CN116003540A - 一种结核分枝杆菌抗原组合物pfhp010的制备及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种结核分枝杆菌抗原组合物PFHP010的制备及其应用。本发明所提供的结核分枝杆菌抗原组合物PFHP010，包含抗原PPE18，FadD28、PlcA以及HspX，并通过基因工程技术将它们融合成为一种新型融合蛋白PFHP010f。本发明构建的多组分蛋白亚单位疫苗可诱导机体产生较强的细胞、体液免疫，且在小鼠免疫过程中未见明显毒副作用。本发明选择将多个结核杆菌不同感染阶段潜在抗原组分联合制备疫苗，更具有针对性，可达到甚至超过BCG的免疫保护效果，且具有成本低、安全性好等优势，有望成为结核病预防和治疗的候选疫苗。

Description

一种结核分枝杆菌抗原组合物PFHP010的制备及其应用

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及一种结核分枝杆菌抗原组合物PFHP010的制备及其应用。

背景技术

结核病(tuberculosis，TB)是由结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis，Mtb)感染引起的慢性传染病，是目前严重危害人类健康的传染性疾病之一。卡介苗(Bacillus Calmette Guerin，BCG)作为控制结核的传统疫苗，在多次传代过程中可能丢失了某些结核分枝杆菌重要抗原导致其对成人保护效果不理想。因此，当前亟待研发新型抗结核疫苗。目前进入临床试验阶段的结核病疫苗，包括重组卡介苗、全菌灭活疫苗、DNA疫苗、蛋白/多肽疫苗和病毒载体疫苗等，结核分枝杆菌蛋白重组亚单位疫苗已经成为新型结核疫苗的研发热点。而构建重组蛋白亚单位疫苗，筛选有效的结核分枝杆菌保护性抗原是关键。

接种卡介苗仍然是结核病控制的重要策略，在儿童中应用能够最大限度的保护其免受结核分枝杆菌的感染，但其主要缺陷在于不能提供持久的免疫保护，且对青少年和成年人保护效果不稳定、可能激活免疫缺陷病人潜伏感染的结核分枝杆菌从而致病。目前在研结核疫苗主要包括亚单位疫苗、病毒载体疫苗、DNA疫苗和重组BCG疫苗等。其中病毒载体疫苗使用的载体多为人腺病毒载体和痘病毒载体，但目前人群中普遍存在对人腺病毒的抗体，使以其为载体的疫苗免疫保护效果欠佳；而以痘病毒为基础构建的疫苗在目前的临床试验中并未显现出完全抵抗结核分枝杆菌的感染或者清除患者体内结核分枝杆菌的能力；虽然重组BCG疫苗和DNA疫苗在动物实验中初步显示了较好的免疫保护效果，但其安全性和有效性尚未得到充分验证。

目前多数亚单位疫苗研发中多选用结核分枝杆菌生长期抗原作为疫苗组分，但结核分枝杆菌不同感染阶段表达的抗原存在较大差异，因此仅选择某一时期的抗原制备疫苗有可能不能诱导针对不同感染状态下的保护性免疫应答。而多组分蛋白亚单位疫苗则以多个结核分枝杆菌不同感染阶段表达的抗原为组分，既可保护健康人群免受感染，还能有效控制、清除结核潜伏感染和活动性结核患者体内结核分枝杆菌。

发明内容

卡介苗存在对成人结核病保护效果不佳，不适用于免疫缺陷人群等问题，而重组蛋白亚单位疫苗成分明确、安全性好,因而具有较好的应用开发前景。本发明提供抗原组合物PFHP010可诱导机体产生保护性免疫反应，具有良好的应用潜力。

