CN114460303A - 一种猪囊等孢球虫CsENO2蛋白与宿主细胞未知蛋白互作的方法 - Google Patents

一种猪囊等孢球虫CsENO2蛋白与宿主细胞未知蛋白互作的方法 Download PDF

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黄翠琴
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Abstract

本发明公开了一种猪囊等孢球虫CsENO2蛋白与宿主细胞未知蛋白互作的方法。该方法是利用Enos引物并以pET30(a)‑enolase为模板进行PCR反应，获得猪囊等孢球虫CsENO2基因，然后将猪囊等孢球虫CsENO2基因以分子克隆的方式接到真核表达载体pcDNA3.1上，并利用转染的方式送到细胞内，通过真核表达CsENO2蛋白后,以CsENO2抗体利用免疫共沉淀的方法将细胞内互作蛋白抓下来，最终经由SDS‑PAGE分析增加的条带，蛋白质条带经由质谱仪分析后即可确认互作蛋白的身份。本发明方法的技术门坎较低，只需基本的转染技术以及免疫共沉淀技术即可进行分析；同时，本发明不易存在假阳性的问题。

Description

一种猪囊等孢球虫CsENO2蛋白与宿主细胞未知蛋白互作的 方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种猪囊等孢球虫CsENO2蛋白与宿主细胞未知蛋白互作的方法。
背景技术
猪球虫病(Swine Coccidiosis)是一种严重危害养猪业的肠道寄生原虫病，该病主要由囊等孢属(Cystoisospora)和艾美耳属(Eimeria)球虫寄生于猪小肠上皮细胞，引起仔猪腹泻、消瘦及发育受阻，其中猪囊等孢球虫(Cystoisospora suis)致病力最强、流行最广泛，常引起仔猪死亡。
由C.suis引起的猪球虫病呈世界性流行和分布，约45％-100％的猪场存在C.suis感染。该虫是引起新生仔猪球虫病的重要病原体，临床上表现为糊状至水样的非出血性腹泻，体重明显下降和消瘦，常引起仔猪死亡，其它生长阶段猪也会感染，经产母猪或产房母猪多为带虫宿主，不表现临床症状，给猪场造成巨大的经济损失。然而，目前对C.suis的研究主要还集中在流行病学调查、药物治疗、分子诊断和免疫保护等方面，对其入侵宿主的致病机制尚不清楚，特别是C.suis被重新归类为囊等孢属家族后。因此，深入探索囊等孢属球虫与宿主细胞的互作蛋白对于囊等孢属球虫的入侵致病机制具有重要的科学意义。
目前常用于研究蛋白质互作的技术有酵母双杂交法和GST pull-down assay。酵母双杂交法存在以下缺点：1、传统的酵母双杂交技术不能研究膜蛋白的相互作用。2、酵母双杂交技术研究的目的蛋白相互作用必须在酵母细胞核内发生相互作用，如果酵母双杂交技术显示两个蛋白相互作用(也就是在酵母细胞核内，这两个蛋白确实相互作用)，但是两个相互作用蛋白在原宿主内位于不同细胞器，那么假阳性就产生了，因此在技术上存在有假阳性的问题。GST pull-down assay则存在的以下缺点：1、必须克隆互作两个基因到两个不同的表达载体，克隆技术门坎高。2、蛋白必须能表达出来，若膜蛋白不容易表达出来，则不适用此方法进行蛋白互作。3、必须是已知的蛋白，无法从一个已知的蛋白去找寻另一个未知的蛋白。4、纯化蛋白质门坎高，纯化蛋白技术不佳容易,存在假阳性发生的可能。
因此，本发明开发了一种新的蛋白质互作的方法，以研究寄生虫与宿主细胞间的互作蛋白
发明内容
本发明的目的在于提供一种猪囊等孢球虫CsENO2蛋白与宿主细胞未知蛋白互作的方法。
为了实现上述目的，本发明采用的技术方案是：
首先，设计Enos引物，引物序列如下：
Enos-F:ATTGCTAGCGAAATCTTCTTCTTCTTTGC；
Enos-R:TTGTCTAGATAATTTCCGATTACGAAAATCCG。
利用Enos引物并以pET30(a)-enolase为模板进行PCR反应，获得猪囊等孢球虫CsENO2基因，然后将猪囊等孢球虫CsENO2基因以分子克隆的方式接到真核表达载体pcDNA3.1上，并利用转染的方式送到细胞内，通过真核表达CsENO2蛋白后,以CsENO2抗体利用免疫共沉淀的方法将细胞内互作蛋白抓下来，最终经由SDS-PAGE分析增加的条带，蛋白质条带经由质谱仪分析后即可确认互作蛋白的身份。
本发明具有以下优点：1)相对于传统的酵母双杂交法，本发明方法能够提高准确度，减少假阳性的发生。2)相对于对另一种蛋白质互作方式:GST pull-down assay，本发明减少了原核表达蛋白质与纯化蛋白质的时间以及会遇到的困难点,节省了时间与成本，可以快速得到目标蛋白。
本发明提供的猪囊等孢球虫CsENO2蛋白与宿主细胞未知蛋白互作的方法，技术门坎较低，只需基本的转染技术以及免疫共沉淀技术即可进行分析；同时，本发明不易存在假阳性的问题，通过SDS-PAGE的比较分析，只有具有差异性蛋白质才会显示在SDS-PAGE胶图上，在胶图上要呈现条带所需要蛋白质的浓度是wetern blot的1000倍,因此互作蛋白的结合量需达到一定程度才会有条带的产生,自然假阳性的机率也就低得多。
附图说明
图1为SDS-PAGE分析免疫共沉淀后CsENO2互作蛋白的实验结果。
其中，M:protein marker；pcDNA3.1:IPEC-J2细胞转染pcDNA3.1后进行共免疫沉淀后结果；pcDNA3.1-enos:IPEC-J2细胞转染pcDNA3.1-enos后进行共免疫沉淀后结果；箭头:IPEC-J2细胞转染pcDNA3.1-enos后进行共免疫沉淀后增加的条带。
具体实施方式
一种猪囊等孢球虫CsENO2蛋白与宿主细胞未知蛋白互作的方法：
