CN116773811B - Brca2截断蛋白在肺癌筛查中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及BRCA2截断蛋白在肺癌筛查中的应用。具体地，本发明提供了Anti‑BRCA2的检测试剂的用途，所述的检测试剂为BRCA2截断蛋白。本发明的截断蛋白对Anti‑BRCA2具有高亲和力，在肺癌检测中具有高灵敏度和高特异性，从而有助于更准确、更早期地进行肺癌的诊断。
Description
技术领域
本发明涉及体外诊断试剂领域，具体涉及BRCA2截断蛋白在肺癌筛查中的应用。
背景技术
肺癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一，其发病率和死亡率呈逐年上升趋势，目前发病率居世界首位，严重威胁着人类健康和生命。
肺癌是一种善于隐匿的疾病，经常在疾病发展到晚期才表现出临床症状，70～80％的肺癌患者在诊断出患有肺癌症状时已是中、晚期，癌细胞已经扩散，错过了最佳治愈时机，五年生存率低。对于早期的肺癌患者，经过及时治疗可大大提高患者的5年及以上生存率和生存质量。因此肺癌的早期诊断和进行有效的筛查至关重要。
因此，本领域迫切需要开发新的可用于肺癌早期诊断或筛查的生物标志物、检测试剂和检测技术。
发明内容
本发明的目的就是提供新的用于肺癌早期诊断或筛查的生物标志物、检测试剂和检测技术。
在本发明的第一方面，提供了一种Anti-BRCA2的检测试剂的用途，用于制备一检测剂/试剂盒，所述检测剂/试剂盒用于检测肺癌；其中，所述的检测试剂为BRCA2截断蛋白。
在另一优选例中，所述的截断蛋白为非全长蛋白。
在另一优选例中，所述的BRCA2截断蛋白长度L1与BRCA2全长蛋白长度L0之比≦1/2，较佳地≦1/3，更佳地≦1/4。
在另一优选例中，所述的检测试剂包括一种或多种BRCA2截断蛋白。
在另一优选例中，所述的BRCA2截断蛋白含有SEQ ID No:2中以下片段：第1-637位、第1500-1908位、第1700-1741位、第1720-1770位、第3160-3418位、第1700-1800位、第1700-1838位、第2279-3418位、或第2840-3418位。
在另一优选例中，所述的BRCA2截断蛋白含有SEQ ID No:2中以下片段：第1720-1770位、第3160-3418位、第1700-1800位、或第1700-1838位。
在另一优选例中，所述的BRCA2截断蛋白含有SEQ ID No:2中第Z1位至ZN位的片段，其中Z1为1700-1720位中任一正整数，ZN为1770-1838位中任一正整数。
在另一优选例中，所述的BRCA2截断蛋白选自下组：
(Y1)截断蛋白6，其氨基酸序列为BRCA2蛋白第1720-1770位氨基酸；
(Y2)截断蛋白9，其氨基酸序列为BRCA2蛋白第3160-3418位氨基酸；
(Y3)截断蛋白3，其氨基酸序列为BRCA2蛋白第1700-1800位氨基酸；
(Y4)截断蛋白4，其氨基酸序列为BRCA2蛋白第1700-1838位氨基酸；
(Y5)上述Y1～Y4的任意组合；
其中，BRCA2蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No:2所示。
在另一优选例中，并且所述截断蛋白包括：
(Y2)截断蛋白9，其氨基酸序列为BRCA2蛋白第3160-3418位氨基酸；和
(Ya)选自下组的任一截断蛋白、或其组合：
(Y1)截断蛋白6，其氨基酸序列为BRCA2蛋白第1720-1770位氨基酸；
(Y3)截断蛋白3，其氨基酸序列为BRCA2蛋白第1700-1800位氨基酸；
(Y4)截断蛋白4，其氨基酸序列为BRCA2蛋白第1700-1838位氨基酸。
在另一优选例中，所述的BRCA2截断蛋白包括：(Y2)截断蛋白9，其氨基酸序列为BRCA2蛋白第3160-3418位氨基酸；和(Y1)截断蛋白6，其氨基酸序列为BRCA2蛋白第1720-1770位氨基酸。
在另一优选例中，所述的检测肺癌是检测待测样品中的Anti-BRCA2的水平。
在另一优选例中，所述的待测样品包括：血液样品、血浆样品和血清样品。
在另一优选例中，所述的肺癌患者是Anti-BRCA2抗体阳性患者。
在另一优选例中，所述的肺癌患者是男性患者或女性患者。
在另一优选例中，所述的检测试剂盒含有一说明书，所述说明书记载了检测方法。
在本发明的第二方面，提供了一种分离的人BRCA2截断蛋白，所述截断蛋白选自下组：
(A1)具有SEQ ID NO:2氨基酸序列的第1720-1770位氨基酸的多肽；
(A2)具有SEQ ID NO:2氨基酸序列的第3160-3418位氨基酸的多肽；
(A3)具有SEQ ID NO:2氨基酸序列的第1700-1800位氨基酸的多肽；
(A4)具有SEQ ID NO:2氨基酸序列的第1700-1838位氨基酸的多肽。
在另一优选例中，其特征在于，所述截断蛋白是具有SEQ ID NO:1氨基酸序列的第1720-1770位氨基酸的多肽。
在本发明的第三方面，提供了一种分离的多核苷酸，其包含一核苷酸序列，所述核苷酸序列选自下组：
(a)编码如本发明第二方面所述截断蛋白的多核苷酸；
(b)与多核苷酸(a)互补的多核苷酸。