第一方面，本发明提供一种结核分枝杆菌抗原组合物，包括nPPE18，nFadD28、PlcA和HspX四种抗原组分。

PPE18属于分泌性抗原，可介导病原体-宿主的相互作用，诱导巨噬细胞产生IL-10，诱导Th2型免疫反应。

HspX可诱导CD4+T细胞反应，同时刺激产生IL-2和IL-17等保护性细胞因子，有效诱导Th1型免疫反应和体液免疫反应，具有成为结核亚单位疫苗的潜力。

FadD28可与结核分枝杆菌型分泌系统ESX-1协同工作，促进结核分枝杆菌的毒力，且具有良好的免疫原性。

PlcA作为一种膜相关磷脂酶，是结核分枝杆菌的重要毒力因子，并且其编码基因在BCG中缺失，可能是BCG无法诱导长期保护的关键因素。

BCG是经过数百次传代后形成的减毒牛型结核杆菌活菌苗，BCG的保护效果不佳可能由于传代过程中丢失了某些重要的优势抗原。因此目前蛋白亚单位疫苗研发的其中一个思路是寻找BCG缺失的优势抗原，即在传代过程中丢失的而在结核分枝杆菌中存在的抗原。本发明发现选择结核分枝杆菌的重要毒力因子PlcA作为抗原组分，可刺激机体产生针对BCG缺失抗原的特异性免疫反应。

根据结核分枝杆菌不同的代谢状态可分为复苏期、复制期和休眠期多个阶段。

在不同代谢状态下，结核分枝杆菌有不同的免疫优势抗原，复制期优势表达抗原如PPE18、Ag85B等；休眠期优势抗原如HspX、Rv2660c等。此外，一些与细胞壁/细胞膜相关的蛋白也能诱导机体产生保护性免疫反应。

结核分枝杆菌侵入机体后一般处于几种代谢状态，如休眠期、潜伏期、感染期等。在不同的阶段，结核分枝杆菌会分泌不同的蛋白成分协助其在宿主体内更稳定的存活。传统的观点会选用其感染期表达的毒力因子或表面蛋白作为抗原成分制备疫苗。但由于结核分枝杆菌的潜伏期较长、且潜伏期对于控制疾病的传播至关重要，因此潜伏期抗原成分正在成为结核疫苗的研发热点。在本申请中，将结核生长期的外膜抗原(如PlcA、FaD8)与潜伏期抗原(如PPE18、HspX)联合佐剂制备多阶段亚单位疫苗，针对结核感染的不同状态甚至是免疫策略的调整提出了潜在的解决方案。

同时，本发明提供的抗原组合突出优势在于：采用PPE18，FadD28、PlcA三种抗原的表位集中区，而非整条抗原分子，这是进入临床期的亚单位疫苗未采用的方式，此种策略一方面提高了免疫针对性，另一方面，也便于后续的抗原表达纯化步骤，提高了抗原表达效率。

对于疫苗的的研发，有效抗原的筛选是决定性的步骤，免疫原性良好的优势抗原选择是疫苗设计的关键。常规的抗原筛选过程，大多基于致病模型验证病原中潜在的有效的抗原。目前处于临床期的亚单位疫苗优势抗原的筛选采用的方法均采用传统的疫苗设计方式，同时对数十甚至数百种抗原同时进行动物模型验证而未应用生物信息学工具预先进行预测，且未进行表位的筛选以及抗原的优化。

目前已有多项研究表明选择抗原表位集中区作为疫苗候选抗原可表现出与整条抗原分子相似甚至更高的免疫原性。如Luan X etc.以及Fan X etc.等的研究均充分验证了抗原表位在免疫原性方面表现出的优势。

在本发明中，研究团队采用反向疫苗学的设计思路，根据病原额基因组特征、利用NetMHCⅡpan3.2 Server、SYFPEITHI、TEpredict等工具对抗原进行表位筛选和结构预测，在优选免疫优势抗原的基础上结合多种生物信息学工具进行抗原表位筛选以及结构预测后进行动物模型验证。使得后期的动物模型验证不仅工作量减少、且针对性更强，验证的结果更加可靠、可信。

亚单位疫苗研发的重点和难点在于选择具有免疫原性的抗原表位，尽管已有多种候选疫苗在临床试验中进行评估，但多数候选疫苗存在优势抗原类型单一的问题，可能在后续临床试验中不能显示出较好的临床保护效果，为克服上述难点，在优选出免疫原性良好的优势抗原基础上，可采用多种抗原表位联合及评估，将多个抗原混合或融合表达的策略以提高疫苗免疫保护效果。ESAT6、CFP10、Ag85复合物、PPE18等结核生长期优势抗原以及Rv2660c、HspX等潜伏期抗原都是目前的热门候选抗原，因此本发明提供抗原组合的设计思路是选用不同代谢状态下结核分枝杆菌优势抗原，不仅包含目前疫苗开发常用的生长期优势抗原PPE18以及潜伏期优势抗原HspX等已被证明具有良好的免疫原性的抗原，同时选用免疫原性良好且目前尚未被应用于结核疫苗研发的重要毒力因子PlcA以及FadD28，并且利用NetMHCⅡpan3.2 Server、SYFPEITHI、TEpredict和IEDB等生物信息学工具进行抗原表位筛选，删除PPE18，FadD28的冗余片段，提高抗原表达效率，以此种方式形成一种全新的抗原组合nPPE18，nFadD28、PlcA和HspX。

