タンパク質濃度は、ブラッドフォードアッセイ(バイオラッドラボラトリーズ社)によって決定された。全細胞溶解液を4℃で13,000rpmで15分間遠心分離にかけた。NP−40に可溶性(NS)のタンパク質を含有している上清をSDS−PAGEによって分析した。ペレットをペレット緩衝液(20mMトリス、pH8.0、15mM MgCl2、2mM DTT、250IU/mlベンゾナーゼ、1mM PMSF、1×完全プロテアーゼ混液、及び20mM NEM)に再懸濁し、そして氷上で30分間インキュベートした。ペレット画分を2%SDS、50mM DTT中で煮沸した。煮沸されたペレット画分の一部をSDS−PAGEによって分離し、そしてゲルに進入しているタンパク質(SDS可溶性、SS)をウェスタンブロットによって検出した。他の部分を、以前に記載されているように(Wanker et al., 1999, Methods Enzymol, 309: 375-386)孔径0.2μmのメンブランフィルターにアプライし、そしてフィルター上に保持されたSDS抵抗性(SR)凝集物をイムノブロットによって分析した。
以下のタンパク質に対する一次抗体を、ウェスタンブロットのために使用し、製品の情報及び希釈率が示されている:PML(ウサギ、H−238、1:1,000及びヤギ、N−19、1:500)、ユビキチン(マウス、P4D1、1:10,000)及びHA(ウサギ、Y−11、1:500)(サンタクルズバイオテクノロジー社);FLAG(マウス、M2、1:7,500)、アクチン(ウサギ、1:10,000)、及びβ−チューブリン(マウス、1:5,000)(シグマ社);GFP(マウス、1:4,000)(クロンテック社);GST(ヤギ、1:1000、GEヘルスケアライフサイエンシーズ社);SUMO1(マウス、1:500、インビトロジェン社);SUMO2/3(ウサギ、1:250、アブジェント社);HA(トランスフェクトされたHA−RNF4のための)(ラット、3F10、セイヨウワサビペルオキシダーゼ又はHRPにコンジュゲート、1:10,000)(ロシュ社);RNF4(マウス、1:500、アブノバ社、及び抗原ペプチドDLTHNDSVVI(配列番号161)を使用してアブマート社によって開発されたマウスモノクローナル抗体、1:1,000)。トランスフェクトされたFLAG−PMLを抗FLAG抗体によって検出し、そしてトランスフェクトされたHA−PML及びHA−RNF4をHA抗体によって検出した。
二次抗体をHRP(サンタクルズバイオテクノロジー社)にコンジュゲートさせたか、又はIRD Fluor800又はIRD Fluor680(LI−COR社)を用いて標識した。ウェスタンブロットを、ECL試薬を使用して展開し、そしてImageJを使用して分析したか、又はオデッセイ赤外線イメージングシステムを用いて走査し、そしてImage Studio Lite(LI−COR社)を使用して分析した。
培養細胞の免疫蛍光
カバーガラス上に培養した細胞を、4%パラホルムアルデヒドを用いて15分間かけて固定し、0.2%トリトンX−100を用いて15分間かけて透過処理を行ない、1%BSAを用いて遮断し、そして示されたような抗体と共にインキュベートした。細胞に、DAPI(DNA検出用)(ベクターラボラトリーズ社)を含有している培地を載せ、そしてニコンEclipseE800又はオリンパスIX81顕微鏡を用いて画像を取得した。以下の一次抗体を使用し、製品の情報及び濃度が示されている:PML(ウサギ、H−238、及びマウス、PG−M3、1:100)、RNF4(ヤギ、C−15、1:25)(サンタクルズバイオテクノロジー社)、及びFLAG(トランスフェクトされたFLAG−PML及びHA−RNF4−FLAGのための)(マウス、M2、1:2,000)(シグマ社)。二次抗体は、FITCのコンジュゲートした抗マウス、抗ウサギ(ザイムド社)、及び抗ヤギ(インビトロジェン社)IgG;テキサスレッドのコンジュゲートした抗マウス及び抗ウサギIgG(ベクターラボラトリーズ社);並びにローダミンレッド−Xのコンジュゲートした抗ヤギ(ジャクソンイムノリサーチラボラトリーズ社)であった。
Atxn1 82Q、Httex1p 97QP、及びSUMO2陽性Atxn1 82Q凝集物の定量のために、10個以上の無作為に選択された領域からのそれぞれ約400個、500個、及び200個の細胞を調べた。Atxn1 82Q封入体のサイズをImageJを使用して測定し、そして細胞を、細胞内の最大の封入物に基づいて分類した。PMLの存在下及び非存在下において様々なサイズの凝集物を有する細胞の比率のP値を、カイ二乗検定を使用して計算した。Httex1p 97QPを用いてトランスフェクトされた細胞については、それらの中の約30%が細胞質内又は核内の凝集物のいずれかを有していた。
タンパク質の半減期のアッセイ
細胞を、[35S]Met及び[35S]Cysの補充されたMet及びCys非含有DMEM培地中でパルス標識し、その後、通常のDMEM中で培養した。あるいは、細胞をCHXを用いて処置した。細胞溶解液中の免疫沈降した[35S]Atxn1 82Q又は標識されていないAtxn1 82Qを、オートラジオグラフィー又はウェスタンブロットによって分析した。
パルスチェイス分析のために、HeLa細胞を、FLAG−Atxn1 82Qを単独で用いて又は適度の量のPMLと一緒に用いてトランスフェクトした。トランスフェクションから17時間後、細胞を、Met及びCys非含有DMEM培地中で30分間培養し、その後、[35S]Met及び[35S]Cys(各々100μCi/ml)を用いて30分間かけてパルス標識した。その後、細胞をPBSで2回濯ぎ、そして10%FBSを含むDMEM中で0〜18時間かけて追跡した。細胞を、2%SDS及び50mM DTTを含有しているIP−溶解緩衝液(50mM HEPES、pH7.5、150mM NaCl、0.5%NP−40、及び2mM DTT)中で溶解し、そして95℃で10分間煮沸した。全細胞溶解液を13,000rpmで15分間遠心分離にかけた。上清をIP−溶解緩衝液中で20倍に希釈し、そして抗FLAG M2ビーズと共に4℃で一晩インキュベートした。ビーズを、追加の0、0.5M、及び1M KClを含むIP溶解緩衝液で順次洗浄し、そして2%SDS試料緩衝液中で煮沸した。試料をSDS−PAGEによって分離し、そしてオートラジオグラフィーによって分析した。様々な条件下でAtxn1 82Qの半減期をより良く比較するために、0時間目において同じようなシグナル強度を有する露光を提示した。
Atxn1 82Qのトランスフェクトされた細胞のシクロヘキシミド(CHX)による処置のために、トランスフェクションから4〜5時間後に150μg/mlのCHXを細胞培養培地に加えた。細胞を収集し、そして指定された時点でドライアイス上で瞬間凍結させ、溶解し、そしてウェスタンブロット分析のために分画した。nFlucDMのトランスフェクトされた細胞のCHXによる処置のために、トランスフェクションから17時間後に50μg/mlのCHXを細胞培養培地に加えた。細胞を指定された時点で収集し、そして全細胞溶解液をウェスタンブロット分析のために使用した。
定量RT−PCR分析
全RNAをトリゾール(インビトロジェン社)を使用して抽出した。cDNA合成を、ファーストストランドcDNA合成キット(マーリゲンバイオサイエンシーズ社)を使用して全RNAの逆転写によって実施した。ヒトAtxn1(Hs00165656_m1)及び18srRNA(4333760F)プライマー/プローブセットを含むタックマン遺伝子発現アッセイ(アプライドバイオシステムズ社)をqPCR分析のために使用した。
タンパク質の精製
FLAG−PML、FLAG−PML M6、及びFLAG−Atxn1 82Q−HAを293T細胞において発現させ、そして改変を加えて以前に記載されているように(Tang et al., 2006, Nat Cell Biol, 8: 855-862; Tang et al., 2004, J Biol Chem, 279: 20369-20377)、抗FLAG M2ビーズ(シグマ社)によって精製した。細胞を、1mM PMSF及び1×完全プロテアーゼ混液の補充されたIP溶解緩衝液(50mMトリス、pH7.5、150mM NaCl、0.5%トリトンX−100、0.5%NP−40、及び2mM DTT)中で溶解した。PMLの精製のために、IP溶解緩衝液にも、20μM ZnCl2を補充した。溶解液を13,000rpmで15分間遠心分離にかけた。上清を、抗FLAG M2ビーズと共に4℃で4時間から一晩インキュベートした。M2ビーズを順次、0、0.5、及び1M KClを含有しているIP溶解緩衝液を用いて、並びに溶出緩衝液(50mMトリス、pH7.5、150mM NaCl、及び2mM DTT)を用いて洗浄した。結合したタンパク質を、0.1〜0.3mg/mlの3×FLAGペプチド(シグマ社)を含有している溶出緩衝液で溶出した。FLAG−PML及びFLAG−PML M6調製物中に観察される主要な追加のバンドは、ウェスタンブロット及び質量分光分析の両方に基づいてPMLに由来していた(図11G)。
PMLのGST融合物を、293T細胞において発現させ、そしてグルタチオン−セファロース(商標)4Bビーズ(GEヘルスケアライフサイエンシーズ社)を使用して上記のものと類似した溶解条件及び洗浄条件を用いて精製した。rRNF4、rRNF4 CS1、RNF4及びRNF4 SIMmのGST融合物を、エシェリヒアコリBL21 DE3又はロゼッタ2(EMDケミカルズ社)において発現させ、そして以前に記載されているように(Hakli et al., 2001, J Biol Chem, 276: 23653-23660)精製した。細菌を37℃でA600nm=0.6〜0.8となるまで増殖させ、そしてタンパク質発現のために0.3mM IPTGを用いて30℃で3時間かけて誘導した。GSTでタグ化されたタンパク質を、グルタチオンビーズを用いて精製した。0.1mM IPTGをタンパク質発現の誘導に使用した以外は、GST及びHtt25Q、Htt103QのGST融合物を同じようにして精製した。結合したタンパク質を、30mMグルタチオン(シグマ社)を含有している溶出緩衝液で溶出した。
ルシフェラーゼ−6×Hisを、以前に記載されているように(Sharma et al., 2010, Nat Chem Biol, 6: 914-920)BL21DE3において発現させた。固定された天然ルシフェラーゼLuc(N)を生成するために、Ni−NTAビーズ(キアゲン社)を細菌溶解液と共にインキュベートし、そして製造業者の説明書に従って洗浄した。変性させたルシフェラーゼLuc(D)は、固定されたLuc(N)を8M 尿素で5分間処理することによって生成された。ルシフェラーゼ活性アッセイは、僅か0.2%の酵素活性が尿素処理後に残っていたことを示した。対照ビーズのために、ルシフェラーゼを全く発現していない細菌からの溶解液を、Ni−NTAビーズと共に平行してインキュベートした。
ルシフェラーゼペプチド走査に使用するPML突然変異体を生成するために、FLAG−PML F12(571〜633)−6xHis及びGST−PML CC−FLAGを、BL21 DE細胞において室温で、3時間及び1時間かけてそれぞれ0.1mM IPTGにより誘導しながら発現させた。Flag−PML F12(571〜633)−6xHisを、M2ビーズ及びFLAGペプチド溶出液を使用してまず精製し、そして製造業者の説明書に従ってNi−NTAビーズを使用して2回目の精製にかけた。PML CCドメインを生成するために、TEVプロテアーゼ切断部位を、GSTとPML CCの間に導入した。GST−PML CC−FLAGのコンジュゲートしたグルタチオンビーズを、TEVプロテアーゼ(シグマ社)と共に製造業者の説明書に従ってインキュベートして、GST部分から(及びビーズから)PML CC−FLAGを遊離させた。プルダウンアッセイのために使用するPML CC−FLAGを、精製されたPML CC−FLAGタンパク質をM2ビーズと共にインキュベートすることによって生成し、そして上記のように洗浄した。
プルダウンアッセイ
FLAGプルダウンアッセイのための、抗FLAG M2ビーズに結合させたFLAG−PML、FLAG−GFP、及びPML CC−FLAGは、上記のように調製された。精製されたGST−Htt 25Q、GST−Htt 103Q、GST−Htt 52Q又はGST−Htt 52Qcc−を、13,000rpmで15分間遠心分離にかけ、あらゆる凝集タンパク質を除去した。同等なモル濃度のFLAG−PML(2.5μg)又はFLAG−GFP(1.1μg)を、GST−Htt 25Q又はGST−Htt 103Q(各々2.5μg)と共に、Hsp70(2.5μg)及びHsp40(1.4μg)(エンドライフサイエンシーズ社)の非存在下又は存在下で、最終容量200μlのアッセイ緩衝液(50mMトリス、pH7.5、150mM NaCl、及び2mM DTT、0.5%NP−40)中で4℃で2時間インキュベートした。ビーズを、コンパクトリアクションカラム(アフィメトリックス/USB社)でIP溶解緩衝液を用いて3回洗浄し、そして2%SDS試料緩衝液中で煮沸した。試料をウェスタンブロットによって分析した。PML CCプルダウンアッセイは、PML CC−FLAG 1.6μgを含有しているM2ビーズ又は対照M2ビーズをGST又はGST−Httタンパク質 5μgと共にインキュベートした以外は、同じように実施された。
GSTプルダウンアッセイのために、グルタチオン−セファロース(商標)4Bビーズに結合させたGST、GST−Htt 25Q、及びGST−Htt 103Qタンパク質の各々2μgをFLAG−PMLタンパク質を発現している293T細胞由来の溶解液400μgと共に4℃で4時間インキュベートした。ビーズを、コンパクトリアクションカラムでIP溶解緩衝液を用いて3回洗浄し、そして2%SDS試料緩衝液中で煮沸した。試料をウェスタンブロットによって分析した。PML突然変異体とHttとの間の相互作用を検出するために、[35S]Metで標識された完全長及び突然変異体のPMLタンパク質を、SP6結合転写/翻訳共役系(プロメガ社)を使用して生成し、そしてビーズに結合させたGST、GST−25Q、及びGST−Htt 103Qと共に150μlのIP溶解緩衝液中で4℃で一晩インキュベートした。ビーズを、上記のように洗浄しそして煮沸した。インプット及びプルダウン試料をオートラジオグラフィー及びクーマシーブルー染色によって分析した。オートラジオグラフィーのために、異なるゲル上で分離された同じ実験由来のプルダウン試料を同じ露光時間にかけた。
ルシフェラーゼプルダウンアッセイのために、等量の細菌溶解液から調製されたNi−NTAビーズ又は対照ビーズに結合させたLuc(N)又はLuc(D)3μgを、精製されたGST(1μg)、GST−PML(3μg)と共に、Hsp70(3μg)及びHsp40(1.7μg)又は[35S]Metで標識された完全長及び突然変異PMLタンパク質の非存在下又は存在下において、15mMイミダゾール、1mM DTT、0.5%トリトンX−100及び0.5%NP−40を含有しているPBS 200μl中で、4℃で4時間インキュベートした。ビーズを、20mMイミダゾール、1mM DTT、0.5%トリトンX−100及び0.5%NP−40を含有しているPBSを用いて3回洗浄し、そして煮沸した。インプット試料及びプルダウン試料を上記のように分析した。
PMLドメインへの結合についてのセルロース結合ペプチドのスクリーニング
フォティナス・ピラリスルシフェラーゼについてのペプチドライブラリー(10個のアミノ酸が重複している13アミノ酸長)を、自動スポット合成(JPTペプチドテクノロジーズ社)によって調製した。ペプチドアレイ膜に、精製されたPML SRS1及びSRS2断片をプローブした。ペプチドアレイ膜をオデッセイ遮断緩衝液(LI−COR社)を用いて遮断し、そしてFLAG−PML F12(571〜633)−HisX6又はPML F4/CC−FLAG(各々150nM)と共にTBS−T(50mMトリス、pH8.0、137mM NaCl、2.7mM KCl、0.05%Tween及び1mM DTT)中で4℃で2時間インキュベートした。膜を洗浄し、そして製造業者の説明書に従ってマウス抗Flag抗体及び抗マウスHRP抗体を用いてブロットした。ブロットを、ECL試薬を使用して展開した。抗Flag抗体及び抗マウスHRP抗体のみを有するブロット上のバックグラウンドシグナルは長時間の露光でも最小限であった。ペプチドアレイ膜を製造業者のプロトコールに従って再生した。
SUMO化及びユビキチン化分析
細胞又はインビトロの反応混合物を、2%SDSを含有している緩衝液中で煮沸し、その後、SDSを含まない緩衝液で希釈したか、又はバイオスピンクロマトグラフィーカラムを通過させることにより、SDS濃度を低下させた。タンパク質を免疫沈降させ(変性IPすなわちd−IP)、そしてウェスタンブロットによって分析した。
インビボでのSUMO化及びユビキチン化アッセイ