在另一优选例中，其特征在于，所述多核苷酸编码选自下组的多肽：
(A1)具有SEQ ID NO:2氨基酸序列的第1720-1770位氨基酸的多肽；
(A2)具有SEQ ID NO:2氨基酸序列的第3160-3418位氨基酸的多肽；
(A3)具有SEQ ID NO:2氨基酸序列的第1700-1800位氨基酸的多肽；
(A4)具有SEQ ID NO:2氨基酸序列的第1700-1838位氨基酸的多肽。
在另一优选例中，所述多核苷酸的序列为SEQ ID No:1中相应的编码序列。
在本发明的第四方面，提供了一种载体，它含有本发明第三方面所述的多核苷酸。
在本发明的第五方面，提供了一种遗传工程化的宿主细胞，它含有本发明第四方面所述的载体，或者基因组中整合有本发明第三方面所述的多核苷酸。
在另一优选例中，所述的宿主细胞为原核细胞或真核细胞。
在另一优选例中，所述的宿主细胞为大肠杆菌或酵母。
在本发明的第六方面，提供了一种BRCA2截断蛋白的制备方法，该方法包含：
(a)在适合表达的条件下，培养本发明第五方面所述的宿主细胞；
(b)从培养物中分离出所述的BRCA2截断蛋白。
在本发明的第七方面，提供了一种试剂盒，所述的试剂盒含有：
(a)第一容器，以及位于第一容器中的Anti-BRCA2的检测试剂，所述的检测试剂为BRCA2截断蛋白；
(b)一说明书，所述说明书记载了检测方法。
在另一优选例中，所述检测方法是检测待测样品中的Anti-BRCA2抗体的水平，并用于肺癌的早期筛查或辅助性诊断。
在另一优选例中，所述的待测样品包括：血液样品、血浆样品和血清样品。
在另一优选例中，所述的BRCA2截断蛋白选自下组：
(Y1)截断蛋白6，其氨基酸序列为BRCA2蛋白第1720-1770位氨基酸；和/或
(Y2)截断蛋白9，其氨基酸序列为BRCA2蛋白第3160-3418位氨基酸。
在本发明的第八方面，提供了一种用于肺癌检测的检测试剂，
所述的检测试剂为BRCA2截断蛋白，并且所述的BRCA2截断蛋白包括：
(Y2)截断蛋白9，其氨基酸序列为BRCA2蛋白第3160-3418位氨基酸；和
(Ya)选自下组的任一截断蛋白、或其组合：
(Y1)截断蛋白6，其氨基酸序列为BRCA2蛋白第1720-1770位氨基酸；
(Y3)截断蛋白3，其氨基酸序列为BRCA2蛋白第1700-1800位氨基酸；
(Y4)截断蛋白4，其氨基酸序列为BRCA2蛋白第1700-1838位氨基酸。
在另一优选例中，所述的BRCA2截断蛋白包括：(Y2)截断蛋白9，其氨基酸序列为BRCA2蛋白第3160-3418位氨基酸；和(Y1)截断蛋白6，其氨基酸序列为BRCA2蛋白第1720-1770位氨基酸。
在本发明的第九方面，提供了一种本发明第七方面所述的试剂盒或本发明第八方面所述检测试剂的用途，其特征在于，用于制备试剂盒，所述试剂盒用于通过检测待测样品中的Anti-BRCA2的水平对肺癌进行早期筛查或辅助性诊断。
在另一优选例中，所述的待测样品包括：血液样品、血浆样品和血清样品。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1显示了BRCA2自身抗体的截断位点。
图2显示了本发明的多种BRCA2的截断蛋白与健康、良性、或肺癌三类人群的血清进行反应后得到的散点图。其中，图2A显示了BRCA2截断蛋白1-637、1500-1908、1700-1800和1700-1838的散点图；图2B显示了BRCA2截断蛋白1700-1741、1720-1770、2279-3418、2840-3418和3160-3418的散点图。
图3显示了在肺癌血清中显著升高且抗原表位活性较强的四个BRCA2片段(1700-1800、1700-1838、1720-1770和3160-3418)的受试者工作曲线(receiver operatingcharacteristic curve，简称ROC曲线)。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入的研究，通过大量筛选，意外地开发了能与肺癌患者的针对BRCA2的自身抗体(Anti-BRCA2)有高特异性结合的BRCA2截断蛋白。本发明的截断蛋白不仅氨基酸序列更短、分子量更小，并且可与血清中的Anti-BRCA2抗体有高特异性的亲和力，而且与血液或血清中其他抗体没有或基本上没有交叉反应，因此可显著改善肺癌的诊断和筛查的敏感性和特异性。在此基础上完成了本发明。
实验表明，本发明的多种BRCA2截断蛋白(如BRCA2截断蛋白1700-1800、1700-1838、1720-1770和3160-3418)，可在早期更有效和更灵敏地检测出血清样本的Anti-BRCA2，从而于肺癌的早期筛查和辅助诊断。
术语
如本文所用，术语“含有”、“包括”可以是开放的、封闭式的、或半封闭式的。因此所述术语也可以包括“由…构成”或“基本由…构成”。
自身抗体
自身抗体是指机体对自身器官、细胞或细胞成分产生的抗体。
目前，某些蛋白的自身抗体已经成为肺癌的标记物，如针对以下蛋白的自身抗体：p53、NY-ESO-1、CYFRA等。
如本文所用，术语“Anti-BRCA2”、“BRCA2的自身抗体”可互换使用，指一个对象(如人)中产生针对BRCA2的自身抗体。应理解，Anti-BRCA2通常包括多种不同的Anti-BRCA2，这些不同的Anti-BRCA2往往针对不同的结合位点。
