CN113292658B - 一种融合蛋白及其在靶向降解细胞内蛋白中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物技术领域，涉及一种由抗体片段和TRIM家族蛋白截短体构成的融合蛋白，以及构建该融合蛋白所需的核酸、质粒、宿主细胞，相应的药用组合物及其应用。本发明将TRIM家族蛋白进行截短，即仅保留N端的保守性结构域(RBCC结构域)，而将C端的可变区结构域删除，并将RBCC结构域与仅含重链可变区的纳米抗体进行融合，构建一种融合蛋白(RBCC‑Nanobody)，命名为TRIMbody。该TRIMbody可以利用其纳米抗体结构域特异性的结合靶蛋白，同时可利用其RBCC结构域启动蛋白降解通路，行使降解靶蛋白的功能。本发明的基于TRIMbody的蛋白靶向降解技术可用于消除细胞内过度表达、突变形式、或错误折叠的蛋白质和蛋白质聚集体。

Description

一种融合蛋白及其在靶向降解细胞内蛋白中的应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种融合蛋白及其应用，具体涉及一种融合蛋白(融合抗体片段的TRIM蛋白截短体)及其在靶向降解细胞内蛋白中的应用，尤其涉及一种由抗体片段和TRIM家族蛋白截短体构成的融合蛋白，以及构建该融合蛋白所需的核酸、质粒、宿主细胞，相应的药用组合物及其应用。
背景技术
在DNA或mRNA水平上干扰蛋白表达的技术方法在基因功能研究中已经获得广泛应用，例如可以利用CRISPR/Cas9(Clustered Regularly Interspaced Short PalindromicRepeats)技术对目的基因进行基因编辑或利用RNA干扰(RNA interference，RNAi)技术干扰mRNA转录等。然而，这些方法不能清除已经合成的蛋白质，尤其是细胞内一些相对稳定的长寿命蛋白质或发挥功能时程较短的目的蛋白。对于与疾病相关的骨架蛋白、结构蛋白、细胞功能调节蛋白、转录因子和其他非酶蛋白等“不可成药”靶点，直接诱导蛋白质进行降解是一种潜在的治疗策略。近年来，靶向蛋白降解(targeting protein degradation，TPD)作为一种高度选择性的诱发蛋白降解方式的研究受到科学和产业界的极大关注。目前已发展了一系列在蛋白水平降解内源性蛋白的技术方法，如蛋白水解靶向嵌合体系统(Proteolysis-Targeting chimaeras，PROTACs)、溶酶体靶向嵌合体(Lysosome-TargetingChimaeras，LYTACs)、自噬靶向嵌合体(Autophagy-targeting chimera，AUTAC)等。
三元基序蛋白(Tripartite motif-containing protein,TRIM)家族是一类含有多个结构域的蛋白分子，其结构在N端通常含有RING结构域(RING-finger domain)、B-Box结构域(B1box-B2 box domain)和coiled-coil结构域(coiled-coil domain)，三个高度保守的结构域排列为环指结构域-锌指结构域-卷曲螺旋结构域(RING-B-box-coiled-coil)，称之为RBCC特征性结构域。人类TRIM家族成员的分类是基于RBCC结构域序列的组成以及C末端结构域的不同进行的。目前，TRIM蛋白家族拥有80多个成员，大部分成员拥有RBCC特征性结构域，虽然有些TRIM蛋白家族成员可能缺少其中一个结构域，但结构域排列顺序和空间结构上是高度保守的。由于TRIM家族的大多数蛋白都含有RING结构域，故而通常有E3泛素连接酶活性。除了RBCC结构域外，TRIM家族蛋白在C末端为非特异的、多变的结构域。根据C末端结构域特点，将TRIM蛋白分为C-Ⅰ至C-Ⅺ共11个家族，但一些TRIM蛋白如TRIM14和TRIM16不具有RING结构域，无E3泛素连接酶活性，不同于其它可分类的TRIM蛋白。最常见的C末端结构域是PRY-SPRY结构域，由两个并列的PRY原件和SPRY原件组成，也被合称为B30.2，在约40个人类TRIM蛋白中存在，此外，PRY原件、SPRY原件还出现在人类其它蛋白家族中。TRIM蛋白在C末端的多变结构域可以和特定的蛋白质相互作用，从而实现不同的生物学功能。近年来，人们发现三元基序蛋白(Tripartite motif-containing protein，TRIM)家族的成员TRIM21在人体清除外来病原体的过程中发挥着重要的作用。TRIM21可通过C末端的PRY-SPRY结构域与进入细胞质中的IgG Fc片段相互作用，再通过N端的RBCC结构域泛素化标记被IgG带入细胞内的病原体或细胞内的蛋白，使与抗体结合的病原体或细胞内蛋白通过泛素-蛋白酶体途径降解。TRIM21介导的抗体依赖的细胞内中和反应(antibody-dependent intracellular neutralization，ADIN)使得人们人们认识到中和反应也可以在细胞内发生并在抵御病原体的入侵方面具有重要的作用，TRIM21作为目前在哺乳动物细胞内发现的唯一一个位于胞浆的IgG Fc受体得到了广泛关注，并基于TRIM21开发了一种靶向降解细胞内源性蛋白的新技术，命名为Trim-Away技术。该技术通过将TRIM21和靶向目的蛋白的特异性单克隆抗体同时导入细胞内，从而在短时间内快速降解哺乳动物细胞中内源性靶蛋白。然而，由于全长的单克隆抗体分子量过大(150kDa)，导致其不易穿过细胞膜进入细胞内，且很难达到一些具有空间位阻的靶点，使得TRIM-Away技术目前尚停留在实验室研发阶段，无法真正在临床上获得应用。
发明内容
本发明的目的是为解决现有技术存在的问题，通过融合抗体片段和TRIM家族蛋白截短体构建了一种融合蛋白。本申请提出将TRIM家族蛋白进行截短，即仅保留N端的RBCC结构域，而将C端的可变区结构域删除，并将RBCC结构域与仅含重链可变区的纳米抗体(15kDa)进行融合，构建一种新型的融合蛋白(RBCC-Nanobody)，命名为TRIMbody。TRIMbody可以利用其纳米抗体结构域特异性的结合靶蛋白，同时可利用其RBCC结构域启动蛋白降解通路，行使降解靶蛋白的功能。我们将这种基于TRIMbody的蛋白降解技术命名为TRIMbody-Away技术，该技术只需将单一蛋白转入细胞内即可完成靶蛋白的降解功能。本发明提供的基于TRIMbody的蛋白靶向降解技术，可以用于消除细胞内错误折叠的蛋白质、蛋白质聚集体或蛋白质包涵体。
具体的，
本发明提供了一种融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白包含抗体片段和TRIM家族蛋白截短体或TRIM家族全长蛋白及其变体，所述TRIM家族蛋白截短体或TRIM家族全长蛋白及其变体具有E3泛素连接酶的活性或诱导细胞发生自噬的功能。
优选的，本发明所述TRIM家族蛋白来源于哺乳动物的TRIM蛋白。
更优选的，本发明所述TRIM家族蛋白选自Ⅰ家族的TRIM1、TRIM9、TRIM18、TRIM36、TRIM46、TRIM67；Ⅱ家族的TRIM54、TRIM55、TRIM63；Ⅲ家族的TRIM42；IV家族的TRIM21、TRIM5、TRIM4、TRIM6、TRIM7、TRIM10、TRIM11、TRIM15、TRIM16、TRIM17、TRIM22、TRIM25、TRIM26、TRIM27、TRIM34、TRIM35、TRIM38、TRIM39、TRIM39、TRIM41、TRIM44、TRIM43、TRIM47、TRIM48、TRIM49、TRIM50、TRIM53、TRIM58、TRIM60、TRIM62、TRIM64、TRIM65、TRIM68、TRIM69、TRIM72、TRIM75；V家族的TRIM8、TRIM19、TRIM31、TRIM40、TRIM52、TRIM56、TRIM61、TRIM73、TRIM74；Ⅵ家族的TRIM24、TRIM28、TRIM33；VII家族的TRIM2、TRIM3、TRIM32、TRIM71；Ⅷ家族的TRIM37；Ⅸ家族的TRIM23；Ⅹ家族的TRIM45；Ⅺ家族的TRIM13、TRIM59或Ⅻ家族的TRIM14、TRIM16、TRIM20、TRIM51、TRIM70、TRIM1L、TRIM29、TRIM44、TRIM66。
经过一个或多个氨基酸残基的替换、缺失或添加而形成的并具有E3泛素连接酶活性的TRIM家族蛋白的氨基酸序列也包括在本发明中。
优选的，本发明所述TRIM家族蛋白截短体包含RBCC结构域。本发明所述的RBCC结构域位于TRIM家族蛋白N端，通常含有RING结构域(环指结构域，RING-finger domain)、B-Box结构域(锌指结构域，B1 box-B2 box domain)和coiled-coil结构域(卷曲螺旋结构域，coiled-coil domain)，三个高度保守的结构域排列为环指结构域-锌指结构域-卷曲螺旋结构域(RING-B-box-coiled-coil)。其中的RING结构域具有E3泛素连接酶活性。经过一个或多个氨基酸残基的替换、缺失或添加而形成的并具有E3泛素连接酶活性的RBCC结构域的氨基酸序列也包括在本发明中。
优选的，本发明所述的RING结构域选自TRIM21、TRIM5α、TRIM19、TRIM28的RBCC结构域。
更优选的，本发明所述的RING结构域包含SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列。
优选的，本发明所述TRIM家族蛋白截短体至少保留了RBCC结构域中的环指结构域(RING结构域)、锌指结构域(B-Box结构域)、卷曲螺旋结构域(coiled-coil结构域)中的一个结构域。本发明所述的RING结构域具有E3泛素连接酶活性，可以与E3泛素连接酶结合，E3泛素连接酶通过将一种叫做泛素的小蛋白贴在靶蛋白上为其加上一个泛素化的标签，多聚泛素化之后的蛋白会被26S蛋白酶体识别，并引导其进入泛素-蛋白酶体降解途径。经过一个或多个氨基酸残基的替换、缺失或添加而形成的并具有E3泛素连接酶活性的RING结构域的氨基酸序列也包括在本发明中。一些TRIM家族蛋白的Coiled-coil结构域中含有LIR(LC3-interacting region)基序，可以与自噬受体结合，此时含有Coiled-coil结构域的TRIMbody就能够引导目标蛋白进入自噬-溶酶体降解通路。经过一个或多个氨基酸残基的替换、缺失或添加而形成的Coiled-coil结构域的氨基酸序列也包括在本发明中。
优选的，本发明所述的抗体片段可以特异性结合目标蛋白。本发明所述的目标蛋白可以是真核细胞中的任何蛋白，如转录因子，骨架蛋白，结构蛋白，受体，酶，细胞功能调节蛋白，在病毒、微生物和寄生性质的传染病、代谢病、老化、环境性疾病、遗传性疾病、生活方式疾病过程中起作用的蛋白，涉及生长和发育、记忆以及感知感觉的蛋白质等。
优选的，本发明所述的抗体片段为完整抗体的抗原结合区和可变区、IgG、IgA、IgM、IgE、IgD、骆驼科动物HCAbs抗体及其VHH片段、IgNAR及其可变区VNAR、Fab片段、Fab’片段、F(ab)2’片段、Fv片段、单链抗体片段、bis-scFv、双抗体、三抗体、四抗体、二硫键稳定的Fv蛋白或单域结构抗体。
优选的，本发明所述的抗体片段为纳米抗体。
优选的，本发明所述的抗体片段为通过基因工程重组技术改造的工程化抗体。
优选的，本发明所述的工程化抗体为嵌合抗体、异源缀合抗体、CDR移植抗体、含有抗原结合位点的融合蛋白或抗原结合片段。
更优选的，本发明所述的抗体片段为HIV-1衣壳蛋白的纳米抗体，Tau蛋白的纳米抗体，乙型肝炎病毒表面抗原的单链抗体，冠状病毒S蛋白抗体或RAB27A蛋白抗体。
进一步，本发明提供的融合蛋白还包含靶向结构域。
优选的，本发明所述的靶向结构域为细胞渗透穿膜肽结构域、信号肽、核酸酶结构域、DNA结合结构域、染色质重塑结构域、表观遗传修饰结构域、组蛋白修饰结构域、抗原结合结构域、跨膜结构域、细胞内信号转导结构域、多聚化结构域，表位标签，谷胱甘肽S转移酶、多肽连接子、多肽切割信号中的一种或几种。其中细胞穿膜肽(Cell-penetratingpeptides,CPPs)是一类能够穿过细胞膜或组织屏障的短肽。CPPs可通过内吞和直接穿透等机制运载蛋白质、RNA、DNA等生物大分子进入细胞内发挥其效应功能。常见的阳离子型的细胞穿膜肽有人类免疫缺陷病毒(Human immunodeficiency virus,HIV)中的反式转录激活因子(Transactivator,TAT)、源于乙酰肝素结合蛋白的DPV1047等一系列DPV穿膜肽，源于RNA结合蛋白的HIV-1Rev、BMV Gag酵母Prp6以及源于DNA结合蛋白的Protamine1和Penetratin；两亲型细胞穿膜包括MAP、Transportan、Pep-1、Bovine Prp、ARF、pVEC、VT5、Bac7；常见的疏水型细胞穿膜肽有BIP、C105Y、Pep-7、SG3和FGF等。信号肽(Signalpeptide)是一段存在于前体蛋白N-端的短肽链，其功能在于引导和调节前体蛋白的折叠，在蛋白转移和分泌过程中扮演着极其重要的角色。
本发明提供的融合蛋白，其特征在于，所述抗体片段和TRIM家族蛋白截短体通过连接序列连接。
优选的，本发明所述的连接序列指含有柔性氨基酸残基的多肽链，所述柔性氨基酸残基为Gly，Ser，Ala，或Thr。所述多肽链应具有合适的距离，该距离适于连接两个分子使其具有正确构型以保持所需活性。连接序列的适宜长度包括至少一个以及不超过30个氨基酸残基。优选的，所述连接序列长度为约1-30个氨基酸，优选的连接序列长度为1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19和20个氨基酸。此外，被选用于包含在所述连接序列中的氨基酸残基所显示的性质不应明显影响两个被连接分子的活性。因此，所述连接序列总体上不显示与所述两个被连接分子不一致的电荷，或不影响内部折叠，或与一或多个单体中的氨基酸残基形成键合或其它相互作用，否则所述单体将严重阻碍受体单体结构域的结合。
更优选的，本发明所述的连接序列包含SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列。
本发明提供了编码所述融合蛋白的核酸。本发明提供了包含所述核酸的质粒，任选地，可操作地连接调控序列，如启动子、增强子等。本发明提供了包含该质粒的宿主细胞，以及用于生产和任选地回收该融合蛋白的方法。本发明所述宿主细胞可以是任何原核细胞或真核细胞，包括但不限于细菌细胞(例如大肠杆菌、枯草杆菌)、昆虫细胞(例如利用杆状病毒表达系统)、酵母或哺乳动物细胞(例如CHO或BHK细胞系)。其它合适的宿主细胞为本领域技术人员所知。
本发明还提供了一种药用组合物，由有效预防或治疗剂量的本发明的融合蛋白或其核酸分子、质粒，和生理学上或药学上可接受的载体、赋形剂或稳定剂混合制备而成，所述组合物包括但不限于冻干剂型、水溶液剂型、脂质体或胶囊剂型等。本发明的融合蛋白或其核酸分子、质粒的浓度可从约0.1％变化为100％(重量)。
本发明还提供了所述融合蛋白在靶向降解细胞内蛋白中的应用。
优选的，所述细胞内蛋白为真核细胞或原核细胞中的短寿命的蛋白、错误折叠的蛋白、过剩的蛋白、长寿命蛋白、不可溶的蛋白聚集体、骨架蛋白、转录因子、结构蛋白、受体、酶、细胞功能调节蛋白、其他非酶蛋白，细胞器或入侵细胞的细菌和病毒。
更优选的，所述细胞器为如线粒体、过氧化物酶体、内质网或核糖体。
优选的，所述细胞内蛋白通过泛素-蛋白酶体途径和/或自噬-溶酶体途径降解。
本发明提供了一种降解细胞内目标蛋白的方法，该方法包含：
1)制备本发明的融合蛋白或其核酸分子、质粒或药用组合物；
2)向细胞内引入制备得到的本发明的融合蛋白或其核酸分子、质粒或药用组合物。
优选的，所述细胞为真核细胞或原核细胞。
优选的，所述目标蛋白为真核细胞或原核细胞中的短寿命的蛋白、错误折叠的蛋白、过剩的蛋白、长寿命蛋白、不可溶的蛋白聚集体、骨架蛋白、转录因子、结构蛋白、受体、酶、细胞功能调节蛋白、其他非酶蛋白，细胞器或入侵细胞的细菌和病毒。
更优选的，所述细胞器为如线粒体、过氧化物酶体、内质网或核糖体。
优选的，所述细胞内目标蛋白通过泛素-蛋白酶体途径和/或自噬-溶酶体途径降解。
所述向细胞引入本发明融合蛋白的核酸分子时，包括DNA和RNA载体的使用，本领域已知的病毒载体包括反转录病毒、慢病毒、痘病毒、单纯疱疹病毒Ⅰ型、腺病毒和腺相关病毒(AAV)载体；本领域已知的非病毒基因转移方法包括：化学技术如磷酸钙共沉淀；机械技术如显微注射；通过脂质体的膜融合介导的转染；直接DNA吸收和受体介导的DNA转移；电穿孔、基因枪、免疫脂质体、纳米粒子、聚阳离子、人工病毒粒子、细胞穿膜肽(CellPenetrating Peptide，CPP)、DEAE-葡聚糖介导的转移和热休克。
本发明提供了一种诊断、预防或治疗疾病的方法，包括向受试者施用本发明所述的融合蛋白、核酸分子、质粒、以及药用组合物。
本发明所述疾病为蛋白质病变或失调有关的疾病，包括但不限于自身免疫性疾病、炎症性疾病、神经退行性疾病、癌症或病原体感染。
优选的，本发明的融合蛋白、核酸分子、质粒、以及药用组合物可用于治疗癌症。本发明所述癌症包括但不限于淋巴瘤、胚细胞瘤、肉瘤(包括脂肉瘤)、神经内分泌肿瘤、间皮瘤、神经鞘瘤、脑膜瘤、腺瘤、黑素瘤以及非白血性白血病或淋巴恶性肿瘤。上述癌症更具体的实例包括鳞状细胞癌(如，鳞状上皮细胞癌)、肺癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌以及肺鳞状细胞癌、腹膜癌、肝细胞癌、胃癌、胃肠癌、胰腺癌、恶性胶质瘤、宫颈癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肝细胞瘤、乳腺癌、结肠癌、直肠癌、结肠直肠癌、子宫内膜或子宫癌、唾液腺癌、肾癌、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、肝癌、肛门癌、阴茎癌、睾丸癌、食道癌、胆管肿瘤，头癌、颈癌、骨髓基质瘤、破骨细胞瘤、多发性骨髓瘤、溶骨性癌(osteolytic bone cancers)、中枢神经系统肿瘤、脑肿瘤(神经胶质瘤、成神经细胞瘤、星细胞瘤、成神经管细胞瘤、室管膜细胞瘤和视网膜成神经细胞瘤)、鼻咽癌、基底细胞癌、胆管癌、卡波氏肉瘤、原发性肝癌或子宫内膜癌、以及血管系统肿瘤(血管肉瘤和hemagiopericytoma)。
优选的，本发明的融合蛋白、核酸分子、质粒、以及药用组合物可用于治疗病原体感染。本发明所述病原体包括但不限于细菌、真菌、病毒、寄生虫，如新型冠状病毒肺炎、艾滋病、乙型肝炎、肺结核、麻风病、流行性感冒、禽流感、带状疱疹、呼吸道合胞病毒肺炎、埃博拉出血热、寨卡病毒病。