細胞を、FLAG−Atxn1、FLAG−nFluc−GFP及び示されているような他の発現プラスミドを用いてトランスフェクトした。図4Aに示された実験のために、SUMO2を発現しているプラスミドも使用した。トランスフェクションから24時間後、細胞を、7.5μMのMG132又はDMSOを用いて5時間かけて処置したか、又は未処置のままとし、そして2%SDS及び50mM DTTの補充されたIP溶解緩衝液中で収集した。変性免疫沈降(d−IP)のために、細胞溶解液を95℃で10分間煮沸した。1つの分取分を、ウェスタンブロット分析のために保存した。残りの溶解液はIP溶解緩衝液で20倍に希釈したか、又はIP溶解緩衝液を用いて平衡化したバイオスピンクロマトグラフィーカラム(バイオラッド社)を通過させ、SDSの濃度を低下させた。次いで、溶解液を抗FLAG(M2)ビーズと共に4℃で4時間又は一晩インキュベートした。ビーズを、FLAGでタグ化されたタンパク質の精製について記載されている通りに洗浄し、そして2%SDS試料緩衝液中で煮沸した。ビーズからのタンパク質を、ウェスタンブロットによって抗FLAG抗体、抗SUMO2/3抗体、抗SUMO1抗体、抗ユビキチン抗体、及び示されているような他の抗体を用いて分析した。ユビキチン化種又はSUMO化種のレベルをより良く比較するために、同じようなレベルの未修飾タンパク質を含有しているd−IP産物をしばしばウェスタンブロット分析のために使用した。
インビトロでのSUMO化アッセイ
インビトロでのユビキチン化及びSUMO化反応のための成分はボストンバイオケム社から購入した。インビトロのSUMO化アッセイは、精製されたHA−Atxn1 82Q−FLAG(600ng/200nM)、FLAG−PML(図4Dでは、50及び200ng、又は22及び90nM;図4Eでは、100ng又は45nM)又はFLAG−PML M6(100ng又は45nM)、SAE1/SAE2(125nM)、Ubc9(1μM)、His−SUMO2(25μM)、Hsp70(420ng/200nM)、Hsp40(240ng/200nM)及びBSA(0.1μg/ml)を含有している反応緩衝液(50mMトリスpH7.5、5.0mM Mg2+−ATP、及び2.5mM DTT)30μl中で37℃で1.5時間実施された。反応混合物を、2%SDS及び50mM DTTを含有しているIP溶解緩衝液 30μlの添加、及び95℃で10分間の加熱によって変性させた。加熱した反応混合物の1つの分取分を、ウェスタンブロット分析のために保存し、そして残りをSDSを含まないIP溶解緩衝液で20倍に希釈した。HA−Atxn1−FLAGを抗HAビーズ(ロシュ社)によって免疫沈降させ、そして抗SUMO2/3抗体を使用してSUMO2/3による修飾について分析した。
インビトロのユビキチン化アッセイ
RNF4の自己ユビキチン化のためのインビトロアッセイを、精製されたGST−RNF4タンパク質(250ng/530nM)、UBE1(125nM)、UbcH5a(625nM)、ユビキチン(2.5μg/30μM)、及びMg2+−ATP(2.5mM)を含有している反応緩衝液(50mMトリスpH7.5及び2.5mM DTT)10μl中で37℃で1時間実施した。反応混合物を95℃で10分間加熱し、そしてウェスタンブロットによって分析した。
SUMO化されたAtxn1 82Qのインビトロでのユビキチン化のために、SUMO化Atxn1 82Qタンパク質と未修飾Atxn1 82Qタンパク質との混合物をユビキチン化反応基質として調製した。FLAG−Atxn1 82Q−HA(1.5μg/300nM)にコンジュゲートさせたM2ビーズ及び対照M2ビーズを、5mM ATP(ボストンバイオケム社)を含有しているMg2+−ATP−エネルギー再生溶液総容量50μlの中、0.75μM SAE1/SAE2、12.5μM Ubc9、125μM
His−SUMO2、及び2.5mM DTTと混合した。十分なAtxn1 82QのSUMO化を達成するために、反応を37℃で24時間実施し、そして反応緩衝液を12時間後に交換した。次いで、ビーズを、追加の0、0.5、及び1M KClを含むIP溶解緩衝液及びユビキチン化反応緩衝液(50mMトリス、pH7.5、及び150mM NaCl)を用いて順次洗浄した(Tang et al., 2006, Nat Cell Biol, 8: 855-862)。
次いで、Atxn1 82Qビーズ及び対照ビーズを、反応緩衝液(50mMトリス−HCl、pH7.5、150mM NaCl、及び2.5mM DTT)中、GST−rRNF4(0、40、160及び500ng、又は0、43、170、及び530nM)、UBE1(100nM)、UbcH5a(500nM)、ユビキチン(5μg/30μM)、及びMg2+−ATP(2.5mM)を含有している容量 20μlのユビキチン化反応混合物と共に37℃で1時間インキュベートした。その後、ビーズを上清から分離し、そしてIP溶解緩衝液を用いて洗浄した。Atxn1 82Qを変性させ、そして2%SDS及び50mM DTTを含有しているIP溶解緩衝液の添加及び95℃で10分間の加熱によってビーズから遊離した。希釈後、Atxn1 82QをM2ビーズを用いて免疫沈降させた。反応液からのIP産物及び上清をウェスタンブロットによって分析した。
マウスの飼育及び遺伝子型の同定
プルキンエ細胞特異的プロモーターエレメントによって駆動される82個のCAG反復配列を有するヒトSCA1コード領域を有する、ヘテロ接合体B05トランスジェニックマウス(Atxntg/−)が提供された(Burright et al., 1995, Cell, 82: 937-948)。PML−/−マウスが提供された(Wang et al., 1998, Science, 279: 1547-1551)。Atxntg/−マウス(FVBバックグラウンド)をPML−/−(129Svバッググラウンド)と交配した。第一世代のPML+/−:Atxntg/−マウスを、PML−/−又はPML+/+と交配することにより、ロータロッド試験及び病理学的検査のために使用するマウスを作成した。交配スキームは、ロータロッドの成績、凝集物の形成、分子層の厚さ、又は第二世代のPML+若しくはPML+/−:Atxntg/−マウスの樹状突起分岐には影響を及ぼさなかった。マウスの遺伝子型は、記載のように(Burright et al., 1995, Cell, 82: 937-948)(Atxn1について)又は米国国立癌研究所のマウスレポジトリによる提案に従って(PMLについて)のいずれかでPCRによって決定された。
加速ロータロッド試験
加速ロータロッド装置(47600、ウゴバジレ社、イタリア)を使用して、運動調整及びバランスを測定した。ナイーブ動物のみを使用した。各動物に4日間連続して1日3回の試験を与え、試験の合間に1時間の休憩をとった。各試験のために、マウスを10分間かけて4〜80rpmまで加速するロータロッド上に置いた。ロータロッドから落ちるまでのその潜伏時間(秒)を記録した。
マウス小脳の免疫染色及び病理学的分析
パラフィンに包埋された正中矢状小脳切片を、示された抗体を用いて染色し、そしてライカSP5IIレーザー走査共焦点顕微鏡を使用して可視化したか、又はヘマトキシリンを用いて染色し、そしてオリンパスBX51顕微鏡を使用して可視化した。
免疫組織化学法及び免疫蛍光法を、改変を加えて以前に記載されているように(Duda et al., 2000, J Neuropathol Exp Neurol, 59: 830-841; Emmer et al., 2011, J Biol Chem 286: 35104-35118)実施した。パラフィンに包埋された小脳を10μmの切片へと切断した。分子層の測定のために、マウス1匹あたり100μmの間隔を有する3つのヘマトキシリンで染色された正中矢状切片を分析した。各切片の最初の亀裂における20回の測定を平均化した。
プルキンエ細胞樹状突起分岐を定量するために、小脳の正中矢状切片を、プルキンエ細胞特異的タンパク質カルビンディンに対する抗体(マウス、CB−955、1:250;シグマ社)を用いて染色した。20個の0.5μmの光学的切片を、ライカSPIIレーザー走査共焦点顕微鏡を用いて蓄積した。最も明るい連続的な12個の切片(6μm)が最大強度のために投影された。山頂前裂の同領域からの蛍光強度プロファイルを、ImageJを使用してプロットした。
プルキンエ細胞を定量するために、正中矢状切片を抗カルビンディン抗体を用いて染色し、そして同等な領域を細胞計数のために使用した。プルキンエ細胞層の長さを、ImageJを使用して、プルキンエ細胞の細胞体中心に沿って分割した線を描くことによって測定した。各マウスについて、約30mmに沿った350〜900個の神経細胞が測定された。プルキンエ細胞密度は、細胞数をプルキンエ細胞層の長さで割ることによって決定された。
凝集物を有するプルキンエ細胞の数を決定するために、正中矢状切片を抗ユビキチン抗体(マウス、Ubi−1、MAB1510、1:2,000;ミリポア社)を用いて染色した。マウス1匹あたり300個又はそれ以上の細胞が、同じ脳領域から計数された。画像は、DP71オリンパスデジタルカメラの搭載されたオリンパスBX51顕微鏡を使用して撮影された。
1つの遺伝子型あたり4匹のマウスを、1才齢のマウスのプルキンエ細胞を計数するために使用し、1つの遺伝子型あたり2匹のPML+/+マウスを樹状突起分岐の定量のために使用し、そして1つの遺伝子型あたり3匹のマウスを残りの研究のために使用した。
統計分析
凝集物を有する細胞の数を、適宜、カイ二乗検定及びスチューデントt検定によって分析した。行動スコア及び小脳病態を、繰り返し測定する二元配置分散分析及びスチューデントt検定によって分析した。全てのデータを、プリズム5ソフトウェア又はマクロソフトエクセル2008を使用して分析した。
実験結果をこれから記載する。
PMLは、病原性アタキシン−1タンパク質のプロテアソームによる分解を促進する
SCA1は、進行性の失調症及び神経細胞の減少、特に小脳プルキンエ細胞の減少によって特徴付けられる致命的な神経学的障害である。それは、SCA1遺伝子産物であるアタキシン−1(Atxn1)におけるポリQ伸長配列の増幅によって引き起こされる(Orr and Zoghbi, 2007, Annu Rev Neurosci, 30: 575-621)。核内のミスフォールドタンパク質の排除におけるPMLの役割を調べるために、C末端で高感度緑色蛍光タンパク質に融合させた82個の連続したグルタミンを有する病原性Atxn1タンパク質、すなわちAtxn1 82Q−GFPをHeLa細胞において発現させた細胞培養モデルを作成した。ヒトSCA1患者及びマウスSCA1トランスジェニックモデルにおける病原性Atxn1タンパク質と同様に(Skinner et al., 1997, Nature, 389: 971-974)、Atxn1 82Q−GFPは核に局在し、拡散した局在化パターンを示し、顕微鏡で見ることのできる封入体内で顕著により高い濃度であった(図1A及び図1B)。Atxn1 82Q−GFPによりまた、細胞溶解液中にNP−40可溶性種(可溶性すなわちNS)及びNP−40不溶性種(凝集した)の両方を生じた。後者はさらにSDS可溶性種(SS)及びSDS抵抗性種(SR)へと分類され得る(図1C)。
以前の報告(Skinner et al., 1997, Nature, 389: 971-974)と一致して、内因性PMLはAtxn1 82Q−GFP封入体と共局在し、それらに隣接する細胞体内に蓄積し、そしてまたその中にも分散されていた(図1A)。PMLはいくつかのアイソフォームとして発現されている(Nisole et al., 2013, Front Oncol, 3: 125)。5つの主要なPMLアイソフォーム(I、II、III、IV、及びVI)を調べ、そして5つ全てがAtxn1−GFP封入体と共局在したことが判明した(図8A)。その後の分析のために、一般的に使用されるアイソフォームIV(本明細書では特記されない限り、以後PMLと呼ぶ)が選択された。
PMLは、Atxn1 82Qと共発現した場合、Atxn1 82Q−GFP核内封入体のサイズを有意に減少させた(図1B)。それはまたAtxn1 82Q−GFPタンパク質、特に凝集したSS種及びSR種の定常状態レベルを減少させた(図1C、左)。内因性PML(全てのアイソフォーム)の効果を評価するために、それは、2つの独立した低分子干渉RNA(siRNA)を使用してノックダウンされた。これは、Atxn1 82Q−GFP、特に凝集種のレベルを著しく上昇させた(図1C、右)。PMLのサイレンシングもまた、FLAGでタグ化されたAtxn1 82Qタンパク質の定常状態レベルを上昇させた(図8B)。Atxn1 82Qに対するPML siRNAの効果は、siRNA抵抗型のPMLによって復帰させることができ(図8C)、siRNAのオフターゲット効果は除外された。
PMLが病原性Atx1タンパク質を特異的に減少させるかどうかを評価するために、非病原性のアタキシン−1タンパク質、すなわちAtxn1 30Qを使用した。PMLの強制発現によりAtxn1 30Q−GFPの存在量は減少しなかったが、PMLのノックダウンによってもそれは有意に増大せず(図1D)、これは病原性Atxn1タンパク質に対するPMLの選択的効果を強調する。
PMLは、Atxn1 82Q遺伝子の転写を阻害しなかった(図8D)。PMLがAtxn1 82Qタンパク質の分解を促進するかどうかを決定するために、パルスチェイスアッセイを実施した。共トランスフェクトされたPMLの非存在下において、全ての[35S]標識されたAtxn1 82Qタンパク質はかなり安定であり、そしてそのレベルは18時間で僅か約20%しか減少しなかった。これに対して、PMLの存在下では、全ての[35S]Atxn1 82Qタンパク質は不安定化され、そしてそのレベルは同じ期間かけて約80%減少した(図1E)。
実験をシクロヘキシミド(CHX)を使用して実施して、タンパク質の合成を遮断し、そして既存のAtxn1 82Qタンパク質の分解を調べた。PMLの強制発現は、凝集したAtxn1 82Qの分解を加速し、その半減期を約8時間から約2時間まで減少させ、一方で可溶性Atxn1 82Qに対して最小限の効果しか及ぼさなかった(図1F)。逆に、PMLのサイレンシングは、凝集したAtxn1 82Qの半減期を延長し、そしてより低い程度で可溶性Atxn1 82Qの半減期を延長した(図1G)。PMLが凝集したAtxn1 82Qを除去する能力は、プロテアソーム阻害剤のMG132によって顕著に減少した(図1H)。これに対して、PMLはAtxn1 30Qの半減期を変化させなかった(図8E)。まとめると、これらの結果は、PMLが、プロテアソームによる分解のために、病原性Atxn1タンパク質を標的化するが、正常なAtxn1タンパク質を標的化しないことを示す。
核内ミスフォールドタンパク質の分解におけるPMLの一般的役割
PMLが核内のミスフォールドタンパク質の分解において広範な役割を果たすかどうかを評価するために、神経変性症に連関した2つの追加のタンパク質を試験した:(1)HD遺伝子の第一エキソンによってコードされるハンチンチン(Htt)の病原性断片であるHttex1p 97QP(Steffan et al., 2004, Science, 304: 100-104);及び(2)筋萎縮性側索硬化症(ALS、ルー・ゲーリック病としても知られる)及びユビキチン化封入体を伴う前頭側頭葉変性症(FTLD−U)の両方に関連したTAR DNA結合タンパク質43(TDP−43)(Chen-Plotkin et al., 2010, Nat Rev Neurosci, 6: 211-220)。Httex1p 97QPは、核内及び細胞質内の両方において顕微鏡で見ることのできる封入体を形成したが(図1I)、TDP−43は主に核内に封入体を形成した。PMLは、核内のHttex1p 97QP封入体を減少させたが、細胞質内のHttex1p 97QP封入体を減少させず(図1I)、そして凝集したHttex1p 97QPの量を減少させた(図1J、レーン1及び2)。PMLはまた凝集しているTDP−43の量を減少させたが、可溶性TDP−43の量は減少させなかった(図1K)。
これらの分析を伸展させるために、シャペロン基質モデルのホタルルシフェラーゼの構造的に不安定化された突然変異体(FlucDM)を使用し、これは細胞内PQC系の能力についての探索子として開発された(Gupta et al., 2011, Nat Methods, 8: 879-884)。内因性PMLは、封入体を形成した核内型のFlucDM(nFlucDM−GFP)と部分的に共局在したが、野生型対応物(nFlucWT−GFP)とは共局在せず、これは分散した局在化を示した(図8F)。PMLのサイレンシングは、凝集したnFlucDM−GFPのレベルを著しく上昇させ(図8G)、そして全てのnFlucDM−GFPタンパク質の半減期を延長した(図1L)。要するに、これらの結果は、PMLが、哺乳動物細胞核内における複数のミスフォールドタンパク質の除去を促進することを示す。
PML上の個別の部位によるミスフォールドタンパク質の認識
PMLがミスフォールドタンパク質を分解する機序を調べるために、PMLがこれらのタンパク質を直接認識することができるかどうかをまず調べた。これらの実験のために、病原性(103Q)及び非病原性(25Q)Htt断片(各々、グルタチオンS−トランスフェラーゼ(GST)に融合させている)を使用した。精製組換えタンパク質を用いたインビトロアッセイでは、固定されたFLAG−PMLはGST−Htt103Qを減少させたが、対照タンパク質であるFLAG−GFPは減少させず(図2A)、このことは、PMLとHtt 103Qの間の特異的かつ直接的な相互作用を示す。FLAG−PMLはまた、GST−Htt 25Qも減少させた。しかしながら、この相互作用は、PML−Htt 103Qの相互作用よりかなり弱かった(図2A)。相反する実験では、固定されたGST−Htt 103Qタンパク質はまた、固定されたGST−Htt 25QよりもFLAG−PMLとより強く相互作用した(図9A)。広範なミスフォールドタンパク質を認識する、Hsp70及びHsp40は、PML−Htt 103Qの相互作用を増強させなかった(図2A)。これらの結果は、PMLがポリQタンパク質と直接会合することができ、そして病原型と優先的に会合できることを示唆する。
