CN117143257B - Trim28-krab-znf10二元复合物、制备方法及用于前列腺癌筛查的试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种TRIM28‑KRAB‑ZNF10二元复合物、制备方法及用于前列腺癌筛查的试剂盒，二元复合物由KRAB‑ZNF10蛋白截短体和TRIM28蛋白组装而成；本发明使用分子筛，首次体外组装了TRIM28蛋白与KRAB‑ZNF10蛋白截短体，形成TRIM28‑KRAB‑ZNF10二元复合物，并使用超速离心分析技术分别检测MBP‑KRAB以及二元复合物的分子量，为后续研究DNA序列特异性基因转录抑制的分子机制提供更多理论参考，提高了蛋白稳定性；用于前列腺癌筛查的试剂盒的质控品中包括TRIM28‑KRAB‑ZNF10，提高了试剂稳定性。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种TRIM28-KRAB-ZNF10二元复合物、制备方法及用于前列腺癌筛查的试剂盒。
背景技术
人类有400多种KRAB-ZNF基因，编码700多种不同的蛋白质。KRAB-ZNF家族蛋白含有C2H2锌指DNA结合结构域（ZNFs）的串联拷贝，和保守的KRAB结构域。
目前的研究表明，KRAB-ZNFs可调节多种生命进程，如胚胎发育、组织特异性基因表达和癌症形成与发展。通过分析乳腺癌和肺癌的临床病理数据，证明了KRAB-ZNFs的表达与癌症患者生存率、肿瘤组织学和分子亚型相关。KRAB-ZNFs蛋白家族种保守的KRAB结构域通常是一段无序氨基酸区域，因此它们在空间结构上比较灵活，难以表达。在近期的研究中，筛选出与KRAB-ZNFs存在相互作用的蛋白，KRAB-ZNFs调控的下游靶点，以及KRAB-ZNFs的结构与功能研究是热门研究方向。
前列腺癌(Prostate cancer, PCa)是最为常见的恶性肿瘤之一，因此有必要研发一种稳定的用于前列腺癌的早期筛查的试剂盒。
发明内容
本发明要解决的技术问题在于，针对上述缺陷，提供一种TRIM28-KRAB-ZNF10二元复合物、制备方法及用于前列腺癌筛查的试剂盒。
本发明解决以上技术问题所采取的技术方案如下：一种TRIM28-KRAB-ZNF10二元复合物，由KRAB-ZNF10蛋白截短体和TRIM28蛋白组装而成，所述KRAB-ZNF10蛋白截短体为KRAB-ZNF10蛋白N端KRAB结构域截短体，KRAB结构域截短区域为10-88AA。
进一步地，优选所述TRIM28-KRAB-ZNF10二元复合物中的TRIM28蛋白与KRAB-ZNF10蛋白截短体的分子比例为2:1。
进一步地，优选所述KRAB-ZNF10蛋白截短体的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，所述TRIM28的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示。
本发明还提供一种所述的TRIM28-KRAB-ZNF10二元复合物的制备方法，包括以下步骤：
S1、KRAB-ZNF10蛋白基本信息收集与整理；
S2、根据S1所获得的信息，进行KRAB-ZNF10的蛋白二级结构以及三级结构预测；
S3、KRAB-ZNF10蛋白截短体设计和构建：根据S2预测的结构信息，设计出KRAB-ZNF10蛋白截短体选取区域为N端KRAB结构域10-88AA；
S4、使用大肠杆菌表达KRAB-ZNF10蛋白截短体；
S5、亲和层析纯KRAB-ZNF10蛋白截短体：对S4步骤中的菌液进行亲和层析纯化；
S6、分子筛纯化KRAB-ZNF10蛋白截短体：分别对S5获得的蛋白溶液进行分子筛纯化；