本发明主要研发流程：

(1)依据GenBank公布的Mycobacterium tuberculosis H37Rv(NC_000962.3)株的基因注释信息，获得其中注释为：膜蛋白、分泌蛋白、营养摄取和存活关键因子等相关的基因信息。

(2)首先，对IEDB数据库已经公开涉及相关基因的人T、B细胞表位情况进行检索；其次，使用表位预测工具，基于前述基因的核酸序列，进行人T细胞表位和B细胞表位预测。随后，对检索获得和预测获得的表位序列在对应基因中进行精确定位，并基于表位序列的定位信息和表位序列的可靠程度，形成表位在基因区的分布图。

(3)基于基因中表位丰富程度和基因编码的蛋白产物类型，确定进行人群免疫学验证的优先顺序：即首先验证其中表位丰富的分泌性蛋白、其次是膜蛋白等其它蛋白。

(4)若需要验证基因序列较短，则采用全长蛋白克隆表达，纯化后进行免疫学验证。若基因序列较长，则选择对其中的表位丰富区区域进行克隆表达或化学合成多肽，进行免疫学验证。

(5)人群免疫学验证：分别使用建康人、结核病患者和其他肺部疾病患者的抗凝全血，使用ELISPOT、T-SPOT等体外免疫反应检测试剂进行筛选，获得相关抗原的抗原性。

(6)动物免疫学验证：对于人群免疫学筛选验证中反应较好的蛋白、多肽，再进行动物实验初步验证，并通过检测淋巴细胞分类变化情况和关键细胞因子水平变化情况，评估相关抗原的免疫原性。

(7)对经人群免疫学和动物免疫学验证，同时具有较好免疫原性和抗原性抗原，对其基因再进行密码子优化、联接臂选择等过程，形成最终串联序列。

(8)序列串联的规则主要是：主要是按照相关基因在基因组中的先后位置，确定抗原基因的排列顺序，同时结合AlphaFold2等结构预测工具，选择能够将最多表位位置暴露的空间构型时的基因序列顺序，形成最终的串联表达序列。

第二方面，本发明提供一种结核分枝杆菌混合蛋白抗原PFHP010m，包含nRv1196、nRv2941、Rv2031c、Rv2351c四种基因片段的表达产物。

在本发明提供的结核分枝杆菌混合蛋白抗原PFHP010m中，所述nRv1196的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，编码蛋白为nPPE18；所述nRv2941的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，编码蛋白为nFadD28；所述Rv2031c的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，编码蛋白为HspX；所述Rv2351c的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示编码蛋白为PlcA。

本发明提供的结核分枝杆菌混合蛋白抗原PFHP010m，由独立表达的抗原nPPE18、nFadD28、HspX和PlcA构成混合抗原PFHP010m；以摩尔比计，含有相同摩尔量的抗原nPPE18、nFadD28、HspX和PlcA。

本发明提供的结核分枝杆菌混合蛋白抗原PFHP010m中，nPPE18的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，nFadD28的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示，HspX的氨基酸序列如SEQ IDNO.7所示；PlcA的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示。

第三方面，本发明提供结核分枝杆菌混合蛋白抗原PFHP010m的制备方法，

针对编码HspX和PlcA抗原的基因Rv2031c和Rv2351c，以结核分枝杆菌菌株H37Rv基因组为模板，通过特异性引物利用PCR技术分别扩增各组分基因片段连接至pET32a载体上，构建重组质粒；利用基因合成技术合成编码nPPE18和nFadD28抗原的基因nRv1196、nRv2941，并连接至PMD19T质粒上后经双酶切连接至pET32a载体上，构建重组质粒；将重组质粒分别经IPTG诱导后在大肠杆菌中表达，采用镍离子亲和层析和离子交换层析技术纯化目的蛋白。