PMLが変性したルシフェラーゼと選択的に結合するかどうかも調べた。Ni−NTAビーズに固定された6xHisでタグ化されたルシフェラーゼを尿素で変性させたか、又は天然型で保持した。変性したルシフェラーゼは、GST−PMLと特異的に相互作用したが天然ルシフェラーゼは特異的に相互作用せず、そしてHsp70/Hsp40系はこの相互作用を増強しなかった(図2B)。したがって、PMLは、ミスフォールドルシフェラーゼを直接認識することができるが、天然ルシフェラーゼを直接認識することはできない。
PMLとミスフォールドタンパク質の相互作用についての分子基礎を解明するために、PMLの基質認識部位(SRS)並びにこれらのSRSが識別する基質上の構造的特徴を同定する努力がなされた。その長さに依存した様式で、ポリQ及びフランキング領域はCC構造(これはポリQタンパク質がオリゴマー状態又は凝集状態へと会合することを促進する)を形成し、そしてまた、ポリQタンパク質とCC含有タンパク質の相互作用を媒介することが以前に示された(Fiumara et al., 2010, Cell, 143: 1121-1135)。したがって、PMLは、TRIM/RBCCモチーフ内のそのCC領域を介して、病原性ポリQタンパク質と相互作用すると仮定された。一連のPML断片(F1〜F5)を構築し、各断片はCC領域を含有していたか又は欠失していたかのいずれかであった(図9B)。CC領域を含有している断片(F1)はHtt 103Qと相互作用したが、この領域を欠失している2つの断片(F2及びF3)は相互作用しなかった(図9B及び図9C)。さらに、CC領域のみ(F4)はHtt 103Qに結合したが、PMLタンパク質全体からこの領域を欠失させると(F5又はΔCC)この結合は大きく減少した。したがって、PMLはほぼ排他的にCC領域を通してHtt 103Qを認識する。完全長PMLと同じように、PML CCは、非病原性Htt 25Qよりも病原性Htt 103Qに対して明瞭な結合選択性を示した(図2C)。PML CCはまた、別の病原性Htt構築物であるHtt 52Qとも強く相互作用した(図2C)。したがって、PML CCはSRS(SRS1と呼ばれる)を構成する可能性が高い。
PML CCがHttタンパク質内の相同なCC構造を認識するかどうかを試験するために、CCの形成に関与すると予測されたHtt 52Q内の残基を突然変異させることにより、Htt 52Qcc−が得られた(図9D)。類似した突然変異が、Htt 72Q内のCC構造の形成を減少させることが以前に示された(Fiumara et al., 2010, Cell, 143: 1121-1135)。実際に、Htt 52Qcc−はHtt 52Qと比較して顕著に減少した凝集物形成傾向、及びPML CCとのかなり弱い相互作用を示した(図2C)。それ故、PML CC/SRS1は、病原性Httタンパク質上のCC構造と相互作用する可能性が高い。
PMLはまた、ポリQ以外のタンパク質、例えばルシフェラーゼ及びTDP−43の分解も促進することを考えると(図1及び図8)、PMLは、ミスフォールドタンパク質上のCC構造ではない特徴を識別することのできる少なくとも別のSRSを含有する可能性があると判断された。この可能性を試験するために、一連のPML断片を、変性ルシフェラーゼとの相互作用について調べた。CC領域のみで、変性ルシフェラーゼと相互作用することができたが、この領域を欠失しているがC末端(アミノ酸361〜633)を含有している2つの断片(F2及びF5)においても有意なレベルの相互作用が観察された(図9B及び図10A)。C末端内の追加の欠失構築物を使用して(F6〜F18、図9B及び図10B)、63アミノ酸(アミノ酸571〜633)の伸長配列が変性ルシフェラーゼへの結合にとって十分であったことが判明した。この伸長配列のNH2末端又はCOOH末端のいずれかの欠失により、結合は消失した(図10)。したがって、PMLの最後の63アミノ酸が別のSRS(SRS2と呼ばれる)を構成する可能性が高い。
PML SRS2によって認識され得るルシフェラーゼ内の線形配列を調べるために、精製されたPML SRS2を使用して、ルシフェラーゼの完全配列を提示したセルロースに結合させたペプチドライブラリーをスクリーニングした。該ライブラリーは、180個のペプチドからなり、各々は、隣のペプチドと10個だけ重複している13アミノ酸残基を含有していた。Hsp70及びClpBなどのシャペロンと同じように(Rudiger et al., 1997, EMBO J, 16: 1501-1507; Schlieker et al., 2004, Nat Struct Mol Biol, 11: 607-615)、PML SRS2はこれらのペプチドの部分集合のみに結合し(図2D)、このことは、異なるアミノ酸組成を有するペプチドを識別できることを示す。ライブラリー中の全てのペプチドに対する、PML SRS2相互作用性ペプチドにおける20個全てのアミノ酸の相対的存在率の分析は、PML SRS2が芳香族残基(Phe、Trp、及びTyr)及び正に荷電した残基(Arg及びLys)を強く好み、そして負に荷電した残基(Asp及びGlu)を嫌ったことを示した(図2E)。このアミノ酸の選択性は、SRS2がLeu及びHis(これはClpBによって嫌われた)に対してさらなる選択性を示したこと以外は、ClpBと類似していた(Schlieker et al., 2004, Nat Struct Mol Biol, 11: 607-615)。
比較のために、ペプチドライブラリーへのPML CC/SRS1の結合を試験した。この領域が線形配列ではなく高次構造を認識するという概念と一致して、PML CC/SRS1はほんの僅かのペプチドに弱く結合した(図9E)。これらの結果に基づいて、PMLは、ミスフォールドタンパク質を認識することのできる少なくとも以下の2つの領域を含有すると結論付けられた:TRIM/RBCCモチーフ内のCC領域(SRS1)、並びにCC構造と、芳香族アミノ酸及び塩基性アミノ酸の両方に富んだ露出ペプチドとをそれぞれ識別することのできるそのC末端の63アミノ酸の伸長配列(SRS2)。
Atxn1 82Qの分解におけるSUMO化の関与
PMLが認識時にどのようにミスフォールドタンパク質の分解を促進するのかを調べるために実験を実施した。神経変性症に関連したミスフォールドタンパク質は、SUMOによって頻繁に修飾されているが、この修飾の役割は依然として不明である(Martin et al., 2007, Nat Rev Neurosci, 8: 948-959)。哺乳動物細胞は3つの主要なSUMOタンパク質(SUMO1〜SUMO3)を発現する。SUMO2及びSUMO3はその配列が互いにほぼ同一であり(まとめてSUMO2/3と呼ぶ)、そしてSUMO1に対して約50%同一である(Wilkinson and Henley, 2010, Biochem J, 428: 133-145)。これらのSUMOタンパク質によるAtxn1 82Qの修飾及びAtxn1 82Qの分解におけるその関与を調べた。
Atxn1 82Qは、外来性SUMO1(Riley et al., 2005, J Biol Chem, 280: 21942-21948)及び内因性SUMO1(図3A、左)の両方によって修飾され、そしてこの修飾は、Atxn1 30Qより弱かった(Riley et al., 2005, J Biol Chem, 280: 21942-21948)。Atxn1 82Qはまた内因性SUMO2/3によっても修飾され(図3A、右)、そして核内においてGFP−SUMO2/3と共局在していた(図3B)。SUMO1及びSUMO2/3とコンジュゲートしたAtxn1 82Q内の部位は異なる可能性がある。なぜなら、SUMO1とのコンジュゲーションが損なわれた突然変異Atxn1 82QであるAtxn1 82Q(5KR)(Riley et al., 2005, J Biol Chem, 280: 21942-21948)は、SUMO2/3とのコンジュゲーションに全く異常を示さなかったからである(図11A)。
注目すべきは、Atxn1 82Qは、Atxn1 30Qと比較して内因性SUMO2/3によってより強く修飾され(図3C)、これは、PMLにより媒介される分解に対するこれらのAtxn1タンパク質の異なる応答に相関する(図1及び図8)。同じように、TDP−43は内因性SUMO2/3によって修飾された(図11B)。SUMO2/3はまたFlucDM並びに別の構造的に不安定化されたルシフェラーゼ突然変異体であるFlucSMも修飾した(Gupta et al., 2011, Nat Methods, 8: 879-884)。これらのルシフェラーゼ突然変異体のSUMO2/3による修飾もまた、野生型ルシフェラーゼよりも強かった(図11C)。
さらに、プロテアソームの阻害は、Atxn1 82QとGFP−SUMO2/3の共局在化を増強させた(図3B)。それはまた、ユビキチン化Atxn1 82Qと同時に、SUMO2/3により修飾されたAtxn1 82Qも増加させたが、SUMO1により修飾されたAtxn1 82Qを増加させなかった(図3A及び図3D、レーン2及び3)。同様に、プロテアソームの阻害は、SUMO2/3により修飾されたTDP−43及びルシフェラーゼ突然変異体を増加させた(図11B及び図11C)。
Atxn1 82Qのユビキチン化及びプロテアソームによる分解におけるSUMOタンパク質の役割を評価するために、SUMO2/3及びSUMO1をsiRNAを使用して別々にサイレンス状態とした。SUMO2/3のサイレンシングにより、Atxn1 82Qのユビキチン化は効果的に減少したが、SUMO1のサイレンシングによっては減少しなかった(図3D、レーン4〜7)。SUMO2/3のサイレンシングによりまた、Atxn1 82Q、特に凝集型のレベルも上昇したが、対照タンパク質のGFPのレベルは上昇せず(図11D〜図11F)、そしてそれはPMLが、凝集したAtxn1 82Qを除去する能力を減少させた(図3E)。
SUMO2及びSUMO3は、ポリ鎖の形成を可能とする内部SUMO化共通部位を含有している。SUMO1はこの部位を含有せず、そしてそれをSUMO2/3鎖にコンジュゲートさせると、鎖の伸長を終了させることができる(Wilkinson and Henley, 2010, Biochem J, 428: 133-145)。それ故、SUMO2/3によるAtxn1 82Qの修飾を阻害するために2つの追加の戦略が使用された。まず、SUMO1を過剰発現させた。これは、SUMO2/3へのAtxn1 82Qのコンジュゲーションを強力に減少させ、そして同時に、ユビキチンへのAtxn1 82Qのコンジュゲーション(図3D、レーン8及び9)及びPMLによるその分解(図3F、左)を妨害した。第二に、鎖形成の欠損したSUMO2突然変異体であるSUMO2 KRを使用した。SUMO2 KRの過剰発現は、SUMO2/3により修飾されたAtxn1 82Q種、特に高分子量種の量を効果的に減少させた。それはまた、ユビキチンにより修飾されたAtxn1 82Q種も減少させ(図3D、レーン12及び13)、そしてPMLがAtxn1 82Qを分解する能力も鈍らせた(図3F、右)。さらに、SUMO化の欠損したHtt突然変異体であるHttex1p 97QP(KR)(Steffan et al., 2004, Science, 304: 100-104)を使用し、そしてそれはPMLにより媒介される分解に対して抵抗性であることが判明した(図1J)。要するに、これらの結果は、Atxn1 82Q及び同じような他のミスフォールドタンパク質のユビキチン化及び分解は、SUMO2/3によるその修飾に依存していることを示す。
Atxn1 82QのSUMO E3リガーゼとしてのPML
PMLは、SUMO化の効力及び特異性を増強するSUMO E3リガーゼ活性を有することが以前に実証された(Chu and Yang, 2011, Oncogene, 30: 1108-1116)。したがって、PMLがAtxn1 82QのSUMO化を促進するかどうかを調べた。細胞内でAtxn1 82Qと共発現させると、PMLは、プロテアソーム阻害剤のMG132の非存在下及び存在下の両方において、SUMO2/3によるAtxn1 82Qの修飾を強く増加させた(図4A)。逆に、PMLのサイレンシングは、これらの条件下においてSUMO2/3により修飾されたAtxn1 82Qを著しく減少させた(図4B)。同様に、PMLのサイレンシングは、SUMO2/3によるnFlucDMの修飾を減少させた(図4C)。
Atxn1 82Qに対するPMLのSUMO E3活性を確認するために、精製された組換えタンパク質を用いてインビトロでのSUMO化アッセイを実施した。PMLの非存在下では、Atxn1 82QはSUMO2によって弱く修飾され(図4D及び図4E)、これは、SUMO化がSUMO E3リガーゼがなくてもインビトロで進行し得るという以前の観察と一致した(Wilkinson and Henley, 2010, Biochem J, 428: 133-145)。注目すべきことに、PMLがAtxn1 82QのSUMO化を用量依存的に増大させた(図4D及び図4E)。これに対して、SUMO E3の欠損した突然変異体のPML M6(Chu and Yang, 2011, Oncogene, 30: 1108-1116)はそれができなかった(図4E及び図11G);PML M6はまた、凝集したAtxn1 82Qを減少させることにおいても無効であった(図4F)。これらの結果は、PMLはAtxn1 82QのSUMO E3リガーゼであり、そしてこの活性がAtxn1 82Qの分解に関与していることを示唆する。
ミスフォールドタンパク質の分解におけるRNF4の役割
ポリ−SUMO2/3鎖とコンジュゲートしたタンパク質は、4つの直列のSUMO相互作用モチーフ(SIM)を有するRINGドメインユビキチンリガーゼであるRNF4によって認識及びユビキチン化され得る(Sun et al., 2007, EMBO J, 26: 4102-4112)。しかしながら、ミスフォールドタンパク質の分解におけるRNF4の役割は依然として定義されていない。RNF4の強制発現は、細胞溶解液中の凝集したAtxn1 82Qの定常状態レベル(図5A)、並びに、核内のAtxn1 82Q封入体の数(図12A)を強力に減少させた。RNF4はまた、凝集しているAtxn1 82Qの半減期も短縮させたが、可溶性Atxn1 82Qの半減期は短縮させなかった(図5B、レーン1〜12;図5C及び図12B)。逆に、内因性RNF4を3つのsiRNAを用いて個々に又は組み合わせてノックダウンすることにより、細胞溶解液中の全ての及び凝集したAtxn1 82Qタンパク質(図5D、図12C及び図1D)、並びに、核内のAtxn1 82Q封入体(図5E)は増加した。siRNAに抵抗型のRNF4は、RNF4ノックダウンの効果を復帰させることができ(図12C)、これはsiRNAの特異性を示す。
さらに、内因性及び外因性RNF4タンパク質の両方共が通常、分散した核内分布パターンを示し、Atxn1 82Q封入体と最小限又は中程度に共局在していた。しかしながら、プロテアソームを遮断すると、RNF4はAtxn1 82Q封入体内に高度に濃縮されるようになり(図5F及び図12E)、このことは、Atxn1 82Qを排除するRNF4の試みが失速したことを反映している可能性が高い。Atxn1 82Qに対するその効果とは対照的に、RNF4はAtxn1 30Qのレベルを減少させなかった(図5G)。要するに、これらの結果は、病原性Atxn1タンパク質の排除におけるRNF4の役割を実証する。
ミスフォールドタンパク質に対するRNF4の一般的な効果を評価するために、それはHttex1p 97QP、TDP−43及びnFlucDMに対して試験された。RNF4の強制発現は、Httex1p 97QP、特に凝集型を顕著に減少させたが、Httex1p 97QP(KR)に対してははるかに弱い効果を示した(図5H)。同様に、RNF4の強制発現はTDP−43のレベルを減少させ(図12F)、一方、RNF4のサイレンシングは、核内封入体を有するTDP−43発現細胞の比率を増大させた(図12G及び図12H)。プロテアソームを阻害すると、内因性RNF4は、TDP43封入体内に高度に濃縮されるようになり(図12I)、これは同じ条件下におけるAtxn1 82Q封入体内におけるその蓄積と類似していた(図5F)。さらに、RNF4のサイレンシングは、nFlucDMの半減期を延長させた(図5I)。要するに、これらの観察は、RNF4が多様なミスフォールドタンパク質の分解に重要な役割を果たすことを示唆する。
RNF4は、SUMO2/3により修飾されたAtxn1 82Qのユビキチン化及び分解を媒介する
PMLと同じように、RNF4がミスフォールドタンパク質を排除する能力は、SUMO2/3に依存していた。なぜなら、この能力は、SUMO2/3の欠損した細胞では損なわれたが、SUMO1の欠損した細胞では損なわれなかったからである(図13A)。注目すべきは、RNF4の強制発現は、未修飾タンパク質よりも、SUMO2/3により修飾されたAtxn1 82Q及びnFlucDMを優先的に減少させた(図6A及び図6B)。逆に、RNF4のサイレンシングは、SUMO2/3により修飾されたAtxn1 82Qを増加させ(図6C)、そしてAtxn1 82Q封入体へのGFP−SUMO2の局在化を増強させた(図13B)。これらの結果は、RNF4が、分解のためにSUMO2/3により修飾されたミスフォールドタンパク質を標的化することを示す。