本发明的研究表明，在某些肺癌患者的血液中，存在针对BRCA2的自身抗体(Anti-BRCA2抗体)，这些自身抗体可作为检测肺癌的生物标志物。进一步地，本发明人还意外地发现，BRCA2的某些截断蛋白可以与血液样品中的这些Anti-BRCA2高特异性和高亲和力结合，因此特别适合用于肺癌早期筛查和辅助诊断。
人乳腺癌易感基因2(BRCA2)及蛋白
如本文所用，术语“BRCA2蛋白”、“BRCA2多肽”可互换使用，都指具有人乳腺癌易感蛋白BRCA2氨基酸序列(SEQ ID NO:2)的蛋白或多肽。
如本文所用，术语“BRCA2截断蛋白”、或“BRCA2截断多肽”、“BRCA2截断体”、或“BRCA2截短体”、“BRCA2截短突变体(truncated mutant)”可互换使用，指对乳腺癌易感蛋白BRCA2的氨基酸序列进行截断所形成的多肽。
人乳腺癌易感基因2(BRCA2)，为具有遗传倾向的乳腺癌和卵巢癌的易感基因，其突变形式可导致这些癌症的发生风险升高。BRCA2基因位于第13号染色体13q12.3位置，全长84,193bp，其mRNA长11,386nt，共有27个外显子，编码3418个氨基酸残基组成的蛋白质(UniProtKB数据库中的序列号为P51587)。
人BRCA2核苷酸序列和氨基酸序列分别如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示。
本发明的截断蛋白
如本文所用，“本发明的截断蛋白”、“本发明的截断多肽”、“本发明多肽”可互换使用，是对BRCA2的氨基酸序列进行截断所形成的多肽，所述多肽可与肺癌患者血液中的Anti-BRCA2发生抗原－抗体反应，从而用于定性或定量检测待测样品中的Anti-BRCA2。
如本文所用，“本发明的截断蛋白”不包括天然蛋白。且
如本文所用，术语“BRCA2截断蛋白1700-1800”指对BRCA2蛋白的氨基酸序列进行截断后，由第1700-1800位氨基酸序列所形成的截断蛋白。“BRCA2截断蛋白1700-1838”、“BRCA2截断蛋白1720-1770”和“BRCA2截断蛋白3160-3418”等的含义类似。
在本发明中，合适的待测样品是血液样品或任何来自于血液且含有血液中抗体成分的样品。代表性的待测样品包括(但并不限于)：血液样品、血浆样品和血清样品。
如本文所用，“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸和多肽是没有分离纯化的，但同样的多聚核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。
如本文所用，“分离的本发明多肽”是指本发明的BRCA2截断蛋白基本上不含天然与其相关的其它蛋白、脂类、糖类或其它物质。本领域的技术人员能用标准的蛋白质纯化技术纯化本发明多肽。基本上纯的多肽在非还原聚丙烯酰胺凝胶上能产生单一的主带。
本发明的多肽可以是重组多肽、合成多肽，优选重组多肽。本发明的多肽可以是化学合成的产物(如采用肽合成技术制备的)，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。根据重组生产方案所用的宿主，本发明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本发明的多肽还可包括或不包括起始的甲硫氨酸残基。
本发明还包括本发明BRCA2截断蛋白的片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明BRCA2截断蛋白相同的与Anti-BRCA2结合的活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(iii)成熟多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列)。根据本文的教导，这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。
在本发明中，“BRCA2截断蛋白”还包括具有与本发明BRCA2截断蛋白相同的与Anti-BRCA2结合功能的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：一个或多个(通常为1-30个，较佳地1-25个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，用少量性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变本发明BRCA2截断蛋白与Anti-BRCA2的结合功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变本发明BRCA2截断蛋白与Anti-BRCA2的结合活性。
本发明还提供BRCA2截断蛋白的类似物。这些类似物与本发明BRCA2截断蛋白的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。
