CN117143220B - Trim28蛋白截短体、trim28蛋白突变体及乳腺癌标记物筛查的试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种TRIM28蛋白截短体、TRIM28蛋白突变体及乳腺癌标记物筛查的试剂盒，TRIM28蛋白截短体由TRIM28蛋白N端RBCC结构域和PxVxL区域连接而成；TRIM28蛋白突变体由TRIM28蛋白截短体的R184与V185位点突变为R184A、V185D；TRIM28截短体蛋白既保证能使用原核系统快速稳定的表达，提高了蛋白稳定性和产量，又维持TRIM28蛋白招募转录抑制复合物功能的完整性；TRIM28蛋白突变体保留了TRIM28 N端RBCC结构域二聚体构象，提高了蛋白均一性；TRIM28蛋白截短体或TRIM28蛋白突变体可作为乳腺癌标记物筛查试剂盒中的重要成分，提高稳定性。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种TRIM28蛋白截短体、TRIM28蛋白突变体及乳腺癌标记物筛查的试剂盒。
背景技术
在现有技术中，为了研究TRIM28以及转录抑制复合物的结构与功能，通常使用原核系统表达TRIM28全长蛋白，但是大肠杆菌表达TRIM28全长蛋白存在稳定性较差，表达量较低，均一度较差等问题。
TRIM28在参与调控基因转录的过程中，需要依赖锌指蛋白KRAB-ZNF家族特异性识别DNA反转座子（retrotransposon）序列并且招募异染色质蛋白HP1，诱导表观遗传沉默复合物的组装，使染色质凝集固缩从而靶向抑制基因转录。在这一过程中，TRIM28主要发挥“脚手架”的功能，通过不同结构域的联合作用，招募多种蛋白及复合物，调节染色质的形态。因此，仅有TRIM28蛋白的部分结构域对于研究其功能并不完整。
另外，在免疫组织化学分析结果显示，在乳腺癌患者肿瘤组织中，TRIM28蛋白水平有明显提高，并且与肿瘤恶性程度，以及患者不良预后成正相关。乳腺是由皮肤、纤维组织、乳腺腺体和脂肪组成的，乳腺并不是维持人体生命活动的重要器官，原位乳腺癌并不致命；但由于乳腺癌细胞丧失了正常细胞的特性，细胞之间连接松散，容易脱落。因此，乳腺癌早期筛查工作的开展是减少发病率，发现早期病例以及提高生存率的关键。乳腺癌标志物是肿瘤细胞产生的一种特异性蛋白质，进入血液后可通过血液检测将其检测出。临床上通常通过正常人的血液检测，可测出上述肿瘤标志物，初步判断患者是否存在肿瘤恶性的可能。基于TRIM28在多种恶性肿瘤中高表达，并且与临床病理特征密切相关，还与肿瘤细胞的增殖、凋亡、迁移和侵袭等生物学行为相关，因此，TRIM28能够作为乳腺癌临床诊断和预后评判的标志和治疗靶点，有必要研发出一种用于乳腺癌标记物筛查的试剂盒。
发明内容
本发明要解决的技术问题在于，针对上述缺陷，提供一种TRIM28蛋白截短体、TRIM28蛋白突变体及乳腺癌标记物筛查的试剂盒。
本发明解决以上技术问题所采取的技术方案如下：一种TRIM28蛋白截短体，氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。
进一步地，优选所述TRIM28蛋白截短体由TRIM28蛋白N端RBCC结构域和中部PxVxL区域连接而成。
进一步地，优选所述N端RBCC结构域为50-418区域，所述PxVxL区域为470-501区域。
进一步地，优选上游引物序列为：5’-ACCAACTCCACTGGCGGCAGCGGCAGCGGCAGCCGGTCCCGCTCAGGT-3’，下游引物序列为：5’-ACCTGAGCGGGACCGGCTGCCGCTGCCGCTGCCGCCAGTGGAGTTGGT-3’。