RNF4がSUMO2/3のコンジュゲートしたミスフォールドタンパク質をユビキチン化することを確認するために、インビトロでのユビキチン化アッセイを、未修飾Atxn1 82Qタンパク質とSUMO2により修飾されたAtxn1 82Qタンパク質との混合物を使用して実施した(図6D)。漸増用量のRNF4の存在下において、比較的低分子量であるSUMO2により修飾されたAtxn1 82Qタンパク質(図6E、レーン1、6及び9)は、より高い分子量の種へと進行的に変換され、これもまたユビキチンによって修飾された(レーン2〜4、7〜9、及び12〜14)。これに対し、未修飾のAtxn1 82Qタンパク質はユビキチン化されなかった(レーン1〜4)。それ故、RNF4は、SUMO2/3により修飾されたAtxn1 82Qタンパク質のためのユビキチンリガーゼであるが、未修飾のAtxn1 82Qタンパク質のためのユビキチンリガーゼではない。
RNF4は、ユビキチンリガーゼ活性及びSUMO結合活性の両方を有する(Sun et al., 2007, EMBO J, 26: 4102-4112)。Atxn1 82Qの分解におけるこれらの活性の関与を確認するために、ユビキチンリガーゼ活性(CS及びCS1)又はSUMO結合活性(SIMm)のいずれかが欠損したRNF4突然変異体を作製した(図13C)。CS及びCS1は、そのユビキチンE3活性を欠失しているにも関わらず(図13D)、依然としてAtxn1 82Q封入体と共局在することができた(図6F)。他方で、SIMmは、かなりのレベルのユビキチンリガーゼ活性を保持していたが(図13E)、Atxn1 82Q封入体と共局在することができなかった(図6G)。いずれのRNF4突然変異体クラスも、凝集したAtxn1 82Qを除去することができなかった(図6H)。要するに、これらの結果は、RNF4が、そのSIM領域を介してSUMO2/3により修飾されたミスフォールドタンパク質に結合し、そしてそのリガーゼ活性を介してこれらのタンパク質をユビキチン化することを示唆する。
PMLの強制発現により、対照細胞内の凝集したAtxn1 82Qは効果的に排除されたが、この能力は、RNF4の枯渇した細胞では大きく減少した(図6I)。逆に、RNF4の強制発現は、対照細胞内のAtxn1 82Qの分解を加速するのに非常に効果的であるにも関わらず、PML枯渇細胞においてはそうすることができなかった(図5B、レーン19〜24対レーン7〜12;及び図5C)。さらに、高いレベルのAtxn1 82Qを示したPML枯渇細胞におけるRNF4のサイレンシングは、Atxn1 82Qのレベルをさらに上昇させなかった(図13F)。これらの結果は、Atxn1 82Qの分解におけるPMLとRNF4の相互依存性を示す。
PMLの欠損は、SCA1のマウスモデルにおいて行動表現型及び病理学的表現型を増悪させる
上記の結果は、連続的なPMLにより媒介されるSUMO化及びRNF4により媒介されるユビキチン化を通して、Atxn1 82Q及び同じような他の核内ミスフォールドタンパク質を分解するPQC系を明らかとした。この系の生理学的役割を調べるために、小脳プルキンエ細胞内でAtxn1 82Q導入遺伝子(Atxn1tg/−)を発現しているSCA1マウスモデル(B05)を使用した。ヒトSCA1患者と似て、B05マウスは加齢と共に失調症及び神経学的異常を発症した(Burright et al., 1995, Cell, 82: 937-948)。マウスにおけるRNF4の欠損により胚の致死がもたらされ(Hu et al., 2010, Proc Natl Acad Sci, 107: 15087-15092)、B05マウスに対するその作用の分析は妨げられる。しかしながら、PMLノックアウト(PML−/−)マウスは生存可能であり、そして正常に発達するようである(Wang et al., 1998, Science, 279: 1547-1551)。B05マウスをPML−/−及びPML野生型(PML+/+)マウスと交雑し、そして全ての遺伝子型(PML+/+、PML+/−、及びPML−/−、PML+/+:Atxn1tg/−、PML+/−:Atxn1tg/−、及びPML−/−:Atxn1tg/−)の同腹仔を、運動性能及び神経病態の両方について比較した。
運動性能(バランス、協調性、及び持久力を含む)を、加速してロータロッド装置を使用して評価した。あらゆる起こり得る行動異常が、発達障害ではなく、進行的に低下する能力に起因していたかどうかを決定するために、様々な年齢のマウスを調べた。長期運動記憶の影響を除外するために、ナイーブ動物のみを使用し、各々を4日間連続して試験した。
7週齢において、全てのマウスはロータロッド上で同じように行動した(図7A)。明確に異なる遺伝子型のマウス間で幾分の差異が観察されたが、それらは統計学的に有意ではなく(分散分析p=0.53)、このことは、PML−/−マウスが、それらの運動機能に既存の障害を有さなかったことを示唆する。11週齢において、Atxn1 82Q導入遺伝子を欠失している全てのマウス(PML+/+、PML+/−、及びPML−/−)は依然として、その性能に統計学的な差は全く示さず(分散分析p=0.33)(図7B)、そしてPML+/+及びPML+/+:Atxn1tg/−も同じように行動した。これらの観察は、PMLの欠損又はAtxn1 82Q導入遺伝子の発現のいずれかのみでは、この年齢において運動異常を引き起こすには不十分であったことを示唆する。興味深いことに、PML−/−:Atxn1tg/−は、PML+/+:Atxn1tg/−又はPML−/−マウスのいずれかと比較して、ロータロッド性能において重度な障害を示した。これらの3つの群の動物は、他の2つの群とは異なり、4日間連続した試験日の開始時には同等であったが、PML−/−:Atxn1tg/−マウスは、時間の経過と共に最小限の改善しか示さなかった。ロータロッド上でのPML−/−:Atxn1tg/−マウスの改善が認められないことは、進行段階のAtxn1tg/−マウスを回想させた(Clark et al., 1997, J Neurosci, 17: 7385-7395)。PMLヘテロ接合体対応物(PML+/−:Atxn1tg/−マウス)は、ロータロッド上で中等度の障害を示した(3つのAtxn1tg/−群についての分散分析、p=0.0004)(図7B)。したがって、PMLの欠損は、Atxn1tg/−マウスの運動異常を増悪する。
Atxn1tg/−マウスの主要な神経病理学的表現型は、小脳皮質の最上部層(分子層)の構成成分であるプルキンエ細胞の変性である。この変性は最初に、分子層の縮み及びプルキンエ細胞樹状突起の萎縮に現れ、そして後にプルキンエ細胞体の減少に現れる(Burright et al., 1995, Cell, 82: 937-948; Clark et al., 1997, J Neurosci, 17: 7385-7395)。12週齢においてPML+/−及びPML−/−マウスは、分子層にほんの僅かなかつ統計学的に有意ではない縮みを示したが、PML+/+:Atxn1tg/−マウスは、PML+/+マウスと比較して識別可能な縮みを示した(図7C及び7D)。PML+/+:Atxn1tg/−マウスはロータロッド上でPML+/+マウスと同じように行動したので(図7B)、PML+/+:Atxn1tg/−マウスにおける神経変性は臨界閾値に達していない可能性があった。SCA1トランスジェニックモデルの行動表現型と病理学的表現型との間のこの非線形相関は以前に観察されている(Gehrking et al., 2011, Hum Mol Genet, 20: 2204-2212)。重要なことには、PML+/+:Atxn1tg/−マウスと比較して、PML+/−:Atxn1tg/−マウス及びPML−/−:Atxn1tg/−マウスは、分子層の厚さにおいて、それぞれ中程度の減少及び強力なさらなる減少を示した(図7C及び図7D)。これは、ロータロッド上でのこれらの動物の悪化した性能と相関した(図7B)。したがって、PMLの欠損は、Atxn1tg/−マウスにおける分子層の縮みを増悪する。
プルキンエ細胞の樹状突起分岐はまた、プルキンエ細胞特異的タンパク質であるカルビンディンに対する抗体を用いての免疫蛍光染色によって調べられた。12週齢において、Atxn1 82Q導入遺伝子を含有している全ての群におけるプルキンエ細胞樹状突起の蛍光強度は非常に低いレベルまで減少し、これにより正確な比較は妨げられた(図14A及び図14B)。注目すべきことには、PML+/+同腹仔と比較して、PML−/−マウスはすでに、プルキンエ細胞の樹状突起分岐の強い減少を示したが、PML+/−マウスは中程度の減少を示した(図14A及び図14B)。これらの結果は、PMLそれ自体が、神経変性症に対する保護において役割を果たすことを示す。
PMLの欠損に関連した分子層の菲薄化及びプルキンエ細胞樹状突起の減少にも関わらず、異なる遺伝子型の12週齢の動物間にプルキンエ細胞個体群の有意差は全く観察されなかった(図14C)。1才齢において、PML−/−マウスは、PML+/+マウスと比較してプルキンエ細胞数のほんの軽度(11.0%)かつ統計学的に有意ではない(p=0.107)減少を示したが、PML+/+:Atxn1tg/−マウスは顕著な減少を示した(図7E及び図7F)。注目すべきことには、PML−/−:Atxn1tg/−マウスは、PML+/+:Atxn1tg/−マウスと比較して、プルキンエ細胞密度の有意なさらなる減少を示し(約24%、p=0.0023)、そしてPML+/−:Atxn1tg/−マウスは中程度の細胞減少を示した(図7E及び図7F)。ここでも、これらの結果は、PMLの欠損が、Atxn1 82Q導入遺伝子によって引き起こされた神経病理学的異常を悪化させることを実証する。
B05マウスの神経変性症は、プルキンエ細胞内のユビキチン陽性Atxn1 82Q封入体の形成を伴う(Clark et al., 1997, J Neurosci, 17: 7385-7395)。Atxn1 82Q核内封入体に対するPMLの効果を決定するために、これらの封入体を有するプルキンエ細胞を、12週齢のマウスにおいて定量した。PMLの欠損だけでは、凝集物は形成されなかったが(図14D)、それはAtxn1 82Qトランスジェニックマウスにおいて凝集物含有プルキンエ細胞の数を有意に増加させる(図7G及び図7H)。要するに、これらの結果は、内因性PMLが、SCA1動物におけるミスフィールドタンパク質の蓄積の防止及びこの神経変性疾患の進行の抑制に役割を果たすことを示唆する。
ミスフォールドタンパク質を分解するPQC系
哺乳動物細胞核内のミスフォールドタンパク質を分解するPQC系についてのエビデンスが本明細書に提示されている。この系は、ミスフォールドタンパク質に選択的に結合しそしてこれらのタンパク質をポリSUMO2/3鎖を用いて印を付ける認識部門であるPML、並びに、SUMO化されたミスフォールドタンパク質をユビキチン化しそしてプロテアソームによる分解のためにそれらを標的化するエフェクター部門であるRNF4を含む。この連携系は、哺乳動物細胞内のミスフォールドタンパク質とプロテアソームとの間の重要な連関を提供している可能性が高く、そしてそれは、神経変性症及び他のタンパク質症に対する保護において重要な役割を果たし得る(図7I)。
PMLによるミスフォールドタンパク質の選択的認識
この系の精巧な選択性は、少なくとも2つのSRSを含有するPMLに存する。TRIM/RBCCモチーフ内のCC領域からなるSRS1は、病原性ポリQタンパク質及びおそらく他のミスフォールドタンパク質上のCC構造を好む。C末端の63アミノ酸からなるSRS2は、芳香族アミノ酸(Phe、Trp及びTyr)及び正に荷電したアミノ酸(Arg及びLys)の両方の富んだ短いペプチドを認識する。SRS2が、ミスフォールドタンパク質において露出していることが多くかつHsp70が関与する残基であるLeuを含有しているペプチドも好む(Rudiger et al., 1997, EMBO J, 16: 1501-1507)ということ以外、SRR2は細菌Hsp100ClpB(Schlieker et al., 2004, Nat Struct Mol Biol, 11: 607-615)と類似している。したがって、SRS2は、ClpB及びHsp70に対して二重基質特異性を示す。これらの観察は、PMLがミスフォールドタンパク質に一般的に認められる構造又は領域を認識することができることを示す。
ミスフォールドタンパク質の分解におけるSUMO化の役割
SUMOへのコンジュゲーションは、数多くのタンパク質で起こる主要な翻訳後修飾であり、そして大半の真核生物の生命にとって不可欠である。しかし、それはタンパク質間相互作用を変化させるという一般論以外には、SUMO化の生理学的機能は依然として解明されていない(Wilkinson and Henley, 2010, Biochem J, 428: 133-145)。PML−RNF4系の卓越した特徴は、ユビキチン化の前のSUMO2/3による修飾の関与である(図3、図4、及び図11)。細胞内タンパク質へのSUMO2/3のコンジュゲーションは、タンパク質変性ストレスによって顕著に増強されることが以前に観察された(Saitoh and Hinchey, 2000, J Biol Chem, 275: 6252-6258)。本研究に提示されたエビデンスはこの観察の説明を提供し、そしてSUMO2/3による修飾の主な生理学的機能は、ユビキチン化と協奏的に作用して、ミスフォールドタンパク質の分解を促進する可能性が高いことを示唆する。
SUMOとのコンジュゲーションは、タンパク質の溶解度を増強させる(Panavas et al., 2009, Methods Mol Biol, 497: 303-317)。凝集したタンパク質はプロテアソームによって効果的に分解されることができないので(Verhoef et al., 2002, Hum Mol Genet, 11: 2689-2700)、タンパク質の溶解度を増強させることは、ユビキチン化前にPMLによって付与される有益な効果であり得る。さらに、SUMO化の程度は、所与のミスフォールドタンパク質がリフォールディングのために選択されるか又は分解のために選択されるかに関する「トリアージ決断」を可能とし得る。この概念と一致して、単一のSUMOへのコンジュゲーションは、タンパク質の溶解度を増強するのに十分であるようであり(Panavas et al., 2009, Methods Mol Biol, 497: 303-317)、したがってリフォールディングを促進し得る。これに対して、SUMO2/3鎖へのコンジュゲーションは、ユビキチン化及び分解のためのRNF4上の4つの直列SIMによる効果的な認識のために必要とされる(Tatham et al., 2008, Nat Cell Biol, 10: 538-546)。このような鎖はリフォールディングの試みが失敗した後に形成され得る。
ミスフォールドタンパク質のSUMO化は、神経変性疾患を促進又は阻害のいずれかを行なうと報告されている(Martin et al., 2007, Nat Rev Neurosci, 8: 948-959)。これらの矛盾しているように思われる観察は、ミスフォールドタンパク質の除去におけるSUMO1及びSUMO2/3の明確に異なる機能に(図3)、並びにSUMO化の機能が二分していること(異常なタンパク質の溶解度を増強すること(これはその毒性を増強させ得る)、及びその分解を促進すること)に合致し得る。したがって、上昇したSUMO化の結果は、それが細胞内分解能と適合し得るかどうかに依存する可能性が高い。
可能性ある主なPQC系
核内のタンパク質は、何処にあるタンパク質でもそうであるように、突然変異を有し得るか、又は急性及び慢性の損傷を維持し得る。核の非常に混雑した環境により、タンパク質の質を維持することが特に困難となる可能性が高い。ユビキチン−プロテアーゼ経路は、核内の主な分解系であると予想され、核内ではオートファジーが作動することは知られていない。以前の研究は、核内ミスフォールドタンパク質の分解における、いくつかのユビキチンリガーゼ、例えば酵母San1及びDoa10並びに哺乳動物UHRF−2及びE6−APの関与を示した(Cummings et al., 1999, Neuron, 24: 879-892; Deng and Hochstrasser, 2006, Nature, 443: 827-831; Gardner et al., 2005, Cell, 120: 803-815; Iwata et al., 2009, J Biol Chem, 284: 9796-9803)。それにも関わらず、多様なミスフォールド核内タンパク質に対するPML及びRNF4の強力な効果と共に、PMLが圧倒的に核内に局在化することは、PML−RNF4系が哺乳動物細胞核における主なPQC系の可能性が高いことを示唆する。
TRIMファミリータンパク質は、C.エレガンスの約20個のメンバーからマウス及びヒトの70個を超えるメンバーまで、後生動物間で共有されている(Ozato et al., 2008, Nat Rev Immunol, 8: 849-860)。少なくともいくつかの他のTRIMタンパク質もまたSUMO E3活性を有していることが以前に実証された(Chu and Yang, 2011, Oncogene, 30: 1108-116)。核内に加えて細胞質内へのその局在化を考えると(Ozato et al., 2008, Nat Rev Immunol, 8: 849-860)、TRIMタンパク質はまた細胞質内のPQCにも関与していることが推測される。進化中のTRIMタンパク質の急速な増殖は、一部には、長寿命動物の細胞内のタンパク質の質を管理する複雑さが増していることに対する応答である可能性がある。