优选的，本发明的融合蛋白、核酸分子、质粒、以及药用组合物可用于治疗神经退行性疾病。本发明所述神经退行性疾病包括但不限于威尔逊病(Wilson’s disease)、脊髓小脑共济性失调(SCA)、亨延顿舞蹈病、阿尔茨海默病(AD)、帕金森氏病(Parkinson’sdisease,PD)、亨廷顿氏病(Huntington’s disease,HD)、连锁于17号染色体伴帕金森病的额颞叶痴呆(Frontotemporal dementia linked to chromosome-17parkinsonism,FTDP-17)、家族性肌萎缩侧索硬化(amyotrophic lateral sclerosis,ALS)、脊髓小脑共济性失调的一些类型(spinocerebellar ataxia types 1,2,3,6,7,17)以及朊病毒病(例如瘙痒病、克雅病、格施谢三氏症、牛海绵样脑病)、致死性家族性失眠症(fatal familialinsomnia)、α-Ⅰ型抗胰蛋白酶缺乏症(alpha-Ⅰantitrypsin deficiency)、齿状核红核苍白球路易斯核萎缩症(spinobulbar muscular atrophy)、神经元核内包涵体病(Neuronalintranuclear hyaline inclusion disease)、皮克氏病(Pick’s disease,PiD)、进行性核上麻痹(progressive supranuclear palsy,PSP)、皮质基底节变性(corticobasaldegeneration,CBD)、原发性年龄相关性tau病(primary age-related tauopathy,PART)、嗜银颗粒病(argyrophilic grain disease,AGD)、老化相关tau星形胶质细胞病(aging-related tau astrogliopathy,ARTAG)、慢性创伤性脑病(chronic traumaticencephalopathy,CTE)、球形胶质细胞tau病变(Globular glial tauopathy,GGT)、脑卒中和癫痫等。其它该类疾病和病症包括但不限于AL淀粉样变性、AA淀粉样变性、家族性地中海热、老年系统性淀粉样变性、家族遗传性淀粉样多神经病、透析相关的淀粉样变性、ApoAⅠ淀粉样变性、ApoAⅡ淀粉样变性、ApoAIV淀粉样变性、芬兰型遗传性淀粉样变性、溶菌酶淀粉样变性、纤维蛋白原淀粉样变性、冰岛性遗传性脑淀粉样血管病、心房性淀粉样变性、遗传性脑出血伴淀粉样变性、注射局部化淀粉样变性、主动脉内侧淀粉样变性、遗传性格子状角膜变性、白内障、牙髓性钙化上皮细胞瘤、肺泡蛋白沉积症、包涵体肌炎症和苔藓型皮肤淀粉样变性。
优选的，本发明的融合蛋白、核酸分子、质粒、以及药用组合物可用于治疗炎症性疾病、自身免疫疾病以及眼部疾病，包括但不限于甲状腺炎、胰腺炎、脑膜炎、心肌炎、肝炎、胆囊炎、过敏反应、组织移植物排斥、器官移植超急性排斥、哮喘、过敏性鼻炎、慢性阻塞性肺病、肾小球炎、感染性休克、重症肌无力、白癜风、自身免疫性垂体机能减退、硬皮病、蕈样真菌病、风湿病(例如类风湿关节炎、舍格伦综合征、硬皮病、狼疮诸如系统性红斑狼疮和狼疮性肾炎、多发性肌炎/皮肌炎、冷球蛋白血症、抗磷脂抗体综合征和银屑病)、骨关节炎、自身免疫性胃肠道和肝脏疾病(诸如炎症性肠病例如溃疡性结肠炎和克罗恩病)、自身免疫性胃炎和恶性贫血、自身免疫性肝炎、原发性胆汁性肝硬化、原发性硬化性胆管炎和乳糜泻)、血管炎、自身免疫性神经系统疾病(诸如多发性硬化、眼阵挛肌阵挛综合征、重症肌无力、视神经脊髓炎和自身免疫性多发性神经病)、肾脏疾病(诸如肾小球肾炎、古德帕斯彻综合征)、Ⅰ型糖尿病、Ⅱ型糖尿病、动脉粥样硬化、注意力缺陷伴多动障碍、孤独症、抑郁症、癫痫、心肌梗塞、自身免疫性皮肤病(诸如牛皮癣、荨麻疹、寻常性天疱疹、大疱性天疱疹和皮肤红斑狼疮)、血液系统疾病(诸如血小板减少性紫癜输血后紫癜和自身免疫性贫血症)、动脉粥样硬化、葡萄膜炎、自身免疫性听力下降、贝切特病、雷诺综合征、器官移植和自身免疫性内分泌失调(诸如糖尿病相关自身免疫疾病诸如胰岛素依赖性糖尿病(IDDM))、艾迪生病自身免疫性甲状腺疾病、肉毒杆菌毒素中毒、染色体显性色素性视网膜炎、IMPDH1介导的色素性视网膜炎、白内障。
本发明的融合蛋白、核酸分子、质粒、以及药用组合物可用于治疗的病症具体包括但不限于：充血性心力衰竭(CHF)、血管炎、红斑痤疮、痤疮、湿疹、心肌炎和其它心肌病症、系统性红斑狼疮、糖尿病、脊椎病、滑液成纤维细胞增生、骨质丢失、变形性骨炎(paget’sdisease)、失用型骨质减少、营养不良、牙周病、家族性脾性贫血、朗罕氏细胞组织细胞增多病、脊髓损伤、急性脓毒性关节炎、骨软化症、皮质醇增多症、单骨纤维性骨发育不良、多发性骨纤维性发育不良、牙周再建以及骨折、肉样瘤病、骨转移/骨痛治疗和体液恶性高钙血症、强直性脊椎炎和其它脊椎关节病、移植排斥、病毒感染、血液瘤、何杰金氏淋巴瘤、非何杰金淋巴瘤(Burkitt’s淋巴瘤、小淋巴细胞淋巴瘤/慢性淋巴细胞性白血病、蕈样肉芽肿病、外套细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、弥漫性巨大B细胞淋巴瘤、边缘区淋巴瘤、毛细胞性白血病以及淋巴浆细胞性白血病)、淋巴细胞前体细胞肿瘤、B细胞急性成淋巴细胞性非白血性白血病/淋巴瘤、T细胞急性成淋巴细胞性非白血性白血病/淋巴瘤、胸腺瘤、成熟T和NK细胞肿瘤、外周T细胞非白血性白血病、成熟T细胞非白血性白血病/T细胞淋巴瘤、大颗粒状淋巴细胞性白血病、朗罕氏细胞组织细胞增多症、急性骨髓性粒细胞性白血病的骨髓瘤，成熟的急性骨髓性白血病(AML)、分化的急性骨髓性白血病、急性前髓细胞性白血病、急性骨髓单核细胞性白血病、急性单核细胞性白血病、脊髓发育不良综合征、慢性骨髓增生病，慢性髓细胞性白血病、骨质疏松症、肝炎、HIV、AIDS、脊椎关节炎、类风湿性关节炎、炎性肠疾病(IBD)、败血症和败血症性休克、节段性回肠炎、牛皮癣、硬皮病、移植物抗宿主病(GVHD)、异源胰岛移植排斥(allogenic islet graft rejection)、血液恶性肿瘤诸如多发性骨髓瘤(MM)、骨髓增生异常综合征(MDS)和急性骨髓性白血病(AML)、肿瘤相关的炎症、周围神经损伤或脱髓鞘性病。
本发明的融合蛋白、核酸分子、质粒、以及药用组合物可以通过各种不同的给药途径给予人或动物受试者，所述给药途径通常取决于待治疗的疾病本身的特征。一般而言，可利用医学上可接受的任何给药模式来实施本发明的方法，所述给药模式包括经口、直肠、局部、眼内、脑池内、脑室内、气管内、鼻内滴入、透皮、皮下、鞘内、肌内、腹腔、腹膜内、颅内输注或者静脉输注。
本发明中，用抗体片段替换TRIM家族蛋白的多变结构域，将靶向结合细胞内蛋白的抗体片段与TRIM家族蛋白的RBCC结构域的表达基因直接进行融合，组合成RBCC-抗体片段(约52kDa)的分子结构，抗体片段负责靶向结合目标蛋白，RBCC结构域负责泛素化目标蛋白并引导目标蛋白进入泛素-蛋白酶体途径降解，从而降解目的蛋白。本发明的技术只需要向细胞中引入一个融合抗体片段的TRIM家族蛋白截短体(约52kDa)，就可以达到靶向结合细胞内目的蛋白同时泛素化降解目标蛋白的目的。将靶向结合细胞内蛋白的抗体片段与TRIM家族蛋白的RBCC结构域的表达基因直接进行融合，所获得的融合抗体片段的TRIM家族蛋白截短体分子量小，可以到达有空间位阻的靶点，且兼具靶向降解目的蛋白的效应功能。具有双功能的融合抗体片段的TRIM家族蛋白截短体(TRIMbody)有可能会成为未来抗体类药物的一个热点研究方向并用于细胞内蛋白的沉默或敲除。
单域抗体(single-domain antibody,sdAb)仅有重链抗体(heavy-chainantibodies,HCAbs，90kDa)中单个重链可变区的抗原识别区片段，又称之为VHH抗体(variable domain of heavy chain of heavy-chain antibody,VHH)。VHH由于缺失轻链和重链恒定区，是传统单链抗体可变区片段(single chain variable fragment,scFv)的一半，其蛋白分子量约为15kDa，而一个完整的单克隆抗体的大小为150kDa。单域抗体VHH晶体结构呈椭圆形，直径约2.5nm，长约4.2nm，又被称为纳米抗体(nanobody，Nb)。VHH依靠3个互补决定区(CDR1、CDR2、CDR3)就具备了特异的抗原结合能力和高亲和力，CDR区氨基酸序列具有很强的突变性，CDR区之间的氨基酸序列变化较小，称为骨架区(FR1、FR2、FR3、FR4)。纳米抗体较长的CDR3可形成一个具有稳定结构的暴露的凸环结构(凸环中具有二硫键)，能够深入抗原内部特异性识别独特和隐匿在缝隙结构中的抗原决定簇表位，从而更好的识别、中和病毒以及其它致病微生物的特殊结构蛋白，极大程度的提高了其抗原特异性亲和力，而抗原结合区片段(antigen-binding fragment,Fab)及单链抗体片段(single-chainvariable fragment,scFv)较短的CDR3常形成凹形拓扑结构，只能识别位于抗原表面的位点。纳米抗体是具备良好的生化特性的抗原结合片段，包括分子小、结构简单且免疫原性低、水溶性好、稳定性(抗聚集性)强以及对抗原具备高亲和力等特点，故纳米抗体受到了广泛的关注。将靶向结合细胞内蛋白的纳米抗体与TRIM家族蛋白的RBCC结构域的表达基因直接进行融合，形成RBCC-VHH的结构，其一端可以由纳米抗体结合目标蛋白，另一端为TRIM家族蛋白的RBCC结构域。由于纳米抗体可以在细胞质、细胞核及内质网中等都可以进行正常折叠，能很好地维持其抗原结合能力，因此可以将RBCC-VHH用作细胞内抗体，去结合酶活性中心、细胞因子及可溶性蛋白，达到中和并降解细胞内蛋白的效果。
为了能更彻底地理解发明，以下列出一些定义。所述定义意在包含语法等同成分。
本文中使用的“可变区结构域”意指TRIM家族蛋白在C末端的非特异的、多变的结构域，可变区结构域可以和特定的蛋白质相互作用，从而实现不同的生物学功能。包括COS结构域(C-terminal subgroup One Signature domain)，Ⅲ型纤维连结蛋白重复结构域(Fibronectin type III repeat domain，FNⅢ)，PRY结构域，SPRY结构域，NHL结构域，富含酸区结构域(Acid-rich region，ACID)，细丝蛋白型Ig结构域(Filamin-type Ig domain，FIL)，PHD结构域，跨膜区结构域(transmembrane region，TM)，布罗莫结构域(Bromodomain，BRD)结构域，甲基多巴(Meprin)和肿瘤坏死因子受体相关因子(TRAF)同源结构域(MATH)和ADP-核糖基化因子家族结构域(ADP-ribosylation factor familydomain，ARF)。
本文中使用的“融合蛋白”意指利用基因工程技术有目的地把两段或多段编码不同生物学活性的功能蛋白的基因通过连接序列(linker)连接在一起，进而表达所需要的新型蛋白，这种通过在人工条件下将两个或多个基因的编码区首位连接，由同一调控序列控制构成的基因表达后所得到的蛋白质产物称为融合蛋白(fusion protein，FP)。具有生物学活性的功能蛋白可以是细胞因子、毒素、受体、酶、抗原肽等。其结构特点为将功能蛋白与其他分子的活性域融合，各组分可发挥协同作用，使融合蛋白的生物学活性较各单体大大增强。融合基因可在原核细胞(如大肠杆菌)也可在真核细胞中进行表达。
本文中使用的“截短体蛋白(truncted protein)”意指一段序列被删除而变短的基因所表达出的蛋白。
本文中使用的“全长蛋白(full-length protein)”意指由基因编码序列(Codingsequence，CDS)所编码的氨基酸序列完整的整条蛋白，而不是其中的一段多肽。
本文中使用的“变体(variant)”意指由于编码氨基酸的基因编码序列发生缺失、替换或插入突变，造成编码氨基酸的序列发生改变而形成的蛋白。
本文中使用的“E3泛素连接酶(E3 ubiquitin ligase enzyme)”能识别底物蛋白并将其泛素化，导致底物蛋白通过26S蛋白酶体进行降解，是调节蛋白水平的重要因子。E3泛素连接酶是目前为止在疾病中研究最为广泛的泛素-蛋白酶体成分，人体中目前已有超过600种E3泛素连接酶被发现。E3连接酶可分为HECT(Homologous to the E6-AP CarboxyTerminus，HECT)结构域家族、RING结构域家族、U-box结构域家族及CRLs(Cullin-RINGubiquitin ligases)家族4个主要亚家族。
本文中使用的“纳米抗体(nanobody，Nb)”又称重链可变区(variable domain ofHcAb，VHH)抗体，是一种仅由一个重链可变区组成的单域抗体(single-domain antibody，sdAb)。纳米抗体保留了重链抗体完整的抗原结合能力，且具有分子质量小、组织穿透性强、抗原亲和力高、能识别隐藏表位、免疫原性低、人源化简单、结构稳定、水溶性好、生产成本低、易于产业化等优点，在疾病诊断、癌症和感染性疾病治疗、小分子药物及毒素残留检测等领域展现出巨大的应用前景。
本文中使用的“氨基酸”意指20种天然存在的氨基酸之一或任一非天然类似物，它们可位于具体规定的位置。本文中“蛋白质”意指至少两个共价连接的氨基酸，其包括蛋白质、多肽、寡肽和肽。蛋白质可由天然存在的氨基酸和肽键构成，或由合成的肽模拟物结构构成，该肽模拟物即“类似物”。因此本文中使用的“氨基酸”或“肽残基”意指天然存在和合成的氨基酸。举例来说，对于本发明目的而言，高苯基丙氨酸、瓜氨酸和降亮氨酸被认为是用于本发明目的的氨基酸。“氨基酸”也包括诸如脯氨酸和羟脯氨酸的亚氨基酸残基。侧链可以是(R)或(S)构型。在优选的实施方案中，氨基酸以(S)或L-构型存在。如果使用非天然存在的侧链，可使用非氨基酸取代，例如以阻止或延迟体内降解。
本文中使用的“多肽”意指一种聚合物，其中单体是通过酰胺键连接在一起的氨基酸残基。当氨基酸是α-氨基酸时，可以使用L-光学异构体或D-光学异构体。如本文所用的术语“多肽”或“蛋白质”旨在涵盖任何氨基酸序列并包括修饰的序列，例如糖蛋白。术语“多肽”特别旨在涵盖天然存在的蛋白质，以及重组或合成产生的蛋白质。
本文中使用的“N端”也称为氨基末端，NH2-末端，N-末端或胺末端，是蛋白质或多肽的起始，指的是位于多肽末端的游离胺基团(-NH2)。“C端”也称为羧基末端，羧基末端，C-末端尾部，C-末端或COOH-末端，是蛋白质或多肽的末端，由游离羧基(-COOH)末端终止。
本文中“抗体”意指由基本上为公认的免疫球蛋白基因的全部或部分所编码的一种或多种多肽组成的蛋白质。所述公认的免疫球蛋白基因，例如在人中，包括kappa(κ)、lambda(λ)和重链基因座，其中包含了无数的可变区基因，以及分别编码IgM、IgD、IgG、IgE和IgA同种型的恒定区基因mu(μ)、delta(δ)、gamma(γ)、epsilon(ε)、alpha(α)。本文中的抗体意指包括全长抗体和抗体片段，以及来自任意生物体的天然抗体，工程抗体，或为试验、治疗目的或其它如下所进一步规定的目的而重组产生的抗体。术语“抗体”包括抗体片段，为本领域所公知，诸如Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv，scFv或抗体的抗原结合的其它亚序列，或通过修饰完整抗体或使用重组DNA技术重新合成的那些抗体而产生的抗体片段。术语“抗体”包括单克隆以及多克隆抗体。抗体可以是拮抗剂、激动剂、中和性抗体、或抑制性抗体、或刺激性抗体。本发明的抗体可以是非人抗体，嵌合抗体，人源化抗体或完全人抗体。
本文中使用的“抗原”意指可以在动物体内刺激抗体产生或T细胞反应的化合物、组合物或物质，包括注射或吸收到动物体内的组合物，可以是蛋白质、糖类、脂质或其它病原体。
本文所使用的“核酸”意指由核苷酸单元(核糖核苷酸，脱氧核糖核苷酸，相关的天然存在的结构变体及其合成的非天然存在的类似物)通过磷酸二酯键组成的聚合物。因此，该术语包括核苷酸聚合物，其中核苷酸和它们之间的键包括非天然存在的合成类似物，例如但不限于硫代磷酸酯，氨基磷酸酯，甲基磷酸酯，手性甲基磷酸酯，2’-O-甲基核糖核苷酸，肽核酸(PNA)等。例如，可以使用自动DNA合成仪合成这些多核苷酸。术语“寡核苷酸”通常是指短多核苷酸，通常不大于约50个核苷酸。应当理解，当核苷酸序列由DNA序列(即A，T，G，C)表示时，这也包括其中“U”取代“T”的RNA序列(即A，U，G，C)。
本文使用常规符号来描述核苷酸序列：单链核苷酸序列的左手末端5'末端；双链核苷酸序列的左手方向称5'方向。向新生RNA转录物添加5’至3’核苷酸的方向称为转录方向。具有与mRNA相同序列的DNA链被称为编码链。
本文中使用的“残基”意指在蛋白质中的位置以及与之相关的氨基酸同一性。例如，天冬氨酸297(也称为Asn297，N297)是在人抗体IgG1中的一种残基。
本文中所使用的“编码”意指多核苷酸中特定核苷酸序列的固有特性，例如基因，cDNA或mRNA，用作在具有确定的核苷酸序列的生物过程中合成其他聚合物和大分子的模板，或确定的氨基酸序列和由此产生的生物学特性。因此，如果由该基因产生mRNA的转录和翻译，在细胞或其他生物系统中产生蛋白质，则基因编码蛋白质。编码链(其核苷酸序列与mRNA序列相同并且通常在序列表中提供)和非编码链(用作转录模板，基因或cDNA)可以被称为编码蛋白质、或该基因或cDNA的其他产物。除非另有说明，否则“编码氨基酸序列的核苷酸序列”包括此简并形式且包括编码相同氨基酸序列的所有核苷酸序列。编码蛋白质和RNA的核苷酸序列可包括内含子。
本文中使用的“质粒”意指在天然质粒的基础上为适应实验室操作而进行人工构建的质粒。可将核酸分子导入宿主细胞，从而产生转化的宿主细胞。载体可包括允许其在宿主细胞中复制的核酸序列，例如复制起点，还可以包括一种或多种选择标记基因和本领域已知的其他遗传元件。
本文所使用的“宿主细胞”也称为受体细胞，是指在转化和转导(感染)中接受外源基因的宿主细胞。
本文中使用的“药学可接受载体”意指常规的药学上可接受的载体。Remington'sPharmaceutical Sciences，EWMartin，Mack Publishing Co.，Easton,Pa.，第15版(1975)，描述了适用于药物递送一种或多种治疗化合物或分子(例如一种或多种抗体)的组合物和制剂，以及另外的药剂。
本文中所使用的“诊断”疾病是指在给病人做检查之后判定病人的病症及其发展情况。“预防”疾病是指抑制疾病的完全发展。“治疗”是指在其开始发展后改善疾病或病理状况的体征或症状的治疗性干预。
本文中“施用”意指选择合适的途径将所述物质引入受试者。例如，如果所选择的途径是静脉内的，则通过将所述物质引入受试者的静脉来施用组合物。
本文中“有效预防/治疗剂量”意指足以在用该药剂治疗的受试者中达到所需效果的一定量的特定药剂。精确的剂量将依赖于治疗的目的，并可为本领域技术人员通过使用公知技术所确定。剂量范围可为0.01-100mg/kg体重或更大，例如0.1、1、10或50mg/kg体重，优选1-10mg/kg。如本领域所公知，对于全身性或局部性递药和新蛋白酶合成速率，以及年龄、体重、大致健康状况、性别、饮食、给药时间、药物相互作用以及病症的严重程度而言，调整可以是必需的，并可由本领域那些技术人员通过常规的实验方法来确定。用于预防，改善和/或治疗受试者的治疗有效量的药剂将取决于所治疗的受试者，痛苦的类型和严重程度，以及治疗组合物的施用方式。
本文中“自身免疫性疾病”指一种疾病，其中免疫系统针对正常宿主的一部分抗原(即自身抗原)产生免疫应答(例如，B细胞或T细胞应答)，随后对组织造成损伤。自身抗原可以源自宿主细胞，或者可以衍生自共生生物，例如通常定殖于粘膜表面的微生物(称为共生生物)。影响哺乳动物的自身免疫疾病包括但不限于类风湿性关节炎，幼年型少关节炎，胶原诱导的关节炎，佐剂诱导的关节炎，斯耶格伦综合征，多发性硬化症，实验性自身免疫性脑脊髓炎，炎性肠病(例如，克罗恩病，溃疡性结肠炎)，自身免疫性胃萎缩，寻常型天疱疮，牛皮癣，白癜风，Ⅰ型糖尿病，非肥胖性糖尿病，重症肌无力，格雷夫斯病，桥本氏甲状腺炎，硬化性胆管炎，硬化性唾液腺炎，系统性红斑狼疮，自身免疫性血小板减少性紫癜，Goodpasture综合征，艾迪生病，系统性硬化症，多发性肌炎，皮肌炎，自身免疫性溶血性贫血，恶性贫血等。