第四方面，本发明提供一种融合蛋白抗原PFHP010f，所述融合蛋白抗原PFHP010f的核苷酸序列从N端到C端按照nRv1196、nRv2941、Rv2031c和Rv2351c，通过linker连接得到联合基因。

本发明提供的融合蛋白抗原PFHP010f，所述联合基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.9所示，所述联合基因编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.10所示。

第六方面，本发明提供融合蛋白抗原PFHP010f的制备方法，

先通过linker将选定的nRv1196、nRv2941、Rv2031c和Rv2351c连接构建成融合基因的重组质粒连接至pET43.1a载体，经IPTG诱导后在大肠杆菌中表达融合蛋白PFHP010f；采用镍离子亲和层析和离子交换层析技术纯化表达出的蛋白。

第七方面，本发明提供上述的结核分枝杆菌抗原组合物或上述的结核分枝杆菌混合蛋白抗原PFHP010m或上述的融合蛋白抗原PFHP010f在以下任一方面的应用：

(1)制备诊断结核分枝杆菌感染或结核分枝杆菌感染引起疾病的试剂；

(2)制备预防结核分枝杆菌感染疫苗；

(3)制备治疗结核分枝杆菌感染引起疾病的药物。

本发明的有益效果在于：

本发明提供了一种具有结核分枝杆菌免疫原性的新型抗原组合PFHP010的表达纯化方法，并将其与佐剂联合构建两种亚单位疫苗、免疫小鼠并进行免疫效果评价。PFHP010m/佐剂和PFHP010f/佐剂免疫小鼠后，抗原特异性抗体IgG水平显著高于BCG组，用于制备亚单位疫苗均可产生较强的体液免疫。IgG2a/IgG1结果显示两组均偏向Th2型免疫反应。PFHP010f/佐剂刺激、诱导产生的IFN-γ、IL-4水平显著高于BCG对照组，PFHP010m/佐剂刺激、诱导产生不低于BCG对照组的IFN-γ、IL-4，提示PFHP010m和EPFHP010f作为亚单位抗原用于结核疫苗可诱导产生更全面的免疫保护反应。同时，结核分枝杆菌体外生长抑制实验(MGIA)发现PFHP010m和PFHP010f组均表现出与BCG组相同的抑制分枝杆菌生长能力。因此，该抗原组合作为亚单位疫苗抗原成分能够刺激机体产生足够的保护性细胞免疫和体液免疫。

本发明构建的多组分蛋白亚单位疫苗可诱导机体产生较强的细胞、体液免疫，且在小鼠免疫过程中未见明显毒副作用。本发明选择将多个结核杆菌不同感染阶段潜在抗原组分联合制备疫苗，更具有针对性，可达到甚至超过BCG的免疫保护效果，且具有成本低、安全性好等优势，有望成为结核病预防和治疗的候选疫苗。

附图说明

为了更清楚地说明本发明或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作一简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是纯化得到PFHP010m各组分抗原和融合蛋白PFHP010f的SDS-PAGE结果图，其中，1为PFHP010f融合蛋白、2为nPPE18、3为nFadD28、4为HspX、5为PlcA，其理论分子量分别为96.1kD、31.4kD、33.93kD、36.35kD、76.83kD。

图2是各组血清抗体滴度的检测结果图，图中ns代表P＞0.05，结果无统计学差异，*代表P≤0.05，结果有统计学差异，****代表P≤0.0001，结果有统计学差异，**代表P≤0.01，结果有统计学差异。

图3是PFHP010m组和PFHP010f组的IgG2a/IgG1比值，图中ns代表P＞0.05，结果无统计学差异，*代表P≤0.05，结果有统计学差异。

图4a是ELISPOT的IFN-γ结果，图中ns代表P＞0.05，结果无统计学差异，****代表P≤0.0001，结果有统计学差异，***代表P≤0.001，结果有统计学差异。

图4b是ELISPOT的IL-4结果，图中ns代表P＞0.05，结果无统计学差异，*代表P≤0.05，结果有统计学差异，***代表P≤0.001，结果有统计学差异，**代表P≤0.01，结果有统计学差异。