RNF4は、脊椎動物間で保存されている(Sun et al., 2007, EMBO J, 26: 4102-4112)。SUMO依存性ユビキチンリガーゼはまた低級真核生物種にも存在し(Sun et al., 2007, EMBO J, 26: 4102-4112)、そして少なくとも1つの酵母転写因子突然変異体の分解にも関与している(Wang and Prelich, 2009, Mol Cell Biol, 29: 1694-1706)。したがって、PML−RNF4系に類似した系が、これらの生物内のタンパク質の質を維持する上で役割を果たし得る可能性もある。
PML−RNF4系及び神経変性症
PML−/−マウスは、腫瘍発生をはじめとする様々な表現型について十分に特徴付けられている(Wang et al., 1998, Science, 279: 1547-1551)。本研究は、神経変性症からの保護におけるPMLの役割を示す(図7及び図14)。SCA及びHDを含む神経変性障害は、通常、後期発症型疾患である。蓄積しつつあるエビデンスは、加齢中のPQCの進行的な下降を示唆する(Balch et al., 2008, Science, 319: 916-919)。SCA1、HD及びALSに関連した病原性タンパク質に対するPML−RNF4の強力な効果、並びにSCA1マウスモデルの進行に対するPMLの欠損の強力な効果は、様々な神経変性疾患を有する患者における神経細胞封入体内のPMLの蓄積と共に(Skinner et al., 1997, Nature, 389, 971-974; Takahashi et al., 2003, Neurobiol Dis, 13: 230-237)、PML−RNF4系の不十分さ又は機能不全が、これらの疾患において役割を果たし得ることを示唆する。したがって、PML−RNF4系及び類似の系は、その処置における価値ある標的であろう。
実施例2:TRIMタンパク質はミスフォールドタンパク質を認識し、そしてその分解を促進することができる
トリパータイトモチーフ含有(TRIM)ファミリーは、C.エレガンスの約20個のタンパク質からマウス及びヒトの70個を超えるタンパク質まで、後生動物細胞内の多くのタンパク質からなる。これらのタンパク質はそれらのN末端に特徴的なTRIM又はRBCCモチーフを共有し、これはRINGドメイン、1つ又は2つのBボックス(これはRINGドメインのように、亜鉛イオンが配位している)、及びコイルドコイル領域を含む。この後に、TRIMタンパク質間ではるかにより可変性でありそして個別のモチーフを含有しているC末端領域が続く(Hatakeyama, 2011, Nat Rev Cancer, 11: 792-804; Ozato et al., 2008, Nat Rev Immunol, 8: 849-860)。TRIMタンパク質は、癌及びウイルス感染から保護するプロセスをはじめとする、様々な細胞内プロセスを調節する。生化学的には、多くのTRIMタンパク質がユビキチンE3リガーゼ活性を示し、これはTRIM/RBCC領域内のRINGドメインに起因する。さらに、少なくともいくつかのTRIMタンパク質が、SUMO(低分子ユビキチン様修飾因子)へのタンパク質のコンジュゲーションのためのE3リガーゼを有する。しかしながら、SUMO E3のTRIMファミリーの基質に関する未解決な問題は依然として残っている。
上記のように、PML(前骨髄性白血病タンパク質;TRIM19としても知られる)はミスフォールドタンパク質の排除において重要な役割を果たすことが実証された。PMLは当初、大半の急性前骨髄性白血病に関連しているt(15;17)染色体転座に関与している遺伝子産物として同定された。それは、PML核内構造体の主要な構造成分かつ同名成分である。PMLは、様々なミスフォールドタンパク質に特異的に結合しそしてその分解を促進することができることが示された。PMLは、個別の領域を介して、芳香族アミノ酸残基及びコイルドコイル構造に富んだペプチドをはじめとする、ミスフォールドタンパク質に見られる共通の特徴を識別することができる。その後、PMLは、ミスフォールドタンパク質を、ポリ−SUMO2/3鎖を用いてそのSUMO E3活性を通してタグ化する。これにより、修飾されたミスフォールドタンパク質は、SUMO標的化ユビキチンリガーゼ(STUbL)RNF4によって認識されることが可能となり、このリガーゼはミスフォールドタンパク質をユビキチン化しそしてプロテアソーム内の連続的分解のためにそれらを標的化する。タンパク質の品質制御におけるPMLの役割は、神経変性疾患に対する保護のために重要である。なぜなら、PMLの欠損は、アタキシン−1におけるポリグルタミン(ポリQ)伸長配列の増幅によって引き起こされる進行的かつ致命的疾患である脊髄小脳失調症1型(SCA1)のマウスモデルの行動表現型並びに神経病理学的表現型を増悪するからである。多くのTRIMタンパク質が存在することを考えると、PMLを使用して得られた結果は、PMLのような他のTRIMタンパク質がミスフォールドタンパク質を認識しそして分解することができるかどうかについての重要な問題を提起する。本明細書に提示された実験において、一連のTRIMタンパク質を分析し、そしてミスフォールドタンパク質を認識しそして分解する能力はTRIMタンパク質間で広範に存在することが観察され、このことは、後生動物細胞におけるタンパク質の品質制御におけるこのファミリーの重要な役割を示す。
これらの実験において使用された材料及び方法をこれから記載する。
プラスミド
FLAG−TRIM27、FLAG−TRIM32及びFLAG−TRIM5δは、PCRによってpRKにおいて作製された。PCR増幅用の鋳型は、オープンバイオシステムズ社から購入し、そして対応する遺伝子アクセッション番号はそれぞれBC013580、BC003154及びCV029096である。3つ全ての遺伝子はヒト起源である。以下のプラスミドは以前に記載されていた:FLAG−PML(アイソフォームIV)(Chu and Yang, 2011, Oncogene, 30: 1108-116);Atxn1 82Q−GFP、FLAG−Atxn1 82Q、及びHA−Httex1p 97QP(Guo et al., 2014, Mol Cell, 55(1): 15-30);FLAG−TRIM11(Ishikawa et al., 2006, FEBS Lett, 580: 4784-4792);FLAG−TRIM22(長い形態)(Barr et al., 2008);HA−TRIM39(Lee et al., 2009, Exp Cell Res, 315: 1313-132);HAでタグ化されたTRIM1、2、3、4、5、6、8、9、10、11、12、13、14、18、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、及び32(Reymond et al., 2001, EMBO J, 20: 2140-2151; Uchil et al., 2008, 2008, PLoS Pathog, 4: e16);並びに、N末端のHAタグ又はC末端のV5タグのいずれかを有するタンパク質を発現している、残りのTRIM発現プラスミド(Versteeg et al., 2013, Immunity, 38: 384-398)。Atxn1 82Q及びHttex1p 97QPのレベルに対するTRIMタンパク質の効果を分析するために、Trim11(NM_145214.2)、Trim15(NM_033229.2)、Trim28(NM_005762.2)、Trim34(NM_021616.5)、Trim39(NM_021253.3)、Trim42(NM_152616.4)、Trim43(NM_138800.1)、Trim65(NM_173547.3)、Trim67(NM_001004342.3)、Trim70(NM_001037330.1)、Trim71(NM_001039111.2)及びTrim75(NM_001033429.2)を、5’−HAタグを含有しているpcDNA3.1(−)ベクターに構築した。全ての他のTrimプラスミドが得られた(Versteeg et al., 2013, Immunity, 38: 384-398)。
siRNA
SUMO2/3siRNA(サンタクルズ社sc−37167)は、5’-CCCAUUCCUUUAUUGUACA-3’(配列番号157)、5’-CAGAGAAUGACCACAUCAA-3’(配列番号158)、及び5’-CAGUUAUGUUGUCGUGUAU-3’(配列番号159)のセンス鎖配列を有する3つの異なるsiRNA二本鎖のプールであった。
TRIM27siRNAはキアゲン社から購入し、センス鎖配列は5’-AACTCTTAGGCCTAACCCAGA-3’(配列番号162)であった。
細胞培養及びトランスフェクション
HeLa細胞をATCCから入手した。PML+/+及びPML−/−MEF細胞は、対応する遺伝子型を有するマウスの胚から得られた。細胞を標準的な培養条件で維持した。DNAプラスミドを、リポフェクタミン2000を使用して細胞にトランスフェクトし、そしてsiRNAをリポフェクタミン2000又はRNAiMAX(インビトロジェン社)のいずれかを使用して製造業者の説明書に従って連日2回細胞にトランスフェクトした。DNA及びsiRNAの両方をトランスフェクトした場合、DNAを、2回目のsiRNAのトランスフェクションの翌日にトランスフェクトした。MG132(シグマ社)を、最後のトランスフェクションから24時間後に7.5〜10μM(最終濃度)で4〜5時間かけて加えた。
免疫蛍光法
カバーガラス上に培養した細胞を、4%パラホルムアルデヒドを用いて15分間かけて固定し、0.2%トリトンX−100を用いて15分間かけて透過処理し、そして一次抗体及び二次抗体を用いて順次インキュベートした。一次抗体は抗HA、抗FLAG(マウスmAb M2、1:2,000)(シグマ社)及び抗TRIM27であった。二次抗体はFITCのコンジュゲートした抗マウス、抗ウサギ(ザイムド社)、及び抗ヤギ(インビトロジェン社)IgG;テキサスレッドのコンジュゲートした抗マウス及び抗ウサギIgG(ベクターラボラトリーズ社);並びにローダミンレッド−Xのコンジュゲートした抗ヤギ(ジャクソンイムノリサーチラボラトリーズ社)であった。その後、細胞に、DAPI(ベクターラボラトリーズ社)を含有している培地を載せ、そしてニコンEclipse E800又はオリンパスIX81顕微鏡を用いて画像を取得した。
細胞溶解液の分画、ウェスタンブロット、及びフィルター位相差アッセイ
試料を記載のように(Guo et al., 2014, Mol Cell, 55(1): 15-30)調製した。簡潔に言えば、細胞を、250IU/mlのベンゾナーゼ(シグマ社)、1mM PMSF、1×完全プロテアーゼ混液(ロシュ社)、及び20mM N−エチルマレイミド(NEM;シグマ社)の補充されたNP−40溶解緩衝液(50mMトリス、pH8.8、100mM NaCl、5mM MgCl2、0.5%NP−40、2mM DTT)中に氷上で溶解した。細胞溶解液を4℃で13,000rpmで15分間遠心分離にかけた。NP−40可溶性(NS)タンパク質を含有している上清を、SDS−PAGE及びウェスタンブロットによって分析した。ペレットを、250IU/mlのベンゾナーゼ、1mM PMSF、1×完全プロテアーゼ混液、及び20mM NEMの補充されたペレット緩衝液(20mMトリス、pH8.0、15mM MgCl2、2mM DTT)中に再懸濁した。ペレット画分を、2%SDSと50mM DTT中で煮沸し、そしてSDS−PAGEによって分離した。ゲルに進入したタンパク質(SDS可溶性、SS)をウェスタンブロットによって検出した。フィルター位相差(ドットブロット)アッセイのために、煮沸されたペレットの一部を、孔径0.2μmのメンブランフィルターにアプライし、そしてフィルター上に留まったSDS抵抗性(SR)凝集物をイムノブロットによって分析した。一次抗体は、抗HA(ウサギ、Y−11、1:500)(サンタクルズバイオテクノロジー社);抗FLAG(マウス、M2、1:7,500)、及び抗アクチン(ウサギ、1:10,000)(シグマ社);抗GFP(マウス、1:4,000)(クロンテック社);及びSUMO2/3(ウサギ、1:250、アブジェント社)であった。二次抗体は、HRP(サンタクルズバイオテクノロジー社)にコンジュゲートされていたか、又はIRD Fluor800若しくはIRD Fluor680(LI−COR社)で標識されているかのいずれかであった。ウェスタンブロットをECL試薬を使用して展開し、そしてImageJを使用して分析するか、又はオデッセイ赤外線イメージングシステムを用いて走査し、そしてImage Studio Lite(LI−COR社)を使用して分析した。
タンパク質精製及びインビトロでのSUMO化アッセイ
FLAG−TRIM27及びHA−Atxn1 82Q−FLAGを293T細胞において発現させ、そして改変を加えて以前に記載されているように(Tang et al., 2006, Nat Cell Biol, 8: 855-862; Tang et al., 2004, J Biol Chem, 279: 20369-20377)、抗FLAG M2ビーズ(シグマ社)によって精製した。細胞を、1mM PMSF及び1×完全プロテアーゼ混液の補充されたIP溶解緩衝液(50mMトリス、pH7.5、150mM NaCl、0.5%トリトンX−100、0.5%NP−40及び2mM DTT)中で溶解した。TRIM27の精製では、IP溶解緩衝液には20μM ZnCl2も補充された。溶解液を抗FLAG M2ビーズと共に4℃で4時間から一晩インキュベートした。M2ビーズを、0、0.5、及び1M KClを含有しているIP溶解緩衝液を用いて並びに溶出緩衝液(50mMトリス、pH7.5、150mM NaCl、及び2mM DTT)を用いて洗浄した。結合したタンパク質を、0.1〜0.3mg/mlの3×FLAGペプチド(シグマ社)を含有している溶出緩衝液で溶出した。
インビトロでのSUMO化反応のための他の成分はボストンバイオケム社から購入した。インビトロでのSUMO化アッセイを、精製されたHA−Atxn1 82Q−FLAG(600ng/200nM)、FLAG−TRIM27、SAE1/SAE2(125nM)、Ubc9(1μM)、His−SUMO2(25μM)及びBSA(0.1μg/ml)を含有している反応緩衝液(50mMトリス、pH7.5、5.0mM Mg2+−ATP、及び2.5mM DTT)30μl中で37℃で1.5時間実施した。反応混合物を、2%SDS及び50mM DTTを含有しているIP溶解緩衝液30μlの添加及び95℃で10分間の加熱によって変性させた。加熱した反応混合物の1つの分取分をウェスタンブロット分析のために保存し、そして残りを、SDSを含まないIP溶解緩衝液で20倍に希釈した。HA−Atxn1 82Q−FLAGを、抗HAビーズ(ロシュ社)によって免疫沈降させ、そして抗SUMO2/3抗体を使用してSUMO2/3による修飾について分析した。
実験結果をこれから記載する。
TRIM27、TRIM32、及びTRIM5δと、病原性アタキシン−1及びハンチンチンタンパク質との共局在化
PML/TRIM19は、脊髄小脳失調症1型(SCA1)に関連している82個のグルタミンの伸長配列を有する病原性アタキシン1タンパク質であるAtxn1 82Qをはじめとする様々な核内ミスフォールドタンパク質の分解を認識及び促進することができることが以前に示された(Guo et al., 2014, Mol Cell, 55(1): 15-30)。ヒト及びマウスにおけるTRIMファミリータンパク質は、保存されたTRIM/RBCCモチーフのC末端領域の構造特徴に基づいて識別され得る70個を超えるメンバーからなる(Ozato et al., 2008, Nat Rev Immunol, 8: 849-860)。大半のTRIMタンパク質は、この領域内に、1つ以上の保存されたドメインを含有し、その中の最も一般的なものとしては、PRY−SPRYドメイン(約40個のTRIMタンパク質に存在)及び複数のNHLドメイン(4つのTRIMタンパク質に存在)が挙げられる。さらに、いくつかのTRIMタンパク質は、C末端領域に認識可能なモチーフを含有していない。PMLのような他のヒトTRIMタンパク質がミスフォールドタンパク質を認識することができるかどうかを調べるために、TRIM27(PRY−SPRYドメインを含む)、TRIM32(複数のNHLドメインを含む)、及びTRIM5δ(公知のドメインを全く含まないTRIM5の短いスプライス変異体)がまず選択された。HeLa細胞において発現させると、これらの3つのTRIMタンパク質は、重複しているが明確に異なる細胞内局在化パターンを示した:TRIM27及びTRIM32は、細胞質内及び核内の両方に局在したが、TRIM5δは細胞質内のみに局在した。それにも関わらず、3つ全てのタンパク質は、顆粒状構造体内のそれらのそれぞれの区画(群)に濃縮されている(図15A)。