S7、KRAB-ZNF10蛋白截短体和TRIM28蛋白的复合组装：取KRAB-ZNF10蛋白截短体和TRIM28蛋白，并将二者按比例混合冰浴，之后使用分子筛分离纯化目标蛋白复合物。
进一步地，优选在步骤S4中使用大肠杆菌表达KRAB-ZNF10蛋白截短体包括以下步骤：将目的基因片段含有His-MBP标签的pcold-MBP的大肠杆菌质粒，转化至大肠杆菌感受态细胞BL21（DE3）中，在涂布平板后挑选单克隆菌落，接种至LB培养基中于37℃继续扩大培养，取样检测菌液OD600=0.6~0.8时，将菌液冷却至16℃，加入0.4 mM IPTG，并在16℃条件下诱导表达16 h。
进一步地，优选在步骤S4前还包括S40、筛选大肠杆菌表达KRAB-ZNF10蛋白截短体的载体，包括以下步骤：将目的基因片段分别构建至含有His标签的pet-28a、含有GST标签的pGEX-6p-1和含有His-MBP标签的pcold-MBP的大肠杆菌质粒，转化至大肠杆菌感受态细胞BL21（DE3）中，在涂布平板后挑选单克隆菌落，接种至LB培养基中于37℃培养，加入0.4mM IPTG诱导表达4 h，取菌液样品并结合SDS-PAGE电泳分析，比较表达效果，筛选出最优表达载体为pcold-MBP。
进一步地，优选在步骤S5中亲和层析纯化KRAB-ZNF10蛋白截短体包括以下步骤：分别低温离心S4步骤获得的大肠杆菌表达的KRAB-ZNF10蛋白截短体菌液，弃去上清液，使用菌液重悬缓冲液重悬菌体，超声；低温高速离心分离，蛋白上清液中加入Ni2+-NTA亲和纯化介质，在低温条件下旋转孵育使目的蛋白与亲和介质充分结合，用菌液重悬缓冲液多次清洗亲和介质，加入洗脱缓冲液，使目标蛋白流穿并收集, 得到高纯度的KRAB-ZNF10蛋白截短体。
进一步地，优选S5、步骤中的所述重悬缓冲液包括以下组分： 0.02% Triton、150mM 氯化钠、20 mM HEPES和25 mM咪唑；所述重悬缓冲液的pH为 7.5；所述洗脱缓冲液包括以下组分：150 mM 氯化钠、20 mM HEPES、250 mM咪唑，所述洗脱缓冲液的pH 为7.5。
本发明还提供一种用于前列腺癌筛查的试剂盒，包括质控品或标准品，所述质控品或所述标准品中包括TRIM28-KRAB-ZNF10二元复合物。
实施本发明具有以下有益效果：本发明使用分子筛，首次体外组装了TRIM28蛋白与KRAB-ZNF10蛋白截短体形成TRIM28-KRAB-ZNF10二元复合物，并使用超速离心分析技术分别检测MBP-KRAB以及二元复合物的分子量，为后续研究DNA序列特异性基因转录抑制的分子机制提供更多理论参考；ZNF10定位于细胞核，具有转录抑制活性且与多种重要转录因子存在相互作用，能够通过促进G1-S周期的进程及抑制细胞凋亡而促进前列腺癌细胞的生长增殖，TRIM28能够明显促进PCa细胞增殖，并且在前列腺癌中表达上调；本发明将TRIM28蛋白与KRAB-ZNF10蛋白截短体复合形成蛋白复合物，对于调节染色质的形态，发挥DNA序列特异性的基因沉默功能，应对DNA损伤等显得尤为重要；KRAB-ZNF10蛋白与TRIM28蛋白结合不仅能抑制基因转录，也可提高TRIM28蛋白结构的稳定性，防止其过快降解，两者结合协同促进PCa细胞增殖的作用；在用于前列腺癌筛查的试剂盒中质控品或标准品中加入TRIM28-KRAB-ZNF10二元复合物，在不影响免疫活性的条件下，能够提高试剂的稳定性。
附图说明
下面将结合附图及实施例对发明作进一步说明，附图中：
图1为本发明中的一些实施例中的分子筛纯化MBP-KRAB-ZNF10蛋白紫外吸收峰；
图2是本发明一些实施例中分子筛纯化MBP-KRAB-ZNF10蛋白对应的SDS-PAGE电泳图；