本文中“神经退行性疾病”指一种疾病，神经退行性疾病(Neurodegenerativediseases)是由于机体特定神经元结构或功能逐渐丧失，进而导致认知和运动功能下降的一类不可逆转的神经系统疾病，主要包括阿尔兹海默症(Alzheimer's disease，AD)、帕金森病(Parkinson’sdisease，PD)、亨廷顿病(Huntington’s disease，HD)、癫痫症(Epilepsy)、记忆障碍(Dysmnesia)、老年性痴呆(senile dementia)、神经痛-周围神经病变(Neuralgia-peripheral Neuropathy)、肌萎缩性侧索硬化症(Amyotrophic lateralsclerosis，ALS)和多发性硬化症(Multiple Sclerosis，MS)等。尽管有不同的临床特点，它们有一些共同的特征：如异常蛋白构象的形成和沉积、突触功能障碍、自噬异常与缺失以及炎症等。全世界约有5000万人患有AD，1000万人患有PD，200多万人患有MS，并且随着人口老龄化，神经退行性疾病的发病率将继续飙升。大量研究表明许多神经退行性疾病均伴随有蛋白质的错误折叠和聚集，自噬与神经退行性疾病密切相关，过度或不充分的自噬活动会影响神经元的存活并导致神经变性。
本文中“病毒”来自但不限于以下家族的病毒：逆转录病毒科(例如，人免疫缺陷病毒(HIV)、人T细胞白血病病毒(HTLV))；小核糖核酸病毒科(例如，脊髓灰质炎病毒、甲型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、肠道病毒、人类柯萨奇病毒、鼻病毒、埃可病毒、口蹄疫病毒)；钙粘病毒科(如引起胃肠炎的病毒株)；披膜病毒科(例如马脑炎病毒、风疹病毒)；黄病毒科(例如，登革病毒、黄热病病毒、西尼罗河病毒、圣路易斯脑炎病毒、日本脑炎病毒和其他脑炎病毒)；冠状病毒科(例如冠状病毒、严重急性呼吸道综合征(SARS)病毒)；弹状病毒科(例如，水疱性口炎病毒、狂犬病病毒)；副粘病毒科(例如，副流感病毒、腮腺炎病毒、麻疹病毒、呼吸道合胞病毒(RSV))；正粘病毒科(例如，流感病毒)；布尼亚病毒科(例如汉坦病毒、SinNombre病毒、裂谷热病毒、bunya病毒、phleboviruses和Nairo病毒)；沙粒病毒科(例如出血热病毒、Machupo病毒、Junin病毒)；呼肠孤病毒科(例如呼肠孤病毒、orbiviurse和轮状病毒)；双核糖核酸病毒科；嗜肝病毒科(例如乙型肝炎病毒)；细小病毒科(例如细小病毒)；乳多空病毒科(例如乳头瘤病毒、多瘤病毒、BK病毒)；腺病毒科(例如，大多数腺病毒，如腺相关病毒)；疱疹病毒科(例如，单纯疱疹病毒(HSV-1和HSV-2)、巨细胞病毒(CMV)、爱泼斯坦-巴尔病毒(EBV)、水痘带状疱疹病毒(VZV)、和其他疱疹病毒、包括HSV-6)；痘病毒科(例如天花病毒、痘苗病毒、痘病毒)；和虹膜病毒科(如非洲猪瘟病毒)；病毒科(例如，埃博拉病毒、马尔堡病毒)；杯状病毒科(例如，诺沃克病毒)和未分类的病毒(例如，海绵状脑病的病原体、三角洲肝炎的病原体(被认为是乙型肝炎病毒的有缺陷的卫星)和星状病毒)。
本文中的“细菌”来自但不限于：幽门螺杆菌、Borelia burgdorferi、嗜肺军团菌、分枝杆菌(如M.tuberculosis，M.avium，M.intracellulare，M.kansaii，M.gordonae)、金黄色葡萄球菌、淋病奈瑟菌，脑膜炎奈瑟菌、单核细胞增生李斯特菌、化脓性链球菌(A组链球菌)、无乳链球菌(B组链球菌)、链球菌(草绿蝇群)、粪链球菌、牛链球菌、链球菌(厌氧菌)、肺炎链球菌、致病性弯曲杆菌、肠球菌、流感嗜血杆菌、炭疽芽孢杆菌、白喉棒状杆菌、棒状杆菌、猪瘟病毒、产气荚膜梭菌、破伤风梭菌、产气肠杆菌、肺炎克雷伯菌、多杀巴斯德氏菌、拟杆菌属、梭状芽孢杆菌、麦芽链霉菌、梅毒螺旋体、密螺旋体、钩端螺旋体或放线菌(Actinomyces israelli)。
本文中的“真菌”来自但不限于：新型隐球菌、夹膜组织胞浆菌(Histoplasmacapsulatum)、粗球孢子菌(Coccidioides immitis)、皮炎芽生菌(Blastomycesdermatitidis)、沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis)或白念珠菌(Candida albicans)。
本文中的“寄生虫”来自但不限于：恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)或弓形虫(Toxoplasma gondii)。
本文中的“癌症”为实体瘤或血源性癌。本发明所述的实体瘤是肉瘤或癌，例如纤维肉瘤，粘液肉瘤，脂肪肉瘤，软骨肉瘤，成骨肉瘤，或另一种肉瘤，滑膜瘤，间皮瘤，尤文氏瘤，平滑肌肉瘤，横纹肌肉瘤，结肠癌，淋巴恶性肿瘤，胰腺癌，乳腺癌，肺癌，卵巢癌，前列腺癌，肝细胞癌，鳞状细胞癌，基底细胞癌，腺癌，汗腺癌，皮脂腺癌，乳头状癌，乳头状腺癌，髓样癌，支气管癌，肾细胞癌，肝细胞癌，胆管癌，绒毛膜癌，肾母细胞瘤，宫颈癌，睾丸肿瘤，膀胱癌或中枢神经系统肿瘤(如胶质瘤，星形细胞瘤，成神经管细胞瘤，颅咽管瘤，室管膜瘤，松果体，血管母细胞瘤，听神经瘤，少突神经胶质瘤，血管瘤，黑素瘤，神经母细胞瘤或视网膜母细胞瘤)。本发明所述的血源性癌症是白血病，如急性白血病(如急性淋巴细胞白血病，急性髓细胞白血病，急性髓性白血病和成髓细胞，早幼粒细胞，髓单核细胞，单核细胞和红白血病)；慢性白血病(如慢性粒细胞性(粒细胞)白血病，慢性粒细胞白血病和慢性淋巴细胞白血病)，真性红细胞增多症，淋巴瘤，霍奇金病，非霍奇金淋巴瘤(惰性和高级形式)，多发性骨髓瘤，瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症，重链性疾病，骨髓增生异常综合征，多毛细胞白血病或骨髓增生异常。
除非另外说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。除非上下文另有明确说明，否则单数术语“一”，“一个”和“该”包括复数指示物。还应理解，对于核酸或多肽给出的所有碱基大小或氨基酸大小，以及所有分子量或分子量值是近似的，并且提供用于描述。尽管与本文描述的那些类似或等同的方法和材料可用于本公开的实践或测试，但下文描述了合适的方法和材料。术语“包含”表示“包括”。本文提及的所有出版物、专利申请、专利和其他参考文献均通过引用整体并入。如果发生冲突，将以本说明书(包括术语解释)为准。另外，材料，方法和实施例仅是说明性的而不是限制性的。
附图说明
图1 Trim21基因PCR产物琼脂糖凝胶电泳鉴定，其中，M1：DNA标准DL2000；1：Trim21基因；M2：DNA标准DL 1,5000。
图2原核质粒表达载体的双酶切琼脂糖凝胶电泳鉴定结果，其中，M1：DNA标准DL2000；1：Trim21基因；2：αEGFP TRIMbody(RBCC-LaG16-G4S×3-LaG2)基因；3：αEGFPNanobody基因；4：EGFP基因；M2：DNA标准DL1,5000。
图3 Trim21、αEGFP TRIMbody、LaG16-LaG2、EGFP蛋白的表达和纯化，其中，A1：His-Lipoyl-hTRIM21；A2：His-Lipoyl-αEGFP TRIMbody；M：彩色预染蛋白Marker；B1：αEGFPTRIMbody；B2：EGFP基因；M：彩色预染蛋白Marker。
图4 TRIM21和αEGFP TRIMbody的体积排阻色谱分析。
图5 ELISA测定αEGFP TRIMbody与EGFP之间的结合动力学。
图6 293T和293T-EGFP-High细胞形态及其特性的表征，其中，A：293T和293T-EGFP-High在不同时间的显微镜图像(20×)。曝光强度选择30％，曝光时间选择250ms；B：使用流式细胞计分选293T-EGFP-High细胞；C：293T和293T-EGFP-High细胞中荧光强度变化。数据以平均值±标准差(mean±SD)表示，两组数据比较使用独立样本t检验(independentsamples t-test)，***P≤0.001被认为在统计学上具有极显著性差异。
图7 293T和293T-EGFP-Low细胞形态及其特性的表征，其中，A：293T和293T-EGFP-Low在不同时间的显微镜图像(20×)。曝光强度选择30％，曝光时间选择250ms；B：使用流式细胞计分选293T-EGFP-Low细胞；C：293T和293T-EGFP-Low细胞中荧光强度变化。数据以平均值±标准差(mean±SD)表示，两组数据比较使用独立样本t检验(independent samplest-test)，***P≤0.001被认为在统计学上具有极显著性差异。
图8 293T-EGFP细胞瞬时转染后荧光强度分析，其中，A：在293T-EGFP-High细胞中瞬时表达αEGFP TRIMbody对EGFP蛋白的降解作用；B：在293T-EGFP-Low细胞中瞬时表达αEGFP TRIMbody对EGFP蛋白的降解作用。数据以平均值±标准差(mean±SD)表示。
图9 Western blot鉴定可诱导αEGFP TRIMbody细胞系的建立，其中，A：蛋白免疫印迹检测293T-EGFP-High/Tet-on-αEGFP TRIMbody细胞中αEGFP TRIMbody的表达；B：蛋白免疫印迹检测293T-EGFP-Low/Tet-on-αEGFP TRIMbody细胞中αEGFP TRIMbody的表达。
图10不同浓度的Dox诱导αEGFP TRIMbody蛋白表达的荧光图像(20×)。
图11不同浓度的Dox诱导αEGFP TRIMbody蛋白表达的荧光强度分析，其中，数据以平均值±标准差(mean±SD)表示，两组数据比较使用独立样本t检验(independentsamples t-test)，*P≤0.05被认为具有统计学差异，***P≤0.001被认为在统计学上具有极显著性差异。
图12 Dox处理293T-EGFP-High细胞在不同时间点的荧光变化分析，其中，A：Dox处理293T-EGFP-High细胞在不同时间点的荧光图像(20×)。曝光强度选择30％，曝光时间选择250ms；B：Dox处理293T-EGFP-High细胞在不同时间点的荧光强度。数据以平均值±标准差(mean±SD)表示，两组数据比较使用独立样本t检验(independent samples t-test)，ns代表无统计学差异。
图13 Dox处理293T-EGFP-Low细胞在不同时间点的荧光变化分析，其中，A：Dox处理293T-EGFP-Low细胞在不同时间点的荧光图像(20×)。曝光强度选择30％，曝光时间选择250ms；B：Dox处理293T-EGFP-Low细胞在不同时间点的荧光强度。数据以平均值±标准差(mean±SD)表示，两组数据比较使用独立样本t检验(independent samples t-test)，ns代表无统计学差异。
图14在293T-EGFP-High细胞中诱导αEGFP TRIMbody表达细胞中EGFP荧光变化，其中，A：在293T-EGFP-High细胞中诱导αEGFP TRIMbody表达在不同时间点的荧光图像(63×)。注：使用共聚焦激光扫描显微镜拍摄；B：在293T-EGFP-High细胞中诱导αEGFPTRIMbody表达在不同时间点的荧光强度变化。数据以平均值±标准差(mean±SD)表示，两组数据比较使用独立样本t检验(independent samples t-test)，***P≤0.001被认为在统计学上具有极显著性差异。
图15在293T-EGFP-High细胞中诱导αEGFP TRIMbody表达细胞中胞质体变化，其中，A：在293T-EGFP-High细胞中诱导αEGFP TRIMbody表达在不同时间点的胞质体图像(63×)；B：在293T-EGFP-High细胞中诱导αEGFP TRIMbody表达在不同时间点的胞质体面积变化。数据以平均值±标准差(mean±SD)表示，两组数据比较使用独立样本t检验(independent samples t-test)，***P≤0.001被认为在统计学上具有极显著性差异。
图16在293T-EGFP-Low细胞中诱导αEGFP TRIMbody表达细胞中EGFP荧光变化，其中，A：在293T-EGFP-Low细胞中诱导αEGFP TRIMbody表达在不同时间点的荧光图像(63×)。注：使用共聚焦激光扫描显微镜拍摄；B：在293T-EGFP-Low细胞中诱导αEGFP TRIMbody表达在不同时间点的荧光强度变化。数据以平均值±标准差(mean±SD)表示，两组数据比较使用独立样本t检验(independent samples t-test)，***P≤0.001被认为在统计学上具有极显著性差异。
图17在293T-EGFP-Low细胞中诱导αEGFP TRIMbody表达细胞中胞质体变化，其中，A：在293T-EGFP-Low细胞中诱导αEGFP TRIMbody表达在不同时间点的胞质体图像(63×)；B：在293T-EGFP-Low细胞中诱导αEGFP TRIMbody表达在不同时间点的胞质体面积变化。数据以平均值±标准差(mean±SD)表示，两组数据比较使用独立样本t检验(independentsamples t-test)，***P≤0.001被认为在统计学上具有极显著性差异。
图18在293T-EGFP-High细胞中诱导αEGFP TRIMbody表达在不同时间点的荧光图像(20×)，其中，注：使用普通荧光显微镜拍摄，曝光强度选择30％，曝光时间选择250ms；。
图19在293T-EGFP-Low细胞中诱导αEGFP TRIMbody表达在不同时间点的荧光图像(20×)，其中，注：使用普通荧光显微镜拍摄，曝光强度选择30％，曝光时间选择250ms；。
图20在293T-EGFP-High细胞中诱导αEGFP TRIMbody表达在不同时间点的代表性荧光图像(63×)，其中，注：使用活细胞成像系统拍摄。
图21在293T-EGFP-Low细胞中诱导αEGFP TRIMbody表达在不同时间点的代表性荧光图像(63×)，其中，注：使用活细胞成像系统拍摄。
图22间接免疫荧光检测αEGFP TRIMbody蛋白和EGFP蛋白在293T-EGFP-High细胞中的共定位，其中，Hochest标记细胞核(蓝色)，EGFP蛋白(绿色)，多克隆抗体标记αEGFPTRIMbody(红色)，标尺表示为7.5μm。
图23间接免疫荧光检测αEGFP TRIMbody蛋白和EGFP蛋白在293T-EGFP-Low细胞中的共定位，其中，Hochest标记细胞核(蓝色)，EGFP蛋白(绿色)，多克隆抗体标记αEGFPTRIMbody(红色)，标尺表示为7.5μm。
图24 293T-EGFP-FOXA2细胞系的建立，其中，透射光下的细胞及细胞核(灰色)，Hochest标记细胞核(蓝色)，EGFP定位的细胞核(绿色)。
图25 293T-EGFP-H2A.Z细胞系的建立，其中，透射光下的细胞及细胞核(灰色)，Hochest标记细胞核(蓝色)，EGFP定位的细胞核(绿色)。
图26 293T-EGFP-FOXA2细胞瞬时转染αEGFP TRIMbody后荧光强度分析，其中，A：293T-EGFP-FOXA2细胞瞬时转染αEGFP TRIMbody后在不同时间点的荧光图像(20×)。曝光强度选择30％，曝光时间选择250ms；B：293T-EGFP-FOXA2细胞瞬时转染αEGFP TRIMbody后在不同时间点的荧光强度分析。数据以平均值±标准差(mean±SD)表示，两组数据比较使用独立样本t检验(independent samples t-test)，**P≤0.01被认为在统计学上具有显著性差异，***P≤0.001被认为在统计学上具有极显著性差异。
图27 293T-EGFP-H2A.Z细胞瞬时转染αEGFP TRIMbody后荧光强度分析，其中，A：293T-EGFP-H2A.Z细胞瞬时转染αEGFP TRIMbody后在不同时间点的荧光图像(20×)。曝光强度选择30％，曝光时间选择250ms；B：293T-EGFP-H2A.Z细胞瞬时转染αEGFP TRIMbody后在不同时间点的荧光强度分析。数据以平均值±标准差(mean±SD)表示，两组数据比较使用独立样本t检验(independent samples t-test)，**P≤0.01被认为在统计学上具有显著性差异，***P≤0.001被认为在统计学上具有极显著性差异。
图28在293T-EGFP-FOXA2细胞中诱导αEGFP TRIMbody表达在不同时间点的荧光图像(20×)，其中，曝光强度选择30％，曝光时间选择250ms。
图29在293T-EGFP-H2A.Z细胞中诱导αEGFP TRIMbody表达在不同时间点的荧光图像(20×)，其中，曝光强度选择30％，曝光时间选择250ms；
图30在293T-EGFP-FOXA2细胞(A)、293T-EGFP-H2A.Z细胞(B)中诱导αEGFPTRIMbody表达在不同时间点的荧光强度变化，其中，数据以平均值±标准差(mean±SD)表示，两组数据比较使用独立样本t检验(independent samples t-test)，ns代表无统计学差异，***P≤0.001被认为在统计学上具有极显著性差异。
图31诱导293T-EGFP-High细胞表达αEGFP TRIMbody在6～24h的荧光图像(63×)，其中，注：使用共聚焦激光扫描显微镜拍摄。
图32诱导293T-EGFP-High细胞表达αEGFP TRIMbody胞质体形成过程图像。
图33在293T-EGFP-High细胞中诱导αEGFP TRIMbody表达细胞中的EGFP荧光变化及胞质体面积变化，其中，A：在293T-EGFP-High细胞中诱导αEGFP TRIMbody表达在6～24h的荧光强度变化；B：在293T-EGFP-High细胞中诱导αEGFP TRIMbody表达在6～24h的胞质体面积变化，数据以平均值±标准差(mean±SD)表示，两组数据比较使用独立样本t检验(independent samples t-test)，ns代表无统计学差异，*P≤0.05被认为具有统计学差异，***P≤0.001被认为在统计学上具有极显著性差异。
图34诱导293T-EGFP-Low细胞表达αEGFP TRIMbody在6～24h的荧光图像(63×)，其中，注：使用共聚焦激光扫描显微镜拍摄。
图35诱导293T-EGFP-Low细胞表达αEGFP TRIMbody胞质体形成过程图像(63×)。
图36在293T-EGFP-Low细胞中诱导αEGFP TRIMbody表达细胞中EGFP荧光变化及胞质体面积变化，其中，A：在293T-EGFP-Low细胞中诱导αEGFP TRIMbody表达在6～24h的荧光强度变化；B：在293T-EGFP-Low细胞中诱导αEGFP TRIMbody表达在6～24h的胞质体面积变化，数据以平均值±标准差(mean±SD)表示，两组数据比较使用独立样本t检验(independent samples t-test)，ns代表无统计学差异，*P≤0.05被认为具有统计学差异，**P≤0.01被认为在统计学上具有显著性差异，***P≤0.001被认为在统计学上具有极显著性差异。
图37诱导293T-EGFP-High细胞表达αEGFP TRIMbody在6～12h的代表性荧光图像(63×)，其中，使用活细胞成像系统拍摄。
图38诱导293T-EGFP-Low细胞表达αEGFP TRIMbody在6～12h的代表性荧光图像(63×)，其中，使用活细胞成像系统拍摄。
图39在293T-EGFP-High细胞中诱导αEGFP TRIMbody表达细胞中EGFP荧光动力学变化及胞质体面积动力学变化，其中，A：在293T-EGFP-High细胞中诱导αEGFP TRIMbody表达细胞中EGFP荧光强度动力学变化；B：在293T-EGFP-High细胞中诱导αEGFP TRIMbody表达细胞中胞质体面积动力学变化。
图40在293T-EGFP-Low细胞中诱导αEGFP TRIMbody表达细胞中EGFP荧光动力学变化及胞质体面积动力学变化，其中，A：在293T-EGFP-Low细胞中诱导αEGFP TRIMbody表达细胞中EGFP荧光强度动力学变化；B：在293T-EGFP-Low细胞中诱导αEGFP TRIMbody表达细胞中胞质体面积动力学变化。