进一步地，优选所述的TRIM28蛋白截短体采用PCR反应获取，反应体系包括以下组分：上游引物0.8 μL、下游引物0.8 μL、模板0.5 μL、2×Phanta Master Mix 15 μL、dNTP1.5 μL、DMSO1.5 μL、ddH2O9.9 μL；所述模板为SUMO-TRIM28，SUMO-TRIM28选定区域为50-501。
进一步地，优选PCR反应扩增的过程为：95℃预变性5min，95℃变性30s，55℃退火30s，68℃延伸7 min，19次循环，68℃后延伸10min，4℃维持。
本发明还提供一种TRIM28蛋白突变体，氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示。
进一步地，优选所述的TRIM28蛋白突变体由上述所述的TRIM28蛋白截短体的R184与V185位点分别突变为R184A、V185D而获得。
进一步地，优选上游引物为：GTGGAGGCGCACCAGCGGGTGAAGTACACCAAGGAC，下游引物为：GTCCTTGGTGTACTTCACCCGCTGGTGCGCCTCCAC。
本发明还提供一种乳腺癌标记物筛查的试剂盒，包括质控品和校准品，所述质控品和所述校准品中均分别包括TRIM28蛋白截短体和/或TRIM28蛋白突变体。
实施本发明具有以下有益效果：一种新的TRIM28蛋白截短体，将TRIM28蛋白N端RBCC结构域和中部HP1结合区域（PxVxL区域）连接。利用大肠杆菌E. coli体外表达系统表达该TRIM28截短体蛋白，之后使用分子筛纯化TRIM28截短体蛋白。与TRIM28全长蛋白对比，TRIM28截短体蛋白既保证了能够使用原核系统快速稳定的表达，提高了蛋白稳定性和产量，又可以维持TRIM28蛋白招募转录抑制复合物功能的完整性。
同时，本发明在TRIM28截短体蛋白B1-box结构域上设计了突变位点R184A、V185D，破坏了疏水相互作用，并改变了盐桥上的电荷，以此减少TRIM28蛋白分子之间的聚集。这些点突变能够破坏TRIM28蛋白的高聚状态，同时保留了TRIM28 N端RBCC结构域二聚体构象，提高了蛋白的均一性。
同时，本发明利用TRIM28蛋白截短体或所述的TRIM28蛋白突变体，作为试剂盒中特异性质控品和校准品的重要成分，与TRIM28蛋白全长相比，试剂性能更稳定，在试剂12个月有效期内，测试结果偏差更小。
附图说明
下面将结合附图及实施例对发明作进一步说明，附图中：
图1为本发明中一些实施例中的分子筛纯化TRIM28蛋白截短体（tTRIM28）紫外吸收峰；
图2为本发明一些实施例中分子筛纯化TRIM28蛋白截短体（tTRIM28）对应的SDS-PAGE电泳图；
图3为本发明中一些实施例中的分子筛纯化TRIM28蛋白突变体（tTRIM28dm）紫外吸收峰；
图4为本发明一些实施例中分子筛纯化TRIM28蛋白突变体（tTRIM28dm）对应的SDS-PAGE电泳图；
图5为本发明中的TRIM28蛋白截短体（tTRIM28）和TRIM28蛋白突变体（tTRIM28dm）超速离心分析技术检测蛋白分子量的结果图；
图6为本发明中的TRIM28蛋白突变体（tTRIM28dm）与KRAB-ZNF10相互作用结果图；
图7为本发明中的TRIM28蛋白突变体（tTRIM28dm）与HP1相互作用结果图；
图8为本发明中的乳腺癌标记物筛查的试剂盒与对比例的蛋白稳定性结构图。
具体实施方式
为了对本发明的技术特征、目的和效果有更加清楚的理解，下面将结合实施例对本发明做进一步详述，本实施例仅用于解释本发明，并不构成对本发明保护范围的限定。
本发明中所用的试剂均可采用市售试剂，也可采用自制试剂。