修饰(通常不改变一级结构)形式包括：体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的多肽。这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。
在本发明中，“BRCA2截断蛋白的保守性变异多肽”指与相应的BRCA2截断蛋白的氨基酸序列(以SEQ ID NO:2中第3160-3418位或1720-1770位的序列为例，其他BRCA2截断蛋白类似)相比，有至多8个，更佳地至多5个，最佳地至多3个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表1进行氨基酸替换而产生。
表1
本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。如本文所用，“简并的变异体”在本发明中是指编码具有BRCA2截断蛋白，但与野生型的人BRCA2的编码区序列有差别的核酸序列。
术语“编码多肽的多核苷酸”可以是包括编码此多肽的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。
本发明还涉及与上述的序列杂交的核酸片段。如本文所用，“核酸片段”的长度至少含15个核苷酸，较好是至少30个核苷酸，更好是至少50个核苷酸，最好是至少100个核苷酸以上。核酸片段可用于核酸的扩增技术(如PCR)以获得和/或分离编码本发明BRCA2截断蛋白的多聚核苷酸。
本发明中的多肽和多核苷酸优选以分离的形式提供，更佳地被纯化至均质。
本发明的BRCA2截断蛋白的核苷酸序列通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA样本作为模板，扩增而得有关序列。
一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。
此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。
目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。
应用PCR技术扩增DNA/RNA的方法，被优选用于获得本发明的基因。用于PCR的引物可根据本文所公开的本发明的序列信息适当地选择，并可用常规方法合成。可用常规方法如通过凝胶电泳分离和纯化扩增的DNA/RNA片段。
本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体，以及用本发明的载体或BRCA2截断蛋白编码序列经基因工程产生的宿主细胞，以及经重组技术产生本发明所述多肽的方法。
通过常规的重组DNA技术，可利用本发明的多聚核苷酸序列可用来表达或生产重组的BRCA2截断蛋白。一般来说有以下步骤：
(1).用本发明的编码人BRCA2截断蛋白的多核苷酸(或变异体)，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；
(2).在合适的培养基中培养的宿主细胞；
(3).从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。
本发明中，编码BRCA2截断蛋白的多核苷酸序列可插入到重组表达载体中。术语“重组表达载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒如腺病毒、逆转录病毒或其他载体。在本发明中适用的载体包括但不限于：在细菌中表达的基于T7的表达载体(Rosenberg,et al.Gene,1987,56：125)；在哺乳动物细胞中表达的pMSXND表达载体(Lee and Nathans,J Bio Chem.263：3521,1988)和在昆虫细胞中表达的来源于杆状病毒的载体。总之，只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。
本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含BRCA2截断蛋白的编码DNA序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等(Sambroook,et al.Molecular Cloning,aLaboratory Manual,cold SpringHarbor Laboratory.New York,1989)。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。这些启动子的代表性例子有：大肠杆菌的lac或trp启动子；λ噬菌体PL启动子；真核启动子包括CMV立即早期启动子、HSV胸苷激酶启动子、早期和晚期SV40启动子、反转录病毒的LTRs和其他一些已知的可控制基因在原核或真核细胞或其病毒中表达的启动子。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。
此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性以及绿色荧光蛋白(GFP)，或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性。