图41在可诱导表达αEGFP TRIMbody的293T-EGFP细胞中加入MG132后EGFP的荧光变化，其中，A：在可诱导表达αEGFP TRIMbody的293T-EGFP-High和293T-EGFP-Low细胞中加入MG132后EGFP的荧光图像(20×)。曝光强度选择30％，曝光时间选择250ms；B：在可诱导表达αEGFP TRIMbody的293T-EGFP-High细胞中加入MG132(400μM)后EGFP的荧光强度变化；C：在可诱导表达αEGFP TRIMbody的293T-EGFP-Low细胞中加入MG132(400μM)后EGFP的荧光强度变化，数据以平均值±标准差(mean±SD)表示，两组数据比较使用独立样本t检验(independent samples t-test)，**P≤0.01被认为在统计学上具有显著性差异，***P≤0.001被认为在统计学上具有极显著性差异。
图42在可诱导表达αEGFP TRIMbody的293T-EGFP细胞中加入氯喹后EGFP的荧光变化，其中，A：在可诱导表达αEGFP TRIMbody的293T-EGFP-High和293T-EGFP-Low细胞中加入氯喹后的荧光图像(20×)，曝光强度选择30％，曝光时间选择250ms；B：在可诱导表达αEGFPTRIMbody的293T-EGFP-High细胞中加入氯喹(40μM)后的荧光强度变化；C：在可诱导表达αEGFP TRIMbody的293T-EGFP-Low细胞中加入氯喹(40μM)后的荧光强度变化，数据以平均值±标准差(mean±SD)表示，两组数据比较使用独立样本t检验(independent samples t-test)，**P≤0.01被认为在统计学上具有显著性差异，***P≤0.001被认为在统计学上具有极显著性差异。
图43，αEGFP TRIMbody的二聚体结构图示。
具体实施方式
实施例中使用的标准的重组DNA技术和分子克隆技术是本领域所熟知的(Ausubel，F.M等人，Current Protocols in Molecular Biology,Greene PublishingAssoc.和Wiley-Interscience出版)，适用于微生物生长的材料和方法是本领域熟知的。主要化学、生物试剂购自KAPA Biosystems，New England Biolabs，TransGen Biotech，Thermo Fisher Scientific，OMEGA bio-tek等。
下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。
本发明公开了用于促进细胞内过度表达或突变形式的蛋白质、错误折叠的蛋白质和蛋白质聚集体进行降解的融合抗体片段的TRIM家族截短体蛋白及其制备方法，融合抗体片段的TRIM家族截短体在本申请中称为TRIMbody。TRIMbody是将抗体片段替换TRIM家族蛋白的可变区结构域，形成RBCC-抗体片段的结构，其一端可以由抗体片段结合目标蛋白，另一端为RBCC结构域。因为RBCC结构中含有RING结构域，通常有E3泛素连接酶的活性，可以与E3泛素连接酶结合，E3泛素连接酶通过将一种叫做泛素的小蛋白贴在靶蛋白上将其标记为缺陷或受损蛋白为其加上一个泛素化的标签，多聚泛素化之后的蛋白会被26S蛋白酶体识别，此时E3就能够泛素化与单域结构抗体片段结合的目标蛋白并引导其进入泛素-蛋白酶体降解途径，从而选择性的降低细胞中靶蛋白的水平。TRIMbody可以用于预防或治疗与过度表达或突变形式的蛋白质、错误折叠的蛋白质或者蛋白质聚集体有关的疾病或病症，TRIMbody也可以用于研究细胞内蛋白质降解的蛋白编辑工具。
一、TRIMbody融合蛋白的制备方法
融合抗体片段的TRIM家族截短体(TRIMbody)及其蛋白的制备方法按照以下步骤实现：
1.提取健康人上皮组织细胞的RNA，反转录成cDNA，以cDNA为模板对TRIM家族的基因进行扩增。根据基因序列及载体的多克隆酶切位点，设计并合成引物，扩增TRIM家族基因的RBCC结构域，同时扩增特异性结合细胞内蛋白的抗体片段。
2.将这种两端带有载体末端序列的RBCC、抗体片段基因和线性化表达载体按照一定比例混合，在非连接酶依赖的重组酶的催化下，将双链DNA目的片段与限制性内切酶酶切过的线性化载体进行连接快速完成定向拼接获得重组克隆(RBCC-抗体片段)。
3.重组克隆(RBCC-抗体片段)转化大肠杆菌感受态细胞Top10用于大量扩增携带目的基因的质粒，转化过夜培养后，挑取转化平板上的若干个单克隆分别接种至含有适当抗生素的LB液体培养基中培养过夜，提取质粒送测序，获得RBCC-抗体片段(TRIMbody)表达载体。
4.测序鉴定正确的RBCC-抗体片段(TRIMbody)质粒转化表达系统，扩大培养后，使用His标签Ni-NTA琼脂糖纯化树脂纯化目的蛋白，使用Ni-NTA Elution Buffer(含250mM咪唑)洗脱结合的蛋白，同时收集洗脱液至超滤管中，PBS置换洗脱缓冲液后即为纯化的RBCC-抗体片段(TRIMbody)蛋白。
二、TRIMbody融合蛋白靶向降解细胞内蛋白的方法
融合抗体片段的TRIM家族截短体(TRIMbody)靶向降解细胞内蛋白的方法按照以下步骤实现：
1.选择TRIMbody降解的靶标。真核细胞中的任何蛋白均可作为TRIMbody降解的靶标，例如转录因子，骨架蛋白，结构蛋白，受体，酶和细胞功能调节蛋白等，特别是那些在病毒、微生物和寄生性质的传染病、代谢病、老化、环境性疾病、遗传性疾病、生活方式疾病过程中起作用的蛋白。
2.递送TRIMbody至宿主细胞。将TRIMbody的多核苷酸引入宿主细胞的物理方法包括DNA和RNA载体的使用。病毒载体可以来源于反转录病毒、慢病毒、痘病毒、单纯疱疹病毒Ⅰ型、腺病毒和腺相关病毒(AAV)。本发明的非病毒基因转移方法包括但不限于：化学技术如磷酸钙共沉淀；机械技术如显微注射；通过脂质体的膜融合介导的转染；直接DNA吸收和受体介导的DNA转移；电穿孔、基因枪、免疫脂质体、纳米粒子、聚阳离子、人工病毒粒子、CPP、DEAE-葡聚糖介导的转移和热休克。
3.TRIMbody特异性降解靶蛋白。TRIMbody是将抗体片段替换TRIM家族蛋白的可变区结构域，形成RBCC-抗体片段的结构，其一端可以由抗体片段结合目标蛋白，另一端为RBCC结构域。TRIMbody含有RING结构域，故而通常有E3泛素连接酶的活性，此时E3就能够泛素化与抗体片段结合的目标蛋白并引导其进入泛素-蛋白酶体途径(Ubiquitin-proteasome system,UPS)降解蛋白。同时TRIMbody含有Coiled-coil结构域，Coiled-coil结构域中含有LIR(LC3-interacting region)基序，可以与自噬受体结合，此时Coiled-coil结构域就能够引导目标蛋白进入自噬-溶酶体途径(Autophagy-lysosome pathway,ALP)降解细胞内蛋白。
三、TRIMbody融合蛋白用于治疗或预防受试者组织或细胞中蛋白质病变或失调有关的疾病或病症的方法
TRIMbody融合蛋白用于治疗或预防受试者组织或细胞中蛋白质病变或失调有关的疾病或病症的方法按照以下步骤实现：
1.制备含有TRIMbody的多核苷酸的DNA和RNA载体或者蛋白。
2.给予受试者(例如，人、猴、小鼠等哺乳动物或其细胞培养物)包含TRIMbody的治疗剂，以调节受试者体内的靶向蛋白质的活性。本发明的TRIMbody融合蛋白可以通过各种不同的给药途径给予人或动物受试者，所述给药途径通常取决于待治疗的疾病本身的特征。
实施例1 anti-EGFP TRIMbody的制备
anti-EGFP TRIMbody(简写为αEGFP TRIMbody)的制备按以下步骤实现：
1.提取皮肤组织的RNA，反转录成cDNA，设计并合成引物(hTrim21-CD-F，hTrim21-CD-R)以cDNA为模板对TRIM21基因进行扩增(具体方法见分子克隆实验指南第四版)，产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定(具体方法见分子克隆实验指南第四版)，TRIM21基因的片段大小与预期基因片段大小基本一致，获得了1428bp的TRIM21全长基因(见图1)。根据基因序列及载体的多克隆酶切位点(BamHⅠ-XhoⅠ)，设计并合成引物(HLTV-trim21-BamHⅠ-PF1，HLTV-trim21-XhoⅠ-PR1)，扩增TRIM21的RBCC结构域的目的基因(其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示)，同时扩增特异性结合EGFP的纳米抗体LaG16-G4S×3-LaG2序列(其氨基酸序列如SEQID NO:3所示)。
引物序列见如下表所示：
Figure BDA0003025921270000231
2.将这种两端带有载体末端序列的RBCC(858bp)、LaG16-G4S×3-LaG2(813bp)基因和线性化HLTV表达载体(载体购自武汉淼灵生物科技有限公司)按照摩尔比为1:1比例混合，利用非连接酶依赖型多片段一步定向无缝克隆技术，在非连接酶依赖的重组酶的催化下，通过同源重组的方法将双链DNA目的片段与限制性内切酶酶切过的线性化载体进行连接快速完成定向拼接获得重组克隆RBCC-LaG16-G4S×3-LaG2(其氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示)。连接反应条件参照诺唯赞快速克隆试剂盒(ClonExpress MultiS One StepCloning Kit)说明书进行。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳结果如图2所示，条带大小与理论值相符，结果表明成功获得RBCC-LaG16-G4S×3-LaG2(2139bp)基因。
3.重组克隆(RBCC-LaG16-G4S×3-LaG2)转化大肠杆菌感受态细胞Top10(购自上海唯地生物技术有限公司)用于大量扩增携带目的基因的质粒(具体方法见分子克隆实验指南第四版)，转化过夜培养后，挑取转化平板上的若干个单克隆分别接种至含有氨苄青霉素(Amp，100μg/mL)的LB液体培养基中培养过夜，提取质粒送测序，测序结果显示插入片段与目的基因参考序列完全一致，成功构建了HLTV-RBCC-LaG16-G4S×3-LaG2(anti-EGFPTRIMbody)载体。
4.测序鉴定正确的TRIMbody质粒转化原核表达系统C43(DE3)pLysS感受态细胞(购自上海唯地生物技术有限公司)，涂布Amp抗性的固体2YT琼脂平板(含0.2％葡萄糖)上，37℃倒置培养获得单菌落C43(DE3)pLysS/HLTV-RBCC-LaG16-G4S×3-LaG2。单菌落接种2×YT液体培养基进行扩大培养，然后接种SB液体培养基进行扩大培养，培养至OD值为0.6～0.8时加入IPTG(1mM，1‰)(购自Sigma-Aldrich)诱导蛋白表达，30℃、250rpm振荡培养14～16h。
5.离心收集菌体，使用多粘菌素B裂解液(购自Sigma-Aldrich)或超声破碎仪(Qsonic，Q700)进行破菌，随后将破碎完全的菌液离心收集上清。使用His标签Ni-NTA琼脂糖纯化树脂(购自翊圣生物)纯化目的蛋白，使用Ni-NTA Elution Buffer(含250mM咪唑)(购自Sigma-Aldrich)洗脱结合的蛋白，同时收集洗脱液至超滤管中，PBS(购自HyClone)置换洗脱缓冲液后即为纯化的RBCC-LaG16-G4S×3-LaG2(62.82kDa)蛋白(见图3)，即anti-EGFP TRIMbody蛋白，简写为αEGFP TRIMbody。
6.本研究通过体积排阻色谱(SEC)确认由TRIM21改造而来的αEGFP TRIMbody蛋白也是可溶的二聚体，洗脱峰在10.3mL处，TRIM21蛋白的洗脱峰在10.4mL处(见图4)。使用酶联免疫吸附测定(ELISA)技术来测定αEGFP TRIMbody与EGFP蛋白的亲和力，经测定αEGFPTRIMbody与EGFP的EC50值为0.63nM，表明αEGFP TRIMbody与EGFP之间具有很高的亲和力(见图5)。
本发明使用的试剂或培养基的配方或制备方法如下：
(1)氨苄青霉素(100mg/mL)：取10.0g氨苄青霉素(Ampicillin)溶于100mL灭菌去离子水中，0.22μm滤器过滤除菌后分装于无菌1.5mL Eppendorf微量离心管中，-20℃保存备用，使用浓度为100μg/mL。
(2)卡那霉素(50mg/mL)：取5.0g卡那霉素(Kanamycin)溶于100mL灭菌去离子水中，0.22μm滤器过滤除菌后分装于无菌1.5mL Eppendorf微量离心管中，-20℃保存备用，使用浓度为50μg/mL。
(3)异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG，1M)：取2.38g IPTG溶于10mL灭菌去离子水中，0.22μm滤器过滤除菌后分装于无菌1.5mL Eppendorf微量离心管中，-20℃保存备用，使用浓度为1mM。
(4)20％(wt/vol)葡萄糖(Glucose)：称取20g葡萄糖溶于约80mL灭菌ddH2O中，充分混匀待完全溶解后，加ddH2O至100mL，0.22μm滤器过滤除菌后4℃保存备用。
(5)2×YT液体培养基：称取胰蛋白胨16.0g，酵母抽提物10.0g，NaCl 5.0g，溶于约800mL ddH2O中，充分混匀待完全溶解后，加ddH2O至1000mL，121℃高压灭菌20min，4℃保存备用；使用时加入储存浓度为20％(wt/vol)的葡萄糖(Glucose)，使其使用浓度为2％。
(6)2×YT-Amp固体培养基：称取胰蛋白胨16.0g，酵母抽提物10.0g，NaCl 5.0g，Agar 15.0g，溶于约800mL ddH2O中，充分混匀待完全溶解后，加ddH2O至1000mL，121℃高压灭菌20min；待培养基冷却至50～60℃时，加入100mg/mL氨苄青霉素(Amp)1mL，储存浓度为20％(wt/vol)的葡萄糖(Glucose)20mL，旋转混匀，倒平板，待冷却后，倒置平板，4℃保存备用(有效期一个月)。
(7)LB液体培养基：称取胰蛋白胨20.0g，酵母抽提物10.0g，NaCl 10.0g，Agar10.0g，溶于约800mL ddH2O中，充分混匀待完全溶解后，加ddH2O至1000mL，121℃高压灭菌20min，4℃保存备用。
(8)LB-Amp固体培养基：称取胰蛋白胨20.0g，酵母抽提物10.0g，NaCl 10.0g，Agar10.0g，溶于约800mL ddH2O中，充分混匀待完全溶解后，加ddH2O至1000mL，121℃高压灭菌20min；待培养基冷却至50～60℃时，加入100mg/mL氨苄青霉素(Amp)1mL，旋转混匀，倒平板，待冷却后，倒置平板，4℃保存备用(有效期一个月)。
(9)SB液体培养基：称取胰蛋白胨30.0g，酵母抽提物20.0g，3-(N-吗啉)丙磺酸(MOPS)10.0g，溶于约800mL ddH2O中，充分混匀待完全溶解后，加ddH2O至1000mL，并调节pH至8.0，121℃高压灭菌20min，4℃保存备用。
(10)Ni-NTA Binding Buffer：称取NaCl 29.22g溶于约800mL PBS中，充分混匀待完全溶解后，加PBS至1000mL，并调节pH至8.0，121℃高压灭菌20min，4℃保存备用。
(11)Ni-NTA Washing Buffer：称取NaCl 29.22g，咪唑1.36g，溶于约800mL PBS中，充分混匀待完全溶解后，加PBS至1000mL，并调节pH至8.0，121℃高压灭菌20min，4℃保存备用。
(12)Ni-NTA Elution Buffer：称取NaCl 29.22g，咪唑17.02g，溶于约800mL PBS中，充分混匀待完全溶解后，加PBS至1000mL，并调节pH至8.0，121℃高压灭菌20min，4℃保存备用。
(14)1.0％琼脂糖凝胶：称取1.0g琼脂糖，加入100mL TAE电泳缓冲液，微波炉中加热溶解，冷却至50～60℃，加入GelRed核酸染料10μL，轻轻地旋转以混匀凝胶溶液，倒在放置电泳板的制胶容器中，插好梳子，水平放置，室温静置约20～30min，凝固后小心地拔去梳子。
(15)多粘菌素B裂解液：称取5.0g多粘菌素B(Polymyxin B sulfate)，溶于约36.1mL ddH2O中，充分混匀待完全溶解后，分装4℃保存备用。
(16)完全培养基：取500mL DMEM高糖培养基加入55mL新生牛血清(FBS)，然后加入5mL青霉素-链霉素溶液，混匀后4℃保存备用。
(17)条件培养基：将293T细胞以6×105/孔的密度接种于6孔板，每孔含完全培养基2mL，置于37℃，5％CO2条件下培养36h，1000rpm离心10min得到的上清即为条件培养基。
(18)强力霉素(50mg/mL)：取1.0g强力霉素(Doxycycline)溶于20mL DMSO中，分装于无菌1.5mL Eppendorf微量离心管中，-20℃保存备用，使用浓度为10μg/mL。
(19)MG132(1mM)：取5mg MG132溶于10.5mL DMSO中，分装于无菌1.5mL Eppendorf微量离心管中，-20℃保存备用，使用浓度为400μM。
(20)氯喹(1mM)：取5mg氯喹(Chloroquine，CQ)溶于9.69mL DMSO中，分装于无菌1.5mL Eppendorf微量离心管中，-20℃保存备用，使用浓度为40μM。
TRIM21的PRYSPRY结构域是位于如SEQ ID NO:1所示的人TRIM21氨基酸序列的287～465位置。RING结构域是位于人TRIM21氨基酸序列的15～58位置，B-Box结构域是位于人TRIM21氨基酸序列的91～128位置，coiled-coil结构域是位于人TRIM21氨基酸序列的137～257位置，RBCC结构域是位于人TRIM21氨基酸序列的1～286位置(即SEQ ID NO:2)。
特异性结合EGFP的纳米抗体(anti-EGFP Nanobody)的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示，anti-EGFP Nanobody是由LaG16和LaG2两个纳米抗体组成的二聚体，中间由一个柔性富含甘氨酸G4S linker(SEQ ID NO:5)连接，组成LaG16-G4S×3-LaG2的形式。anti-EGFPNanobody蛋白分子量(Mol.Wt)为30,791Da，anti-EGFP Nanobody与EGFP具有很高的亲和力，Kd值可达0.036nM。
特异性结合EGFP的anti-EGFP TRIMbody的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，RBCC结构域是位于人anti-EGFP TRIMbody氨基酸序列的1～286位置，anti-EGFP Nanobody是位于人anti-EGFP TRIMbody氨基酸序列的301～571位置，中间(287～300位置)由一个柔性富含甘氨酸GGGGS linker连接，组成RBCC-G4S×3-Nanobody的形式。anti-EGFP TRIMbody是将纳米抗体片段替换TRIM21蛋白的PRYSPRY结构域，其包括TRIM21蛋白的RBCC结构域、G4S×3Linker连接序列和特异性结合EGFP的纳米抗体LaG16-G4S×3-LaG2序列，形成RBCC-G4S×3-LaG16-G4S×3-LaG2的结构，其一端可以由纳米抗体LaG16-G4S×3-LaG2结合EGFP蛋白，另一端为TRIM21蛋白的RBCC结构域。TRIM21蛋白的RING结构域具有E3泛素连接酶的活性，此时E3就能够泛素化与纳米抗体结合的EGFP蛋白并引导其进入泛素-蛋白酶体降解通路，最终实现EGFP蛋白的特异性降解。