TRIM27、TRIM32、及びTRIM5δと、Atxn1 82Qとの、並びに、HDに関連している97個のグルタミンの伸長配列を含有しているハンチンチンタンパク質(Htt)断片(Httex1p 97Q)との共局在化を調べるために実験を実施した。高感度緑色蛍光タンパク質(GFP)との融合物として発現されたAtxn1 82Qは、核内のみに封入体を形成したが、HAでタグ化されたHttex1p 97QPは、核内及び細胞質内の両方に封入体を形成した(Guo et al., 2014, Mol Cell, 55(1): 15-30)(図15A及び図15B)。外因性TRIM27及びTRIM32は、核内のAtxn1 82Q−GFP封入体(図15A)と、並びに核内及び細胞質内の両方のHA−Httex1p 97Q封入体(図15B及び図15C)と共局在した。さらに、内因性TRIM27もまた、Atxn1 82Q封入体と共局在した(図15D)。外因性TRIM5δは、細胞質内HA−Httex1p 97QP封入体とのみ共局在した(図15B及び図15C)。したがって、そのC末端配列が異なるにも関わらず、TRIM27、TRIM32及びTRIM5δは、それらのそれぞれの細胞内区画(群)に形成されたミスフォールドタンパク質を認識することができる。
TRIM27、TRIM32、及びTRIM5δは、不溶性及び可溶性の両方のAtxn1 82Qタンパク質のレベルを低減させる
これらのTRIMタンパク質がミスフォールドタンパク質のレベルを減少させることができるかどうかを調べるために、それらの各々をHeLa細胞内においてFLAGでタグ化されたAtxn1 82Qと共に発現させた。NP40可溶性(可溶性すなわちNS)及びNP40不溶性であったがSDS可溶性(凝集又はSS)であった、細胞溶解液中のFLAG−Atxn1 82Qのレベルを分析した。注目すべきことには、各TRIMタンパク質は、可溶性Atxn1 82Qタンパク質及び凝集したAtxn1 82Qタンパク質のレベルを減少させることができた(図16A及び図16B)。TRIM27及びTRIM32もまた、NB−40及びSDS(SR)の両方に対して抵抗性であったAtxn1 82Qタンパク質のレベルを減少させ、これは、フィルター位相差アッセイによって検出され、そしてβ−アミロイド構造(以下参照)を提示する可能性が高かった。
3つ全てのTRIMタンパク質、特にTRIM32は、同じようなレベルで発現されると、可溶性Atxn1 82Qのレベルの低減においてPMLよりも強い活性を示した(図16A)。さらに、TRIM27及びTRIM5δの活性は幾分より弱かったが、凝集したAtxn1 82Qの低減におけるTRIM32の活性は、PMLと同等であった(図16A及び図16B)。TRIM27がさらなる分析のために選択された。内因性TRIM27の発現をsiRNAを使用してノックダウンし、これにより、可溶性Atxn1 82Qタンパク質及び凝集したAtxn1 82Qタンパク質の両方のレベルは有意に増加した(図16C)。要するに、これらの結果は、PMLと同じように、TRIM27、TRIM32、及びTRIM5δは、ミスフォールドタンパク質を除去することができることを示唆する。これらのTRIMタンパク質とは対照的に、SUMO E3のPIASファミリーメンバーであるPIASyは、可溶性Atxn1 82Q又は凝集したAtxn1 82Qのいずれかのレベルを減少させることができなかった(図16D)。
Atxn1 82Qに対するTRIM27及びTRIM32の効果はPMLとは独立している
TRIM27は、PML核内構造体に部分的に共局在している(Cao et al., 1998, J Cell Sci, 111(Pt 10): 1319-132)(図17A)。TRIM27及び他の核内局在化TRIMタンパク質であるTRIM32が、ミスフォールドタンパク質を分解するためにPMLに依拠するかどうかを調べるために、PML野生型(PML+/+)及びPML欠損(PML−/−)マウス胚性線維芽細胞(MEF)を使用した。TRIM27とPML核内構造体の共局在にも関わらず、TRIM27は、PMLの非存在下でさえAtxn1 82Q凝集物内に存在していた(図17B)。SDS不溶性Atxn1 82Q凝集物のレベルは、PML+/+MEFと比較してPML−/−において顕著により高く(図17C)、これは、Atxn1 82Qの除去におけるPMLの役割と一致する(Guo et al., 2014, Mol Cell, 55(1): 15-30)。PMLの再導入は、Atxn1 82Qの凝集物のレベルを減少させた。注目すべきことには、TRIM27及びTRIM32は、PML+/+及びPML−/−細胞の両方において凝集したAtxn1 82Qを低減するに際してPMLと同じぐらいに効果的であった(図17C)。要するに、これらの結果は、TRIM27及びTRIM32はPMLとは独立してAtxn1 82Qを排除することができることを示唆する。
TRIM27、TRIM32、及びTRIM5δは、SUMO2/3依存的な様式でプロテアソームによる分解のためにAtxn1 82Qを標的化する
PMLは、そのSUMO E3活性を介してミスフォールドタンパク質のプロテアソームによる分解を促進することが以前に判明した(Guo et al., 2014, Mol Cell, 55(1): 15-30)。細胞をプロテアソーム阻害剤のMG132を用いて処置した場合、TRIM27、TRIM32及びTRIM5δが可溶性Atxn1 82Qタンパク質及び特に不溶性のAtxn1 82Qタンパク質を低減する能力は有意に損なわれ、このことは、これらの3つのTRIMタンパク質がまたプロテアソームによる分解のためにAtxn1 82Qを標的化することを示唆する(図18A〜図18C)。さらに、内因性SUMO2/3がsiRNAを用いてノックダウンされた場合、TRIM27、TRIM32、及びTRIM5δはもはやAtxn1 82Qのレベルを効果的に低減させることができなかった(図18D〜図18F)。したがって、これらのTRIMタンパク質もまた、Atxn1 82Qの分解においてSUMO2/3に依拠する。
一例としてTRIM27を使用して、PML以外のTRIMタンパク質がAtxn1 82QのためのSUMO E3リガーゼとして作用することができるかどうかを次に調べた。SUMO E1(SAE1/SAE2)、E2(Ubc9)、SUMO2、及びATPをはじめとする、SUMO化反応成分と共にインキュベートすると、Atxn1 82QはSUMO2に最小限にしかコンジュゲートしなかった。しかしながら、SUMO2へのAtxn1 82Qのコンジュゲーションは、TRIM27の用量依存的に増強され(図18G)、このことは、TRIM27がAtxn1 82QのためのSUMO E3であることを示唆する。
ミスフォールドタンパク質との共局在は、TRIMタンパク質の広く存在している特性である
これらの観察によって促され、残りのTRIMタンパク質を、Atxn1 82Qを認識するその能力について試験した。マウスには存在するがヒトには存在しない2つ(TRIM12及びTRIM30)を除いて、他の全てのTRIMタンパク質はヒト起源である。各TRIMをHA、Flag、又はV5エピトープのいずれかを用いてタグ化し、そしてHeLa細胞内でAtxn1 82Q−EGFPと共発現させた。
TRIMタンパク質の部分集合の以前の調査は、これらのタンパク質が細胞質内及び核内の両方の区画と同一であるとみなされることを示した(Reymond et al., 2001, EMBO J, 20: 2140-2151)。ここで試験されたTRIMタンパク質の中で、11個(TRIM42、43、53、59〜61、67、70〜72、及び75)は、免疫蛍光法によって検出することができなかった。残りの63個のTRIMタンパク質の中で、その中の5つ(TRIM22、28、33、65、及び66)が専ら核内に局在し、局在化パターンはPMLに類していた。しかしながら、ここで試験されなかったこれらのTRIMタンパク質の特定のアイソフォームが細胞質内に存在し得るという可能性は排除できなかった。例えば、このような細胞質内アイソフォームがPMLについて示されている。27個のTRIMタンパク質(TRIM1〜5、7、9、10、13、18、20、24、25、29、34、36、37、39、45〜47、50、54、63、69、及び76)は主に又は専ら細胞質内に局在した。27個のTRIMタンパク質(TRIM6、8、11、12、16、21、23、27、30〜32、35、38、40、44、48、49、51、52、55、56、58、62、64、68、73及び74)はかなりの量が核内及び細胞質内の両方に存在していた。多くのTRIMタンパク質が核内又は細胞質内に顆粒状又は繊維状の構造のいずれかを形成し、他は分散して局在し、そしてその中のいくつかは核周囲の局在を示した。しばしば、TRIMタンパク質は、同じ又は異なる細胞のいずれかにおいてこれらの局在化パターンの組合せを示した(図19及び表2)。
PML/TRIM19をはじめとする、14個のTRIMタンパク質(TRIM6、8、11、19、21、22、27、28、30、32、33、35、38及び51)は、かなりの数の細胞において核内Atxn1 82Q封入体と共局在し(図19及び表2)、32個のTRIMタンパク質のほぼ43%が、部分的に又は専らのいずれかで核内に存在していたことを示す。これらのTRIMタンパク質は、異なるC末端配列を有する明確に異なる亜群に由来する。6つのタンパク質(TRIM6、11、21、22、35及び38)は、TRIM27のように、PRYモチーフの後にくることが多いSPRYモチーフを含有しているIV亜群のメンバーである。TRIM8は、PMLのように、公知のドメインを全く含有していない、V群のメンバーである。TRIM28及びTRIM33は、PHD−BRモチーフを含有しているVI群のメンバーである。TRIM32は、5つのNHL反復配列を有するVII亜群に属する。TRIM51は、2つのBボックスを欠失しているがRINGドメイン及びコイルドコイル領域を含有しているTRIM様タンパク質であると考えられ;それはまた、IV亜群のメンバーのようにSPRYドメインも含有している。要するに、これらの結果は、かなりの数のTRIMタンパク質が、それらのC末端における多様性にも関わらず、ミスフォールドタンパク質を認識する能力を有することを示す。
他のTRIMタンパク質によって媒介されるミスフォールドタンパク質の分解
タンパク質の品質制御におけるTRIMタンパク質の役割を調べるために、TRIM53(偽遺伝子)及びTRIM57(TRIM59と同じ)並びにTRIM12及びTRIM30(マウス起源)を除く全てのヒトTRIMタンパク質を、Atxn1 82Q分解能について試験した。35個のヒトTRIMタンパク質(TRIM3、4、5、6、7、9、11、13〜17、19、20、21、24、25、28、29、34、39、43〜46、49、50、52、58、59、65、70、74、及び75)及びマウスTRIM30は、異なる程度でAtxn1 82QのNS及び/又はSS画分のレベルを低減させることができた(図20A及び表2)。TRIM4、5、9、11、16、17、20、30、39、43、65、70、75をはじめとするいくつかのTRIMタンパク質は強力な活性を示し(図20A及び表2)、そして最も強い活性を有するものはTRIM11のようであった(図16A、図20A及び表2)。注目すべきことには、TRIM27及びTRIM32は、Atxn1 82Qを低減させることができることが上記に示されているが、これはこのアッセイにおいては効果を示さなかった。この差異は、発現レベルに起因する可能性が高かった。上記の実験では、TRIM27及びTRIM32をプラスミドpRK5にクローニングした。しかしこの章に記載された実験では、TRIM27及びTRIM32はpcDNAにクローニングされた。pcDNAプラスミドからの発現と比較してpRK5プラスミドからのより強力な発現が一貫して観察された。それ故、Atxn1 82Qを分解する活性を示さなかったものでさえ、その発現レベルが上昇すればそれらは示し得る。それ故、Atxn1 82Qの分解を促進する能力は、TRIMタンパク質間に広く存在すると結論付けられる。
注目すべきことには、TRIM26、33、42、47、48、66、69及び76をはじめとする、いくつかのTRIMタンパク質がAtxn1 82Qの発現を阻害するのではなくむしろ増強した。このことは、Atxn1 82Qに対する様々なTRIMタンパク質の多様な効果を示唆する。
平行して、Httex1p 97QPに対するTRIMタンパク質の効果も調べた(図20B)。TRIM3、11、30、68、74及び75をはじめとする、ほんの僅かなTRIMタンパク質が、NS及び/又はSS画分内のHttex1p 97QPのレベルを低減させることができた。TRIM1、4、6〜10、12〜15、21、23〜28、32〜39、41〜47、49〜51、54〜56、58、60〜67、69〜73、76及び77をはじめとする、大半のTRIMタンパク質が、Httex1p 97QPのレベルを増加させることができた。Atxn1 82Qとは異なり、Httex1p 97QPを発現しているほんの僅かな割合の細胞が封入体を含有していた。一貫して、SS画分内のHttex1p 97QPタンパク質の割合は、同じ画分内のAtxn1 82Qの割合と比較して非常に低かった。また、以前の研究では、(pRK5プラスミド内にクローニングされた)PMLはHttex1p 97QPのレベルを低減させることができたが、ここで(pcDNAにクローニングされた)PMLはできなかった。したがって、Httex1p 97QPに対するTRIMタンパク質の効果は、Atxn1 82Qに対するそれらの効果のように、それらの発現レベルによっても影響され得る。これらの結果は、様々なミスフォールドタンパク質に対するTRIMタンパク質の様々な効果を示唆し、これはとりわけ、それらの発現レベルによって影響を受け得る。
TRIMタンパク質
以前に、PMLは、哺乳動物細胞の核内に提示された様々なミスフォールドタンパク質を排除することができることが示された。本明細書において提示された実験は、ほぼ全てのTRIMタンパク質を系統的に分析し、そしてそれらの中の前例のない多数が、ミスフォールドタンパク質を認識することができることを見い出す。依然として、この数は過小評価されている可能性が高い。なぜなら、1つのミスフォールドタンパク質のAtxn1 82Qが主に使用されたからである。少なくとも2つの基質認識部位(SRS)、すなわちRBCCモチーフ内のコイルドコイル領域及び最後の60アミノ酸を含む領域が、PMLにおいて同定された。これらのSRSは、コイルドコイル構造と、芳香族残基(Phe、Trp及びTyr)に富んだペプチドとをそれぞれ識別することができ、これらはいくつかの変性したタンパク質に見られる。TRIMタンパク質はそれらのC末端領域において最も多様である(Hatakeyama, 2011, Nat Rev Cancer, 11: 792-804; Ozato et al., 2008, Nat Rev Immunol, 8: 849-860)。他のTRIMタンパク質は、明確に異なる構造特徴のミスフォールドタンパク質を認識する特異的な能力を有し得る可能性が高い。また、多くのTRIMタンパク質が、細胞質内のミスフォールドタンパク質を認識することができる可能性が高い。したがって、この観察は、タンパク質の品質制御においてこの大きなファミリーが非常に重要であることを強調する。
注目すべきことには、TRIM5δは、その細胞質内の局在化にも関わらずAtxn1 82Qの分解を促進することができた。TRIM5δは、核内に輸送される前に、細胞質内で可溶性でミスフォールドされたAtxn1 82Qを認識できる可能性がある。また、TRIM27及びTRIM32は、可溶性Atxn1 82Qを分解する強力な能力を示し、一方、PMLはより少ない活性を示す。これは、PMLとは異なり、TRIM27及びTRIM32は一部が細胞質に局在し、細胞質内でAtxn1 82Qタンパク質(及び実質的に全ての他のタンパク質)が生成されるという事実に関連し得る。したがって、核内へと向かうミスフォールドタンパク質を認識することによって、細胞質内TRIMタンパク質は、核内でのタンパク質品質制御において重要な役割を果たし得る。
PMLは、そのSUMO E3活性に依存した様式でミスフォールドタンパク質を分解する(Guo et al., 2014, Mol Cell, 55(1): 15-30)。同様に、TRIM5δ、TRIM27、及びTRIM32は、Atxn1 82Qを除去するのにSUMOに依拠する。インビトロでのアッセイはまた、Atxn1 82Qに対するTRIM27のSUMO E3活性を確認する。したがって、TRIMタンパク質は、細胞からミスフォールドタンパク質を取り除くために同じような機序を使用し得る。ミスフォールドタンパク質を分解するための最も関連性のあるSUMOタンパク質は、SUMO2/3である。SUMO2/3によって形成されたポリ鎖は、RNF4上の複数のSIMによる認識を促進する(Tatham et al., 2008, Nat Cell Biol, 10: 538-546)。タンパク質品質制御における役割と一致して、ストレス無負荷の細胞におけるSUMO2/3は主に非コンジュゲート型であるが、タンパク質損傷ストレス後に標的タンパク質とコンジュゲートするようになる(Golebiowski et al., 2009, Sci Signal, 2: ra24; Saitoh and Hinchey, 2000, J Biol Chem, 275: 6252-6258)。それにも関わらず、TRIMタンパク質間の多様性及びいくつかに伴うユビキチンE3リガーゼ活性を考えれば(Meroni and Diez-Roux, 2005, Bioessays, 27: 1147-1157)、いくつかのTRIMタンパク質は主に、ミスフォールドタンパク質のためのユビキチンE3として機能し得るという可能性が依然としてある。