图5是PFHP010f/佐剂与PFHP010m/佐剂的分枝杆菌体外生长抑制实验结果，图中ns代表P＞0.05，结果无统计学差异，*代表P≤0.05，结果有统计学差异，**代表P≤0.01，结果有统计学差异，***代表P≤0.001，结果有统计学差异，****代表P≤0.0001，结果有统计学差异。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明中的附图，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1T细胞表位预测及富含T细胞表位序列的选择

在美国国家生物技术信息中心(NCBI)的数据库中，检索全部结核分枝杆菌的Rv1196、Rv2941基因序列，利用NetMHCⅡpan3.2 Server、SYFPEITHI、TEpredict和IEDB在线工具预测PPE18、FadD28的CD4+、CD8+T细胞表位，选取HLA-Ⅱ类分子(HLA-DRB1*0101、DRB1*0301、DRB1*0401、DRB1*0701、DRB1*0802、DRB1*0901、DRB1*1101、DRB1*1302、DRB1*1501)、MHC类型选择HLA-I类分子HLA-A*0201、*0202、*0203、*0206作为预测限定条件。综合分析CD4+、CD8+T细胞表位预测分析结果，选取与HLA-I类分子和HLA-Ⅱ类分子结合性较好的表位肽段，得到优势抗原表位肽集中区。PPE18选择的集中区为PPE18蛋白的第201-300位氨基酸序列；FadD28选择的集中区为FadD28的第217-339位氨基酸序列，分别将表位区对应的核苷酸进行剪接后串联形成表位富集区基因nPPE18和nFadD28。

实施例2nPPE18、nFadD28、HspX、PlcA以及融合蛋白PFHP010f重组质粒构建

1、引物设计与合成

根据结核分枝杆菌H37Rv的Rv2031c、Rv2351c基因序列设计特异性引物；基于表位富集区基因nPPE18和nFadD28体外合成nPPE18和nFadD28片段，并在两端添加酶切位点BamHI/HindIII后分别连接至载体PMD19T构建成PMD19T-nRv1196和PMD19T-nRv2941，同时针对合成的基因序列设计特异性引物(引物及酶切位点信息见表1)。

表1

注：表中下划线部分表示酶切位点。

2、基因的扩增、克隆与鉴定

以结核分枝杆菌H37Rv基因组为模板，扩增目的基因Rv2031c、Rv2351c(反应条件：94℃预变性10min；94℃变性30s，56℃退火35s，72℃延伸45s，循环数为35；最后于72℃延伸10min)，将扩增得到的PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳后检测PCR产物，用于重组质粒构建。将Rv2031c、Rv2351c基因的PCR产物、表达载体pET32a以及PMD19T-nRv1196和PMD19T-nRv2941分别利用限制性核酸内切酶EcoRI、Hin dⅢ和BamHI、HindIII进行双酶切，然后用T4连接酶(反应体系：DNA 500ng、Ec oRI1μl、HindⅢ1μl(或BamHI、HindIII 1μl)、ddH2O补足50μl、2×buffer25μl，16℃连接14～16h)将Rv2031c、Rv2351c、nRv1196、nRv2941的DNA片段与载体质粒pET32a连接，转化进入DH5α感受态细胞(转化条件：质粒与感受态细胞混合物冰浴30min，42℃热激90s，冰浴2min，加入800μl LB液体培养基，37℃振荡1h，离心1min，弃600μl上清，重悬后取200μl菌液涂布于含氨苄青霉素的LB固体平板)。最后，挑取阳性单菌落经PCR、酶切及测序鉴定后抽提质粒核酸pET32a-Rv2031c、pET32a-Rv2351c、pET32a-nRv1196以及pET32a-nRv2941，存于-20℃备用。

同时，以上述五种组分为基础构建融合蛋白PFHP010f，利用基因合成技术将前述4个基因以nRv1196-[linker]-nRv2941-[linker]-Rv2031c-[linker]-Rv2351c串联之后连接至载体pET43.1a构建成为重组质粒，序列两端连接的酶切位点为NdeI和XhoI，Li nker由GGTGGTTCTGGCGGT(SEQ ID NO.19)基因序列组成，对应氨基酸为GGS GG。