实施例2 anti-Capsid protein TRIMbody的制备
制备步骤与实施例1相同，不同的是步骤一中扩增的是TRIM5α(其氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示)的RBCC结构域的基因(其氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示)和特异性结合HIV-1衣壳蛋白的纳米抗体(其氨基酸序列如SEQ ID NO:16所示)，TRIM5α的RBCC结构域的基因序列与特异性结合衣壳蛋白(Capsid protein)的纳米抗体序列融合后获得anti-Capsid protein TRIMbody的基因序列，在步骤二中与pSecTag真核表达载体(购自武汉淼灵生物科技有限公司)连接后，转化大肠杆菌获得无内毒素重组质粒，使用PEI转染试剂(购自PolyPlus)转染293F悬浮细胞(购自ATCC)表达anti-Capsid protein TRIMbody重组蛋白，其它步骤与实施例1相同。
实施例3 TRIMbody-anti-Tau的制备
制备步骤与实施例1相同，不同的是步骤一中扩增的是特异性结合Tau蛋白的纳米抗体，TRIM21的RBCC结构域的基因序列(SEQ ID NO:2)与特异性结合Tau蛋白的纳米抗体序列融合后获得anti-Tau TRIMbody的基因序列(其氨基酸序列如SEQ ID NO:17所示)，在步骤二中与pSecTag真核表达载体(购自武汉淼灵生物科技有限公司)连接后，转化大肠杆菌获得无内毒素重组质粒，使用PEI转染试剂(购自PolyPlus)转染293F悬浮细胞(购自ATCC)表达anti-Tau TRIMbody重组蛋白，其它步骤与实施例1相同。
实施例4 anti-HBsAg TRIMbody的制备
制备步骤与实施例1相同，不同的是步骤一中扩增的是特异性结合乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)的单链抗体(scFv)。TRIM21的RBCC结构域的基因序列(SEQ ID NO:2)与特异性结合乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)的单链抗体(scFv)序列融合后获得anti-HBsAgTRIMbody的基因序列(其氨基酸序列如SEQ ID NO:18所示)，与HLTV表达载体(购自武汉淼灵生物科技有限公司)连接后获得HLTV-RBCC-anti-HBsAg表达载体，质粒转化原核表达系统C43(DE3)pLysS感受态细胞(购自上海唯地生物技术有限公司)，IPTG(购自Sigma-Aldrich)诱导蛋白表达获得anti-HBsAg TRIMbody蛋白。
实施例5 anti-EGFP TRIMbody特异性结合并降解细胞中的EGFP
anti-EGFP TRIMbody(简写为αEGFP TRIMbody)特异性结合并降解细胞中表达的EGFP的方法按照以下方式实现：
1.采用PEIpro转染试剂(购自PolyPlus)，将含有EGFP基因(其氨基酸序列如SEQID NO:6所示)的慢病毒重组载体pLVX-IRES-Puro(购自武汉淼灵生物科技有限公司)及其psPAX2包装质粒(购自武汉淼灵生物科技有限公司)和pMD2.G包膜质粒(购自武汉淼灵生物科技有限公司)共转染入HEK293T细胞(购自ATCC)。孵育细胞后，收集包含慢病毒的上清液，感染HEK293T细胞，进行流式细胞分选(具体方法引自Snyder GA,Browne WE,Traylor-Knowles N,et al.Fluorescence-Activated Cell Sorting for the Isolation ofScleractinian Cell Populations.J Vis Exp,2020,(159).)收集低表达和高表达EGFP的细胞，置于6孔板中，将这些细胞消化后传代即得到了稳定高表达EGFP(293T-EGFP-High)(见图6)和低表达EGFP(293T-EGFP-Low)(见图7)的细胞系。
2.采用PEIpro转染试剂，将pcDNA3.1-LaG16-LaG2(αEGFP Nanobody)的质粒瞬时转染分选的293T-EGFP细胞(293T-EGFP-High和293T-EGFP-Low)，在0h、24h、48h、72h时收集细胞，使用流式细胞计检测荧光强度，发现瞬时转染αEGFP TRIMbody的细胞中EGFP的荧光强度明显降低(见图8)，提示细胞中存在EGFP蛋白的降解过程，并且EGFP蛋白的降解可能是由αEGFP TRIMbody的表达导致的。
3.采用PEIpro转染试剂，将含有目的基因RBCC-LaG16-G4S×3-LaG2的pLVX-Tet-On-3G慢病毒重组载体(同步骤1一样，载体购自武汉淼灵生物科技有限公司)及其psPAX2包装质粒和pMD2.G包膜质粒共转染入293T-EGFP细胞(293T-EGFP-High和293T-EGFP-Low)。孵育细胞后，收集包含慢病毒的上清液，将慢病毒上清液直接感染293T-EGFP-High和293T-EGFP-Low细胞。扩大培养一代后，进行梯度有限稀释，获得可以使用Dox(购自Sigma-Aldrich)诱导RBCC-LaG16-G4S×3-LaG2基因表达的单克隆细胞293T-EGFP-High/Tet-on-αEGFP TRIMbody和293T-EGFP-Low/Tet-on-αEGFPTRIMbody。Western blot检测鉴定结果表明(见图9)，293T-EGFP-High/Tet-on-αEGFPTRIMbody和293T-EGFP-Low/Tet-on-αEGFPTRIMbody细胞在不加入Dox时，不启动αEGFP TRIMbody的表达，在细胞中加入Dox时，诱导αEGFP TRIMbody表达。293T-EGFP-High/Tet-on-αEGFP TRIMbody细胞对Dox敏感；加入0.5μg/mL的Dox处理24h细胞中形成了大量绿色点状胞质体并且细胞的EGFP荧光逐渐减弱，细胞颜色由绿变黑；加入10μg/mL的Dox处理24h细胞中形成了大量绿色点状胞质体并且细胞的EGFP荧光减弱到很低的程度；之后继续提高Dox浓度，细胞的EGFP荧光能维持在一个很低的程度(见图10、图11)。
4.将293T-EGFP-High细胞、293T-EGFP-Low细胞中加入10μg/mL的强力霉素(Dox)，在24h、48h、72h使用荧光显微镜拍照并使用流式细胞仪记录其荧光强度，实验结果表明，强力霉素(Dox)诱导并不会引起293T-EGFP-High、293T-EGFP-Low细胞中EGFP水平的变化(见图12、图13)。但是在293T-EGFP/Tet-on-αEGFP TRIMbody-High、293T-EGFP/Tet-on-αEGFPTRIMbody-Low细胞中加入Dox诱导，细胞中有Dox时在细胞质中均匀分布的EGFP蛋白形成点状自噬体并随后急剧减少，绿色荧光蛋白荧光强度减弱，部分细胞中看不到绿色荧光或绿色荧光蛋白消失，提示Dox诱导表达的αEGFPTRIMbody可以与EGFP相互作用并导致细胞中EGFP蛋白的降解(见图14、图16)。Dox-组的图像中点状胞质体的数量很少或没有，Dox+组的图片中在24h时存在大量胞质体，随着Dox处理时间的延长，胞质体数量及面积呈现减少的趋势(见图15、图17)。与Dox-组细胞相比，Dox+组细胞中出现的大量点状胞质体及其数量和面积的变化预示着αEGFPTRIMbody与EGFP之间存在强烈的相互作用并将细胞中聚集成点状的EGFP蛋白降解为没有荧光信号的氨基酸。本研究对Dox处理的细胞使用了普通光学显微镜进行了成像。使用普通光学显微镜拍摄的图像与使用激光共聚焦显微镜拍摄的图像所呈现的现象二者基本一致(见图18、图19)。本研究还使用活细胞成像系统监测拍摄了293T-EGFP-High/Tet-on-αEGFP TRIMbody、293T-EGFP-Low/Tet-on-αEGFP TRIMbody经Dox诱导后在24～72h EGFP蛋白的降解过程，视频中代表性图片见图20、图21。本研究对αEGFPTRIMbody蛋白诱导表达后在细胞质中的分布情况使用间接免疫荧光进行了分析，激光共聚焦显微镜图像显示，当在293T-EGFP/Tet-on-αEGFP TRIMbody细胞中加入Dox诱导αEGFPTRIMbody蛋白表达时，诱导表达的αEGFP TRIMbody蛋白(红色)明显促进均匀分布在细胞质中的EGFP(绿色)成点状聚集并随着时间的延长而大量减少，αEGFP TRIMbody蛋白与EGFP存在明显的共定位(见图22、图23)。
实施例6 anti-EGFP-TRIMbody特异性结合并降解细胞核中的EGFP融合蛋白
叉头框因子A2(Forkhead box A2,FOXA2)也称为肝细胞核因子3β(HNF3β)，是FOXA亚类蛋白质的成员，是一类DNA结合区具有翼状螺旋结构的转录因子。研究发现，FOXA2的过表达能够明显抑制细胞的增殖，促进细胞凋亡及降低克隆形成的能力，FOXA2的表达下调或功能缺失可促进肿瘤的发生、发展。FOXA2作为重要的肿瘤抑制转录因子，可能具有分子靶向治疗作用靶点的潜在功能。本发明在研究中发现，RBCC-LaG16-G4S×3-LaG2(anti-EGFPTRIMbody)可以特异性降低细胞中表达的FOXA2-EGFP蛋白水平。
H2A.Z(H2A histone family,member Z)为细胞周期相关基因，参与维持异染色质和常染色质水平，与哺乳动物干细胞的生成和分化有关，常受到甲基化、乙酰化、泛素化等修饰的调控。H2A.Z是组蛋白H2A的一类变体，在基因转录、DNA复制、基因组稳定性维持等过程中发挥重要的作用。H2A.Z通过精确定位于基因组的特定位点来改变染色质结构并实现其功能。染色质重塑复合物SWR通过水解ATP释放能量，逐步将转录起始位点附近的H2A核小体替换成H2A.Z核小体，从而实现H2A.Z的染色质定位。组蛋白和组蛋白变体之间的相互替换是调节调节核小体的结构、稳定性、动态性和DNA的可接近性的一种有效方式，在促进基因转录、发育精确调控以及对外界环境的应答中发挥重要作用。本发明在研究中发现，RBCC-LaG16-G4S×3-LaG2(anti-EGFP TRIMbody)可以特异性降低细胞中表达的H2A.Z-EGFP蛋白水平。
anti-EGFP TRIMbody(简写为αEGFP TRIMbody)特异性结合并降解细胞中表达的EGFP融合蛋白的方法按照以下方式实现：
1.采用PEIpro转染试剂(购自PolyPlus)，将含有FOXA2-EGFP或H2A.Z-EGFP基因的慢病毒重组载体pLVX-IRES-Puro(载体购自武汉淼灵生物科技有限公司)及其psPAX2包装质粒(质粒购自武汉淼灵生物科技有限公司)和pMD2.G包膜质粒(质粒购自武汉淼灵生物科技有限公司)共转染入HEK293T细胞(购自ATCC)。孵育细胞后，收集包含慢病毒的上清液，感染HEK293T细胞，进行流式细胞分选(具体方法引自Snyder GA,Browne WE,Traylor-Knowles N,et al.Fluorescence-Activated Cell Sorting for the Isolation ofScleractinian Cell Populations.J Vis Exp,2020,(159).)收集表达FOXA2-EGFP或H2A.Z-EGFP的细胞，置于6孔板中，将这些细胞消化后传代即得到了稳定表达FOXA2-EGFP的细胞系(293T-FOXA2-EGFP)(见图24)或稳定表达H2A.Z-EGFP的细胞系(293T-H2A.Z-EGFP)(见图25)。
2.采用PEIpro转染试剂，将pcDNA3.1-LaG16-LaG2(αEGFP Nanobody)的质粒瞬时转染分选的293T-FOXA2-EGFP和293T-H2A.Z-EGFP)，在0h、24h、48h、72h时收集细胞，使用流式细胞计检测荧光强度，发现瞬时转染αEGFP TRIMbody的细胞中EGFP的荧光强度明显降低(见图27)，提示细胞中存在EGFP蛋白的降解过程，并且EGFP蛋白的降解可能是由αEGFPTRIMbody的表达导致的。
3.采用PEIpro转染试剂，将含有目的基因Tet-on-RBCC-LaG16-G4S×3-LaG2的慢病毒重组载体pLVX-Tet-On-3G(载体购自武汉淼灵生物科技有限公司)及其psPAX2包装质粒(质粒购自武汉淼灵生物科技有限公司)和pMD2.G包膜质粒(质粒购自武汉淼灵生物科技有限公司)共转染入293T细胞(购自ATCC)。孵育细胞后，收集包含慢病毒的上清液，将慢病毒上清液直接感染细胞293T-FOXA2-EGFP或293T-H2A.Z-EGFP细胞。扩大培养一代后，进行梯度有限稀释，获得可以使用Dox(购自Sigma-Aldrich)诱导表达αEGFP TRIMbody的单克隆细胞，即293T-FOXA2-EGFP/Tet-on-αEGFP TRIMbody或293T-H2A.Z-EGFP/Tet-on-αEGFPTRIMbody。
4.在293T-FOXA2-EGFP/Tet-on-αEGFP TRIMbody细胞中加入Dox诱导RBCC-LaG16-2蛋白开始表达，表达出的RBCC-LaG16-2蛋白可以与EGFP蛋白进行结合，FOXA2-EGFP在细胞中的荧光强度逐渐减弱(见图28、图30)。在293T-H2A.Z-EGFP/Tet-on-αEGFP TRIMbody细胞中加入Dox诱导RBCC-LaG16-2蛋白开始表达，H2A.Z-EGFP在细胞中的荧光强度逐渐减弱(见图29、图30)。
实施例7融合纳米抗体的TRIM21截短体介导蛋白降解的机制分析
1.诱导anti-EGFP TRIMbody(简写为αEGFP TRIMbody)表达能在细胞中形成绿色点状胞质体
在培养至60～70％成片的293T-EGFP-High/Tet-on-αEGFP TRIMbody、293T-EGFP-Low/Tet-on-αEGFP TRIMbody细胞中加入Dox诱导，在37℃、5％二氧化碳培养箱诱导培养至24h，用激光共聚焦显微镜观察细胞经Dox诱导6h、12h、18h、24h后的荧光图像并用流式细胞仪检测荧光强度。细胞中有Dox时在细胞质中均匀分布的EGFP蛋白在6h时候开始聚集并形成少量绿色点状胞质体，并且随着Dox处理时间的延长绿色点状胞质体急剧增加，绿色荧光蛋白荧光信号强度减弱，部分细胞中看不到绿色荧光或绿色荧光蛋白消失，在Dox处理至24h时绿色点状胞质体数目最多，EGFP荧光强度最弱(图31、图33、图34、图36)。Dox+组的图片中点状胞质体在6h时开始出现，在12h时急剧增多，在18h时增加至最多，在24h时其点状胞质体的数量和面积均呈现下降的趋势(图32、图33、图35、图36)。本研究还使用活细胞成像系统监测拍摄了293T-EGFP-High/Tet-on-αEGFP TRIMbody、293T-EGFP-Low/Tet-on-αEGFP TRIMbody经Dox诱导后在6～18h绿色点状胞质体的形成过程，视频中代表性图片见图37、图38。
2.αEGFP TRIMbody表达使细胞中的EGFP蛋白呈现快速的动力学变化
在培养至60～70％成片的293T-EGFP-High/Tet-on-αEGFP TRIMbody、293T-EGFP-Low/Tet-on-αEGFP TRIMbody细胞中加入Dox诱导，在37℃、5％二氧化碳培养箱诱导培养至24h，用流式细胞仪检测Dox诱导6h、12h、18h、24h、48h、72h后的荧光强度动力学变化，并分析不同时间点的共聚焦显微镜图片经ImageJ软件处理后的细胞中自噬体面积的变化。从图39A、图40A中可以看出没有加入Dox的细胞中EGFP荧光强度维持在一个较高的水平并在6～72h呈现无明显变化趋势，加入Dox的细胞中EGFP荧光强度呈现急剧下降的趋势并维持在一个较低的水平。从图39B、图40B中可以看出Dox-组的细胞中胞质体的面积在6～72h呈现无明显变化趋势，Dox+组细胞中胞质体的面积在6～72h呈现先增加后降低的趋势。加入Dox的细胞中的点状胞质体面积的快速动力学变化与EGFP荧光强度的动力学变化存在相关性，预示着Dox诱导表达出的αEGFP TRIMbody与EGFP之间存在强烈的相互作用并导致细胞的荧光强度的降低。
3.泛素-蛋白酶体途径和自噬-溶酶体途径介导EGFP蛋白降解
将293T-EGFP/Tet-on-αEGFP TRIMbody-High、293T-EGFP/Tet-on-αEGFPTRIMbody-Low细胞分别培养至60～70％成片时，分为四组，Dox-组不做处理，Dox+组加入Dox诱导，Dox+MG132+++组加入Dox(10μg/mL)同时加入蛋白酶体抑制剂MG132(400μM)处理，Dox+CQ+++(40μM)组加入Dox同时加入溶酶体抑制剂氯喹(Chloroquine，CQ)处理，在37℃、5％二氧化碳培养箱诱导培养至24h，用普通荧光显微镜观察24h后的荧光图像并用流式细胞仪检测荧光强度。本研究在细胞培养液中加入蛋白酶体抑制剂MG132时，EGFP蛋白的降解程度会被部分抑制，证实αEGFP TRIMbody蛋白与EGFP蛋白结合后可以通过泛素-蛋白酶体途径(UPS)途径进行降解(见图41)。本研究在细胞培养液中加入溶酶体抑制剂Chloroquine(CQ)时，EGFP蛋白的降解很大程度上被抑制，这种现象在高表达EGFP细胞中较为明显，证实αEGFP TRIMbody蛋白与EGFP蛋白结合后可以通过自噬-溶酶体途径(ALP)进行降解。泛素-蛋白酶体途径(UPS)和自噬-溶酶体途径(ALP)都可以介导EGFP的降解，但是当EGFP的表达量较高时，细胞主要通过自噬-溶酶体途径(ALP)降解EGFP(见图42)。
实施例8 anti-Tau TRIMbody特异性结合并降解细胞中的Tau
anti-Tau TRIMbody特异性结合并降解细胞中表达的Tau的方法按照以下方式实现：
1.挑选健康的转Tau-EGFP基因的斑马鱼(源自中国科学院分子细胞科学卓越创新中心公共技术服务中心)雌雄各6只，让雄雌斑马鱼自由交配0.5h，产卵后10min内收集胚胎，挑选200枚表达Tau-EGFP的健康的胚胎。
2.向表达Tau-EGFP的且处于单细胞阶段的斑马鱼胚胎使用显微注射的方式(方法引自CHEN X,LIU M,LOU H,et al.Degradation of endogenous proteins andgeneration of a null-like phenotype in zebrafish using Trim-Away technology[J].Genome Biol,2019,20(1):19.)注入2nL的anti-Tau TRIMbody蛋白，注射结束后，置于28.5℃的培养箱中培养。
3.在凹面载玻片上滴加甲基纤维素(购自Sigma-Aldrich)，将胚胎固定在载玻片上，用荧光显微镜(AMG，EVOS)EGFP通道观察斑马鱼胚胎中Tau-EGFP的荧光强度变化，并观察拍照。
实验结果表明，注入anti-Tau TRIMbody蛋白的斑马鱼胚胎中绿色荧光蛋白荧光强度减弱，部分胚胎中看不到绿色荧光或绿色荧光蛋白消失。
实施例9 anti-Capsid protein TRIMbody特异性结合并降解细胞中的HIV-1衣壳蛋白
anti-Capsid protein TRIMbody(简写为αCP TRIMbody)特异性结合并降解细胞中表达的HIV-1衣壳蛋白的方法按照以下方式实现：