現在、なぜいくつかのTRIMタンパク質は、Atxn1 82Qなどのミスフォールドタンパク質を分解することができるが、他のものはできないのかは不明である。また、試験されたTRIMタンパク質の中で、TRIM11は、Atxn1 82Qを低減する顕著に強力な活性を有する。何がその活性の原因となり得るかは依然として決定されていない。いくつかのTRIMタンパク質は、Atxn1 82Q及び特にHttex1p97QPの発現レベルを増強することができる。これはさらに、これらのタンパク質の機能的多様性を強調する。TRIMタンパク質は、タンパク質ミスフォールドを防ぐためのシャペロンとして、及び以前に形成されたタンパク質凝集物を溶解するための脱凝集剤として機能することができる。これらの活性は一部には、Atxn1 82Q及び特にHttex1p97QPを安定化させるためのTRIMタンパク質の効果の一因となり得る。これは、ミスフォールドタンパク質に関連した疾患の治療法におけるTRIMタンパク質の別の重要な用途を示唆する。多くのヒト疾患が、部分的に機能的である突然変異タンパク質の分解に密接に連関している。顕著な例は嚢胞性線維症(CF)であり、これは嚢胞性線維症膜貫通コンダクタンス調節因子(CFTR)遺伝子の突然変異によって引き起こされる。これらの突然変異は、細胞質内で分解される。CFTR突然変異体を安定化させるための治療法が開発され、これにより、CFTR突然変異体は、その機能を果たすためにメンバーに到達することが可能となる。TRIMタンパク質を使用することにより、部分的に機能的なタンパク質の分解に関連したCF及び他の疾患におけるこのような目標を達成し得ると想定される。
実施例3:哺乳動物細胞への組換えTRIM11の送達は、ミスフォールドタンパク質の分解を促進する
上記のように、トリパータイトモチーフ含有(TRIM)ファミリーメンバーは、ミスフォールドタンパク質の認識及び分解において重要な役割を果たすことが実証されている。最初に一例としてPML/TRIM19を使用して、PMLは、ミスフォールドタンパク質に共通して見られる構造特徴を認識する個別の領域を介してミスフォールドタンパク質に特異的に結合することができることが示された。その後、PMLは、そのSUMO E3活性を使用して、ポリ−SUMO2/3鎖を用いてミスフォールドタンパク質をタグ化する。これにより、ミスフォールドタンパク質は、SUMO化に標的化されるユビキチンリガーゼ(STUbL)RNF4によって認識されることが可能となり、結果としてミスフォールドタンパク質のユビキチン化及びプロテアソームによる分解が起こる。このPML−RNF4により媒介される連続的なSUMO化及びユビキチン化系は、神経変性疾患に対する保護において重要な役割を果たすことがさらに示された。
続いて、公知の全てのヒトTRIMタンパク質の圧倒的大多数を調べ、そしてそれらの中のかなりの数が、病原性アタキシン1(Atxn1 82Q)及びハンチンチン(Htt97Q)タンパク質などのミスフォールドタンパク質によって形成された封入体に局在化することができることが判明した。代表的なTRIMタンパク質を試験することによって、多くのTRIMタンパク質もまた、SUMO依存的にミスフォールドタンパク質を分解することができることが示された。注目すべきことには、試験されたTRIMタンパク質の中で、あるTRIMタンパク質、すなわちTRIM11が、ミスフォールドタンパク質を低減させる特に強力な活性を示す。
本明細書に提示された実験において、神経変性症に関連した細胞内ミスフォールドタンパク質を分解するための薬剤としての組換えTRIM11を開発することを探究した。このために、HIV Tat由来ペプチドが使用され、これはタンパク質を哺乳動物細胞に送達することができる(図22)。TRIM11を、Tat由来ペプチドと融合させ、融合タンパク質を細菌において発現させ、そしてタンパク質を、アフィニティ樹脂、続いてゲルろ過カラムを使用して均一となるまで精製した。比較のために、Tatペプチドに融合させたSUMO2タンパク質も平行して精製した。
HeLa細胞を、Atxn1 82Q−GFP、Atxn1 30Q、又はHtt97Q−GFPを用いてトランスフェクトし、そして続いて組換えTRIM11又はSUMO2タンパク質と共にインキュベートした。図21Aに示されているように、HeLa細胞をTRIM11を用いて処置することにより、Atxn1 82Qのレベルは強く減少した。Htt97Qのレベルも強く減少した(図21B)。これに対し、SUMO2は、Atxn1 82Qのレベルに対しては最小限の効果しか及ぼさなかった(図21C)。これらのデータは、哺乳動物細胞へのTRIM11の送達が、ミスフォールドタンパク質のレベルを低下させ、神経変性症及び他のタンパク質ミスフォールド疾患の治療法のためにTRIM−RNF4系を標的化するための証明又は概念の証拠を提供することを示唆する。
実施例4:SCA1及びHD患者における神経細胞封入体へのRNF4の局在化
マウスにおけるRNF4の欠損により胚の致死がもたらされ(Hu et al., 2010, Proc Natl Acad Sci, 107: 15087-15092)、神経変性症のマウスモデルに対するその欠損の分析は妨げられる。以前の研究は、PMLがSUMO及びユビキチンと共に、ポリグルタミン疾患患者における神経細胞封入体と共局在することを示し(Dorval and Fraser; 2006, J BIol Chem 281:9919-24; Martin et al., 2007, Nat Rev Neurosci 8:948-59; Skinner et al., 1997, Nature 389:971-4; Takahasi et al., 2003, Neurobiol Dis 13:230-70)、このことは、これらの疾患におけるPMLの関与を示唆する。本明細書に提示されたデータは、ヒトSCA1及びHD患者の死後脳組織におけるRNF4の局在化を分析する。
これらの実験において使用された材料及び方法をこれから記載する。
HD患者組織(淡蒼球)はハーバード脳組織リソースセンターによって提供された:AN06564、AN12127、及びAN12029(凝集物が観察された)、並びにAN09048、AN19685、AN14942、AN13612、及びAN17467(凝集物は全く観察されず);SCA1患者組織(基底点)は国立失調症財団から入手した。免疫組織化学法及び免疫蛍光法は、改変を加えて以前に記載されているように実施された(Duda et al., 2000, J Neuropathol Exp Neurol 59:830-41; Emmer et al., 2011, J Biol Chem 286:35104-18)。HD及びSCA1患者の脳をパラフィンに包埋し、そして6□m切片に切断した。切片を、示されているような抗RNF4(#1:ウサギ、11−25、1:300、シグマ社;#2:ヤギ、C15、1:25、サンタクルズ社)、抗ハンチンチン(マウス、MAB5374、1:500;ミリポア社)、抗ユビキチン(マウス、Ubi−1、MAB1510、1:2,000;ミリポア社)、及び抗ポリQ(マウスMAB1574、1C2、1:1,000;ミリポア社)について染色した。対照ウサギ抗体を使用して、抗RNF4染色の特異性を確認した。
実験結果をこれから記載する。
封入体を含まない患者の神経細胞において検出された場合、RNF4は核全体に分散して分布しているか又は核内フォーカスを形成する傾向があった(図23)。調べた2つのSCA1症例では、抗ポリQ抗体(1C2)に対して反応性である核内封入体が存在していた。RNF4は、それぞれ16個中5個及び17個中4個の1C2反応性核内封入体に認められた(図24)。
HD患者間では、抗ハンチンチン抗体又は抗ユビキチン抗体のいずれかに対して反応性である細胞質内封入体が、調べた8人中3人の患者試料における淡蒼球領域に存在していた。これは、核内封入体が成人発症型HD症例では稀であるという以前の観察と一致していた(DiFiglia et al., 1997, Science 277:1990-3)。それにも関わらず、RNF4は、2つの別々の抗RNF4抗体を用いての結果に基づいて淡蒼球領域内の封入体の約20%と共局在していた(図25及び図26)。RNF4を含有している封入体は、ハンチンチン又はユビキチンシグナルの輪によって囲まれたRNF4免疫反応性を示す傾向があった(図25及び図26)。SCA1及びHD患者におけるRNF4とポリQ凝集物の部分的な共局在化は、PMLとポリQ凝集物の部分的な共局在化を回想させ(Skinner et al., 1997, Nature 389:971-4; Takahashi et al., 2003, Neurobiol Dis 13:230-7)、そしてそれは疾患に罹患した神経細胞におけるPML/TRIM−RNF4系の遮断を反映し得る。
実施例5:TRIMタンパク質の分子シャペロン活性及びタンパク質脱凝集活性
本明細書に記載されたデータは、TRIM11が、分子シャペロン及び脱凝集剤として機能することができることを実証する。1つの態様では、TRIM11は、凝集物の形成を防ぐことができる。他方では、TRIM11は、ストレスにより誘発された非アミロイド凝集物(ルシフェラーゼ及びGFP凝集物)をリフォールドできるだけでなく、アミロイド凝集物(Atxn1 82Q凝集物及びα−シヌクレイン線維)を脱凝集することができる。さらに、また、TRIM11は、Atxn1 82QをSUMO化し、そして続いて分解することができる、SUMO E3リガーゼでもあることが本明細書において示される。それ故、TRIM11は、タンパク質の脱凝集と分解との間の連関としての役目を果たし得る。
これらの実験に使用された材料及び方法をこれから記載する。
siRNAのトランスフェクション
マウスTRIM11siRNA(sc−76735)はサンタクルズ社から購入した。1日目に、海馬神経細胞(15000個の細胞/ウェル)を播種培地を含む96ウェルプレート中に播種した。2日目に(播種から約18時間後)、播種培地から神経細胞用培地へと完全に交換した。3日目に、siRNA(1pmol)をリポフェクタミンRNAiMAXによって細胞にトランスフェクトした。トランスフェクション法は、製造業者の説明書に従って実施された。
細胞培養
HCT16細胞を、マッコイ5A培地を用いて培養した。A549細胞を、RPMI1640培地を用いて培養した。HeLa細胞及びHEK293T細胞を、DMEM培地を用いて培養した。
これらの培養培地は全て、10%胎児ウシ血清(FBS)を含有している。一次神経細胞が得られた。神経細胞を以前に記載された方法に従って培養した。簡単に言えば、細胞をまず、播種培地(複合Neurobasal培地、B27、GlutaMAX、ペニシリン/ストレプトマイシン及び10%FBSを示された希釈比で)を用いて播種した。18〜24時間後、播種培地を神経細胞用培地(複合Neurobasal培地、B27、GlutaMAX、及びペニシリン/ストレプトマイシンを示された希釈比で)に完全に交換する。通知したものを除いて、全ての細胞は加湿5%CO2雰囲気中37℃で維持された。
免疫蛍光法
カバーガラス上に播種された細胞を、4%パラホルムアルデヒドを用いて室温で10分間固定した。細胞をさらにメタノールを用いて20℃で10分間透過処理を行なった。細胞をPBSを用いて洗浄し、そして次いで2%ウシ血清アルブミン(BSA)によって室温で30分間かけて遮断した。細胞を一次抗体と共に4℃で一晩インキュベートし、続いて蛍光二次抗体と共に室温で1時間インキュベートした。最後に、カバーガラスを、4’,6−ジアミジノ−2−フェニルインドール(DAPI)(ベクトンラボラトリーズ社;H−1200)を含有している封入剤と共にスライドガラスに載せた。抗体の希釈のために、抗HA(1:100)、抗p−α−Syn(1:100)及び抗p62(1:200)を適用した。
抗体
抗TRIM11(ABC926)抗体はミリポア社から購入した。モノクローナル抗Flag抗体、ウサギFlag抗体、及び抗Flagアガロースビーズはシグマ社から購入した。抗HAアフィニティマトリックス(クローン3F10、11815016001)はロシュ社から購入した。抗HSF1(sc−9144)はサンタクルズ社から購入した。抗α−シヌクレインホスホ−Ser129(825701)はバイオレジェンド社から購入した。抗Hsp70(ADI−SPA−810−D)はエンゾ社から購入した。抗α−シヌクレイン(2642)及び抗Hsp90(4874)はセルシグナリングテクロノロジー社から購入した。
タンパク質の分画、フィルター位相差アッセイ及びイムノブロット
細胞を溶解緩衝液(50mMトリス、pH8.8、100mM NaCl、5mM MgCl2、0.5%IGEPAL CA−630、1mM DTT、250IU/mlベンゾナーゼ(シグマ社)、1mM PMSF、及び1×完全プロテアーゼ混液(ロシュ社))を用いて氷上で30分間かけて溶解した。上清は、13000rpmで4℃で15〜20分間遠心分離することによって得られた。ペレットをさらにペレット緩衝液(20mMトリス、pH8.0、15mM MgCl2、1mM DTT、250IU/mlベンゾナーゼ、1mM PMSF、及び1×完全プロテアーゼ混液)に氷上で30分間かけて再懸濁し、その後、2%SDS緩衝液と共に直接煮沸した。タンパク質の濃度をブラッドフォードアッセイ(バイオラッドラボラトリーズ社)によって測定した。全てのタンパク質試料をSDS−PAGEによるイムノブロットにかけた。上清は可溶性画分と判断された。ペレットは不溶性画分(SDS可溶性)と判断された。他の部分はフィルター位相差アッセイにかけられた。簡単に言えば、ペレット試料を孔径0.2μMのメンブランを通してろ過し、これによりメンブラン上に保持されたSDS抵抗性凝集物をイムノブロットによって分析した。
タンパク質の精製
Flag−Atxn1−82Q−HAを293T細胞にトランスフェクトし、そして抗Flag M2ビーズによって精製した。高度に精製されたタンパク質を得るために、ビーズを漸増濃度のNaClを用いて十分に洗浄した。
His−ルシフェラーゼを、BL21 DE3細胞において発現させ精製した。固定化された天然の又は変性させたルシフェラーゼを生成するために、天然ルシフェラーゼをまず、製造業者の説明書に従って細菌細胞溶解液から精製した。第二に、天然ルシフェラーゼを8M 尿素と共に5分間インキュベートすることによって、変性ルシフェラーゼを生成した。
インビボ及びインビトロでのSUMO化アッセイ
インビボでのSUMO化アッセイのために、細胞を示されたプラスミドを用いてトランスフェクトした。48時間後、細胞を、2%SDS及び50mM DTTの補充された溶解緩衝液(50mMトリス−Cl、pH7.4、150mM NaCl、0.5%トリトン、1mM DTT、1mM PMSF、及び1×完全プロテアーゼ混液)中に溶解した。細胞溶解液をさらに95℃で10分間煮沸した。1つの分取分をインプットのために保存した。残りの細胞溶解液を溶解緩衝液で10倍に希釈し、そしてその後、抗HAビーズと共に4℃で一晩インキュベートした。ビーズを十分に洗浄し、そして示された抗体を用いてイムノブロットによって分析した。インビトロでのSUMO化アッセイのために、His−SUMO−2(UL−753)、UbcH9(E2−465)及びSUMO E1(E−315)はボストンバイオケム社から購入した。
プラスミド
Flag−TRIM11は、KpnI/XbaI TRIM11 cDNAを、KpnI/XbaIにより消化されたpcDNA3.1−Flagベクターに挿入することによって構築された。Flag−TRIM11突然変異(12/13EEから12/13AA)は、部位特異的突然変異によって作製された。GST−TRIM11は、BglII/SalI TRIM11 cDNAをBamHI/SalIにより消化されたpGEX−1λTベクターに挿入することによって構築された。GFP−Hsp70及びGFP−TRIM11は、Hsp70及びTRIM11cDNAをpEGFP−C1ベクターに挿入することによって構築された。全ての構築物はDNAシークエンスによって確認された。
ルシフェラーゼ再活性化アッセイ
凝集物を生成するために、ルシフェラーゼリフォールディング緩衝液(LRB;25mMHEPES−KOH[pH7.4]、150mM KAOc、10mM MgAOc、10mM DTT)中のホタルルシフェラーゼ(100nM)を45℃で8〜10分間加熱した。凝集したルシフェラーゼ(10nM)を示された濃度のTRIM11又は他のタンパク質と共に25℃で90分間インキュベートした。Hsp104/Hsp70−Hsp40ジ−シャペロン系のために、5mM ATP及びATP再生系(1mM クレアチンホスフェート、0.5uM クレアチンキナーゼ)が必要とされた。インビボでのルシフェラーゼリフォールディングアッセイのために、96ウェルプレート中の細胞を、野生型ルシフェラーゼを用いて一過性にトランスフェクトした。24時間後、細胞を42℃又は45℃で1時間又は30分間それぞれ加熱した。熱ショック前に、20μg/mlのシクロヘキシミドを培養培地に加えた。熱ショック後に、細胞をさらに1.5又は3時間37℃のインキュベーターに移した。ルシフェラーゼ活性をプロメガルシフェラーゼシステムを用いて測定した。
GFP脱凝集アッセイ