实施例3nPPE18、nFadD28、HspX、PlcA以及融合蛋白PFHP010f的表达、纯化及复性

1、nPPE18p、nFadD28p、HspX、PlcA以及PFHP010f的诱导表达

将实施例2中构建成功的表达质粒转化进入BL21(DE3)感受态细胞，转化的菌液涂布至含氨苄青霉素的LB平板上于37℃培养过夜。挑取单菌落接种于5ml的LB液体培养基中，37℃培养6小时后取1ml该培养液接种于300ml的LB液体培养基，37℃培养至OD600≈0.8后加入终浓度为1.0mmol/L的IPTG，37℃培养适宜时间后，4℃、4000rpm/min离心10min，收集菌体沉淀，加入PBS重悬沉淀。随后冰浴超声破碎菌体(功率设置：220W，工作15s间隔20s，共15min)后4℃，12000rpm离心10min分离上清与沉淀，并应用SDS-PAGE对上述五种蛋白进行表达形式鉴定。(蛋白诱导表达条件见表2，蛋白表达形式及纯化条件见表3。)

表2各组分蛋白诱导表达条件

表3蛋白表达形式及纯化条件

2、目的蛋白纯化

pET-32a、pET-43.1a作为载体所表达的基因工程重组蛋白在其N端带有6个组氨酸组成的His-tag，可用Ni²⁺-NTA树脂进行亲和层析纯化。具体方式如下，针对可溶性表达形式的蛋白HspX，收集超声离心后的上清作为可溶性蛋白样品液，以包涵体形式表达的蛋白nPPE18、nFadD28、PlcA以及PFHP010f，分别收集超声离心后的菌体沉淀用8M尿素重悬沉淀以裂解包涵体，再次超声5min，以4℃，12000rpm离心10min后收集上清作为包涵体样品液，向镍柱泵入3倍柱体积的平衡缓冲液(可溶性蛋白使用PBS、0.4mol/L氯化钠、30mmol咪唑混合液；包涵体蛋白使用PBS、0.4mol/L氯化钠、8M尿素混合液)淋洗至流出液PH为8.0，调蛋白核酸检测仪280nm处吸光值为零，泵入样品液后用平衡缓冲液淋洗至吸光度值稳定，随后用含不同浓度咪唑的洗脱缓冲液(可溶性蛋白使用30mmol/L、60mmol/L、150mmol/L、300mmol/L咪唑，PBS,0.4mol/L氯化钠；包涵体蛋白使用30mmol/L、60mmol/L、150mmol/L、300mmol/L咪唑，PBS,8M尿素)将与镍柱结合的蛋白梯度洗脱下来，收集不同阶段的洗脱峰后进行SDS-PAGE鉴定纯化效果。针对镍亲和层析后得纯度不足的蛋白nFadD28、PlcA和PFHP010f，采用离子交换层析继续纯化，具体方式采用截留分子量为10kDa的透析袋透析除盐后进行离子交换层析，泵入样品液后用平衡缓冲液(8M尿素，PBS)淋洗至核酸蛋白仪吸光度值稳定后采用含有不同浓度的NaCl的洗脱缓冲液(50mM、100mM、200mM、400mM NaCl)进行梯度洗脱，收集各阶段样品进行SDS-PAGE电泳检测。

3、包涵体蛋白nPPE18、nFadD28、PlcA以及PFHP010f的复性

纯化结束后将目的蛋白装入透析袋中梯度透析去除尿素、咪唑及其他小分子杂质，蛋白透析液中尿素浓度逐步降低，即6mol/L、4mol/L、2mol/L、1mol/L、0.5mol/L和不含尿素的透析液。最后使用pH为8.0的PBS条件下透析14～16h，透析结束后超滤浓缩并用0.22μm滤器滤过除菌，分装后于-70℃保存。纯化得到PFHP010m各组分抗原和融合蛋白PFHP010f的SDS-PAGE结果见图1。