包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。
宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属；鼠伤寒沙门氏菌的细菌细胞；真菌细胞如酵母；植物细胞；果蝇S2或Sf9的昆虫细胞；CHO、COS、293细胞、或Bowes黑素瘤细胞的动物细胞等。
本发明的多核苷酸在高等真核细胞中表达时，如果在载体中插入增强子序列时将会使转录得到增强。增强子是DNA的顺式作用因子，通常大约有10到300个碱基对，作用于启动子以增强基因的转录。可举的例子包括在复制起始点晚期一侧的100到270个碱基对的SV40增强子、在复制起始点晚期一侧的多瘤增强子以及腺病毒增强子等。
本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体、启动子、增强子和宿主细胞。
用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl2法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl2。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。
获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。
在上面的方法中的重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。
诊断应用
本发明BRCA2截断蛋白或多肽有多方面的用途。这些用途包括(但不限于)：检测血液样品中是否存在Anti-BRCA2，从而提供早期诊断或辅助性诊断肺癌的有用信息。
本发明还涉及定量或定性检测Anti-BRCA2水平的诊断试验方法。这些试验是本领域所熟知的。
一种检测检测样品中是否存在Anti-BRCA2的方法是利用BRCA2截断蛋白与Anti-BRCA2的特异性结合进行检测。典型地，该方法包括：将样品(如血浆或血清样品)与BRCA2截断蛋白接触；观察是否形成抗体复合物，形成了抗体复合物就表示样品中存在Anti-BRCA2。
用于诊断的检测剂和试剂盒
本发明还提供了用于早期或辅助性诊断肺癌的检测剂和试剂盒，其包括本发明的一种或多种BRCA2截断蛋白作为检测试剂。
本发明的主要优点包括：
(a)本发明截断蛋白与肺癌患者血液样本中的Anti-BRCA2具有高亲和力。
(b)本发明截断蛋白与血液样品的其他无关抗体几乎无结合，可减少非特异性的交叉反应，提高检测的信噪比、特异性和准确性。
(c)本发明截断蛋白可高灵敏度地检测血液样本中的Anti-BRCA2。(d)本发明的截断蛋白的序列短，可通过重组或多肽合成进行制备大规模制备。
(e)通过本发明所述的截断蛋白进行肺癌的诊断或检测，仅需要通过血清或血浆样本进行，无需取组织样品进行检测，避免了患者对该类检测的抗拒性，有助于发现早期肺癌患者，延长患者生存周期和提升生活质量，具有很高的临床应用前景。
(f)本发明所述的BRCA2蛋白的截断蛋白在肺癌患者血清中能引发比BRCA2蛋白更明显的抗原-抗体反应，尤其位于BRCA2分子的全长中部和羧基端的截断蛋白对肺癌血清具有较高的筛查能力。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。
实施例1
BRCA2的截断蛋白的设计
在本实施例中，基于人BRCA2蛋白的序列，本发明设计了一系列BRCA2的候选截断蛋白，候选截断位点如图1。
人BRCA2的核酸序列如SEQ ID NO：1所示，氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。一些代表性的二级结构如表1所示。
表1二级结构
| 位置(基于SEQ ID No:2) | 二级结构 |
| 31-35 | Helix |
| 203-206 | Beta strand |
| 1228-1230 | Beta strand |
| 1231-1241 | Helix |
| 1520-1522 | Helix |
| 1536-1541 | Helix |
| 1542-1546 | Turn |
| 2300-2302 | Beta strand |
| 2311-2314 | Helix |
| 2315-2317 | Beta strand |
在本实施例中，各BRCA2的候选截断蛋白用其起始和终止的氨基酸的位数进行表示，如表2所示。
表2 BRCA2截断蛋白
实施例2
BRCA2截断抗原蛋白的制备方法
在本实施例中，基于实施例1中各截断抗原蛋白的结构，通过重组方法，制备各BRCA2截断蛋白。制备方法包括以下步骤：
(1)表达BRCA2截断蛋白的重组质粒构建
通过PCR法，制备肺癌抗原BRCA2截断蛋白的核苷酸序列，一系列的BRCA2截断蛋白的编码序列对应表2中所示的BRCA2截断蛋白1至BRCA2截断蛋白9的9种截断蛋白。