1.1 PCR扩增
利用下列Enos引物并以pET30(a)-enolase为模板进行PCR
Enos-F:ATTGCTAGCGAAATCTTCTTCTTCTTTGC
Enos-R:TTGTCTAGATAATTTCCGATTACGAAAATCCG
PCR反应体系设置为50μl，加入2μl模板，正反向引物各1μl，0.5μl Taq，4μl dNTP，5μl 10×Buffer，ddH2O补足至50μl，利用常规PCR扩增enos基因片段，反应程序为：95℃预变性5min，30个循环包括95℃变性30sec，52℃退火30sec，72℃延伸90sec，最后72℃延伸10min。
1.2酶切、接合与转化作用
将pcDNA3.1与上述PCR得到的产物用Nhe1以及Xba1两种酶进行双酶切,切胶回收之后进行接合与转化作用，得到菌落后，重新进行PCR与酶切验证。
1.3大量质粒提取
利用QIAGEN plasmid kit试剂盒提取pcDNA3.1以及pcDNA3.1-enolase质粒，具体的步骤如下:
1)从琼脂板上挑取单一菌落,接种到含有AMP+的LB液体培养基中生长,并且培养于37℃,220rpm的摇床中，震荡12小时；
2)用LB培养液以1/100比例稀释上述含菌落的培养液，让其培养于37℃,220rpm的摇床中，震荡12-16小时；
3)于4℃离心机6000rpm离心15分钟以收集细菌细胞；
4)加入3ml P1 Buffer重悬细菌细胞，用1000μl的枪头将细胞上下打散；
5)加入3ml P2 Buffer后,上下颠倒4-6次，充分混合溶液，并于室温下静置5分钟；
6)加入预冷3ml P3 Buffer后，上下颠倒4-6次，并于冰上孵育5分钟；
7)于4℃离心机离心，13000rpm，10分钟后收集上清液；
8)用1ml QBT Buffer平衡QIAGEN column，利用重力的方式流空；
9)将上清液转移至平衡后的QIAGEN column，利用重力的方式流进QIAGEN管柱的树脂；
10)用2x10ml的QC Buffer洗QIAGEN column；
11)用0.8ml的QF Buffer洗脱QIAGEN column中的DNA；
12)向DNA洗提液加入0.56ml的异丙醇,混匀后立即于4℃离心机离心13,000rpm,30分钟,弃上清液；
13)用70％1ml的乙醇洗涤DNA颗粒，于4℃离心机离心13,000rpm,30分钟,弃上清液；
14)空气干燥10分钟,用50μl的双蒸水进行DNA颗粒的溶解；
15)分光亮度仪进行DNA浓度测定。
1.4转染
提取的pcDNA3.1以及pcDNA3.1-enolase质粒利用Turbofect TransfectionReagent(Thermo fisher)分别转染10盘10公分的IPEC-J2猪小肠上皮细胞,具体的步骤如下(下列步骤为1盘的细胞与DNA浓度):
1)接种5x106IPEC-J2细胞到20盘10公分细胞培养盘，隔天观察细胞是否到达到70-90％的满盘度；
2)将10μg的pcDNA3.1以及pcDNA3.1-enolase质粒分别加入1ml无血清的DMEM中,简单的涡漩几下；
3)将30μl的Turbofect Transfection Reagent加入步骤2中含质粒DNA的无血清的DMEM中,再次涡漩；
4)室温静置20分钟；
5)以顺时钟方向滴入上述的液体至10公分细胞培养盘内；
6)24小时后收集20盘细胞並进行细胞裂解。
1.5细胞裂解与免疫互作
1)先对试剂称重，每100mg细胞沉淀加入1ml 1X lysis buffer涡旋搅拌后利用超声破碎处理；
2)12000rpm离心5min，收集上清液；
3)加入0.7mL细胞裂解液，加入7μl PMSF和1μg CsENO2抗体到新的1.5ml微量离心管中；
4)4℃水平摇床孵育隔夜；
5)加30μl的protein A beads到过滤柱中，加入700μl的1X PBS洗涤，低速离心，清洗4次；
6)孵育后，将细胞裂解液转移到过滤柱中洗净的protein A beads上；
7)4℃水平摇床孵育隔夜；
8)离心12,000rpm,4℃,1min；
9)加入700μl 1X IP缓冲液于过滤柱中离心，12000rpm洗珠6次；用700μl0.1X IP缓冲液清洗珠6次。将过滤柱以12000rpm的转速离心30秒；
10)在protein A beads上加入40-50μl的1X loading buffer，轻轻搅拌(不涡流)；
11)将每个过滤柱插入2ml微离心管中；
12)12000rpm离心30s；
13)将样品在95℃加热5分钟；
14)洗脱的免疫沉淀准备SDS-PAGE进行分析。
1.6实验结果:
SDS-PAGE结果如图1所示，从胶图上可以明显看出marker右边比左边多出2个蛋白质条带(45-50；55-70kDa)。
以上方法在鉴定蛋白质的部分，不同于传统方法，传统方法都是进行2维电泳搭配银染，蛋白质在胶图上辨识度低,而本发明方法经由收集10盘细胞后进性共免疫沉淀，可以直接于SDS-PAGE上经由考马氏蓝进行显色，可以轻易的鉴别出互作蛋白。
序列表
<110> 龙岩学院
<120> 一种猪囊等孢球虫CsENO2蛋白与宿主细胞未知蛋白互作的方法
<130> 2021
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
attgctagcg aaatcttctt cttctttgc 29
<210> 2
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ttgtctagat aatttccgat tacgaaaatc cg 32