1.采用PEIpro转染试剂(购自PolyPlus)，将含有αCP TRIMbody基因的慢病毒重组载体pLVX-ZsGreen1-αCP TRIMbody及其psPAX2包装质粒和pMD2.G包膜质粒共转染入HEK293T细胞(见实施例2)。孵育细胞后，收集包含慢病毒的上清液，感染MT-2或CEMx1745.25M7细胞(购自ATCC)，进行流式细胞分选(方法引自Snyder GA,Browne WE,Traylor-Knowles N,et al.Fluorescence-Activated Cell Sorting for the Isolation ofScleractinian Cell Populations.J Vis Exp,2020,(159).)收高表达EGFP的细胞，置于6孔板中，将这些细胞消化后传代即得到了稳定表达αCP TRIMbody的细胞系。
2.将HIV-1ⅢB和Bal病毒(来源于NIH艾滋病试剂项目)按照100倍的50％组织感染剂量(即100倍的TCID50)进行稀释，加入细胞板中。将MT-2或CEMx174 5.25M7细胞(购自ATCC)用含有10％血清的1640培养基(购自HyClone)稀释至105/mL，每孔加入100μL已稀释的细胞。将含有细胞和病毒混合液的细胞板于37℃、5％CO2培养箱中培养过夜。细胞培养16h后换液，将MT-2-αCP TRIMbody细胞培养4天或CEMx174 5.25M7-αCP TRIMbody细胞培养七天。
3.收取MT-2-αCP TRIMbody细胞或CEMx174 5.25M7-αCP TRIMbody细胞上清，加入等体积的5％Triton-X-100-PBS(购自Beyotime)，4℃放置裂解过夜，用Triton-X(购自Beyotime)裂解后可以用ELISA方法(方法引自Robert Hnasko.Western Blotting.MIMB,2015,volume 1318)检测细胞培养上清中衣壳蛋白的含量或使用实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR,qRT-PCR)(方法引自Roberto Biassoni,AlessandroRaso.Quantitative Real-Time PCR.MIMB,2020,volume 2065)检测细胞培养上清中病毒粒子数量。
实验结果表明，MT-2-αCP TRIMbody细胞或CEMx174 5.25M7-αCP TRIMbody细胞中上清中衣壳蛋白的含量和上清中病毒粒子数量明显下降。
实施例10 anti-spike glycoprotein(S)TRIMbody治疗新型冠状病毒肺炎
本发明提供的TRIMbody蛋白可以用于治疗病原体感染性疾病，所述的TRIMbody蛋白通过抗体片段结合病毒抗原或微生物抗原，RBCC结构域对抗体片段结合病毒抗原或微生物抗原进行泛素化标记，进而通过泛素-蛋白酶体途径特异性降解进入细胞内的病原体从而达到抗感染，特别是抗病毒感染的目的。
本发明中所述病原体感染性疾病包括经病毒(DNA病毒、RNA病毒、动物病毒)、细菌(例如革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、抗酸菌)、真菌、寄生微生物、线虫等的感染，例如新型冠状病毒肺炎、艾滋病、乙型肝炎、肺结核、麻风病、流行性感冒、禽流感、带状疱疹、呼吸道合胞病毒肺炎、埃博拉出血热、寨卡病毒病等。
SARS-CoV-2拥有典型的冠状病毒基因结构，其S蛋白具有较强的免疫原性且该蛋白S1亚基介导的受体结合过程和S2亚基介导的膜融合过程是SARS-CoV-2特异性入侵宿主细胞的关键。
anti-spike glycoprotein(S)TRIMbody可以有效的与进入细胞内的SARS-CoV-2表面的S蛋白结合，从而泛素化标记SARS-CoV-2病毒粒子，并引导进入细胞内的病毒粒子或新合成的病毒粒子进入泛素-蛋白酶体途径(Ubiquitin-proteasome system,UPS)或自噬-溶酶体途径(Autophagy-lysosome pathway,ALP)进行降解，达到特异性治疗新型冠状病毒肺炎感染患者的目的。
anti-spike glycoprotein(S)TRIMbody(简写为αS TRIMbody)特异性结合SARS-CoV-2刺突糖蛋白并降解的方法按照以下方式实现：
1.优化Ad-5-αS TRIMbody的基因序列，在翻译起始密码子前面加上Kozak序列(核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示)，并在整个序列上下游加入酶切位点(BamHⅠ-EcoRⅠ)，进行基因合成。将这种两端带有载体末端序列的αS TRIMbody基因(SEQ ID NO:19)和线性化腺病毒系统穿梭质粒pD316(源自BioVector)按照摩尔比为1:1的比例混合，利用非连接酶依赖型多片段一步定向无缝克隆技术(参照
Figure BDA0003025921270000341
MultiS One Step Cloning Kit(Vazyme)说明书)进行连接快速完成定向拼接获得重组克隆pD316-αS TRIMbody。
2.将pD316-αS TRIMbody与腺病毒系统的pBHGlox、3cre(源自BioVector)共转染293T细胞进行重组腺病毒包装(具体转染方法引自Ostapchuk P,Hearing P.Control ofadenovirus packaging[J].J Cell Biochem,2005,96(1):25-35.)。腺病毒扩大培养后分离纯化腺病毒颗粒，并进行Ad-5-αS TRIMbody的鉴定和病毒滴度测定(具体方法引自HeimA,Ebnet C,Harste G,et al.Rapid and quantitative detection of human adenovirusDNA by real-time PCR.J Med Virol,2003,70(2):228-39.)。
3.20只SPF级雌性BALB/c小鼠(6～8周龄)(购自上海灵畅生物科技有限公司)，随机分成两组，每组10只。将小鼠用异氟烷(购自深圳瑞沃德生命科技有限公司)麻醉，实验组小鼠经鼻腔滴入20μL 5×107VP的Ad-5-αS TRIMbody，对照组小鼠经鼻腔滴入20μL1×107Pfu的Ad-5。免疫两周后将小鼠转移至生物安全3级实验室，进行SARS-CoV-2攻毒。小鼠攻毒后连续观察3天，记录体重变化，并检测肺组织病毒载量。
实验结果表明，对照组在攻毒后5～14d内全部死亡，免疫Ad-5-αS TRIMbody的小鼠在攻毒后无一死亡，对SARS-CoV-2强毒攻击的保护率为100％，未见任何临床症状。
实施例11 anti-Tau TRIMbody治疗神经退行性疾病
Tau蛋白的聚集和累积是引起神经元退行性病变的重要原因，降低Tau蛋白的含量可抑制Tau蛋白的聚集和累积，Tau蛋白是这类疾病的重要治疗靶点，开发新的靶向降解策略降解细胞内功能异常的Tau蛋白将是治疗阿尔茨海默症最为直接有效的手段之一。
本发明提供了特异性降解Tau蛋白的TRIMbody-Away技术。本发明所述的特异性降解Tau蛋白的TRIMbody可在预防和治疗包括阿尔茨海默病在内的一系列神经退行性疾病中发挥作用。
mRNA疫苗作为一种新型疫苗，具有安全性高、有效性高和生产便捷等优点。把mRNA包裹到脂质体纳米粒(Lipid Nanoparticle，LNP)中不仅可以防止酶对RNA的降解，还可以提高肌肉注射后组织对基因的摄取效率，并且脂质体纳米粒表面不含有任何表面蛋白，因此不受抗载体免疫反应的干扰。
mRNA/anti-Tau TRIMbody-LNPs特异性结合Tau蛋白并降解的方法可以按照以下方式实现：
1.合成anti-Tau TRIMbody(其氨基酸序列如SEQ ID NO:17所示)的mRNA。由苏州泓迅生物科技股份有限公司合成。
2.以脂质体为载体，以mRNA/anti-Tau TRIMbody为模型药物，采用乙醇注入-超声乳化法(方法引自Santo IE,Campardelli R,Albuquerque EC,et al.Liposomes SizeEngineering by Combination of Ethanol Injection and Supercritical Processing[J].J Pharm Sci,2015,104(11):3842-3850.)制备载anti-Tau TRIMbody mRNA的脂质体纳米粒(mRNA/anti-Tau TRIMbody-LNPs)，将阳离子脂质DOTMA或DOTAP(购自CreativeEnzymes)、辅助脂质DOPE或胆固醇(购自Sigma-Aldrich)溶于乙醇中，将mRNA溶解在柠檬酸盐缓冲液中(pH 4.0)，脂质体与mRNA的重量比为40/1。将三倍体积的有机相以一定的速度将其注入到一倍体积的水相中(3/1,aqueous./ethanol,vol./vol.)，使用高速剪切机(Fluko，FA25型)剪切后超声波分散仪(BRANSON，S-450D)超声处理后室温孵育10分钟。对mRNA/anti-Tau TRIMbody-LNPs的制备工艺，对纳米粒的形态、分散性，平均粒径，Zeta电位，包封率，载药量、体外释放特性、冻干粉储存稳定性等理化特性进行研究；通过细胞毒性试验(方法引自Kumar P,Nagarajan A,Uchil PD.Analysis of Cell Viability by theMTT Assay.Cold Spring Harb Protoc,2018,2018(6).)评价了mRNA/TRIMbody-anti-Tau-LNPs递送系统的安全性；
3.取Tau转基因雄性SD大鼠(购自上海灵畅生物科技有限公司)10只随机分成两组，每组5只，实验前10h禁食不禁水。实验组小鼠静脉注射mRNA/anti-Tau TRIMbody-LNPs，对照组小鼠注射空载的LNPs。Morris水迷宫检测(方法引自Joseph Nunez.Morris WaterMaze Experiment.JoVE Journal,2008)各组小鼠的学习记忆能力，HE、Niss染色(方法引自Yun Zhu,Tiesheng Wang.Thyroid FNA Cytology,2019,pp 347-354)观察小鼠海马CA3区组织学变化和尼氏体变化，Western Blot检测(方法引自Biji T,Kurien R.WesternBlotting.MIMB,2015,volume 1312)mRNA对AD小鼠脑内Tau蛋白的影响及PI3K/Akt/Gsk3β信号通路上相关蛋白的表达。
实验结果表明，治疗组显著降低了小鼠脑组织中Tau蛋白的水平，通过增加PI3K/Akt/Gsk3β信号通路上相关蛋白的表达，抑制AD模型小鼠脑内的Aβ表达，进而改善其学习记忆能力。
实施例12 TRIMbody-anti-RAB27A治疗黑色素瘤
RAB27A蛋白是黑色素瘤转移的关键驱动因素，抑制这种蛋白质的表达能减少外泌体的数量。腺相关病毒(AAV)载体是目前基因治疗最常用的病毒载体之一。
anti-RAB27A TRIMbody特异性结合RAB27A蛋白并降解的方法可以按照以下方式实现：
1.将这种两端带有载体末端序列的anti-RAB27A TRIMbody基因(由苏州金唯智生物科技有限公司合成，其氨基酸序列如SEQ ID NO:20所示)和线性化载体pBR322-AAV2(源自NEW ENGLAND BioLabs)按照摩尔比为1:1的比例混合，利用非连接酶依赖型多片段一步定向无缝克隆技术(参照
Figure BDA0003025921270000361
MultiS One Step Cloning Kit(Vazyme)说明书)进行连接快速完成定向拼接获得重组克隆pBR322-AAV2-anti-RAB27A TRIMbody。
2.将pBR322-AAV2-anti-RAB27A TRIMbody与含有Rep和Lip/Cap基因(GenBank:MT709014.1)的辅助质粒pHelper(源自BioVector)共转染293T细胞进行重组腺病毒包装。腺病毒扩大培养后分离纯化腺病毒颗粒，并进行pBR322-AAV2-anti-RAB27A TRIMbody的鉴定和病毒滴度测定(方法引自Maria A.Thomas,Drew L.Lichtenstein,Peter Krajcsi,etal.A Real-Time PCR Method to Rapidly Titer Adenovirus Stocks.MIMB,2007,volume130,pp 185-192)。
3. 20只SPF级雌性C57BL小鼠(6～8周龄)(购自上海灵畅生物科技有限公司)，随机分成两组，每组10只。将小鼠用异氟烷(购自深圳瑞沃德生命科技有限公司)麻醉，实验组小鼠和对照组小鼠经右腋窝皮下接种B16F10黑素瘤细胞2×105个，接种7天后实验组小鼠经静脉注射滴入20μL 8×1012vg/kg的pBR322-AAV2-anti-RAB27A TRIMbody，对照组小鼠经静脉注射20μL 8×1012vg/kg的pBR322-AAV2。观察瘤体生长情况以及各组小鼠死亡数和死亡时间。
实验表明，免疫anti-RAB27A TRIMbody对肿瘤细胞的增殖具有抑制作用。
序列表
<110> 复旦大学
<120> 一种融合蛋白及其在靶向降解细胞内蛋白中的应用
<130> 20210417
<160> 20
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 475
<212> PRT
<213> TRIM21
<400> 1
Met Ala Ser Ala Ala Arg Leu Thr Met Met Trp Glu Glu Val Thr Cys
1 5 10 15
Pro Ile Cys Leu Asp Pro Phe Val Glu Pro Val Ser Ile Glu Cys Gly
20 25 30
His Ser Phe Cys Gln Glu Cys Ile Ser Gln Val Gly Lys Gly Gly Gly
35 40 45
Ser Val Cys Pro Val Cys Arg Gln Arg Phe Leu Leu Lys Asn Leu Arg
50 55 60
Pro Asn Arg Gln Leu Ala Asn Met Val Asn Asn Leu Lys Glu Ile Ser
65 70 75 80
Gln Glu Ala Arg Glu Gly Thr Gln Gly Glu Arg Cys Ala Val His Gly
85 90 95
Glu Arg Leu His Leu Phe Cys Glu Lys Asp Gly Lys Ala Leu Cys Trp
100 105 110
Val Cys Ala Gln Ser Arg Lys His Arg Asp His Ala Met Val Pro Leu
115 120 125
Glu Glu Ala Ala Gln Glu Tyr Gln Glu Lys Leu Gln Val Ala Leu Gly
130 135 140
Glu Leu Arg Arg Lys Gln Glu Leu Ala Glu Lys Leu Glu Val Glu Ile
145 150 155 160
Ala Ile Lys Arg Ala Asp Trp Lys Lys Thr Val Glu Thr Gln Lys Ser
165 170 175
Arg Ile His Ala Glu Phe Val Gln Gln Lys Asn Phe Leu Val Glu Glu
180 185 190
Glu Gln Arg Gln Leu Gln Glu Leu Glu Lys Asp Glu Arg Glu Gln Leu
195 200 205
Arg Ile Leu Gly Glu Lys Glu Ala Lys Leu Ala Gln Gln Ser Gln Ala
210 215 220
Leu Gln Glu Leu Ile Ser Glu Leu Asp Arg Arg Cys His Ser Ser Ala
225 230 235 240
Leu Glu Leu Leu Gln Glu Val Ile Ile Val Leu Glu Arg Ser Glu Ser
245 250 255
Trp Asn Leu Lys Asp Leu Asp Ile Thr Ser Pro Glu Leu Arg Ser Val
260 265 270
Cys His Val Pro Gly Leu Lys Lys Met Leu Arg Thr Cys Ala Val His
275 280 285
Ile Thr Leu Asp Pro Asp Thr Ala Asn Pro Trp Leu Ile Leu Ser Glu
290 295 300
Asp Arg Arg Gln Val Arg Leu Gly Asp Thr Gln Gln Ser Ile Pro Gly
305 310 315 320
Asn Glu Glu Arg Phe Asp Ser Tyr Pro Met Val Leu Gly Ala Gln His
325 330 335
Phe His Ser Gly Lys His Tyr Trp Glu Val Asp Val Thr Gly Lys Glu
340 345 350
Ala Trp Asp Leu Gly Val Cys Arg Asp Ser Val Arg Arg Lys Gly His
355 360 365
Phe Leu Leu Ser Ser Lys Ser Gly Phe Trp Thr Ile Trp Leu Trp Asn
370 375 380
Lys Gln Lys Tyr Glu Ala Gly Thr Tyr Pro Gln Thr Pro Leu His Leu
385 390 395 400
Gln Val Pro Pro Cys Gln Val Gly Ile Phe Leu Asp Tyr Glu Ala Gly
405 410 415
Met Val Ser Phe Tyr Asn Ile Thr Asp His Gly Ser Leu Ile Tyr Ser
420 425 430
Phe Ser Glu Cys Ala Phe Thr Gly Pro Leu Arg Pro Phe Phe Ser Pro
435 440 445
Gly Phe Asn Asp Gly Gly Lys Asn Thr Ala Pro Leu Thr Leu Cys Pro
450 455 460
Leu Asn Ile Gly Ser Gln Gly Ser Thr Asp Tyr
465 470 475
<210> 2
<211> 286
<212> PRT
<213> TRIM21--RBCC
<400> 2
Met Ala Ser Ala Ala Arg Leu Thr Met Met Trp Glu Glu Val Thr Cys
1 5 10 15
Pro Ile Cys Leu Asp Pro Phe Val Glu Pro Val Ser Ile Glu Cys Gly
20 25 30
His Ser Phe Cys Gln Glu Cys Ile Ser Gln Val Gly Lys Gly Gly Gly
35 40 45
Ser Val Cys Pro Val Cys Arg Gln Arg Phe Leu Leu Lys Asn Leu Arg
50 55 60
Pro Asn Arg Gln Leu Ala Asn Met Val Asn Asn Leu Lys Glu Ile Ser
65 70 75 80