提取质粒载体含6XHis标记的PET28(a)，用Ncol和Ndel双酶切，电泳后胶回收双酶切的质粒片段；用Ncol和Ndel双酶切BRCA2截断蛋白基因片段，电泳回收双酶切的基因片段，-20℃放置备用；将双酶切的质粒片段和双酶切的基因片段按1:3-10比例，用T4连接酶16℃过夜连接，连接后的重组质粒为PET28(a)-BRCA2(1-637)，PET28(a)-BRCA2(1500-1908)，PET28(a)-BRCA2(1700-1800)，PET28(a)-BRCA2(1700-1838)，PET28(a)-BRCA2(1700-1741)，PET28(a)-BRCA2(1720-1770)，PET28(a)-BRCA2(2279-3418)，PET28(a)-BRCA2(2840-3418)，PET28(a)-BRCA2(3160-3418)。
(2)重组质粒的筛选和鉴定
将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)，涂布含氨苄青霉素(60ug/ml)的LB平板上，37℃恒温培养箱过夜；次日随机挑取重组质粒转化菌落和对照菌落(空载PGEM-5zf质粒转化菌)，分别提取质粒，用Ndel和Ncol双酶切，酶切后跑电泳，均能看见相应的目的片段和载体，构建表达载体成功，即为阳性表达菌。
(3)重组蛋白工程菌高效表达
将阳性表达菌接种至2ml LB培养基(60ug/ml氨苄青霉素)的试管中，37℃恒温摇床振荡4h，加终浓度为0.5mmol/l IPTG，37℃继续诱导6h，离心收集沉淀菌体，将沉淀菌体进行破碎，取上清和沉淀分别进行SDS-PAGE检测，上清中得到表达的目的蛋白。
(4)表达蛋白的纯化
挑选高效表达的重组蛋白工程菌单菌落，接种到含100ml LB液体培养基的三角瓶中，加氨苄青霉素至终浓度60ug/ml，置37℃摇床内过夜。次日按菌液和LB培养基1:10接种至1000ml LB(氨苄青霉素60ug/ml)培养液的三角瓶中，培养4h，加IPTG(终浓度为0.5mmol/l)，37℃条件下继续诱导6h，将诱导表达融合蛋白的1000ml工程菌离心，高速(10000rpm)低温(4℃)离心10min，将沉淀的菌体重悬于原离心体积的1/10裂解液(50mM Tris-Hcl、10mMEDTA、15mM NaCL、10mM DTT)内，冰浴超声菌体，高速(12000rpm)低温(4℃)离心30min，收集菌液上清。
用平衡液(20mM PB PH7.4)冲洗平衡镍离子亲和层析柱后，将超声收集的菌液上清直接上柱，上样流速1.5ml/min，上样结束后用平衡液洗涤柱子，依次用含20、50、100、200、500mM浓度咪唑的洗脱液洗脱蛋白，收集各洗脱峰蛋白，SDS-PAGE电泳检测各峰蛋白。
结果表明，分别制备了高纯度的以下重组蛋白：截断蛋白1、截断蛋白2、截断蛋白3、截断蛋白4、截断蛋白5、截断蛋白6、截断蛋白7、截断蛋白8和截断蛋白9。
实施例3
BRCA2的截断蛋白1700-1800、1700-1838、1720-1770和3160-3418具有良好的肺癌检测特异性
将实施例2制备的纯化的各重组蛋白，用碳酸盐缓冲液(50mM，PH9.6)稀释后100ul/孔、100ng/孔的蛋白量包被酶联板，4℃过夜。洗涤后加200ul/孔10％小牛血清的PBS37℃封闭2h，洗涤后4℃备用。
间接酶联免疫法检测人群包括肺癌患者47例，良性肺部疾病患者25例(包括慢阻肺、肺结核、肺炎、尘肺等)，以及与肺癌病例年龄相匹配的健康对照20例。肺癌患者的基本信息如表3所示。
表3
| 肺癌患者(n＝47) | |
| 年龄范围 | 31～81 |
| 年龄均值 | 59 |
| 性别男 | 23 |
| 女 | 24 |
根据华中科技大学同济医学院李军川等人的研究，BRCA2在非小细胞肺癌的组织样本中，有35.7％的阳性检出率，可以作为非小细胞肺癌恶性特征的一个检测指标，该研究成果发表在《中国组织化学与细胞化学杂志》。根据金陵医院Song等人的团队研究，BRCA2基因在非小细胞肺癌患者中的突变率为4.97％，不同的突变形式对预后情况产生不同的影响，并且BRCA2的突变和高表达都会使机体产生自身抗体，该研究的成果发表在《胸科肿瘤学杂志》(Journal of Thoracic Oncology)。
间接酶联免疫法检测肺癌患者(47例)、良性肺病患者(25例，包括慢阻肺、肺结核、肺炎、尘肺等)及健康人(20例)血清中BRCA2自身抗体的反应性。
血清或血浆样本用磷酸盐缓冲稀释1:110倍，加入微孔进行反应(50毫升/孔)。用洗液冲洗未结合的血清或血浆成分后，每孔加入辣根过氧化物酶(HRP)偶联的抗-人IgG进行反应。然后加入反应底物TMB(3,3',5,5'-四甲基联苯胺)进行显色。加入终止溶液(1NHCl)，吸光度为450nm单光谱进行酶标仪进行读值(OD)。
结果如图2和表4所示。每种BRCA2的截断蛋白分别经过健康、良性、肺癌三类人群的血清反应后，得到如图2所示的散点图，这些截断蛋白普遍在肺癌患者血清中引发更明显的抗原-抗体反应，即OD值在肺癌组出现升高趋势。
表4(OD值)
| 健康 | 良性 | 肺癌 | Cutoff | |
| 1-637 | 0.21 | 0.25 | 0.29 | 0.4 |
| 1500-1908 | 0.29 | 0.25 | 0.29 | 0.6 |
| 1700-1800 | 0.33 | 0.26 | 0.55 | 1 |
| 1700-1838 | 0.34 | 0.31 | 0.67 | 1 |