本发明提供一种TRIM28蛋白截短体，氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，DNA序列如SEQ ID NO：2所示。TRIM28蛋白截短体简称tTRIM28。本发明将TRIM28蛋白进行截短，保留TRIM28蛋白N端RBCC结构域和中部PxVxL区域，并将两者进行连接，构建一种TRIM28蛋白截短体，利用大肠杆菌E. coli体外表达系统表达该TRIM28截短体蛋白，之后使用分子筛纯化TRIM28截短体蛋白。与TRIM28全长蛋白对比， TRIM28截短体蛋白既保证了能够使用原核系统快速稳定的表达，提高了蛋白稳定性和产量，又可以维持TRIM28蛋白招募转录抑制复合物功能的完整性。
本发明通过以下步骤制备TRIM28蛋白截短体，并进行验证，具体如下：
S1、TRIM28全长蛋白基本信息收集与整理：利用Uniprot数据库检索TRIM28人源蛋白，确认其全长氨基酸序列，并在GenBank数据库中找到对应的DNA序列。根据Uniprot数据库中的Family&Domain部分的信息可知，TRIM28蛋白RBCC结构域包含氨基酸65-376，而异染色质蛋白HP1的结合位点PxVxL位于481-494区域。使用Expasy-ProtParam网站可以得知蛋白质相应的分子量、等电点等信息。
S2、TRIM28蛋白二级结构以及三级结构预测：利用PSIPRED网站，输入TRIM28全长蛋白氨基酸序列信息，提交后可以得到TRIM28蛋白二级结构预测信息。在Uniprot数据库检索TRIM28人源蛋白，在Structure部分可以得到Alphafold预测的TRIM28蛋白三级结构。
S3、TRIM28蛋白截短体构建设计：根据TRIM28蛋白二级结构，已解析部分结构域的晶体结构以及Alphafold预测的三级结构预测信息，结合需要保留的TRIM28蛋白RBCC和PxVxL两部分结构域，利用AI算法技术辅助设计出两部分对应的截短体选取区域分别为RBCC（50-418区域）以及PxVxL（470-501区域）。
S4、TRIM28蛋白截短体构建引物合成：使用缺失突变的方法分别设计出上下游引物。上游引物序列为：5’-ACCAACTCCACTGGCGGCAGCGGCAGCGGCAGCCGG TCCCGCTCAGGT-3’，下游引物序列为：5’-ACCTGAGCGGGACCGGCTGCCGCTGCCGCTGCCGCCAGTGGAGTTGGT-3’。 TRIM28蛋白截短体采用PCR反应获取，反应体系如表1所述；所述模板为SUMO-TRIM28（50-501区域），并根据表2进行PCR反应扩增。
表1.TRIM28截短体缺失突变反应体系
表2. PCR扩增反应步骤
PCR反应结束后，将反应产物转化至大肠杆菌DH5α中，并小量抽提质粒DNA，经过测序鉴定后，获得TRIM28截短体DNA序列，即SUMO-TRIM28（50-501del 420-470），简称为SUMO-tTRIM28。
使用大肠杆菌表达SUMO-tTRIM28蛋白：将质粒转化至大肠杆菌感受态细胞BL21（DE3）中，在涂布平板后挑选单克隆菌落，接种至1 L LB培养基（Luria-Bertani） 培养基：用电子天平称取 10 g 蛋白胨， 5 g 酵母提取物，10 g 氯化钠于玻璃摇瓶中，用蒸馏水溶解并定容至 1 L，之后高压灭菌）中于37℃继续扩大培养，取样检测菌液OD600=0.6~0.8时，将菌液冷却至16℃，加入0.4 mM IPTG（异丙基硫代半乳糖苷），并在16℃条件下诱导表达16h左右。
