CN113980145A - 一种结核分枝杆菌融合蛋白及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种结核分枝杆菌融合蛋白及其制备方法和应用，采用EAST6和CFP10两种蛋白组成，具有EEC、ECE、CEE、ECC、CEC和CCE的六种连接结构，可用于制备MTB感染及NTM感染的各类诊断或辅助诊断产品，并具备较高的灵敏度和特异性。

Description

一种结核分枝杆菌融合蛋白及其制备方法和应用
技术领域
本发明是一种结核分枝杆菌融合蛋白及其制备方法和应用，具体涉及一种结核分枝杆菌融合蛋白EEC、ECE、CEE、ECC、CEC和CCE及其制备方法和应用，属于生物技术领域。
背景技术
结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis，MTB）感染发病，俗称结核病，是一种慢性传染性疾病。根据2020年10月，WHO发布的《2020年全球结核病报告》：2019年，全球估算新发结核病患者996万例，其中成年男性554万例，成年女性322万例；0~14岁儿童119万例，较去年增长7万例，其中男童和女童分别为62.4万和57万。居前三位的印度（264万）、印度尼西亚（84.5万）和中国（83.3万）估算新发结核病患者总数占全球估算发病总数近一半。2019年全球估算结核病死亡例数141万，其中HIV阳性患者为20.8万，HIV阴性患者为121万。自2007年结核病持续位列全球十大死因之一，并为传染病中的头号杀手。
MTB感染主要以潜伏状态存在，其中5%~10%潜伏感染者会在其一生中发展成活动性结核病患者。根据2010年全国第五次结核病流行病学抽样调查结果显示，国内MTB感染潜伏患者约为5.5亿人，占全国总人数的45%，平均每年新发结核病患者100万例。若能对MTB潜伏感染者进行早期预防性治疗，就能够大大降低其发展成活动性结核病患者的机率，有效控制结核病的传播。因此，对潜伏感染者的筛查就显得尤为重要。
MTB感染临床诊断方法较多，但均不能达到早期、有效、特异的诊断目的：痰涂片的检出率太低，痰培养时间太长；影像学（胸部X光、CT等）难以做到早期发现及大规模普筛；免疫学诊断虽然简单、快速、灵敏而有较好发展前景，但仍缺乏特异性抗原。现在对于MTB的筛查主要有二种方法：结核菌素纯蛋白衍生物的皮肤试验（TB-PPD法）和γ-干扰素释放试验（IGRAs法）。TB-PPD法是经典方法，皮试操作方便易行，是我国MTB筛查最广泛的方法。然而，TB-PPD法虽已用于大规模普筛，但其包含有分枝杆菌属（MTB和NTM）的大多数共有抗原，使得诊断的特异性较差，无法区分卡介苗接种、MTB和NTM感染，假阳性较高。IGRAs法为WHO推荐的方法，通过MTB特异性抗原刺激淋巴细胞释放γ干扰素来检测是否为MTB感染的检查方法。阳性表明既往曾感染MTB，可排除卡介苗接种及大部分NTM感染，所需时间也较短，但价格昂贵，不适合大规模筛查。
近年来，利用特异性MTB抗原制备新型皮试试剂，已经成为全球结核病防控研究的热点。其中ESAT-6蛋白是一种低分子量的早期分泌蛋白，ESAT-6基因存在于MTB中，因此，ESAT-6对MTB感染者具有高度特异性。ESAT-6蛋白可刺激MTB感染者产生T细胞免疫应答并释放多种细胞因子（白细胞介素-2、γ-干扰素、肿瘤坏死因子等），进而诱导机体发生迟发型超敏反应（DTH）。此反应强度与细胞免疫应答呈正相关，反应越强，表示MTB感染的可能性越大，可作为MTB感染的诊断方法。ESAT-6在MTB增值期和非增值期都能高水平转录，因此，无论是活动性结核病患者还是MTB潜伏感染者，ESAT-6都能有效诱导机体产生细胞免疫应答。CFP-10蛋白与ESAT-6蛋白相似，也是一种早期分泌小分子蛋白，通常与ESAT-6蛋白形成异源二聚体，同样具有高度特异性，能诱导机体产生细胞免疫反应。
根据前人研究，在结核病体外诊断及皮肤试验中，联用两种以上抗原的诊断特异性及灵敏度均好于单一抗原，能大幅降低注射剂量，提高安全性。在生产成本方面，融合蛋白解决了小分子蛋白不易纯化的难题。在操作方面，皮肤试验简便易行，对MTB感染的大规模筛查提供很好的选项。例如：公开号为CN110423279A的发明专利公开的一种结核分枝菌融合蛋白EECC，采用顺次连接EAST6-EAST6-CFP10- CFP10组成蛋白融合。在进行结核病诊断时，在保证较高特异性的同时具有较好的灵敏度，可有效降低使用剂量，降低检测成本，有效区分结核菌活菌感染、死菌致敏、BCG接种，可用于结核病诊断、结核病疫苗制备、抗原特异的细胞因子的检测。以及公开号为CN110684116A的发明专利还公开的一种结核分枝杆菌EEC融合蛋白，采用顺次连接EAST6-EAST6-CFP10组成蛋白融合。同样具有较高的特异性和灵敏度，也可有效区分结核菌活菌感染、死菌致敏、BCG接种，可用于未感染结核杆菌人群、结核感染人群的诊断和治疗。
非结核分枝杆菌（Nontuberculosis mycobacteria，NTM）是指除结核分枝杆菌、牛分枝杆菌和麻风分枝杆菌以外的其他分枝杆菌。其特性有别于结核分枝杆菌，如对酸、碱比较敏感；生长温度不如结核分枝杆菌严格；多存在于环境中；为条件致病菌。因可引起结核样病变而受到关注，常见咳嗽、疲乏，病情较重者有发热、体重减轻、咯血和气促，有基础病者临床症状恶化等表现。其抗原与MTB有交叉。NTM还有一个重要特点，就是对常用的抗MTB的药物耐药，需要用其他治疗方案治疗。因此，如何区分MTB感染和NTM感染同样显得十分重要。
发明内容
本发明的目的在于提供一种含有结核分枝杆菌融合蛋白的产品，结核分枝杆菌融合蛋白采用EAST6和CFP10两种蛋白组成，具有EEC、ECE、CEE、ECC、CEC和CCE的六种连接结构，可用于制备MTB感染及NTM感染的各类诊断或辅助诊断疫苗，并具备较高的灵敏度和特异性。
本发明通过下述技术方案实现：一种结核分枝杆菌融合蛋白在制备用于诊断或辅助诊断结核分支杆菌感染、非结核分支杆菌感染产品中的应用，所述结核分枝杆菌融合蛋白为氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示的融合蛋白EEC、氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示的融合蛋白ECE、氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示的融合蛋白CEE、氨基酸序列如SEQ ID NO:12所示的融合蛋白ECC、氨基酸序列如SEQ ID NO:14所示的融合蛋白CEC或氨基酸序列如SEQID NO:16所示的融合蛋白CCE中的一种，
所述结核分枝杆菌融合蛋白满足以下产品指标：
纯度≥95%；
分子量为30.6kD±3.1kD；
等电点主区带为3.8~4.8；
紫外光谱最大吸收峰波长为280nm±3nm；
N端氨基酸序列为(Met)-Gly-Thr-Glu-Gln-Gln-Trp-Asn-Phe-Ala-Gly-Ile-Glu-Ala-Ala-Ala或(Met)-Ala-Glu-Met-Lys-Thr-Asp-Ala-Ala-Thr-Leu-Ala-Gln-Glu-Ala-Gly；
外源性DNA残留量≤10ng/ml；
宿主菌蛋白质残留量≤蛋白质总量的0.01%；
抗生素残留量≤1ng/ml。
所述诊断或辅助诊断的方法包括皮肤试验法、免疫学法或其他医学上可实现的方法。
所述产品包括试剂、试剂盒或其他医学上可实现的产品。
一种用于诊断或辅助诊断结核分支杆菌感染、非结核分支杆菌感染的产品，包含上述结核分枝杆菌融合蛋白，且满足上述产品指标。
所述诊断或辅助诊断的方法包括皮肤试验法、免疫学法或其他医学上可实现的方法。
所述产品包括试剂、试剂盒或其他医学上可实现的产品。
一种如上述应用中使用的结核分枝杆菌融合蛋白。
一种制备上述结核分枝杆菌融合蛋白的方法，将编码所述结核分枝杆菌融合蛋白的核酸导入宿主细胞中进行表达。
还包括对表达菌株的发酵和纯化，步骤如下：
（1）发酵：将表达菌株接种至M9培养基中，经两级培养得到发酵种子液，再将种子液接种至全合成培养基中进行发酵培养后，离心收集菌体；
（2）纯化：将菌体破碎、离心后，经阴离子交换层析、疏水作用层析、分子筛层析后得到纯化的结核分枝杆菌融合蛋白。