Claims (3)

1.一种猪囊等孢球虫CsENO2蛋白与宿主细胞未知蛋白互作的方法，其特征在于：利用Enos引物并以pET30(a)-enolase为模板进行PCR反应，获得猪囊等孢球虫CsENO2基因，然后将猪囊等孢球虫CsENO2基因以分子克隆的方式接到真核表达载体pcDNA3.1上，并利用转染的方式送到细胞内，通过真核表达CsENO2蛋白后,以CsENO2抗体利用免疫共沉淀的方法将细胞内互作蛋白抓下来，最终经由SDS-PAGE分析增加的条带，蛋白质条带经由质谱仪分析后即可确认互作蛋白的身份；
所述Enos引物序列如下：
Enos-F:ATTGCTAGCGAAATCTTCTTCTTCTTTGC；
Enos-R:TTGTCTAGATAATTTCCGATTACGAAAATCCG。
2.根据权利要求1所述的一种猪囊等孢球虫CsENO2蛋白与宿主细胞未知蛋白互作的方法，其特征在于：具体步骤如下：
1)利用Enos引物并以pET30(a)-enolase为模板进行PCR反应，获得PCR产物；
PCR反应体系设置为50μl，加入2μl模板，正反向引物各1μl，0.5μl Taq，4μl dNTP，5μl10×Buffer，ddH2O补足至50μl，利用常规PCR扩增enos基因片段，反应程序为：95℃预变性5min，30个循环包括95℃变性30sec，52℃退火30sec，72℃延伸90sec，最后72℃延伸10min。
2)将pcDNA3.1与上述PCR产物用Nhe1以及Xba1两种酶进行双酶切,切胶回收之后进行接合与转化作用，得到菌落后，重新进行PCR与酶切验证；
3)利用试剂盒提取pcDNA3.1以及pcDNA3.1-enolase质粒；
4)将提取的pcDNA3.1以及pcDNA3.1-enolase质粒分别转染10盘PEC-J2猪小肠上皮细胞；
5)以CsENO2抗体利用免疫共沉淀的方法将细胞内互作蛋白抓下来，最终经由SDS-PAGE分析增加的条带，蛋白质条带经由质谱仪分析后即可确认互作蛋白的身份。
3.根据权利要求2所述的一种猪囊等孢球虫CsENO2蛋白与宿主细胞未知蛋白互作的方法，其特征在于：步骤4)的转染方法具体如下：
4-1)接种5x 106IPEC-J2细胞到20盘10公分细胞培养盘，隔天观察细胞是否到达到70-90％的满盘度；
4-2)将10μg的pcDNA3.1以及pcDNA3.1-enolase质粒分别加入1ml无血清的DMEM中，涡漩；
4-3)将30μl的Turbofect Transfection Reagent加入步骤4-2)中含质粒DNA的无血清的DMEM中,再次涡漩；
4-4)室温静置20分钟；
4-5)以顺时钟方向滴入上述液体至10公分细胞培养盘内；
4-6)24小时后收集20盘细胞并进行细胞裂解。
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