实施例4混合物PFHP010m和融合蛋白PFHP010f免疫原性评价

1、构建亚单位疫苗PFHP010m/佐剂和PFHP010f/佐剂

①PFHP010m/佐剂：nPPE18、nFadD28、HspX和PlcA四种蛋白以等摩尔比混合后与氢氧化铝佐剂按体积比3:1混匀。

②PFHP010f/佐剂：融合蛋白PFHP010f与氢氧化铝佐剂按体积比3:1混匀。

2、动物分组及免疫

将30只BALB/c小鼠随机分成5组，每组6只，分别为PBS组、佐剂组、BCG组、PFHP010f组、PFHP010m组，其中BCG组免疫一次，其余4组均在第0、10、20天分别进行皮下多点免疫，免疫抗原量为50μg/只，剂量为200μl/只。PBS组免疫PBS，佐剂组免疫氢氧化铝佐剂，BCG组免疫BCG-China 1×10⁶CFU活菌，PFHP010f组免疫PFHP010f/佐剂、PFHP010m组免疫PFHP010m/佐剂。

3、体液免疫检测

(1)动物血清制备：免疫前眼眶采血，末次免疫后摘眼球取血，分离血清，–20℃保存，用于ELISA体液免疫检测。

(2)IgG、IgG1、IgG2a抗体水平检测

混合蛋白PFHP010m和融合蛋白PFHP010f以2μg/well分别包被96孔酶标板(包被条件：4℃，14～16h)，以PBST洗板五次扣干后用含5％脱脂奶粉的PBS封闭2h，封闭完成后洗板扣干。向每孔依次加入2倍梯度稀释的血清100μl，37℃孵育1h；加入1：5000稀释的HRP标记的羊抗鼠IgG、IgG1、IgG2a二抗，洗板拍干，37℃孵育1h，洗板扣干；随即加入TMB显色液100μl/well，显色15～30min；2mol/LH2SO4终止；检测吸光度为450nm处吸光度A₄₅₀。

各组血清抗体滴度的检测结果见图2。结果显示PFHP010m/佐剂和PFHP010f/佐剂免疫后小鼠血清IgG抗体效价均与BCG免疫组小鼠血清抗体效价相当，PFHP010m组和PFHP010f组的IgG2a和IgG1水平均显著高于BCG组，表明PFHP010m和PFHP010f可诱导不低于BCG的体液免疫反应。IgG2a/IgG1比值见图3。通过计算IgG2a和IgG1比值可知PFHP010m/佐剂和PFHP010f/佐剂产生免疫效应均偏向于Th2型免疫反应，即可诱导机体产生有效的体液免疫反应。

4、细胞免疫的检测

(1)脾脏淋巴细胞的制备

将每只小鼠无菌取出的脾脏放在200目尼龙筛网上，滴加4ml淋巴细胞分离液研磨，研磨液用巴氏管吸入到15ml离心管中，缓慢滴加200～500μl无血清培养基低速梯度离心(条件：25℃，800×g，30min)，吸出中间的淋巴细胞层，加入10ml无血清培养基，颠倒洗涤，室温250×g离心收集细胞，并调整至浓度为1×10⁶cells/ml用于细胞免疫的检测。

(2)ELISPOT检测IFN-γ、IL-4释放水平

分离小鼠脾脏淋巴细胞后，取96孔细胞培养板，每孔中加混有1×10⁶个/ml浓度的脾细胞100μl，每孔分别加入10μlPFHP010f和PFHP010m抗原(终浓度为2μg/well)。每种抗原刺激物做3个复孔，另设3组对照组分别为背景对照组(10％胎牛血清的RPMI-1640培养基)，负对照(不加抗原刺激的5组脾细胞100μl/well)和正对照(1μg/well的ConA)。孵育20h后，按ELISPOT操作依次加入检测抗体等试剂，洗板，显色，计数斑点数，进行结果分析。

ELISPOT的IFN-γ结果如图4a所示，IL-4结果如图4b所示。IFN-γ结果显示PFHP010m组IFN-γ的释放水平均显著高于PBS组、佐剂组BCG组，提示PFHP010m可诱导Th1型免疫反应。IL-4结果显示，PFHP010f组和PFHP010m组均能诱导小鼠脾细胞产生高于PBS和佐剂的IL-4释放水平，且IL-4释放量与BCG组持平，提示PFHP010f和PFHP010m作为亚单位疫苗的抗原成分能诱导产生较强的Th2型免疫反应。

实施例5亚单位疫苗体外保护性评价

分枝杆菌体外生长抑制实验(MGIA)