一种编码上述结核分枝杆菌融合蛋白的核酸，其核苷酸序列选自下述中的任一种：
（1）如SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列，或其互补序列，或与其具有至少80%同源性的核苷酸序列；
（2）如SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列，或其互补序列，或与其具有至少80%同源性的核苷酸序列；
（3）如SEQ ID NO:9所示的核苷酸序列，或其互补序列，或与其具有至少80%同源性的核苷酸序列；
（4）如SEQ ID NO:11所示的核苷酸序列，或其互补序列，或与其具有至少80%同源性的核苷酸序列；
（5）如SEQ ID NO:13所示的核苷酸序列，或其互补序列，或与其具有至少80%同源性的核苷酸序列；
（6）如SEQ ID NO:15所示的核苷酸序列，或其互补序列，或与其具有至少80%同源性的核苷酸序列。
本发明与现有技术相比，具有以下优点及有益效果：
（1）本发明提供了六种连接顺序为EEC、ECE、CEE、ECC、CEC和CCE的结核分枝杆菌融合蛋白，其氨基酸序列依次如SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:16所示。在用相同参考品（TB-PPD，50IU/ml）与现有专利CN110423279A 公开的EECC和CN110684116A公开的EEC进行比较时，CN110423279A中公布的灵敏度（与参考品平均直径的比值）为1.21；CN110684116A中公布的灵敏度（与参考品平均直径比值）为1.55；本发明涉及的结核分枝杆菌融合蛋白（EEC）的灵敏度（与参考品平均直径比值）为1.83，因此，本发明提供的结核分枝杆菌融合蛋白具有更高的灵敏度。
（2）本发明提供了上述六种结核分枝杆菌融合蛋白在用于制备诊断或辅助诊断MTB感染疫苗的用途外，还可用于NTM感染的各类诊断或辅助诊断产品，通过与结核菌素纯蛋白衍生物联用，表现了对NTM感染者的特异性。这一新用途在现有技术中并未涉及。
（3）本发明为制备得到上述六种结核分枝杆菌融合蛋白，提供了更优化的发酵方法，如采用全合成培养基，没有生物来源（动物源、植物源、微生物源）成分，较CN110684116A中EEC的发酵工艺而言，可避免引入致病因子（如朊病毒引起的疯牛病、大豆蛋白引发的哮喘等）的风险，提高产品的安全性。
（4）本发明所用纯化工艺仅采用四步工序，包括菌体破碎（需要高压均质机和离心机）→阴离子交换层析（需要阴离子层析填料和柱层析系统）→疏水作用层析（需要疏水层析填料和柱层析系统）→分子筛层析（需要分子筛填料和柱层析系统），较CN110423279A中EECC和CN110684116A中EEC的制备工艺而言，具有工序更简单，所需设备较少，便于大规模生产，将会大大降低生产成本。其中，CN110423279A中所述工艺采用七步工序：菌体破碎（需要高压均质机和离心机）→稀释过滤（需要囊氏滤器）→阴离子交换层析（需要阴离子层析填料和柱层析系统）→盐析（需要离心机）→脱盐换液（需要分子筛填料和柱层析系统）→阳离子交换层析（需要阳离子层析填料和柱层析系统）→分子筛层析（需要分子筛填料和柱层析系统）。CN110684116A中所述工艺采用六步工序：菌体破碎（需要高压均质机和离心机）→盐析（需要离心机）→脱盐换液（需要分子筛填料和柱层析系统或单用超滤设备）→阴离子交换层析（需要阴离子层析填料和柱层析系统）→浓缩（需要离心机或单用超滤设备）→分子筛层析（需要分子筛填料和柱层析系统）。
综上所述，本发明通过采用MTB的特异性抗原EAST6和CFP10设计得到具有特定氨基酸序列的融合蛋白EEC、ECE、CEE、ECC、CEC和CCE，除用于MTB感染者的诊断或辅助诊断外，还表现了对NTM感染者的特异性，可用于诊断或辅助诊断NTM的感染。同时，还可以制备得到满足产品指标体系的结核分枝杆菌融合蛋白，在制备过程中，通过对发酵及纯化工艺的优化，不仅提高了产品的灵敏度和安全性，更降低了生产成本，适宜大规模生产。
附图说明
图1为转化子双酶切（Nco I及Hind III）鉴定图谱。
图2为菌株表达鉴定图谱（显阳性）。
图3为EEC蛋白纯品SDS-PAGE电泳图谱（97.0%）。
图4为EEC蛋白纯品免疫印迹图谱（ESAT-6单克隆抗体显阳性）。
图5为EEC蛋白纯品高效液相谱图。
图6为EEC与TB-PPD联用的诊断流程图（无结核病症状）。
图7为EEC与TB-PPD联用的诊断流程图（有结核病症状）。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步地详细说明，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1：结核分枝杆菌融合蛋白的组合
分析结核分枝杆菌中ESAT-6及CFP-10基因的核酸序列，根据大肠杆菌密码子的偏好性，利用大肠杆菌偏好的同义密码子替换掉原基因序列在大肠杆菌中利用率低的密码子，将序列进行优化，以提高该蛋白在大肠杆菌中的表达量，增加生产效率。
ESAT-6基因序列如SEQ ID NO:1，CFP-10基因序列如：SEQ ID NO:2。优化过后的ESAT-6基因序列如SEQ ID NO:3，CFP-10基因序列如SEQ ID NO:4。
设计得到的ESAT-6_revised及CFP-10_revised序列，去除终止密码子后直接相接，并在其前后分别加上Nco I及Hind III酶切位点，以利后续重组质粒的构建。得到三联融合蛋白的基因序列，包括EEC、ECE、CEE、ECC、CEC、CCE。
设计的EEC基因及氨基酸序列分别为SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6；ECE基因及氨基酸序列分别为SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8；CEE基因及氨基酸序列分别为SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10；CCE基因及氨基酸序列分别为SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12；CEC基因及氨基酸序列分别为SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14；ECC基因及氨基酸序列分别为SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:16。
实施例2：上述三联融合蛋白EEC表达菌株的构建
S1：EEC表达质粒的构建
用Nco I及Hind III限制性内切酶分别对pET-28a空质粒和EEC基因质粒进行双酶切，双酶切的反应体系如下：
EEC基因质粒：EEC基因质粒43µl、10×限制酶缓冲液5µl、Nco I限制酶1µl、HindIII限制酶1µl，总反应体积50µl，以37℃孵育1小时，反应产物以1%琼脂糖凝胶进行电泳后，利用胶回收试剂盒回收EEC目的片段。
pET-28a空质粒：pET-28a空质粒88µl、10×限制酶缓冲液10µl、Nco I限制酶1µl、Hind III限制酶1µl，总反应体积100µl，以37℃孵育1小时，反应产物直接用试剂盒回收EECpET-28a空质粒片段。
将回收后的EEC目的片段和pET-28a空质粒片段进行连接，反应体系如下：
连接反应体系：pET-28a空载质粒片段2µl、EEC目的基因片段10.5µl、10×连接酶缓冲液1.5µl、T4 DNA连接酶1µl，总反应体积15µl，以16℃过夜培养完成连接反应，得到连接产物。
S2：连接产物的转化
取15µl连接产物加入含有100µl大肠杆菌DH5α感受态细胞的离心管中，冰浴30分钟，接着放入42℃水浴90秒后，迅速取出冰浴2分钟。冰浴后向离心管中加入900µl LB培养基，以37℃、220rpm震荡培养1小时，培养液适当浓缩，涂布于LB平板（Kan+），37℃倒置培养16小时。选取数个单克隆菌落，培养后小抽质粒，进行双酶切鉴定（见图1，M：Ladder；1~5：不同转化子）及测序分析（与理论序列一致），确定阳性克隆，得到EEC表达质粒