图3为本发明的一些实施例中的分子筛组装TRIM28-KRAB-ZNF10二元复合物蛋白吸收峰结果图；
图4是本发明的分子筛组装TRIM28-KRAB-ZNF10二元复合物对应的SDS-PAGE电泳图；
图5为本发明中的一些实施例中的超速离心分析技术检TRIM28-KRAB-ZNF10二元复合物、以及KRAB-ZNF10蛋白截短体、TRIM28蛋白的分子量结果图；
图6本发明中的用于前列腺癌筛查的试剂盒与对比例的稳定性数据结果图。
具体实施方式
为了对本发明的技术特征、目的和效果有更加清楚的理解，下面将结合实施例对本发明做进一步详述，本实施例仅用于解释本发明，并不构成对本发明保护范围的限定。
本发明中所用试剂均为市面上可直接购买的市售制剂，也可采用自制获取。
本发明提供一种TRIM28-KRAB-ZNF10二元复合物，由KRAB-ZNF10蛋白截短体和TRIM28蛋白组装而成，KRAB-ZNF10蛋白截短体为KRAB-ZNF10蛋白N端KRAB结构域（10-88AA）截短体，KRAB结构域截短区域为10-88AA。
在一具体的实施例中，体外重组表达并组装的TRIM28-KRAB二元复合物分子中的TRIM28与KRAB-ZNF10蛋白截短体的分子比例为2:1，也就是说在体外条件下两者之间的组装配比为2:1，以便后续研究体内生理环境下蛋白间的相互作用提供理论基础，为后续研究DNA序列特异性基因转录抑制作用的分子机制提供更多理论参考。
在一具体的实施例中，现有的KRAB-ZNF10蛋白氨基酸序列14-85为KRAB结构域，参与结合TRIM28，而剩余的锌指结构区域参与识别结合特异性DNA序列，且KRAB-ZNFs蛋白家族种保守的KRAB结构域通常是一段无序氨基酸区域，因此它们在空间结构上比较灵活；而本发明中，从KRAB-ZNF10蛋白中截短的区域为KRAB-ZNF10蛋白N端KRAB结构域（10-88AA），即KRAB-ZNF10蛋白截短体为KRAB-ZNF10蛋白N端KRAB结构域（10-88AA）截短体，本发明通过构建KRAB-ZNF10蛋白N端KRAB结构域（10-88AA），使得可使用大肠杆菌进行表达，并且该截短体可与TRIM28进行体外组装。
进一步地，KRAB-ZNF10蛋白截短体的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，DNA序列如SEQ ID NO：2所示；TRIM28的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示，DNA序列如SEQ ID NO：4所示。
本发明还提供一种TRIM28-KRAB-ZNF10二元复合物的制备方法，包括以下步骤：
S1、KRAB-ZNF10蛋白基本信息收集与整理：利用Uniprot数据库检索KRAB-ZNF10，确认其全长氨基酸序列，如SEQ ID NO：1所示，并在GenBank数据库中找到对应的DNA序列，如SEQ ID NO：2所示。使用Expasy-ProtParam网站可以得知蛋白质相应的分子量、等电点等信息。根据Uniprot数据库中的Family&Domain部分的信息可知，KRAB-ZNF10蛋白氨基酸序列14-85为KRAB结构域，参与结合TRIM28，而剩余的锌指结构区域参与识别结合特异性DNA序列。
S2、根据S1所获得的信息，进行KRAB-ZNF10的蛋白二级结构以及三级结构预测：利用PSIPRED网站，输入KRAB-ZNF10蛋白氨基酸序列信息，提交后可以得到蛋白二级结构预测信息。在Uniprot数据库Structure部分可以得到Alphafold预测的蛋白三级结构。