1、小鼠脾淋巴细胞分离

分离步骤同上述实施例4操作步骤，分离淋巴细胞后测定淋巴细胞浓度并调整至浓度为1×10⁶cells/ml。

2、取24孔细胞培养板，每孔中加入1×10⁶个/ml浓度的脾细胞1ml，每组取3只老鼠脾细胞，作2个复孔，每孔接种100μl分枝杆菌强毒株H37Rv混悬液(终浓度为500CFU/ml)，同时取50CFU混悬液直接涂布与7H10平板作对照。37℃，5％CO₂培养箱中孵育96h，孵育完毕对培养物进行离心，弃各孔细胞培养液上清，用500μL无菌组织培养级重悬细胞并室温孵育15min以裂解细胞后涡旋混匀，取50μl涂布于7H10平板后37℃培养2周，对各组平板进行菌落计数。实验数据以每管样品的log₁₀CFU表示，用样品的生长比值(CFU样品(96小时)/CFU第0天对照)进行比较。

MGIA结果如图5所示，结果显示，PFHP010f/佐剂与PFHP010m/佐剂免疫的小鼠脾细胞相较于PBS组、佐剂组能够更好地抑制结核分枝杆菌生长，两种亚单位疫苗均表现出与BCG相当的抑制能力。

最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。

Claims (10)

1.一种结核分枝杆菌抗原组合物，其特征在于，包括nPPE18，nFadD28、HspX和PlcA四种抗原组分。

2.一种结核分枝杆菌混合蛋白抗原PFHP010m，其特征在于，包含nRv1196、nRv2941、Rv2031c、Rv2351c四种基因片段的表达产物。

3.根据权利要求2所述的结核分枝杆菌混合蛋白抗原PFHP010m，其特征在于，

所述nRv1196的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述nRv2941的核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示，所述Rv2031c的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述Rv2351c的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

4.根据权利要求3所述的结核分枝杆菌混合蛋白抗原PFHP010m，其特征在于，由独立表达的抗原nPPE18、nFadD28、HspX和PlcA构成混合抗原PFHP010m；以摩尔比计，含有相同摩尔量的抗原nPPE18、nFadD28、HspX和PlcA。

5.根据权利要求4所述的结核分枝杆菌混合蛋白抗原PFHP010m，其特征在于，nPPE18的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，nFadD28的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示，HspX的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示；PlcA的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示。

6.权利要求2-5任一项所述的结核分枝杆菌混合蛋白抗原PFHP010m的制备方法，其特征在于，

针对编码HspX和PlcA抗原的基因Rv2031c和Rv2351c，以结核分枝杆菌菌株H37Rv基因组为模板，通过特异性引物利用PCR技术分别扩增各组分基因片段连接至pET32a载体上，构建重组质粒；利用基因合成技术合成编码nPPE18和nFadD28抗原的基因nRv1196、nRv2941，并连接至PMD19T质粒上后经双酶切连接至pET32a载体上，构建重组质粒；将重组质粒分别经IPTG诱导后在大肠杆菌中表达，采用镍离子亲和层析和离子交换层析技术纯化目的蛋白。

7.一种融合蛋白抗原PFHP010f，其特征在于，所述融合蛋白抗原PFHP010f的核苷酸序列从N端到C端按照nRv1196、nRv2941、Rv2031c和Rv2351c，通过linker连接得到联合基因。

8.根据权利要求7所述的融合蛋白抗原PFHP010f，其特征在于，所述联合基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示，所述联合基因编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.10所示。

9.权利要求7-8任一项所述的融合蛋白抗原PFHP010f的制备方法，其特征在于，

先通过linker将选定的nRv1196、nRv2941、Rv2031c和Rv2351c连接构建成融合基因的重组质粒连接至pET43.1a载体，经IPTG诱导后在大肠杆菌中表达融合蛋白PFHP010f；采用镍离子亲和层析和离子交换层析技术纯化表达出的蛋白。

10.权利要求1所述的结核分枝杆菌抗原组合物或权利要求2-5任一项所述的结核分枝杆菌混合蛋白抗原PFHP010m或权利要求7-8任一项所述的融合蛋白抗原PFHP010f在以下任一方面的应用：

(1)制备诊断结核分枝杆菌感染或结核分枝杆菌感染引起疾病的试剂；

(2)制备预防结核分枝杆菌感染疫苗；

(3)制备治疗结核分枝杆菌感染引起疾病的药物。

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