S3：EEC表达菌株的构建
取1µl EEC表达质粒加入含有100µl大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞的离心管中，冰浴30分钟，接着放入42℃水浴90秒后，迅速取出冰浴2分钟。冰浴后向离心管中加入900µlLB培养基，以37℃、220rpm震荡培养1小时，取100µl培养液涂布于LB平板（Kan+），37℃倒置培养16小时。选取1个单克隆菌落，培养后进行表达鉴定（见图2，M：标准蛋白分子量；诱导：添加1mM IPTG；未诱导：未添加IPTG），确定阳性菌株，得到EEC表达菌株。
实施例3：上述三联融合蛋白EEC的发酵及纯化工艺
S1：发酵
EEC表达菌株接种至M9培养基（Kan+）中进行复苏，得复苏菌液。将复苏菌液接种至M9培养基（Kan+）中进行第二级培养，得发酵种子液。将种子液接种至全合成培养基（包括磷酸二氢钾、磷酸氢二铵、枸橼酸、甘油，其浓度可根据需要进行配制）中，以37℃，进行发酵。发酵液OD值至5左右时，加入IPTG至终浓度0.1mmol/L，诱导培养10±2h小时。离心收集菌体，冷冻保存。
S2：菌体破碎
菌体解冻后，用高压均质机对菌体进行循环破碎。菌体破碎后离心，收集上清液，弃去沉淀。
S3：阴离子交换层析-捕获
取上步上清液，以流速1cm/min上样。上样结束，用阴离子交换平衡液以2cm/min流速继续冲平基线。用阴离子交换洗脱液洗以2cm/min流速洗脱目的蛋白，收集280nm波长处吸收大于500mAU洗脱液。
S4：疏水作用层析-中度纯化
取上步洗脱液，用饱和硫酸铵溶液调节电导，以流速2.5cm/min上样。上样结束，用疏水作用平衡液以5cm/min流速继续冲平基线。用疏水作用洗脱液洗以5cm/min流速洗脱目的蛋白，收集280nm波长处吸收大于100mAU洗脱液。
S5：分子筛层析-精细纯化
取上步洗脱液，加入尿素使目的蛋白变性，以流速0.5cm/min上样。上样结束，继续以0.5cm/min分子筛平衡液冲洗，收集280nm波长处吸收大于100mAU洗脱液。
S5：结果
纯化样品分别进行SDS-PAGE电泳、免疫印迹及HPLC检测，结果如图3（Marker：标准蛋白分子量；C3：EEC蛋白纯品）、图4（左边：标准蛋白分子量；C3：EEC蛋白纯品）、图5所示。
纯化样品满足以下产品指标：
纯度≥95%（高效液相色谱法或电泳法）；
分子量为30.6kD±3.1kD（电泳法）；
等电点主区带为3.8~4.8（电泳法）；
紫外光谱最大吸收峰波长为280nm±3nm（紫外-可见光分光光度法）；
N端氨基酸序列为(Met)-Gly-Thr-Glu-Gln-Gln-Trp-Asn-Phe-Ala-Gly-Ile-Glu-Ala-Ala-Ala或(Met)-Ala-Glu-Met-Lys-Thr-Asp-Ala-Ala-Thr-Leu-Ala-Gln-Glu-Ala-Gly（Edman降解法）；
外源性DNA残留量≤10ng/ml（酶联免疫吸附法）；
宿主菌蛋白质残留量≤蛋白质总量的0.01%（酶联免疫吸附法）；
抗生素残留量≤1ng/ml（酶联免疫吸附法）。
实施例4：BCG活菌致敏豚鼠皮肤试验
S1：致敏
向检定用卡介菌中加入等体积生理盐水，制得致敏用卡介菌菌液（5mg/ml）。取符合致敏要求，体重在300~500g的豚鼠4只，皮下腹股沟注射1.0ml卡介菌菌液（5mg/ml）。
S2：皮试
致敏第五周，选取成功致敏的4只豚鼠，于每只豚鼠背部脊柱两侧皮内注射BCG-PPD（50IU/ml）、TB-PPD（50IU/ml）、EEC（10µg/ml）及稀释液各0.2ml。注射后24h观察和测量局部硬结或红晕的纵径与横径（以硬结或红晕大者为准），并求其平均直径（纵径与横径相加除以2）；平均硬结或红晕反应直径≥5mm判为阳性，＜5mm判为阴性。
S3：结果
表1. BCG活菌致敏豚鼠皮试24小时检测结果汇总表
Figure DEST_PATH_IMAGE002
在卡介菌活菌致敏的豚鼠上，稀释液皮试无反应；EEC在24h后平均硬结或红晕反应直径均小于5mm，均为阴性反应；TB-PPD、BGC-PPD在24h后所产生平均硬结或红晕反应直径分别为13.33mm、15.58mm，均为阳性反应。
实施例5：MTB灭活菌致敏豚鼠皮肤试验
S1：致敏
取结核分枝杆菌（H37Ra）菌液（50mg/ml、1ml/支）115℃灭菌20分钟，临用前取灭活结核分枝杆菌（H37Ra）菌液与等体积弗氏不完全佐剂混合并充分乳化，即得致敏用灭活结核分枝杆菌（H37Ra）菌液，浓度为25mg/ml。取符合致敏要求的豚鼠4只，腹股沟皮下注射0.2ml（左右各0.1ml）结核分枝杆菌（H37Ra）灭活菌液（25mg/ml）。
S2：皮试
致敏第三周，选取成功致敏的4只豚鼠，于每只豚鼠背部脊柱两侧皮内注射BCG-PPD（50IU/ml）、TB-PPD（50IU/ml）、EEC（10µg/ml）及稀释液各0.2ml。注射后24h观察和测量局部硬结或红晕的纵径与横径（以硬结或红晕大者为准），并求其平均直径（纵径与横径相加除以2）；平均硬结或红晕反应直径≥5mm判为阳性，＜5mm判为阴性。
S3：结果
表2. MTB灭活菌致敏豚鼠皮试24小时检测结果汇总表
Figure DEST_PATH_IMAGE004
在MTB（H37Ra）灭活菌致敏的豚鼠上，稀释液皮试无反应；EEC在24h后平均硬结或红晕反应直径均小于5mm，均为阴性反应；TB-PPD、BGC-PPD在24h后所产生平均硬结或红晕反应直径分别为13.40mm、12.69mm，均为阳性反应。
实施例6：MTB活菌致敏豚鼠皮肤试验
S1：致敏
取结核分枝杆菌H37Ra活菌，用生理盐水稀释成5mg/ml的致敏菌液（现用现配）。取符合致敏要求的豚鼠6只，腹股沟皮下注射0.2ml致敏活菌液；三周后，同法于另一侧腹股沟皮下注射0.2ml致敏用活菌液。
S2：皮试
第一次致敏第五周，选取成功致敏的6只豚鼠，于每只豚鼠背部脊柱两侧皮内注射BCG-PPD（50IU/ml）、TB-PPD（50IU/ml）、EEC（10µg/ml）及稀释液各0.1ml。注射后24h观察和测量局部硬结或红晕的纵径与横径（以硬结或红晕大者为准），并求其平均直径（纵径与横径相加除以2）；平均硬结或红晕反应直径≥5mm判为阳性，＜5mm判为阴性。
S3：结果
表3. MTB活菌致敏豚鼠皮试24小时检测结果汇总表
Figure DEST_PATH_IMAGE006
在结核分枝杆菌（H37Ra）活菌致敏的豚鼠上，稀释液皮试无反应；EEC在24h后平均硬结或红晕反应直径分别为14.93mm，为阳性反应；TB-PPD、BGC-PPD在24h后所产生平均硬结或红晕反应直径分别为8.15mm、6.82mm，均为阳性反应。
实施例7：各种NTM致敏豚鼠皮肤试验
S1：致敏
分别取表4所列已活菌NTM，用生理盐水稀释成50mg/ml的致敏菌液（现用现配）。取符合致敏要求的豚鼠，于每只豚鼠腹股沟处皮下注射0.2ml致敏菌液，每种NTM注射4只，共48只分别，做好标记。三周后，同法于另一侧腹股沟皮下注射0.2ml致敏菌液。
S2：皮试
第一次致敏五到七周，选取每种NTM活菌成功致敏的4只豚鼠，于每只豚鼠背部脊柱两侧皮内注射TB-PPD（50IU/ml），EEC（5µg/ml），致敏菌对应的NTM-PPD（5µg/ml）、致敏菌对应的NTM-PPD（10µg/ml）各0.1ml。注射后24小时观察和测量局部硬结或红晕的纵径与横径（以硬结或红晕大者为准），并求其平均直径（纵径与横径相加除以2）；平均硬结或红晕反应直径≥5mm判为阳性，＜5mm判为阴性。
表4. 致敏用NTM信息表
Figure DEST_PATH_IMAGE008
S3：结果
表5. 堪萨斯分枝杆菌致敏豚鼠皮试24小时检测结果汇总表
Figure DEST_PATH_IMAGE010
表6. 海分枝杆菌致敏豚鼠皮试24小时检测结果汇总表
Figure DEST_PATH_IMAGE012
表7. 戈登分枝杆菌致敏豚鼠皮试24小时检测结果汇总表
Figure DEST_PATH_IMAGE014
表8. 瘰疬分枝杆菌致敏豚鼠皮试24小时检测结果汇总表
Figure DEST_PATH_IMAGE016
表9. 胞内分枝杆菌致敏豚鼠皮试24小时检测结果汇总表