亲和层析纯化SUMO-tTRIM28蛋白：利用低温离心机4000 rpm离心20 min收集菌液（上述经过大肠杆菌表达的菌液），弃去上清液，使用菌液重悬缓冲液（0.02% Triton ，150mM 氯化钠，20 mM HEPES pH 7.0，25 mM咪唑）重悬菌体，并使用超声破碎仪将大肠杆菌充分破碎裂解。之后，在4℃条件下以18000 rpm高速离心40 min，将细胞碎片与溶解的蛋白上清液分离。蛋白上清液中加入5 mL Ni2+-NTA亲和纯化介质，在4℃条件下旋转孵育2 h使目的蛋白与亲和介质充分结合。用缓冲液多次清洗亲和介质，洗去非特异性结合的杂蛋白后，加入Ulp蛋白酶切除融合蛋白的His标签，使目标蛋白tTRIM28流穿。
分子筛纯化tTRIM28蛋白：将上述步骤中得到的tTRIM28蛋白溶液浓缩至1 mL，并使用AKTA pure 25蛋白纯化仪和Superdex 200 10/30 increase分子筛对蛋白样品进一步分离纯化（分子筛缓冲液：150 mM 氯化钠，20 mM HEPES pH 7.0），按照不同的紫外吸收峰收集蛋白，对各个吸收峰的蛋白洗脱液进行SDS-PAGE凝胶电泳分析，如图1-图2所示，由图可知通过分子筛纯化得到纯度较高的SUMO-tTRIM28蛋白。
超速离心分析技术检测tTRIM28蛋白性质：沉降速率（sedimentation velocity，SV）实验，用于研究单一蛋白的单聚或多聚状态，蛋白复合物的分子量，相互作用等信息，具有较高的准确性。选取浓度A280=0.1~1.0 mg/mL的蛋白样品，在离心开始前需要将转子预冷。之后将380 μL蛋白样品加入到离心管的其中一个样品池内，在相邻的另外一个样品池内加入分子筛缓冲液400 μL（要求不含Triton等去垢剂）作为背景，严格配平转子后，打开真空泵，并等待仪器冷却至预设温度。在4℃的真空条件下40000 rpm离心12 h。收集超速离心的紫外光和干涉光的实验原始数据，利用Sedfit软件处理即可得到样品的真实分子量，纯度等参数。通过超速离心分析技术检测tTRIM28，结果如图5所示，结果显示tTRIM28蛋白分子量为90.1KD。
本发明的TRIM28蛋白截短体（即tTRIM28），可利用大肠杆菌E. coli体外稳定表达。与TRIM28全长蛋白对比， TRIM28截短体蛋白既保证了能够使用原核系统快速稳定的表达，极大提高了蛋白稳定性和产量，又可以维持TRIM28蛋白招募转录抑制复合物功能的完整性。
本发明还提供一种TRIM28蛋白突变体，即tTRIM28dm，氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示，DNA序列如SEQ ID NO：4所示。
本发明在tTRIM28蛋白的基础上进一步设计的双位点突变，使用位点突变的方法，将SUMO-tTRIM28蛋白R184与V185位点分别突变为R184A，V185D。其中，上游引物为：GTGGAGGCGCACCAGCGGGTGAAGTACACCAAGGAC，下游引物为：GTCCTTGGTGTACTTCACCCGCTGGTGCGCCTCCAC。经过PCR位点突变并测序确认，得到SUMO-tTRIM28突变体构建，以下简称为SUMO-tTRIM28dm。
使用大肠杆菌表达SUMO-tTRIM28dm蛋白：将质粒转化至大肠杆菌感受态细胞BL21（DE3）中，在涂布平板后挑选单克隆菌落，接种至1 L LB培养基（LB 培养基：用电子天平称取 10 g 蛋白胨， 5 g 酵母提取物，10 g 氯化钠于玻璃摇瓶中，用蒸馏水溶解并定容至 1L，之后高压灭菌）中于37℃继续扩大培养，取样检测菌液OD600=0.6~0.8时，将菌液冷却至16℃，加入0.4 mM IPTG（异丙基硫代半乳糖苷），并在16℃条件下诱导表达16 h左右。