| 1700-1741 | 0.61 | 0.61 | 0.73 | 2.3 |
| 1720-1770 | 0.22 | 0.36 | 0.50 | 0.8 |
| 2279-3418 | 0.25 | 0.32 | 0.26 | 0.6 |
| 2840-3418 | 0.44 | 0.42 | 0.57 | 1.6 |
| 3160-3418 | 0.18 | 0.17 | 0.26 | 0.4 |
此外，Kruskal-Wallis检验表明，BRCA2的截断蛋白1700-1800(P＝0.0356)、1700-1838(P＝0.0270)、1720-1770(P＝0.0012)、3160-3418(P＝0.0417)在肺癌患者血清得到的OD信号上升结果，具有统计学意义(P<0.05)。BRCA2的自身抗体在肺癌患者血清中的水平显著高于健康人群和肺部良性疾病患者。
上述结果表明，本发明的上述截断蛋白与肺癌血清的反应性良好，而与健康和良性人群反应微弱，证明它们具备良好的特异性，可用于肺癌的早期筛查和辅助性诊断。
实施例4
BRCA2截断蛋白1700-1800、1700-1838、1720-1770和3160-3418对肺癌血清的筛查能力评估
本发明人利用受试者工作特征曲线(ROC)分析在肺癌血清中显著升高且抗原表位活性较强的四个BRCA2截断蛋白(或BRCA2片段)：1700-1800、1700-1838、1720-1770和3160-3418。
分析结果如图3所示。
以健康人群作对照，ROC曲线的约登指数最大时，BRCA2各片段的检测性能如表5所示。
表5
| BRCA2片段 | 敏感性(％) | 特异性(％) | 曲线下面积(AUC) |
| 1700-1800 | 23.40 | 95.00 | 0.6202 |
| 1700-1838 | 31.91 | 90.00 | 0.6346 |
| 1720-1770 | 46.67 | 90.00 | 0.7367 |
| 3160-3418 | 27.66 | 94.74 | 0.6338 |
以良性患者作对照，ROC曲线的约登指数最大时，BRCA2各片段的检测性能如表6所示。
表6
| BRCA2片段 | 敏感性(％) | 特异性(％) | 曲线下面积(AUC) |
| 1700-1800 | 29.79 | 92.00 | 0.6766 |
| 1700-1838 | 34.04 | 96.00 | 0.6791 |
| 1720-1770 | 33.33 | 100.0 | 0.7222 |
| 3160-3418 | 25.53 | 92.00 | 0.6651 |
上述结果表明，四种优选的BRCA2截断蛋白(或BRCA2片段)：1700-1800、1700-1838、1720-1770和3160-3418可用作早期诊断或辅助诊断肺癌的检测试剂，用于定量或定性检测患者血液样品中的Anti-BRCA2。
此外，根据图3中各曲线下面积结果，结合敏感性和特异性分析可知：无论以健康人群作为对照还是以良性患者作为对照，BRCA2分子位于全长中部(即1700-1838位，尤其是1720-1770的核心区段)和羧基端的抗原表位(即3160-3418位)可用于肺癌血清的筛查和肺癌的辅助诊断。
讨论
BRCA2蛋白为一种肿瘤抑制因子，这种保护性蛋白通过同源重组及部分调节Rad51蛋白因子的活性参与双链DNA损伤的修复，从而阻止癌细胞的生长和发育。
在肺癌研究中，发现BRCA2第3326位赖氨酸发生突变与小细胞肺癌的发生有相关性(Rafnar T,Sigurjonsdottir GR,Stacey SN,et al.,Association of BRCA2K3326*With Small Cell Lung Cancer and Squamous Cell Cancer of the Skin.JNatl CancerInst.2018Sep 1；110(9):967-974.doi:10.1093/jnci/djy002.PMID:29767749；PMCID：PMC6136924.)。
有回顾性研究显示，BRCA2基因的mRNA和蛋白表达异常发生在肺腺癌中，其启动子高甲基化是该基因失调的主要机制。BRCA2的表达异常使DNA双链断裂修复途径发生改变，可能伴随着与p53和RB蛋白的相互作用失调。这种机制在部分非小细胞肺癌的发病过程中起重要作用(Lee MN,Tseng RC,Hsu HS,Chen JY,Tzao C,Ho WL,Wang YC.Epigeneticinactivation of the chromosomal stability control genes BRCA1,BRCA2,andXRCC5in non-small cell lung cancer.Clin Cancer Res.2007Feb 1；13(3):832-8.doi:10.1158/1078-0432.CCR-05-2694.PMID:17289874.)。