Gln Glu Ala Arg Glu Gly Thr Gln Gly Glu Arg Cys Ala Val His Gly
85 90 95
Glu Arg Leu His Leu Phe Cys Glu Lys Asp Gly Lys Ala Leu Cys Trp
100 105 110
Val Cys Ala Gln Ser Arg Lys His Arg Asp His Ala Met Val Pro Leu
115 120 125
Glu Glu Ala Ala Gln Glu Tyr Gln Glu Lys Leu Gln Val Ala Leu Gly
130 135 140
Glu Leu Arg Arg Lys Gln Glu Leu Ala Glu Lys Leu Glu Val Glu Ile
145 150 155 160
Ala Ile Lys Arg Ala Asp Trp Lys Lys Thr Val Glu Thr Gln Lys Ser
165 170 175
Arg Ile His Ala Glu Phe Val Gln Gln Lys Asn Phe Leu Val Glu Glu
180 185 190
Glu Gln Arg Gln Leu Gln Glu Leu Glu Lys Asp Glu Arg Glu Gln Leu
195 200 205
Arg Ile Leu Gly Glu Lys Glu Ala Lys Leu Ala Gln Gln Ser Gln Ala
210 215 220
Leu Gln Glu Leu Ile Ser Glu Leu Asp Arg Arg Cys His Ser Ser Ala
225 230 235 240
Leu Glu Leu Leu Gln Glu Val Ile Ile Val Leu Glu Arg Ser Glu Ser
245 250 255
Trp Asn Leu Lys Asp Leu Asp Ile Thr Ser Pro Glu Leu Arg Ser Val
260 265 270
Cys His Val Pro Gly Leu Lys Lys Met Leu Arg Thr Cys Ala
275 280 285
<210> 3
<211> 270
<212> PRT
<213> anti-EGFP Nanobody
<400> 3
Met Ala Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Gln Ala
1 5 10 15
Gly Asp Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser
20 25 30
Thr Ser Ala Met Ala Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Arg Glu Arg Glu
35 40 45
Phe Val Ala Ala Ile Thr Trp Thr Val Gly Asn Thr Ile Leu Gly Asp
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Arg Ala Lys Asn Thr
65 70 75 80
Val Asp Leu Gln Met Asp Asn Leu Glu Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Ser Ala Arg Ser Arg Gly Tyr Val Leu Ser Val Leu Arg Ser
100 105 110
Val Asp Ser Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser
115 120 125
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Met
130 135 140
Ala Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly
145 150 155 160
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Asn
165 170 175
Tyr Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe
180 185 190
Val Ala Ala Ile Ser Trp Thr Gly Val Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser
195 200 205
Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Asp Lys Asn Thr Val
210 215 220
Tyr Val Gln Met Asn Ser Leu Ile Pro Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr
225 230 235 240
Cys Ala Ala Val Arg Ala Arg Ser Phe Ser Asp Thr Tyr Ser Arg Val
245 250 255
Asn Glu Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val
260 265 270
<210> 4
<211> 571
<212> PRT
<213> RBCC-LaG16-G4S×3-LaG2
<400> 4
Met Ala Ser Ala Ala Arg Leu Thr Met Met Trp Glu Glu Val Thr Cys
1 5 10 15
Pro Ile Cys Leu Asp Pro Phe Val Glu Pro Val Ser Ile Glu Cys Gly
20 25 30
His Ser Phe Cys Gln Glu Cys Ile Ser Gln Val Gly Lys Gly Gly Gly
35 40 45
Ser Val Cys Pro Val Cys Arg Gln Arg Phe Leu Leu Lys Asn Leu Arg
50 55 60
Pro Asn Arg Gln Leu Ala Asn Met Val Asn Asn Leu Lys Glu Ile Ser
65 70 75 80
Gln Glu Ala Arg Glu Gly Thr Gln Gly Glu Arg Cys Ala Val His Gly
85 90 95
Glu Arg Leu His Leu Phe Cys Glu Lys Asp Gly Lys Ala Leu Cys Trp
100 105 110
Val Cys Ala Gln Ser Arg Lys His Arg Asp His Ala Met Val Pro Leu
115 120 125
Glu Glu Ala Ala Gln Glu Tyr Gln Glu Lys Leu Gln Val Ala Leu Gly
130 135 140
Glu Leu Arg Arg Lys Gln Glu Leu Ala Glu Lys Leu Glu Val Glu Ile
145 150 155 160
Ala Ile Lys Arg Ala Asp Trp Lys Lys Thr Val Glu Thr Gln Lys Ser
165 170 175
Arg Ile His Ala Glu Phe Val Gln Gln Lys Asn Phe Leu Val Glu Glu
180 185 190
Glu Gln Arg Gln Leu Gln Glu Leu Glu Lys Asp Glu Arg Glu Gln Leu
195 200 205
Arg Ile Leu Gly Glu Lys Glu Ala Lys Leu Ala Gln Gln Ser Gln Ala
210 215 220
Leu Gln Glu Leu Ile Ser Glu Leu Asp Arg Arg Cys His Ser Ser Ala
225 230 235 240
Leu Glu Leu Leu Gln Glu Val Ile Ile Val Leu Glu Arg Ser Glu Ser
245 250 255
Trp Asn Leu Lys Asp Leu Asp Ile Thr Ser Pro Glu Leu Arg Ser Val
260 265 270
Cys His Val Pro Gly Leu Lys Lys Met Leu Arg Thr Cys Ala Gly Gly
275 280 285
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Met Ala Gln
290 295 300
Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Gln Ala Gly Asp Ser
305 310 315 320
Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Thr Ser Ala
325 330 335
Met Ala Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Arg Glu Arg Glu Phe Val Ala
340 345 350
Ala Ile Thr Trp Thr Val Gly Asn Thr Ile Leu Gly Asp Ser Val Lys
355 360 365
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Arg Ala Lys Asn Thr Val Asp Leu
370 375 380
Gln Met Asp Asn Leu Glu Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ser
385 390 395 400
Ala Arg Ser Arg Gly Tyr Val Leu Ser Val Leu Arg Ser Val Asp Ser
405 410 415
Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Gly Gly Gly
420 425 430
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Met Ala Gln Val
435 440 445
Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly Ser Leu
450 455 460
Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Asn Tyr Ala Met
465 470 475 480
Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val Ala Ala
485 490 495
Ile Ser Trp Thr Gly Val Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly
500 505 510
Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Asp Lys Asn Thr Val Tyr Val Gln
515 520 525
Met Asn Ser Leu Ile Pro Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Ala
530 535 540
Val Arg Ala Arg Ser Phe Ser Asp Thr Tyr Ser Arg Val Asn Glu Tyr
545 550 555 560
Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val
565 570
<210> 5
<211> 15
<212> DNA
<213> 连接序列(linker sequence)
<400> 5
ggggsggggs ggggs 15
<210> 6
<211> 239
<212> PRT
<213> EGFP
<400> 6
Met Val Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu
1 5 10 15
Val Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val Ser Gly
20 25 30
Glu Gly Glu Gly Asp Ala Thr Tyr Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile
35 40 45
Cys Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr
50 55 60
Leu Thr Tyr Gly Val Gln Cys Phe Ser Arg Tyr Pro Asp His Met Lys
65 70 75 80
Gln His Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu
85 90 95
Arg Thr Ile Phe Phe Lys Asp Asp Gly Asn Tyr Lys Thr Arg Ala Glu
100 105 110
Val Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly
115 120 125
Ile Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr
130 135 140
Asn Tyr Asn Ser His Asn Val Tyr Ile Met Ala Asp Lys Gln Lys Asn
145 150 155 160
Gly Ile Lys Val Asn Phe Lys Ile Arg His Asn Ile Glu Asp Gly Ser
165 170 175
Val Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly
180 185 190
Pro Val Leu Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser Thr Gln Ser Ala Leu
195 200 205
Ser Lys Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Met Val Leu Leu Glu Phe
210 215 220
Val Thr Ala Ala Gly Ile Thr Leu Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys
225 230 235
<210> 7
<211> 10
<212> DNA
<213> KOZAK
<400> 7
gccaccatgg 10
<210> 8
<211> 493
<212> PRT
<213> TRIM5α
<400> 8
Met Ala Ser Gly Ile Leu Val Asn Val Lys Glu Glu Val Thr Cys Pro
1 5 10 15
Ile Cys Leu Glu Leu Leu Thr Gln Pro Leu Ser Leu Asp Cys Gly His
20 25 30
Ser Phe Cys Gln Ala Cys Leu Thr Ala Asn His Lys Lys Ser Met Leu
35 40 45
Asp Lys Gly Glu Ser Ser Cys Pro Val Cys Arg Ile Ser Tyr Gln Pro
50 55 60
Glu Asn Ile Arg Pro Asn Arg His Val Ala Asn Ile Val Glu Lys Leu
65 70 75 80
Arg Glu Val Lys Leu Ser Pro Glu Gly Gln Lys Val Asp His Cys Ala
85 90 95
Arg His Gly Glu Lys Leu Leu Leu Phe Cys Gln Glu Asp Gly Lys Val
100 105 110
Ile Cys Trp Leu Cys Glu Arg Ser Gln Glu His Arg Gly His His Thr
115 120 125
Phe Leu Thr Glu Glu Val Ala Arg Glu Tyr Gln Val Lys Leu Gln Ala
130 135 140
Ala Leu Glu Met Leu Arg Gln Lys Gln Gln Glu Ala Glu Glu Leu Glu
145 150 155 160
Ala Asp Ile Arg Glu Glu Lys Ala Ser Trp Lys Thr Gln Ile Gln Tyr
165 170 175
Asp Lys Thr Asn Val Leu Ala Asp Phe Glu Gln Leu Arg Asp Ile Leu
180 185 190
Asp Trp Glu Glu Ser Asn Glu Leu Gln Asn Leu Glu Lys Glu Glu Glu
195 200 205
Asp Ile Leu Lys Ser Leu Thr Asn Ser Glu Thr Glu Met Val Gln Gln
210 215 220
Thr Gln Ser Leu Arg Glu Leu Ile Ser Asp Leu Glu His Arg Leu Gln
225 230 235 240
Gly Ser Val Met Glu Leu Leu Gln Gly Val Asp Gly Val Ile Lys Arg
245 250 255
Thr Glu Asn Val Thr Leu Lys Lys Pro Glu Thr Phe Pro Lys Asn Gln
260 265 270
Arg Arg Val Phe Arg Ala Pro Asp Leu Lys Gly Met Leu Glu Val Phe
275 280 285
Arg Glu Leu Thr Asp Val Arg Arg Tyr Trp Val Asp Val Thr Val Ala
290 295 300
Pro Asn Asn Ile Ser Cys Ala Val Ile Ser Glu Asp Lys Arg Gln Val
305 310 315 320
Ser Ser Pro Lys Pro Gln Ile Ile Tyr Gly Ala Arg Gly Thr Arg Tyr
325 330 335
Gln Thr Phe Val Asn Phe Asn Tyr Cys Thr Gly Ile Leu Gly Ser Gln
340 345 350
Ser Ile Thr Ser Gly Lys His Tyr Trp Glu Val Asp Val Ser Lys Lys
355 360 365
Thr Ala Trp Ile Leu Gly Val Cys Ala Gly Phe Gln Pro Asp Ala Met
370 375 380