亲和层析纯化SUMO-tTRIM28dm蛋白：利用低温离心机4000 rpm离心20 min收集菌液，弃去上清液，使用菌液重悬缓冲液（0.02% Triton ，150 mM 氯化钠，20 mM HEPES pH7.0，25 mM咪唑）重悬菌体，并使用超声破碎仪将大肠杆菌充分破碎裂解。之后，在4℃条件下以18000 rpm高速离心40 min，将细胞碎片与溶解的蛋白上清液分离。蛋白上清液中加入5 mL Ni2+-NTA亲和纯化介质，在4℃条件下旋转孵育2 h使目的蛋白与亲和介质充分结合。用缓冲液多次清洗亲和介质，洗去非特异性结合的杂蛋白后，加入Ulp蛋白酶切除融合蛋白的His标签，使目标蛋白tTRIM28dm流穿。
分子筛纯化tTRIM28dm蛋白：将上述步骤中得到的tTRIM28dm蛋白溶液浓缩至1 mL，并使用AKTA pure 25蛋白纯化仪和Superdex 200 10/30 increase分子筛对蛋白样品进一步分离纯化（分子筛缓冲液：150 mM 氯化钠，20 mM HEPES pH 7.0），按照不同的紫外吸收峰收集蛋白，对各个吸收峰的蛋白洗脱液进行SDS-PAGE凝胶电泳分析，如图3-图4所示，由图可知，得到纯度较高的SUMO-tTRIM28dm蛋白。
超速离心分析技术检测tTRIM28dm蛋白性质：沉降速率（sedimentation velocity，SV）实验，用于研究单一蛋白的单聚或多聚状态，蛋白复合物的分子量，相互作用等信息，具有较高的准确性。选取浓度A280=0.1~1.0 mg/mL的蛋白样品，在离心开始前需要将转子预冷。之后将380 μL蛋白样品加入到离心管的其中一个样品池内，在相邻的另外一个样品池内加入分子筛缓冲液400 μL（要求不含Triton等去垢剂）作为背景，严格配平转子后，打开真空泵，并等待仪器冷却至预设温度。在4℃的真空条件下40000 rpm离心12 h。收集超速离心的紫外光和干涉光的实验原始数据，利用Sedfit软件处理即可得到样品的真实分子量，纯度等参数。通过超速离心分析技术检测tTRIM28dm，结果如图5所示，结果显示tTRIM28dm蛋白分子量为90.7KD, 表明这些点突变能够破坏TRIM28蛋白的高聚状态，同时保留了TRIM28N端RBCC结构域二聚体构象，进一步提高了蛋白的均一性。
蛋白pull-down实验验证tTRIM28dm蛋白活性：将GST标签融合的KRAB-ZNF10和HP1蛋白分别亲和固化在谷胱甘肽亲和介质上，充当 “诱饵蛋白”，之后加入tTRIM28dm蛋白溶液孵育，使用GST蛋白作为阴性对照实验组；另外将GST标签融合的tTRIM28dm蛋白亲和固化在谷胱甘肽亲和介质上，之后分别加入KRAB和HP1蛋白，于4℃条件下结合1 h后，洗脱多余结合物后并利用SDS-PAGE电泳分析，从而证实两种蛋白间的相互作用；结果如图6~图7所示，使用pull-down实验证明了tTRIM28dm蛋白与KRAB-ZNF10蛋白以及异染色质蛋白HP1存在明显的相互作用，说明了该蛋白截短和突变后，并不影响转录抑制作用功能的完整性。
本发明还提供一种乳腺癌标记物筛查的试剂盒，用于乳腺癌标记物早期筛查，TRIM28蛋白作为肿瘤标记物筛查的靶点之一，可以用于乳腺癌早期筛查。 试剂盒中包括质控品和校准品，在质控品和标准品中均包括TRIM28蛋白截短体和/TRIM28蛋白突变体，tTRIM28或tTRIM28dm是试剂盒特异性质控品和校准品的重要成分，用于肿瘤标记物筛查试剂的质量控制，验证测量精密度和测量准确度，评价由于试剂或分析仪器的变化产生的分析偏差等性能特征。