在肺癌模型中，BRCA2的表达水平可以受到非编码RNA的调控，Hsa_circ_0046264可以通过RNA干扰现象降低hsa-miR-1245的水平，这样实现BRCA2蛋白水平上升来抑制肿瘤生长(Yang L,Wang J,Fan Y,Yu K,Jiao B,Su X.Hsa_circ_0046264up-regulatedBRCA2to suppress lung cancer through targeting hsa-miR-1245.RespirRes.2018Jun 11；19(1):115.doi:10.1186/s12931-018-0819-7.PMID:29891014；PMCID:PMC5996480.)。
关于BRCA2自身抗体的报道多出现于乳腺癌检测的研究中，在本发明之前，尚未见其在肺癌研究中的相关报道，也未见其与肺癌相关的现有技术。
本发明人研究意外发现，BRCA2是一个肺癌相关的自身抗原，并且在肺癌患者的血液中存在Anti-BRCA2。
由于BRCA2分子量较大，以全长状态进行原核细胞表达的产量低；并且全长状态下很多抗原表位难以在原核细胞表达体系的产物中充分暴露，所以将这样的蛋白产物用于肺癌筛查势必活性较低；然而原核表达体系仍旧是目前最为经济和高效的生物反应器；其次，人体免疫系统在日常生活中会接触大量的抗原分子，它们难免存在与肺癌相关抗原近似的活性表位，这样会引起自身抗体对肺癌抗原和其它抗原的交叉反应，降低肺癌筛查的特异性，而将肺癌抗原进行截断表达以减少其抗原表位的复杂程度，则大幅减少发生交叉反应的概率。
本发明人将BRCA2蛋白进行截断并进行筛选，意外地发现，所形成的一些特定截断蛋白与Anti-BRCA2具有高亲和力、高特异性的结合。本发明BRCA2截断蛋白具有高免疫原性的活性表位，可显著改善肺癌筛查的灵敏性，同时减少非特异性的交叉反应，提高检测的信噪比、特异性和准确性。
本发明的截断蛋白片段易于重组表达或多肽合成，尤其在原核表达体系中可获得高产量，便于大规模生产。
肺癌早期筛查对于提示。本发明BRCA2截断蛋白可用于肺癌的筛查(尤其是早期筛查)，特别适合用于对那些没有肺癌相关症状的人群进行常规筛查，可以在出现症状前尽早发现肺癌，从而更早地提示临床医生对患者采取相关后续诊断或采取相应的治疗措施或者决策。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
Claims (9)
1.一种Anti-BRCA2的检测试剂的用途，其特征在于，用于制备一检测试剂/试剂盒，所述检测试剂/试剂盒用于肺癌的筛查或辅助性诊断；其中，所述的检测试剂为BRCA2截断蛋白，
其中，所述的BRCA2截断蛋白包括：
(Y1)截断蛋白6，其氨基酸序列为BRCA2蛋白第1720-1770位氨基酸；
其中，BRCA2蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No:2所示。
2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的BRCA2截断蛋白还包括选自下组的截断蛋白：
(Y2)截断蛋白9，其氨基酸序列为BRCA2蛋白第3160-3418位氨基酸；
(Y3)截断蛋白3，其氨基酸序列为BRCA2蛋白第1700-1800位氨基酸；
(Y4)截断蛋白4，其氨基酸序列为BRCA2蛋白第1700-1838位氨基酸。
3.如权利要求2所述的用途，其特征在于，所述的BRCA2截断蛋白为重组多肽。
4.如权利要求2所述的用途，其特征在于，所述的BRCA2截断蛋白包括：
(Y1)截断蛋白6，其氨基酸序列为BRCA2蛋白第1720-1770位氨基酸；和
选自下组的任一截断蛋白、或其组合：
(Y2)截断蛋白9，其氨基酸序列为BRCA2蛋白第3160-3418位氨基酸；
(Y3)截断蛋白3，其氨基酸序列为BRCA2蛋白第1700-1800位氨基酸；
(Y4)截断蛋白4，其氨基酸序列为BRCA2蛋白第1700-1838位氨基酸。
5.如权利要求2所述的用途，其特征在于，所述的BRCA2截断蛋白为以下Y1～Y4的组合：
(Y1)截断蛋白6，其氨基酸序列为BRCA2蛋白第1720-1770位氨基酸；
(Y2)截断蛋白9，其氨基酸序列为BRCA2蛋白第3160-3418位氨基酸；
(Y3)截断蛋白3，其氨基酸序列为BRCA2蛋白第1700-1800位氨基酸；和
(Y4)截断蛋白4，其氨基酸序列为BRCA2蛋白第1700-1838位氨基酸。
6.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述截断蛋白是采用重组技术从原核或真核宿主细胞中产生，所述的宿主细胞为大肠杆菌或酵母。
7.如权利要求6所述的用途，其特征在于，所述宿主细胞为遗传工程化的宿主细胞，它含有一载体，所述载体含有编码所述BRCA2截断蛋白的多核苷酸，或者基因组中整合有编码所述BRCA2截断蛋白的多核苷酸。
8.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的试剂盒含有：
(a)第一容器，以及位于第一容器中的Anti-BRCA2的检测试剂，所述的检测试剂为BRCA2截断蛋白；
(b)一说明书，所述说明书记载了检测方法。
9.如权利要求8所述的用途，其特征在于，所述检测方法是检测待测样品中的Anti-BRCA2抗体的水平，并用于肺癌的筛查或辅助性诊断。
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