S3、KRAB-ZNF10蛋白截短体设计和构建：根据KRAB-ZNF10蛋白二级结构，三级结构以及蛋白质之间相互作用的预测信息，结合AI算法辅助设计出KRAB-ZNF10蛋白截短体选取区域为N端KRAB结构域（10-88AA）。
S40、筛选大肠杆菌表达KRAB-ZNF10蛋白截短体的载体：将KRAB-ZNF10蛋白截短体基因片段分别构建至含有His标签的pet-28a、含有GST标签的pGEX-6p-1和含有His-MBP标签的pCold-MBP的大肠杆菌质粒，转化至大肠杆菌感受态细胞BL21（DE3）中，在涂布平板后挑选单克隆菌落，接种至1 mL LB培养基中于37℃培养，加入0.4 mM IPTG诱导表达4 h，取菌液样品并结合SDS-PAGE电泳分析，实验结果表明KRAB结构域截短体在pCold-MBP载体中表达效果最优，以下简称为MBP-KRAB。KRAB-ZNFs蛋白家族种保守的KRAB结构域通常是一段无序氨基酸区域，因此它们在空间结构上比较灵活。本发明设计了KRAB-ZNF10蛋白N端KRAB结构域的构建，并且在三种不同的大肠杆菌表达载体中筛选了表达效果，其中在pCold-MBP载体中表达效果最优。
S4、使用大肠杆菌表达KRAB-ZNF10蛋白截短体：挑选pCold-MBP-KRAB构建的单克隆菌落，接种至1 L LB培养基中于37℃扩大培养，取样检测菌液OD600=0.6~0.8时，将菌液冷却至16℃，加入0.4 mM IPTG，并在16℃条件下诱导表达16 h左右。
S5、亲和层析纯KRAB-ZNF10蛋白截短体：利用低温离心机4000 rpm/min，离心20min收集菌液，弃去上清液，使用菌液重悬缓冲液（菌液重悬缓冲液包括0.02% Triton 、150mM 氯化钠、20 mM HEPES pH 7.5、25 mM咪唑）重悬菌体，并使用超声破碎仪将大肠杆菌充分破碎裂解。之后，在4℃条件下以18000 rpm高速离心40 min，将细胞碎片与溶解的蛋白上清液分离。蛋白上清液中加入5 mL Ni2+-NTA亲和纯化介质，在4℃条件下旋转孵育2 h使目的蛋白与亲和介质充分结合。用缓冲液多次清洗亲和介质，洗去非特异性结合的杂蛋白后，加入洗脱缓冲液（洗脱缓冲液包括以下组分：150 mM 氯化钠、20 mM HEPES pH 7.5、250 mM咪唑），使目标蛋白流穿并收集。
S6、分子筛纯化KRAB-ZNF10蛋白截短体：将步骤S5中得到的蛋白溶液浓缩至1 mL，并使用AKTA pure 25蛋白纯化仪和Superdex 200 10/30 increase分子筛对蛋白样品进一步分离纯化（分子筛缓冲液包括以下组分：150 mM 氯化钠、20 mM HEPES pH 7.5），按照不同的紫外吸收峰收集蛋白，对各个吸收峰的蛋白洗脱液进行SDS-PAGE凝胶电泳分析，得到了纯度较高的MBP-KRAB蛋白，如图1-图2所示。
S7、KRAB-ZNF10蛋白截短体和TRIM28蛋白的复合组装：在TRIM28蛋白中加入摩尔质量1.2倍MBP-KRAB蛋白，充分混合均匀后冰浴2 h使蛋白充分结合。将混合后的蛋白样本溶液浓缩至1 mL，并使用AKTA pure 25蛋白纯化仪和Superdex 200 10/30 increase分子筛对蛋白样品进一步分离纯化，按照不同的紫外吸收峰收集蛋白，对各个吸收峰的蛋白洗脱液进行SDS-PAGE凝胶电泳分析如图3-图4所示，可以看出TRIM28与MBP-KRAB在同一个蛋白吸收峰中被洗脱，证明了二者存在直接相互作用并在体外组装成为二元复合物。