取本发明的实施例1的试剂盒（其标准品包括tTRIM28）、实施例2的试剂盒（其标准品包括tTRIM28dm）与对比例1的试剂盒（其标准品包括TRIM28蛋白）置于4℃下储存，使用乳腺癌标记物筛查试剂盒中的检测试剂（含有TRIM28单克隆抗体成分）检测实施例1-2以及对比例的质控品并用酶标仪进行定量（检测三次取平均值），记录下对应的数据。之后，每个月按照相同的方法，检测4℃保存的试剂盒特异性质控品，并计算与第一天信号值的相对偏差，连续检测12个月并将数据统计。结果如图8所示，使用tTRIM28或tTRIM28dm作为试剂盒质控品，在试剂有效期内，信号值的相对偏差与TRIM28蛋白全长相比明显更小。因此，tTRIM28或tTRIM28dm作为试剂盒质控品或校准品，其稳定性和准确度更高。
以上已经描述了本发明的各实施例，上述说明是示例性的，并非穷尽性的，并且也不限于所披露的各实施例。在不偏离所说明的各实施例的范围和精神的情况下，对于本技术领域的普通技术人员来说许多修改和变更都是显而易见的。本文中所用术语的选择，旨在最好地解释各实施例的原理、实际应用或对市场中的技术的改进，或者使本技术领域的其他普通技术人员能理解本文披露的各实施例。
Claims (10)
1.一种TRIM28蛋白截短体，其特征在于，氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。
2.根据权利要求1所述的TRIM28蛋白截短体，其特征在于，所述TRIM28蛋白截短体由TRIM28蛋白N端RBCC结构域和中部PxVxL区域连接而成。
3.根据权利要求2所述的TRIM28蛋白截短体，其特征在于，所述N端RBCC结构域为50-418区域，所述PxVxL区域为470-501区域。
4.根据权利要求3所述的TRIM28蛋白截短体，其特征在于，上游引物序列为：5’-ACCAACTCCACTGGCGGCAGCGGCAGCGGCAGCCGG TCCCGCTCAGGT-3’，下游引物序列为：5’-ACCTGAGCGGGACCGGCTGCCGCTGCCGCTGCCGCCAGTGGAGTTGGT-3’。
5.根据权利要求4所述的TRIM28蛋白截短体，其特征在于，所述的TRIM28蛋白截短体采用PCR反应获取，反应体系包括以下组分：上游引物0.8 μL、下游引物0.8 μL、模板0.5 μL、2×Phanta Master Mix 15 μL、dNTP1.5 μL、DMSO1.5 μL、ddH2O9.9 μL；所述模板为SUMO-TRIM28，SUMO-TRIM28选定区域为50-501。
6.根据权利要求5所述的TRIM28蛋白截短体，其特征在于，PCR反应扩增的过程为：95℃预变性5min，95℃变性30s，55℃退火30s，68℃延伸7 min，19次循环，68℃后延伸10min，4℃维持。
7.一种TRIM28蛋白突变体，其特征在于，氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示。
8.根据权利要求7所述的TRIM28蛋白突变体，其特征在于，所述的TRIM28蛋白突变体由权利要求1-6任意一项所述的TRIM28蛋白截短体的R184与V185位点分别突变为R184A、V185D而获取。
9.根据权利要求8所述的TRIM28蛋白突变体，其特征在于，上游引物为：GTGGAGGCGCACCAGCGGGTGAAGTACACCAAGGAC，下游引物为：GTCCTTGGTGTACTTCACCCGCTGGTGCGCCTCCAC。
10.一种乳腺癌标记物筛查的试剂盒，其特征在于，包括质控品和校准品，所述质控品和所述校准品中均分别包括权利要求1-6任意一项所述的TRIM28蛋白截短体和/或权利要求7-9任意一项所述的TRIM28蛋白突变体。
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