Figure DEST_PATH_IMAGE018
表10. 鸟分枝杆菌致敏豚鼠皮试24小时检测结果汇总表
Figure DEST_PATH_IMAGE020
表11. 脓肿分枝杆菌致敏豚鼠皮试24小时检测结果汇总表
Figure DEST_PATH_IMAGE022
表12. 龟分枝杆菌致敏豚鼠皮试24小时检测结果汇总表
Figure DEST_PATH_IMAGE024
通过分析上述8组实验结果，可以得出TB-PPD对这8种NTM致敏豚鼠呈阳性反应；结核杆菌融合蛋白（EEC）除Ⅰ型的堪萨斯分枝杆菌致敏豚鼠呈阳性反应外，其余均呈阴性反应。
根据全国各大胸科医院及高校的部分文献数据：Ⅰ型NTM感染人数、Ⅱ型NTM感染人数、Ⅲ型NTM感染人数和Ⅳ型NTM感染人数分别占NTM感染总人数的4.2%、5.2%、41.9%和28.4%，主要以Ⅲ型和Ⅳ型为主。因此，结核杆菌融合蛋白（EEC）可用于大多数NTM感染的筛查。
实施例8：应用
结核杆菌融合蛋白（EEC）与结核菌素纯蛋白衍生物（TB-PPD）联用，诊断MTB感染和NTM感染。诊断流程见图6、图7。
实施例9：产品试剂
生产制备得到分别含有结核杆菌融合蛋白（EEC）和结核菌素纯蛋白衍生物（TB-PPD）的试剂，在诊断时，采用实施例8所述方法。
实施例10：产品试剂盒
生产制备得到分别含有结核杆菌融合蛋白（EEC）和结核菌素纯蛋白衍生物（TB-PPD）的制剂，检测所需的标准溶液、反应板、比色卡及产品说明书等，按实施例8所述方法进行诊断。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明做任何形式上的限制，凡是依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化，均落入本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 成都可恩生物科技有限公司
<120> 一种结核分枝杆菌融合蛋白及其制备方法和应用
<130> 2021.11.08
<160> 16
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 288
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
atgacagagc agcagtggaa tttcgcgggt atcgaggccg cggcaagcgc aatccaggga 60
aatgtcacgt ccattcattc cctccttgac gaggggaagc agtccctgac caagctcgca 120
gcggcctggg gcggtagcgg ttcggaggcg taccagggtg tccagcaaaa atgggacgcc 180
acggctaccg agctgaacaa cgcgctgcag aacctggcgc ggacgatcag cgaagccggt 240
caggcaatgg cttcgaccga aggcaacgtc actgggatgt tcgcatag 288
<210> 2
<211> 303
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
atggcagaga tgaagaccga tgccgctacc ctcgcgcagg aggcaggtaa tttcgagcgg 60
atctccggcg acctgaaaac ccagatcgac caggtggagt cgacggcagg ttcgttgcag 120
ggccagtggc gcggcgcggc ggggacggcc gcccaggccg cggtggtgcg cttccaagaa 180
gcagccaata agcagaagca ggaactcgac gagatctcga cgaatattcg tcaggccggc 240
gtccaatact cgagggccga cgaggagcag cagcaggcgc tgtcctcgca aatgggcttc 300
tga 303
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<211> 288
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
atgaccgaac agcagtggaa cttcgcaggc attgaagcgg cggcttctgc aatccagggt 60
aacgttacct ctattcattc tctgttagat gaaggtaaac agagcctgac caaactggct 120
gctgcatggg gtggtagcgg tagtgaagcg tatcagggtg ttcagcaaaa atgggacgca 180
actgcaactg aactgaacaa tgcacttcag aacctggctc gtaccatctc tgaagcaggc 240
caggctatgg cgagcaccga aggtaatgtg actggtatgt tcgcatag 288
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<211> 303
<212> DNA
<213> 人工序列
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atggctgaaa tgaaaactga tgcggctacc ctggctcaag aagctggtaa ctttgaacgt 60
attagcggtg acctgaaaac tcagattgat caagttgaat ctaccgctgg ttctctgcaa 120
ggtcagtggc gtggtgctgc tggtaccgct gctcaggctg cagttgttcg ctttcaagaa 180
gcggcgaaca aacagaaaca ggaactggat gaaatcagca ccaacatccg tcaggctggt 240
gtgcagtata gccgtgctga tgaagaacag cagcaggcac tgtcttctca gatgggtttc 300
taa 303
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
atgggcaccg aacagcagtg gaacttcgca ggcattgaag cggcggcttc tgcaatccag 60
ggtaacgtta cctctattca ttctctgtta gatgaaggta aacagagcct gaccaaactg 120
gctgctgcat ggggtggtag cggtagtgaa gcgtatcagg gtgttcagca aaaatgggac 180
gcaactgcaa ctgaactgaa caatgcactt cagaacctgg ctcgtaccat ctctgaagca 240
ggccaggcta tggcgagcac cgaaggtaat gtgactggta tgttcgcaat gactgaacaa 300
cagtggaatt ttgcgggtat cgaagcagct gcatctgcaa ttcagggtaa cgtgacctct 360
atccactctc tgctcgatga aggtaaacag tctttaacta aactggccgc agcatggggt 420
ggttctggtt ctgaagcata ccagggtgtg cagcagaaat gggatgctac tgctaccgaa 480
ttaaacaacg cgttacaaaa cctggcgcgt actatttctg aagcaggtca ggctatggct 540
tctactgaag gtaacgtaac gggtatgttc gcgatggctg aaatgaaaac tgatgcggct 600
accctggctc aagaagctgg taactttgaa cgtattagcg gtgacctgaa aactcagatt 660