超速离心分析检测蛋白及复合物分子量：选取步骤S7获取的浓度ABS=0.1~1.0mg/mL的蛋白样品，在离心开始前需要将转子预冷。之后将380 μL蛋白样品加入到离心管的其中一个样品池内，在相邻的另外一个样品池内加入上述的分子筛缓冲液400 μL（要求不含Triton等去垢剂）作为背景，严格配平转子后，打开真空泵，并等待仪器冷却至预设温度。在4℃的真空条件下40000 rpm离心12 h。收集超速离心的紫外光和干涉光的实验原始数据，利用Sedfit软件处理即可得到样品的真实分子量、纯度等参数；如图5所示，TRIM28-KRAB-ZNF10二元复合物（图中为TRIM28-KRAB）的分子量为210KD，MBP-KRAB分子量为45KD，TRIM28全长分子量为165KD，证明了二元复合物组装的分子比例为TRIM28：KRAB=2:1。
本发明还提供一种用于前列腺癌筛查的试剂盒，包括质控品或标准品，所述质控品或所述标准品中包括TRIM28-KRAB-ZNF10二元复合物。本发明在质控品或标准品中加入TRIM28-KRAB-ZNF10二元复合物可提高蛋白4℃下的蛋白稳定性。
将本发明的实施例1中用于前列腺癌筛查的试剂盒（其质控品使包括TRIM28-KRAB-ZNF10二元复合物）以及对比例的试剂盒（其质控品包括TRIM28全长蛋白）置于4℃环境下保存，在第一天使用检测试剂（含有TRIM28单克隆抗体成分）检测质控品并用酶标仪测试记录数据（检测三次取平均值）。之后，每个月按照相同的方法，检测4℃保存的试剂盒特异性质控品，并计算与第一天信号值的相对偏差，连续检测12个月并将数据统计。结果如图6所示，在本发明中使用TRIM28-KRAB-ZNF10二元复合物作为试剂盒质控品， TRIM28-KRAB-ZNF10二元复合物不影响其免疫活性，并且在试剂有效期12个月内，信号值的相对偏差与对比例的TRIM28蛋白相比明显更小。因此，TRIM28-KRAB-ZNF10二元复合物作为试剂盒质控品或标准品，其稳定性和准确度更可靠。
实施本发明具有以下有益效果：本发明使用分子筛，首次体外组装了TRIM28蛋白与KRAB-ZNF10蛋白截短体形成TRIM28-KRAB-ZNF10二元复合物，并使用超速离心分析技术分别检测MBP-KRAB以及二元复合物的分子量，为后续研究DNA序列特异性基因转录抑制的分子机制提供更多理论参考；ZNF10定位于细胞核，具有转录抑制活性且与多种重要转录因子存在相互作用，能够通过促进G1-S周期的进程及抑制细胞凋亡而促进乳腺癌细胞的生长增殖，本发明将TRIM28蛋白与KRAB-ZNF10蛋白截短体复合形成蛋白复合物，对于调节染色质的形态，发挥DNA序列特异性的基因沉默功能，应对DNA损伤等显得尤为重要，TRIM28-KRAB-ZNF10二元复合物可作为前列腺癌筛查试剂盒中质控品与标准品的重要成分，提高了试剂在4℃保存条件下的稳定性。
以上已经描述了本发明的各实施例，上述说明是示例性的，并非穷尽性的，并且也不限于所披露的各实施例。在不偏离所说明的各实施例的范围和精神的情况下，对于本技术领域的普通技术人员来说许多修改和变更都是显而易见的。本文中所用术语的选择，旨在最好地解释各实施例的原理、实际应用或对市场中的技术的改进，或者使本技术领域的其他普通技术人员能理解本文披露的各实施例。
Claims (5)
1.一种TRIM28-KRAB-ZNF10二元复合物，其特征在于，由KRAB-ZNF10蛋白截短体和TRIM28蛋白组装而成，所述KRAB-ZNF10蛋白截短体由 His-MBP 标签和KRAB-ZNF10蛋白N端KRAB结构域截短体组成，KRAB结构域截短区域为10-88AA；
所述TRIM28-KRAB-ZNF10二元复合物中的TRIM28蛋白与KRAB-ZNF10蛋白截短体的分子比例为2:1；
所述KRAB-ZNF10蛋白截短体的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，所述TRIM28蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示。