凝集物を生成するために、緩衝液A(20mMトリス−HCl、pH7.5、100mM KCl、20mM MgCl2、5mM DTT、0.1mM EDTA、10%(v/v)グリセロール)中のGFP(4.5μM)を85℃で15分間インキュベートした。GFP凝集物(0.45μM)を、様々な量の示されたタンパク質と共に25℃で60分間インキュベートした。GFP凝集物の脱凝集は、395nmでの励起時の510nmの蛍光を測定することによって検出された(インフィニットM200pro)。
試薬
ルシフェラーゼ(L9506)、Mg−ATP(A9187)、ホスホクレアチン(P1937)及びクレアチンキナーゼ(C3755)はシグマ社から購入した。KRIBB11(385570)はミリポア社から購入した。β−アミロイド(1−42)(RP10017)はジェンスクリプト社から購入した。
実験結果をこれから記載する。
PML(TRIM19)は、プロテアソームを通して分解されるためにRNF4によって認識されることのできるミスフォールドタンパク質をSUMO化した。しかしながら、TRIM11はまたSUMO E3リガーゼでもあるかどうかは不明である。TRIMの構造分析によると、TRIM25の2つの高度に保存されたグルタミン酸(Glu9及びGlu10)がそのユビキチンE3リガーゼ活性に必要とされる。それ故、E3リガーゼ活性を欠失させた突然変異させたTRIM11(Glu12/Glu13からAla12/Ala13へ)が作製された(図27A及び図27B)。インビボでのSUMO化アッセイは、Atxn1 82Qが、PMLによってだけでなく野生型TRIM11によっても効率的にSUMO化されたことを示した(図27A)。これをさらに確認するために、インビトロでのSUMO化アッセイは、精製されたAtxn1 82QがTRIM11によって有意にSUMO化され得ることを示した。それ故、TRIM11もまた、Atxn1 82QのためのSUMO E3リガーゼであった。細胞内では、TRIM11はHsp70のように、主に細胞質内に局在していた(図28A及び図28B)。興味深いことに、TRIM11又はHsp70は、Atxn1 82Qの凝集物に補充され得(図28C及び図28D)、このことは、TRIM11とAtxn1 82Qの間に相互作用がある可能性があることを示唆する。これを試験するために、プルダウン分析は、TRIM11がAtxn1 82Qに選択的に結合したことを提示した(図29A)。重要なことには、TRIM11は、病原型のAtxn1 82Qとは優先的に相互作用したが、Atxn1 30Qとは相互作用しなかった(図29B)。それ故、TRIM11は、ミスフォールドタンパク質に選択的に結合する能力を有すると仮定した。予想を調べるために、天然ルシフェラーゼビーズ又は変性ルシフェラーゼビーズをさらに作製し、そしてその後、プルダウンアッセイを実施した。図29Cに示されているように、対照GSTタンパク質とは対照的に、TRIM11は変性ルシフェラーゼに特異的に結合し、このことは、TRIM11がミスフォールドタンパク質に結合することができることを示した。
分子シャペロンであるHsp70が、SCA1マウスにおいて病態に関連したAtxn1 82Qの発現を抑制することができることが実証された。さらに、Hsp70は、洗浄剤に不溶性のAtxn1 82Q画分のタンパク質レベルを減少させ、これは本明細書に提示された結果と一致した(図28E)。凝集物の形成についてTRIM11とHsp70との間に類似性が存在するかどうかを次に調べた。これを研究するために、Atxn1 82Qの可溶化特徴を、洗浄剤の分画によって分析した。図28Eに示されているように、TRIM11は、Hsp70のように、洗浄剤に不溶性のAtxn1 82Q画分を減少させ、このことは、TRIM11がタンパク質の凝集を制御することができたことを示唆する。さらに、MG132による処置は、Atxn1 82Qの不溶性画分を中程度に増加させ(図28E)、これは、プロテアソームがAtxn1 82Q凝集物形成の制御に必要とされるという以前の報告と一致した。興味深いことに、Atxn1 82Qを野生型TRIM11又は突然変異型TRIM11と共発現させると、突然変異型TRIM11は、野生型TRIM11と比較することによって、洗浄剤に不溶性のAtxn1 82Q画分を減少させる能力がより低く(図28F)、このことは、TRIM11のE3リガーゼ活性がAtxn1 82Q凝集物の減少に必要とされたことを示唆する。TRIM11が、細胞内でアミロイド様凝集物に対して効果を及ぼしたかどうかをさらに試験するために、野生型又は突然変異型TRIM11を細胞にトランスフェクトし、そしてThT染色は、野生型及び突然変異型TRIM11が両方共に、アミロイド様凝集物のレベルをダウンレギュレートすることができたことを示した(図28G)。Atxn1 82Qの安定な過剰発現は、ThT染色を中程度に増強させた(図30A)。同様に、TRIM11はまた、安定な細胞内において洗浄剤に不溶性のAtxn1 82Q画分を減少させることができた(図30B)。重要なことには、野生型TRIM11は、突然変異型TRIM11よりも細胞内凝集物を低減させるより強力な能力を有していた(図30C及び30D)。
Hsp70及びTRIM11の類似性のために、TRIM11は、タンパク質凝集を制御するための分子シャペロンとして機能し得ると仮定された。一般的には、シャペロンは、凝集しがちなミスフォールドタンパク質を防ぐ能力を有する。これは、タンパク質凝集を制御するための最も重要でかつ効果的な方法である。それ故、凝集物の形成におけるTRIM11の防止機能を調べた。ルシフェラーゼ活性は、熱ショックに応答してシャペロンの非存在下では急速に減少した(図31A)。しかしながら、TRIM11並びにHsp70のインキュベーションは、熱による失活からルシフェラーゼを効果的に保護することができた(図31A)。同様に、TRIM11はまた、熱からGFPタンパク質も保護する(図31C)。これらの結果は、TRIM11は、Hsp70のように分子シャペロンとして機能し得ることを示唆した。細胞内では、TRIM11の安定な過剰発現は、熱ショックからルシフェラーゼを中程度に保護することができた(図31C及び図31D)。さらには、TRIM11はまた、ルシフェラーゼの熱による失活を明らかに回復することができ(図31C及び図31D)、これによりさらにTRIM11のシャペロン様機能が確認された。重要なことには、TRIM11の過剰発現は、Hsp70のタンパク質レベルを変化させなかった(図31E)。次に、アルツハイマー病に関連したβ−アミロイド(1−42)を、TRIM11の防止機能を研究するための基質として使用した。図31Fに示されているように、TRIM11は、ThT分析によりアミロイド線維形成を阻害することができた。さらに、Atxn1 82Qを精製して、凝集物の形成プロセスを試験した。対照タンパク質のGSTはAtxn1凝集物の形成を防ぐことができなかったが、TRIM11は、凝集物の形成を効果的に遮断した(図31G)。さらに、TRIM11はまた、Atxn1 82Qのアミロイド様凝集物も防ぐことができた(図31G)。p53はインビトロにおいて凝集物を形成する傾向があることが知られている。図31Hに示されているように、TRIM11は、p53を変性から有意に防いだ。興味深いことには、p53は、インビトロにおいてTRIM11によってSUMO化され得(図27C)、そしてp53のSUMO化は、アミロイド様の凝集物を遮断することができたが、オリゴマー形成を促進した。要約すると、TRIM11は、凝集物の形成を防ぐための分子シャペロンとして機能し得る。
TRIM11が、熱ショックに応答してアップレギュレートされ得るかどうかを決定するために、ベクター又はTRIM11を安定に発現しているHCT116細胞を使用した。対照の安定な細胞においては、TRIM11は、熱ショック後の回復中に増加した(図32A)。しかしながら、TRIM11発現細胞では、外因性TRIM11タンパク質はアップレギュレートされ得ず(図32B)、このことは、熱によって誘発されるTRIM11のアップレギュレーションは、タンパク質の安定性の変化に起因しなかったことを意味する。熱により誘発されるTRIM11のアップレギュレーションはさらにHeLa細胞においても確認された(図32C)。多くのストレスがタンパク質ミスフォールドを誘発し得るので、TRIM11が他のストレスによって誘発され得るかどうかを調べた。図30D及び30Eに示されているように、TRIM11のタンパク質レベルはAs2O3及びH2O2による処置に応答してアップレギュレートされた。TRIM11のmRNAレベルは、熱ショックに応答して誘導され得(図32F)、これは、Hsp70と類似している。TRIM11が熱ショックによって誘発された機序を調べるために、熱応答性タンパク質を制御するための重要な転写因子であるHSF1を安定に発現するA549細胞を作製した。驚くべきことに、HSF1の過剰発現は、熱ショックによる処置を行なっても又は行なわなくてもTRIM11タンパク質レベルをダウンレギュレートさせ(図32G)、このことは、HSF1がおそらくTRIM11の転写を調節するために必要とされなかったことを示唆する。
別の重要な転写因子であるp53も、熱ショック応答中に活性化され得る。p53もまた、TRIM、例えばTRIM21及びTRIM24の転写を直接増加させることができる。それ故、TRIM11が熱ショックに応答してp53によって制御され得るかどうかを調べた。図33Aに示されているように、TRIM11は、p53野生型HCT116細胞では熱ショックに応答して増加したが、p53ヌルHCT116細胞では増加しなかった。したがって、TRIM11のmRNAレベルだけが、p53野生型HCT116細胞において増強され(図33B)、このことは、p53がTRIM11の転写に寄与したことを示唆する。p53の重要性をさらに確認するために、TRIM11のタンパク質レベル及びmRNAレベルは、p53shRNAを安定に発現しているA549細胞においてはアップレギュレートされることができなかった(図33C)。類似の現象が、p53ノックダウンHCT116細胞においても再度確認された(図33D)。総合すると、これらの結果は、p53が熱ショック応答においてTRIM11をアップレギュレートするための重要な因子であり得ることを強く意味した。HSF1は、熱ストレス後の細胞の生存のための保護物質と考えらえる。化学物質阻害剤であるKRIBB11を使用して、HSF1活性を阻害することができる。図33E及び図33Fに示されているように、KRIBB11による処置により、p53ヌルは熱ショックに対してより感受性が高くなり、このことはp53もまた、熱ストレスに応答した細胞の生存能に寄与することを意味した。
Hsp70は、いくつかの種類のタンパク質凝集物の溶解を促進し得る。次に、TRIM11がタンパク質凝集物を脱凝集することができるかどうかを調べた。予想された通り、TRIM11は、不溶性凝集物に由来する熱で失活したルシフェラーゼを再可溶化し(図34A)、そして用量依存的にルシフェラーゼ活性を回復させた(図34B)。また、TRIM11の可溶化機能はさらに、基質として予め形成されたGFP凝集物を使用して確認された(図34C及び図34D)。これらの結果は、TRIM11が、無秩序な凝集物を脱凝集することができることを示唆した。次に、アッセイを、基質としてAtxn1 82Q凝集物を使用して実施した。図34Eに示されているように、TRIM11は、Atxn1 82Q凝集物を効果的に再可溶化することができた。注目すべきことには、Hsp70/Hsp40ジ−シャペロンのみが、Atxn1 82Qのアミロイド様構造をペレットへと脱凝集し(図34F)、このことは、TRIM11は異なる方法で作用し得ることを示唆する。予想された通り、TRIM11並びにHsp104は、アミロイド様構造を上清中に有意に回復させた(図34G)。
TRIM11のどの機能的ドメインがTRIM11の脱凝集活性に必要とされるかを決定するために、加熱したルシフェラーゼ凝集物を基質として使用した。図35Bに示されているように、TRIM11は、ルシフェラーゼ活性の熱による失活を効果的に回復することができたが、TRIM11のRBC断片又はB30.2断片はより弱い再活性化能を有していた。矛盾なく、沈降アッセイにおいて、TRIM11は、予め形成されたルシフェラーゼ凝集物を再可溶化する上でその2つの断片よりも強力な活性を有していた(図35C)。さらに、それぞれの単一のドメインは、完全長のTRIM11と比較することによって、リフォールディング活性をほぼ失っていた(図35D)。さらに、完全長のTRIM11は、Atxn1 82Qと非常に強力に相互作用したが、RBC又はB30.2はAtxn1 82Qに結合しなかった(図36A)。同様に、TRIM11の単一ドメインは、Atxn1 82Qに結合しなかった(図36B)。これらの結果は、基質への結合が、TRIM11の脱凝集機能に必要とされる可能性があることを強く示唆した。
SUMO E3リガーゼ活性が、タンパク質の脱凝集に必要とされるかどうかを次に調べた。ここで突然変異型TRIM11を使用して、その脱凝集活性を試験した。図37Aに示されているように、突然変異型TRIM11は、野生型TRIM11と同様にルシフェラーゼの熱による失活を防止する能力を維持していた。さらに、突然変異型TRIM11はまた、変性したルシフェラーゼ活性を回復するのに野生型TRIM11と類似した能力を有していた(図37B)。突然変異型TRIM11は依然として、変性ルシフェラーゼに選択的に結合することができた(図37C)。これらの全ての結果は、インビトロでTRIM11は、そのE3活性とは独立して、その脱凝集機能を遂行することを示した。とりわけ、突然変異型TRIM11は主に核内に局在化し(図37D)、これは野生型TRIM11とは異なっていた。さらに、突然変異型TRIM11はまた、Atxn1 82Qと共局在することができた。
以前の研究は、後生動物のタンパク質脱凝集酵素系であるHsp110、Hsp70及びHsp40は、アミロイドを効果的に脱凝集することができなかったことを示した。それ故、TRIM11はアミロイド線維を脱凝集することができるかどうかを調べた。ここでα−シヌクレインをクライアントとして適用した。まず、TRIM11は、α−シヌクレイン線維形成も防ぐことができるかどうかを決定した。図38Aに示されているように、TRIM11並びにHsp70及びHsp104は、α−シヌクレインアミロイド線維の形成を効率的に阻害する(図38A)。また、阻害は用量依存的であった(図38B)。実際に、電子顕微鏡(EM)により、α−シヌクレイン線維は対照GSTタンパク質によって示されたが、TRIM11によって線維は全く観察されなかったことが明らかとなった(図38C)。次に、α−シヌクレイン線維を使用して、TRIM11の脱凝集を試験した。図38Dに示されているように、TRIM11又は突然変異型Hsp104による処置を用いると、α−シヌクレイン線維の可溶化は用量依存的に増加した。したがって、TRIM11又はHsp104を用いての処置による線維の脱会合は、ThT蛍光によって明らかであった(図38E)。
共通のN末端及び異なるC末端を有する70個を超えるTRIMファミリーメンバーが存在する。それ故、次に他のTRIMタンパク質もまたTRIM11のような類似した機能を有するかどうかを調べた。それ故、TRIM21を選択した。なぜなら、それはTRIM11と同じドメインを共有するからである。インビトロでのプルダウンアッセイは、TRIM21も、変性ルシフェラーゼに優先的に結合することを明らかとした(図39A)。同様に、TRIM21は、加熱されたルシフェラーゼ凝集物を中程度に可溶化することができ(図39B)、そしてルシフェラーゼの熱による失活を回復させることができた(図39C)。TRIM21もまた、熱による失活からルシフェラーゼを保護することができた(図39D)。PMLは、プロテアソームを通してAtxn1 82Q凝集物を分解することができた。よってAtxn1凝集物の脱凝集及び分解がPMLと共役するかどうかを調べるために、PMLを293T細胞から精製した(図40A)。図40Bに示されているように、PMLは、用量依存的にGFP蛍光の熱による失活を回復させることができた。しかしながら、回復能はTRIM11より弱かった(図40C)。PMLのいくつかの断片もまた、293T細胞から精製された(図40D)。興味深いことに、PMLの1つの断片(361−633)が、加熱されたGFP凝集物の再活性化のために必要とされる可能性がある(図40E)。
α−シヌクレイン凝集物の形成の制御におけるTRIM11の役割をより良く理解するために、マウス一次海馬神経細胞をモデルとして使用した。α−シヌクレイン線維(PEF)を、GST又はTRIM11を用いてインビトロで作製した(GST−PEF及びTRIM11−PEF)。PEFの添加から2週間後、約30%の神経細胞死が、PEF凝集物によって誘発された(図41A)。しかしながら、TRIM11−PEFは、神経細胞に対してより低い毒性を示す(図41A)。実際に、免疫蛍光法により、パーキンソン病脳のレビー小体の特徴を再現したかなりのα−シヌクレイン凝集物が存在したが、TRIM11−PEFの添加後には大きな凝集物は全く存在しなかったことが判明し(図41B)、これはさらに、TRIM11が、α−シヌクレイン線維の形成の防止機能を有することを示した。とりわけ、2種類の神経細胞(皮質神経細胞及び海馬神経細胞)において、TRIM11は、熱ショックに応答してアップレギュレートされることができた(図42A及び図42B)。さらに、TRIM11のmRNAレベルもまた、海馬神経細胞において増加した(図42C)。TRIM11が、神経変性疾患の制御に関与している可能性が高いことは興味深いことであった。
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