gatcaagttg aatctaccgc tggttctctg caaggtcagt ggcgtggtgc tgctggtacc 720
gctgctcagg ctgcagttgt tcgctttcaa gaagcggcga acaaacagaa acaggaactg 780
gatgaaatca gcaccaacat ccgtcaggct ggtgtgcagt atagccgtgc tgatgaagaa 840
cagcagcagg cactgtcttc tcagatgggt ttctaa 876
<210> 6
<211> 293
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 6
Met Gly Thr Glu Gln Gln Trp Asn Phe Ala Gly Ile Glu Ala Ala
1 5 10 15
Ala Ser Ala Ile Gln Gly Asn Val Thr Ser Ile His Ser Leu Leu Asp
20 25 30
Glu Gly Lys Gln Ser Leu Thr Lys Leu Ala Ala Ala Trp Gly Gly Ser
35 40 45
Gly Ser Glu Ala Tyr Gln Gly Val Gln Gln Lys Trp Asp Ala Thr Ala
50 55 60
Thr Glu Leu Asn Asn Ala Leu Gln Asn Leu Ala Arg Thr Ile Ser Glu
65 70 75 80
Ala Gly Gln Ala Met Ala Ser Thr Glu Gly Asn Val Thr Gly Met Phe
85 90 95
Ala Met Thr Glu Gln Gln Trp Asn Phe Ala Gly Ile Glu Ala Ala Ala
100 105 110
Ser Ala Ile Gln Gly Asn Val Thr Ser Ile His Ser Leu Leu Asp Glu
115 120 125
Gly Lys Gln Ser Leu Thr Lys Leu Ala Ala Ala Trp Gly Gly Ser Gly
130 135 140
Ser Glu Ala Tyr Gln Gly Val Gln Gln Lys Trp Asp Ala Thr Ala Thr
145 150 155 160
Glu Leu Asn Asn Ala Leu Gln Asn Leu Ala Arg Thr Ile Ser Glu Ala
165 170 175
Gly Gln Ala Met Ala Ser Thr Glu Gly Asn Val Thr Gly Met Phe Ala
180 185 190
Met Ala Glu Met Lys Thr Asp Ala Ala Thr Leu Ala Gln Glu Ala Gly
195 200 205
Asn Phe Glu Arg Ile Ser Gly Asp Leu Lys Thr Gln Ile Asp Gln Val
210 215 220
Glu Ser Thr Ala Gly Ser Leu Gln Gly Gln Trp Arg Gly Ala Ala Gly
225 230 235 240
Thr Ala Ala Gln Ala Ala Val Val Arg Phe Gln Glu Ala Ala Asn Lys
245 250 255
Gln Lys Gln Glu Leu Asp Glu Ile Ser Thr Asn Ile Arg Gln Ala Gly
260 265 270
Val Gln Tyr Ser Arg Ala Asp Glu Glu Gln Gln Gln Ala Leu Ser Ser
275 280 285
Gln Met Gly Phe
290
<210> 7
<211> 876
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
atgggcaccg aacagcagtg gaacttcgca ggcattgaag cggcggcttc tgcaatccag 60
ggtaacgtta cctctattca ttctctgtta gatgaaggta aacagagcct gaccaaactg 120
gctgctgcat ggggtggtag cggtagtgaa gcgtatcagg gtgttcagca aaaatgggac 180
gcaactgcaa ctgaactgaa caatgcactt cagaacctgg ctcgtaccat ctctgaagca 240
ggccaggcta tggcgagcac cgaaggtaat gtgactggta tgttcgcaat ggctgaaatg 300
aaaactgatg cggctaccct ggctcaagaa gctggtaact ttgaacgtat tagcggtgac 360
ctgaaaactc agattgatca agttgaatct accgctggtt ctctgcaagg tcagtggcgt 420
ggtgctgctg gtaccgctgc tcaggctgca gttgttcgct ttcaagaagc ggcgaacaaa 480
cagaaacagg aactggatga aatcagcacc aacatccgtc aggctggtgt gcagtatagc 540
cgtgctgatg aagaacagca gcaggcactg tcttctcaga tgggtttcat gactgaacaa 600
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<211> 293
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 8
Met Gly Thr Glu Gln Gln Trp Asn Phe Ala Gly Ile Glu Ala Ala
1 5 10 15
Ala Ser Ala Ile Gln Gly Asn Val Thr Ser Ile His Ser Leu Leu Asp
20 25 30
Glu Gly Lys Gln Ser Leu Thr Lys Leu Ala Ala Ala Trp Gly Gly Ser
35 40 45
Gly Ser Glu Ala Tyr Gln Gly Val Gln Gln Lys Trp Asp Ala Thr Ala
50 55 60
Thr Glu Leu Asn Asn Ala Leu Gln Asn Leu Ala Arg Thr Ile Ser Glu
65 70 75 80
Ala Gly Gln Ala Met Ala Ser Thr Glu Gly Asn Val Thr Gly Met Phe
85 90 95
Ala Met Ala Glu Met Lys Thr Asp Ala Ala Thr Leu Ala Gln Glu Ala
100 105 110
Gly Asn Phe Glu Arg Ile Ser Gly Asp Leu Lys Thr Gln Ile Asp Gln
115 120 125
Val Glu Ser Thr Ala Gly Ser Leu Gln Gly Gln Trp Arg Gly Ala Ala
130 135 140
Gly Thr Ala Ala Gln Ala Ala Val Val Arg Phe Gln Glu Ala Ala Asn
145 150 155 160
Lys Gln Lys Gln Glu Leu Asp Glu Ile Ser Thr Asn Ile Arg Gln Ala
165 170 175
Gly Val Gln Tyr Ser Arg Ala Asp Glu Glu Gln Gln Gln Ala Leu Ser
180 185 190
Ser Gln Met Gly Phe Met Thr Glu Gln Gln Trp Asn Phe Ala Gly Ile