2.一种权利要求1所述的TRIM28-KRAB-ZNF10二元复合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、KRAB-ZNF10蛋白基本信息的收集与整理；
S2、根据步骤S1所获得的信息，进行KRAB-ZNF10的蛋白二级结构以及三级结构预测；
S3、KRAB-ZNF10蛋白截短体设计和构建：根据步骤S2预测的结构信息，设计出KRAB-ZNF10蛋白截短体选取区域为N端KRAB结构域10-88AA；
S4、使用大肠杆菌表达KRAB-ZNF10蛋白截短体：筛选大肠杆菌表达KRAB-ZNF10蛋白截短体的载体，包括以下步骤：将目的基因片段分别构建至含有His标签的pet-28a、含有GST标签的pGEX-6p-1和含有His-MBP标签的pcold-MBP的大肠杆菌质粒，转化至大肠杆菌感受态细胞BL21中，在涂布平板后挑选单克隆菌落，接种至LB培养基中于37℃培养，加入0.4 mMIPTG诱导表达4 h，取菌液样品并结合SDS-PAGE电泳分析，比较表达效果，筛选出最优表达载体为pCold-MBP；
将目的基因片段含有His-MBP标签的pCold-MBP的大肠杆菌质粒，转化至大肠杆菌感受态细胞BL21中，在涂布平板后挑选单克隆菌落，接种至LB培养基中于37℃继续扩大培养，取样检测菌液OD600=0.6~0.8时，将菌液冷却至16℃，加入0.4 mM IPTG，并在16℃条件下诱导表达16 h；
S5、亲和层析纯KRAB-ZNF10蛋白截短体：对S4步骤中的菌液进行亲和层析纯化；
S6、分子筛纯化KRAB-ZNF10蛋白截短体：分别对步骤S5获得的蛋白溶液进行分子筛纯化；
S7、KRAB-ZNF10蛋白截短体和TRIM28蛋白的复合组装：取KRAB-ZNF10蛋白截短体和TRIM28蛋白，两者的投料摩尔质量比为1.2:1，并将二者混合冰浴2h，之后使用分子筛分离纯化目标蛋白复合物。
3.根据权利要求2所述的TRIM28-KRAB-ZNF10二元复合物的制备方法，其特征在于，
在步骤S5中，亲和层析纯化KRAB-ZNF10蛋白截短体包括以下步骤：分别低温离心S4步骤获得的大肠杆菌表达的KRAB-ZNF10蛋白截短体菌液，弃去上清液，使用菌液重悬缓冲液重悬菌体，超声；低温高速离心分离，蛋白上清液中加入Ni2+-NTA亲和纯化介质，在低温条件下旋转孵育使目的蛋白与亲和介质充分结合，用菌液重悬缓冲液多次清洗亲和介质，加入洗脱缓冲液，使目标蛋白流穿并收集, 得到高纯度的KRAB-ZNF10蛋白截短体。
4.根据权利要求3所述的TRIM28-KRAB-ZNF10二元复合物的制备方法，其特征在于，步骤S5中的所述菌液重悬缓冲液包括以下组分： 0.02% Triton、150 mM 氯化钠、20 mMHEPES和25 mM咪唑；所述HEPES的pH为 7.5；所述洗脱缓冲液包括以下组分：150 mM 氯化钠、20 mM HEPES、250 mM咪唑，所述HEPES的pH 为7.5。
5.一种用于前列腺癌筛查的试剂盒，包括质控品或标准品，所述质控品或所述标准品中包括权利要求1所述的TRIM28-KRAB-ZNF10二元复合物。
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| PB01 | Publication | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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