Cys Asn Ile Glu Lys Asn Glu Asn Tyr Gln Pro Lys Tyr Gly Tyr Trp
385 390 395 400
Val Ile Gly Leu Glu Glu Gly Val Lys Cys Ser Ala Phe Gln Asp Ser
405 410 415
Ser Phe His Thr Pro Ser Val Pro Phe Ile Val Pro Leu Ser Val Ile
420 425 430
Ile Cys Pro Asp Arg Val Gly Val Phe Leu Asp Tyr Glu Ala Cys Thr
435 440 445
Val Ser Phe Phe Asn Ile Thr Asn His Gly Phe Leu Ile Tyr Lys Phe
450 455 460
Ser His Cys Ser Phe Ser Gln Pro Val Phe Pro Tyr Leu Asn Pro Arg
465 470 475 480
Lys Cys Gly Val Pro Met Thr Leu Cys Ser Pro Ser Ser
485 490
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<211> 298
<212> PRT
<213> TRIM5α--RBCC
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Met Ala Ser Gly Ile Leu Val Asn Val Lys Glu Glu Val Thr Cys Pro
1 5 10 15
Ile Cys Leu Glu Leu Leu Thr Gln Pro Leu Ser Leu Asp Cys Gly His
20 25 30
Ser Phe Cys Gln Ala Cys Leu Thr Ala Asn His Lys Lys Ser Met Leu
35 40 45
Asp Lys Gly Glu Ser Ser Cys Pro Val Cys Arg Ile Ser Tyr Gln Pro
50 55 60
Glu Asn Ile Arg Pro Asn Arg His Val Ala Asn Ile Val Glu Lys Leu
65 70 75 80
Arg Glu Val Lys Leu Ser Pro Glu Gly Gln Lys Val Asp His Cys Ala
85 90 95
Arg His Gly Glu Lys Leu Leu Leu Phe Cys Gln Glu Asp Gly Lys Val
100 105 110
Ile Cys Trp Leu Cys Glu Arg Ser Gln Glu His Arg Gly His His Thr
115 120 125
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Ala Asp Ile Arg Glu Glu Lys Ala Ser Trp Lys Thr Gln Ile Gln Tyr
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Arg Arg Val Phe Arg Ala Pro Asp Leu Lys Gly Met Leu Glu Val Phe
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<212> PRT
<213> TRIM19
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1 5 10 15
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65 70 75 80
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100 105 110
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115 120 125
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130 135 140
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165 170 175
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180 185 190
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195 200 205
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Leu Lys Cys Asp Ile Ser Ala Glu Ile Gln Gln Arg Gln Glu Glu Leu
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245 250 255
Val His Ala Gln Met His Ala Ala Val Gly Gln Leu Gly Arg Ala Arg
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275 280 285
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405 410 415
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420 425 430
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435 440 445
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450 455 460
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465 470 475 480
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Gln Ser
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<212> PRT
<213> TRIM28
<400> 11
Met Ala Ala Ser Ala Ala Ala Ala Ser Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ser
1 5 10 15
Gly Ser Pro Ser Pro Gly Glu Gly Ser Ala Gly Ala Glu Lys Arg Ala
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Ala Ala Ser Ser Ala Ala Ala Ser Ala Ser Ala Ser Ala Ser Ala Ser
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Ala Ser Ser Pro Ala Gly Gly Gly Gly Glu Ala Leu Glu Leu Leu Glu
50 55 60
His Cys Gly Val Cys Arg Glu Arg Leu Arg Pro Glu Arg Glu Pro Arg
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Leu Leu Pro Cys Leu His Ser Ala Cys Ser Ala Cys Leu Gly Pro Ala
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Pro Asp Leu Lys Glu Glu Asp Gly Ser Leu Asn Leu Asp Gly Gly Asp
675 680 685
Ser Thr Gly Val Val Ala Lys Leu Ser Pro Ala Asn Gln Gln Lys Cys
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Glu Arg Val Leu Leu Ala Leu Phe Cys His Glu Pro Cys Arg Pro Leu
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His Gln Leu Ala Thr Asp Ser Thr Phe Ser Leu Asp Gln Pro Gly Gly
725 730 735
Thr Leu Asp Leu Thr Leu Ile Arg Ala Arg Leu Gln Glu Lys Leu Ser
740 745 750
Pro Pro Tyr Ser Ser Pro Gln Glu Phe Ala Gln Asp Val Gly Arg Met
755 760 765
Phe Lys Gln Phe Asn Lys Leu Thr Glu Asp Lys Ala Asp Val Gln Ser
770 775 780
Ile Ile Gly Leu Gln Arg Phe Phe Glu Thr Arg Met Asn Glu Ala Phe
785 790 795 800
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<212> DNA
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<400> 15
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<211> 123
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<400> 16
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65 70 75 80
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485 490 495
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515 520 525
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<210> 19
<211> 427
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Glu Glu Ala Ala Gln Glu Tyr Gln Glu Lys Leu Gln Val Ala Leu Gly
130 135 140
Glu Leu Arg Arg Lys Gln Glu Leu Ala Glu Lys Leu Glu Val Glu Ile
145 150 155 160
Ala Ile Lys Arg Ala Asp Trp Lys Lys Thr Val Glu Thr Gln Lys Ser
165 170 175
Arg Ile His Ala Glu Phe Val Gln Gln Lys Asn Phe Leu Val Glu Glu
180 185 190
Glu Gln Arg Gln Leu Gln Glu Leu Glu Lys Asp Glu Arg Glu Gln Leu
195 200 205
Arg Ile Leu Gly Glu Lys Glu Ala Lys Leu Ala Gln Gln Ser Gln Ala
210 215 220
Leu Gln Glu Leu Ile Ser Glu Leu Asp Arg Arg Cys His Ser Ser Ala
225 230 235 240
Leu Glu Leu Leu Gln Glu Val Ile Ile Val Leu Glu Arg Ser Glu Ser
245 250 255
Trp Asn Leu Lys Asp Leu Asp Ile Thr Ser Pro Glu Leu Arg Ser Val
260 265 270
Cys His Val Pro Gly Leu Lys Lys Met Leu Arg Thr Cys Ala Gly Gly
275 280 285
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln
290 295 300
Leu Val Glu Ser Gly Val Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly Ser Val Ser
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Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Trp Ser Ser Gly Ala Met Gly
325 330 335
Gln Phe Arg Gln Ser Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val Ala Ala Ile
340 345 350
Ser Gln Ser Gly Ser Ser Ile Leu Tyr Gly Asp Ser Val Lys Gly Arg
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<211> 426
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<213> anti-RAB27A TRIMbody
<400> 20
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50 55 60
Pro Asn Arg Gln Leu Ala Asn Met Val Asn Asn Leu Lys Glu Ile Ser
65 70 75 80
Gln Glu Ala Arg Glu Gly Thr Gln Gly Glu Arg Cys Ala Val His Gly
85 90 95
Glu Arg Leu His Leu Phe Cys Glu Lys Asp Gly Lys Ala Leu Cys Trp
100 105 110
Val Cys Ala Gln Ser Arg Lys His Arg Asp His Ala Met Val Pro Leu
115 120 125
Glu Glu Ala Ala Gln Glu Tyr Gln Glu Lys Leu Gln Val Ala Leu Gly
130 135 140
Glu Leu Arg Arg Lys Gln Glu Leu Ala Glu Lys Leu Glu Val Glu Ile
145 150 155 160
Ala Ile Lys Arg Ala Asp Trp Lys Lys Thr Val Glu Thr Gln Lys Ser
165 170 175
Arg Ile His Ala Glu Phe Val Gln Gln Lys Asn Phe Leu Val Glu Glu
180 185 190
Glu Gln Arg Gln Leu Gln Glu Leu Glu Lys Asp Glu Arg Glu Gln Leu
195 200 205
Arg Ile Leu Gly Glu Lys Glu Ala Lys Leu Ala Gln Gln Ser Gln Ala
210 215 220
Leu Gln Glu Leu Ile Ser Glu Leu Asp Arg Arg Cys His Ser Ser Ala
225 230 235 240
Leu Glu Leu Leu Gln Glu Val Ile Ile Val Leu Glu Arg Ser Glu Ser
245 250 255
Trp Asn Leu Lys Asp Leu Asp Ile Thr Ser Pro Glu Leu Arg Ser Val
260 265 270
Cys His Val Pro Gly Leu Lys Lys Met Leu Arg Thr Cys Ala Gly Gly
275 280 285
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Lys
290 295 300
Leu Glu Glu Ser Gly Gly Arg Leu Met Gln Ala Gly Gly Ser Leu Arg
305 310 315 320
Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Arg Thr Phe Tyr Ala Met Gly Trp Phe
325 330 335
Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val Ala Ala Ile Asn Arg
340 345 350
Gly Asp Gly Thr Thr Phe Tyr Ala Glu Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr
355 360 365
Ile Ser Arg Asp Tyr Ala Lys Ser Thr Leu Ser Leu Gln Met Asn Ser
370 375 380
Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ala Lys Gly Gly
385 390 395 400
Gly Ser Arg Tyr Asp Ile Tyr Ser Arg Val Tyr Glu Tyr Glu Tyr Trp
405 410 415
Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
420 425

Claims (10)

1.一种融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：17所示。
2.一种融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：19所示。
3.一种融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：20所示。
4.一种核酸分子，其特征在于编码权利要求1-3中任一所述的融合蛋白。
5.一种质粒，其特征在于含有权利要求4所述的核酸分子。
6.一种宿主细胞，其特征在于含有权利要求5所述的质粒。
7.一种药用组合物，含有有效治疗剂量的如权利要求1-3中任一所述的融合蛋白或如权利要求4所述的核酸分子或如权利要求5中所述的质粒，和任一种药学可接受载体。
8.权利要求1所述的融合蛋白在制备用于治疗神经退行性疾病的药物中的用途。
9.权利要求2所述的融合蛋白在制备用于治疗新型冠状病毒肺炎的药物中的用途。
10.权利要求3所述的融合蛋白在制备用于治疗黑色素瘤的药物中的用途。
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