195 200 205
Glu Ala Ala Ala Ser Ala Ile Gln Gly Asn Val Thr Ser Ile His Ser
210 215 220
Leu Leu Asp Glu Gly Lys Gln Ser Leu Thr Lys Leu Ala Ala Ala Trp
225 230 235 240
Gly Gly Ser Gly Ser Glu Ala Tyr Gln Gly Val Gln Gln Lys Trp Asp
245 250 255
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260 265 270
Ile Ser Glu Ala Gly Gln Ala Met Ala Ser Thr Glu Gly Asn Val Thr
275 280 285
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<211> 873
<212> DNA
<213> 人工序列
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gctgcatggg gtggtagcgg tagtgaagcg tatcagggtg ttcagcaaaa atgggacgca 480
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<212> PRT
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<400> 12
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195 200 205
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<213> 人工序列
<400> 13
atggctgaaa tgaaaactga tgcggctacc ctggctcaag aagctggtaa ctttgaacgt 60
attagcggtg acctgaaaac tcagattgat caagttgaat ctaccgctgg ttctctgcaa 120
ggtcagtggc gtggtgctgc tggtaccgct gctcaggctg cagttgttcg ctttcaagaa 180
gcggcgaaca aacagaaaca ggaactggat gaaatcagca ccaacatccg tcaggctggt 240
gtgcagtata gccgtgctga tgaagaacag cagcaggcac tgtcttctca gatgggtttc 300
atgaccgaac agcagtggaa cttcgcaggc attgaagcgg cggcttctgc aatccagggt 360
aacgttacct ctattcattc tctgttagat gaaggtaaac agagcctgac caaactggct 420
gctgcatggg gtggtagcgg tagtgaagcg tatcagggtg ttcagcaaaa atgggacgca 480
actgcaactg aactgaacaa tgcacttcag aacctggctc gtaccatctc tgaagcaggc 540
caggctatgg cgagcaccga aggtaatgtg actggtatgt tcgcaatggc tgaaatgaaa 600
actgatgcgg ctaccctggc tcaagaagct ggtaactttg aacgtattag cggtgacctg 660
aaaactcaga ttgatcaagt tgaatctacc gctggttctc tgcaaggtca gtggcgtggt 720
gctgctggta ccgctgctca ggctgcagtt gttcgctttc aagaagcggc gaacaaacag 780
aaacaggaac tggatgaaat cagcaccaac atccgtcagg ctggtgtgca gtatagccgt 840
gctgatgaag aacagcagca ggcactgtct tctcagatgg gtttctaa 888
<210> 14
<211> 297
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 14
Met Ala Glu Met Lys Thr Asp Ala Ala Thr Leu Ala Gln Glu Ala
1 5 10 15
Gly Asn Phe Glu Arg Ile Ser Gly Asp Leu Lys Thr Gln Ile Asp Gln
20 25 30
Val Glu Ser Thr Ala Gly Ser Leu Gln Gly Gln Trp Arg Gly Ala Ala
35 40 45
Gly Thr Ala Ala Gln Ala Ala Val Val Arg Phe Gln Glu Ala Ala Asn
50 55 60
Lys Gln Lys Gln Glu Leu Asp Glu Ile Ser Thr Asn Ile Arg Gln Ala
65 70 75 80
Gly Val Gln Tyr Ser Arg Ala Asp Glu Glu Gln Gln Gln Ala Leu Ser
85 90 95
Ser Gln Met Gly Phe Met Thr Glu Gln Gln Trp Asn Phe Ala Gly Ile
100 105 110
Glu Ala Ala Ala Ser Ala Ile Gln Gly Asn Val Thr Ser Ile His Ser
115 120 125
Leu Leu Asp Glu Gly Lys Gln Ser Leu Thr Lys Leu Ala Ala Ala Trp
130 135 140
Gly Gly Ser Gly Ser Glu Ala Tyr Gln Gly Val Gln Gln Lys Trp Asp
145 150 155 160
Ala Thr Ala Thr Glu Leu Asn Asn Ala Leu Gln Asn Leu Ala Arg Thr
165 170 175
Ile Ser Glu Ala Gly Gln Ala Met Ala Ser Thr Glu Gly Asn Val Thr
180 185 190
Gly Met Phe Ala Met Ala Glu Met Lys Thr Asp Ala Ala Thr Leu Ala
195 200 205
Gln Glu Ala Gly Asn Phe Glu Arg Ile Ser Gly Asp Leu Lys Thr Gln
210 215 220
Ile Asp Gln Val Glu Ser Thr Ala Gly Ser Leu Gln Gly Gln Trp Arg
225 230 235 240
Gly Ala Ala Gly Thr Ala Ala Gln Ala Ala Val Val Arg Phe Gln Glu
245 250 255
Ala Ala Asn Lys Gln Lys Gln Glu Leu Asp Glu Ile Ser Thr Asn Ile
260 265 270
Arg Gln Ala Gly Val Gln Tyr Ser Arg Ala Asp Glu Glu Gln Gln Gln
275 280 285
Ala Leu Ser Ser Gln Met Gly Phe
290 295
<210> 15
<211> 888
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 15
atggctgaaa tgaaaactga tgcggctacc ctggctcaag aagctggtaa ctttgaacgt 60
attagcggtg acctgaaaac tcagattgat caagttgaat ctaccgctgg ttctctgcaa 120
ggtcagtggc gtggtgctgc tggtaccgct gctcaggctg cagttgttcg ctttcaagaa 180
gcggcgaaca aacagaaaca ggaactggat gaaatcagca ccaacatccg tcaggctggt 240
gtgcagtata gccgtgctga tgaagaacag cagcaggcac tgtcttctca gatgggtttc 300
atggctgaaa tgaaaactga tgcggctacc ctggctcaag aagctggtaa ctttgaacgt 360
attagcggtg acctgaaaac tcagattgat caagttgaat ctaccgctgg ttctctgcaa 420
ggtcagtggc gtggtgctgc tggtaccgct gctcaggctg cagttgttcg ctttcaagaa 480
gcggcgaaca aacagaaaca ggaactggat gaaatcagca ccaacatccg tcaggctggt 540
gtgcagtata gccgtgctga tgaagaacag cagcaggcac tgtcttctca gatgggtttc 600
atgaccgaac agcagtggaa cttcgcaggc attgaagcgg cggcttctgc aatccagggt 660
aacgttacct ctattcattc tctgttagat gaaggtaaac agagcctgac caaactggct 720
gctgcatggg gtggtagcgg tagtgaagcg tatcagggtg ttcagcaaaa atgggacgca 780
actgcaactg aactgaacaa tgcacttcag aacctggctc gtaccatctc tgaagcaggc 840
caggctatgg cgagcaccga aggtaatgtg actggtatgt tcgcataa 888
<210> 16
<211> 297
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 16
Met Ala Glu Met Lys Thr Asp Ala Ala Thr Leu Ala Gln Glu Ala
1 5 10 15
Gly Asn Phe Glu Arg Ile Ser Gly Asp Leu Lys Thr Gln Ile Asp Gln
20 25 30
Val Glu Ser Thr Ala Gly Ser Leu Gln Gly Gln Trp Arg Gly Ala Ala
35 40 45
Gly Thr Ala Ala Gln Ala Ala Val Val Arg Phe Gln Glu Ala Ala Asn
50 55 60
Lys Gln Lys Gln Glu Leu Asp Glu Ile Ser Thr Asn Ile Arg Gln Ala
65 70 75 80
Gly Val Gln Tyr Ser Arg Ala Asp Glu Glu Gln Gln Gln Ala Leu Ser
85 90 95
Ser Gln Met Gly Phe Met Ala Glu Met Lys Thr Asp Ala Ala Thr Leu
100 105 110
Ala Gln Glu Ala Gly Asn Phe Glu Arg Ile Ser Gly Asp Leu Lys Thr
115 120 125
Gln Ile Asp Gln Val Glu Ser Thr Ala Gly Ser Leu Gln Gly Gln Trp
130 135 140
Arg Gly Ala Ala Gly Thr Ala Ala Gln Ala Ala Val Val Arg Phe Gln
145 150 155 160
Glu Ala Ala Asn Lys Gln Lys Gln Glu Leu Asp Glu Ile Ser Thr Asn
165 170 175
Ile Arg Gln Ala Gly Val Gln Tyr Ser Arg Ala Asp Glu Glu Gln Gln
180 185 190
Gln Ala Leu Ser Ser Gln Met Gly Phe Met Thr Glu Gln Gln Trp Asn
195 200 205
Phe Ala Gly Ile Glu Ala Ala Ala Ser Ala Ile Gln Gly Asn Val Thr
210 215 220
Ser Ile His Ser Leu Leu Asp Glu Gly Lys Gln Ser Leu Thr Lys Leu
225 230 235 240
Ala Ala Ala Trp Gly Gly Ser Gly Ser Glu Ala Tyr Gln Gly Val Gln
245 250 255
Gln Lys Trp Asp Ala Thr Ala Thr Glu Leu Asn Asn Ala Leu Gln Asn
260 265 270
Leu Ala Arg Thr Ile Ser Glu Ala Gly Gln Ala Met Ala Ser Thr Glu
275 280 285
Gly Asn Val Thr Gly Met Phe Ala
290 295

Claims (10)

1. 一种结核分枝杆菌融合蛋白在制备用于诊断或辅助诊断结核分支杆菌感染、非结核分支杆菌感染产品中的应用，其特征在于：所述结核分枝杆菌融合蛋白为氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示的融合蛋白EEC、氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示的融合蛋白ECE、氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示的融合蛋白CEE、氨基酸序列如SEQ ID NO:12所示的融合蛋白ECC、氨基酸序列如SEQ ID NO:14所示的融合蛋白CEC或氨基酸序列如SEQ ID NO:16所示的融合蛋白CCE中的一种，
所述结核分枝杆菌融合蛋白满足以下产品指标：
纯度≥95%；
分子量为30.6kD±3.1kD；
等电点主区带为3.8~4.8；
紫外光谱最大吸收峰波长为280nm±3nm；
N端氨基酸序列为(Met)-Gly-Thr-Glu-Gln-Gln-Trp-Asn-Phe-Ala-Gly-Ile-Glu-Ala-Ala-Ala或(Met)-Ala-Glu-Met-Lys-Thr-Asp-Ala-Ala-Thr-Leu-Ala-Gln-Glu-Ala-Gly；
外源性DNA残留量≤10ng/ml；
宿主菌蛋白质残留量≤蛋白质总量的0.01%；
抗生素残留量≤1ng/ml。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述诊断或辅助诊断的方法包括皮肤试验法、免疫学法或其他医学上可实现的方法。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述产品包括试剂、试剂盒或其他医学上可实现的产品。
4.一种用于诊断或辅助诊断结核分支杆菌感染、非结核分支杆菌感染的产品，其特征在于：包含权利要求1所述结核分枝杆菌融合蛋白，且满足权利要求1所述产品指标。
5.根据权利要求4所述的产品，其特征在于：所述诊断或辅助诊断的方法包括皮肤试验法、免疫学法或其他医学上可实现的方法。
6.根据权利要求4所述的产品，其特征在于：所述产品包括试剂、试剂盒或其他医学上可实现的产品。
7.一种如权利要求1所述应用中使用的结核分枝杆菌融合蛋白。
8.一种制备权利要求7所述结核分枝杆菌融合蛋白的方法，其特征在于：将编码所述结核分枝杆菌融合蛋白的核酸导入宿主细胞中进行表达。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：还包括对表达菌株的发酵和纯化，步骤如下：
（1）发酵：将表达菌株接种至M9培养基中，经两级培养得到发酵种子液，再将种子液接种至全合成培养基中进行发酵培养后，离心收集菌体；
（2）纯化：将菌体破碎、离心后，经阴离子交换层析、疏水作用层析、分子筛层析后得到纯化的结核分枝杆菌融合蛋白。
10.一种编码权利要求8所述结核分枝杆菌融合蛋白的核酸，其特征在于：其核苷酸序列选自下述中的任一种：
（1）如SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列，或其互补序列，或与其具有至少80%同源性的核苷酸序列；
（2）如SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列，或其互补序列，或与其具有至少80%同源性的核苷酸序列；
（3）如SEQ ID NO:9所示的核苷酸序列，或其互补序列，或与其具有至少80%同源性的核苷酸序列；
（4）如SEQ ID NO:11所示的核苷酸序列，或其互补序列，或与其具有至少80%同源性的核苷酸序列；
（5）如SEQ ID NO:13所示的核苷酸序列，或其互补序列，或与其具有至少80%同源性的核苷酸序列；
（6）如SEQ ID NO:15所示的核苷酸序列，或其互补序列，或与其具有至少80%同源性的核苷酸序列。
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Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114957487A (zh) * 2022-05-24 2022-08-30 北京祥瑞生物制品股份有限公司 一种重组结核分枝杆菌融合蛋白及其在结核诊断中应用
CN115184603A (zh) * 2022-06-30 2022-10-14 首都医科大学附属北京胸科医院 EspC蛋白在制备结核分枝杆菌分离或富集产品中的应用
WO2023078438A1 (zh) * 2021-11-08 2023-05-11 成都可恩生物科技有限公司 一种结核分枝杆菌融合蛋白及其制备方法和应用
WO2023179592A1 (zh) * 2022-03-22 2023-09-28 安博智联(北京)生物科技有限公司 结核分枝杆菌特异性的重组融合蛋白e35及其应用

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110423279A (zh) * 2019-06-20 2019-11-08 扩增生物科技(北京)有限公司 结核分枝杆菌重组融合蛋白eecc及其制备方法和应用
CN110684116A (zh) * 2019-08-23 2020-01-14 北京恩元华生物科技有限公司 一种结核分枝杆菌eec融合蛋白、制备方法及其应用
CN111905110A (zh) * 2020-07-27 2020-11-10 北京恩元华生物科技有限公司 一种鉴别结核杆菌感染与非结核分枝杆菌感染的方法、系统及应用
CN113045677A (zh) * 2021-05-06 2021-06-29 北京祥瑞生物制品有限公司 一种重组融合蛋白及其在结核诊断中应用

Family Cites Families (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB0215710D0 (en) * 2002-07-05 2002-08-14 Isis Innovation Diagnostic method
CN101221173A (zh) * 2007-01-12 2008-07-16 中国人民解放军总医院第二附属医院 ELISpot结核感染诊断试剂盒及其应用
CN107076744B (zh) * 2014-08-29 2021-01-19 国家科研中心 用于诊断潜伏性感染的结核分枝杆菌的组合物
CN105524177A (zh) * 2015-10-14 2016-04-27 中国人民解放军第三O九医院 结核分枝杆菌特异性融合蛋白及其编码基因与应用
CN106955361B (zh) * 2016-01-08 2020-10-27 浙江海正药业股份有限公司 一种含有结核病变态反应原ce的药物组合物
CN107219362B (zh) * 2017-03-29 2019-08-09 武汉海吉力生物科技有限公司 用于检测结核感染t细胞的抗原、试剂盒及应用
CN107219363B (zh) * 2017-03-29 2019-06-21 武汉海吉力生物科技有限公司 用于检测结核感染t细胞的抗原、试剂盒及应用
CN107144694B (zh) * 2017-03-29 2019-06-14 武汉海吉力生物科技有限公司 用于检测结核感染t细胞的抗原、试剂盒及应用
CN107141341B (zh) * 2017-03-29 2020-08-28 武汉海吉力生物科技有限公司 检测结核分枝杆菌感染的抗原多肽池及应用
CN107011418B (zh) * 2017-03-29 2020-08-25 武汉海吉力生物科技有限公司 检测结核分枝杆菌感染的抗原多肽池及其应用
CN107216373B (zh) * 2017-03-29 2020-08-21 武汉海吉力生物科技有限公司 检测结核分枝杆菌感染的抗原多肽池及其应用
US20220214340A1 (en) * 2019-04-28 2022-07-07 Leide Biosciences Co., Ltd. Zipper structure that helps the formation of protein dimer and application thereof
CN113980145B (zh) * 2021-11-08 2022-08-12 成都可恩生物科技有限公司 一种结核分枝杆菌融合蛋白及其制备方法和应用

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110423279A (zh) * 2019-06-20 2019-11-08 扩增生物科技(北京)有限公司 结核分枝杆菌重组融合蛋白eecc及其制备方法和应用
CN110684116A (zh) * 2019-08-23 2020-01-14 北京恩元华生物科技有限公司 一种结核分枝杆菌eec融合蛋白、制备方法及其应用
CN111905110A (zh) * 2020-07-27 2020-11-10 北京恩元华生物科技有限公司 一种鉴别结核杆菌感染与非结核分枝杆菌感染的方法、系统及应用
CN113045677A (zh) * 2021-05-06 2021-06-29 北京祥瑞生物制品有限公司 一种重组融合蛋白及其在结核诊断中应用

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2023078438A1 (zh) * 2021-11-08 2023-05-11 成都可恩生物科技有限公司 一种结核分枝杆菌融合蛋白及其制备方法和应用
WO2023179592A1 (zh) * 2022-03-22 2023-09-28 安博智联(北京)生物科技有限公司 结核分枝杆菌特异性的重组融合蛋白e35及其应用
CN114957487A (zh) * 2022-05-24 2022-08-30 北京祥瑞生物制品股份有限公司 一种重组结核分枝杆菌融合蛋白及其在结核诊断中应用
CN114957487B (zh) * 2022-05-24 2024-01-26 北京先声祥瑞生物制品股份有限公司 一种重组结核分枝杆菌融合蛋白及其在结核诊断中应用
CN115184603A (zh) * 2022-06-30 2022-10-14 首都医科大学附属北京胸科医院 EspC蛋白在制备结核分枝杆菌分离或富集产品中的应用
CN115184603B (zh) * 2022-06-30 2024-02-06 首都医科大学附属北京胸科医院 EspC蛋白在制备结核分枝杆菌分离或富集产品中的应用

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