CN116655754A - 一种抗原组合物及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物医药技术领域，尤其涉及一种抗原组合物及其应用。所述抗原组合物包括ESAT‑6、CFP‑10、Mpt83和Ag85B，利用该抗原组合物制备的疫苗可以用以解决现有技术中结核候选疫苗大多只能诱导机体产生细胞免疫应答的缺陷，产生体液免疫和细胞免疫相互平衡的保护性免疫应答。

Description

一种抗原组合物及其应用

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，尤其涉及一种抗原组合物及其应用。

背景技术

结核病主要是由结核分枝杆菌复合群(Mycobacterium tuberculosis complex，MTBC)感染引起的一种慢性传染病，日益成为重要公共卫生问题。

疫苗接种是预防和控制传染病最有效的手段，卡介苗(Bacillus CalmetteGuerin，BCG)是目前唯一批准用于预防人结核病的疫苗。BCG对新生儿的保护力最高可达80％，但是随着接种者年龄的增长，BCG的保护力逐渐下降，不能有效地防止成人肺结核的发生。此外BCG作为一种减毒活疫苗，在免疫功能缺陷人群中接种存在感染的风险，在多次传代后也出现保护性抗原丢失的问题。因此，亟需研发新型结核疫苗作为BCG的替代疫苗或加强型疫苗。

佐剂作为一种非特异性免疫增强剂，已被广泛应用于疫苗的成分配制，佐剂与亚单位疫苗联合使用能够最大化疫苗的免疫原性，使其保护效果更佳。铝盐佐剂，具有良好的安全性和稳定性，在百白破三联疫苗、人乳头瘤病毒疫苗、H5N1禽流感疫苗和灭活脊髓灰质炎疫苗等多种疫苗中广泛使用。

正在进行临床试验的新型结核疫苗主要分为以下三类：亚单位疫苗及病毒载体疫苗、重组BCG及减毒/灭活疫苗、DNA疫苗，其中ID93/GLA-SE、GamTBvac、M72/AS01E等亚单位疫苗，已经进入二期临床试验阶段。

联合佐剂应用的重组蛋白亚单位疫苗因其良好的安全性以及成分明确等优点而成为疫苗研发的热点。重组蛋白亚单位疫苗含有大量人T/B细胞表位，能够被人体MHCI类和MHCⅡ类分子识别并刺激机体产生明显的保护性免疫反应，诱导T淋巴细胞和B淋巴细胞活化并分化为记忆性淋巴细胞，可以长期保护机体免受相应病原体感染。目前结核亚单位疫苗主要用于BCG接种后的增强免疫和作为治疗性疫苗保护活动性结核病患者及潜伏性结核感染患者。

机体针对结核分枝杆菌感染的免疫抵抗是一个复杂的过程，活动性结核患者和结核潜伏感染患者体内结核分枝杆菌的保护性抗原表达情况存在明显的差异，因此目前开发结核亚单位疫苗共同的策略是选取多种免疫优势抗原进行组合，以期诱导机体针对包括BCG接种人群、活动性结核患者和结核潜伏感染患者在内的广泛群体产生高效而特异的保护性免疫应答。常用的结核疫苗候选抗原主要是结核分枝杆菌分泌蛋白和细胞膜/细胞壁蛋白成分，ESAT-6(Rv3875)、CFP-10(Rv3874)、Mpt83(Rv2873)和Ag85B(Rv1886c)是结核分枝杆菌重要的免疫优势抗原，在机体感染结核分枝杆菌的不同阶段高水平表达并各自发挥重要的作用。ESAT-6和CFP-10属于结核分枝杆菌毒力因子Esx家族，是结核菌重要的早期分泌抗原；Mpt83是一种结核分枝杆菌分泌的糖脂蛋白，与结核菌的粘附和播散相关；Ag85B主要在结核分枝杆菌对数生长期表达，是结核菌侵袭宿主细胞重要的毒力因子。

目前新型结核疫苗均存在所诱导的保护性免疫应答较为单一的缺陷，传统观点认为细胞免疫是机体抵抗结核分枝杆菌感染的主要途径，但最新的研究结果不断提示体液免疫和细胞免疫在机体抗结核免疫应答过程中同样发挥不可替代的作用，正在进行临床试验的十余种结核候选疫苗大多只能诱导机体产生细胞免疫应答，无法诱导针对结核分枝杆菌全面的免疫应答，因此疫苗的保护作用比较局限，难以诱导机体针对包括BCG接种人群、活动性结核患者和结核潜伏感染患者在内的广泛群体产生高效而特异的保护性免疫应答。

发明内容

本发明提供一种抗原组合物及其应用，用以解决现有技术中结核候选疫苗大多只能诱导机体产生细胞免疫应答的缺陷，产生体液免疫和细胞免疫相互平衡的保护性免疫应答。

本发明提供一种抗原组合物，包括ESAT-6、CFP-10、Mpt83和Ag85B；

所述ESAT-6的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示；

所述CFP-10的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示；

所述Mpt83的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示；

所述Ag85B的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示。

本发明选择四种结核分枝杆菌免疫优势抗原ESAT-6、CFP-10、Mpt83和Ag85B，构建ECMA019m及ECMA019f两种多组分亚单位疫苗，可以解决现有技术中候选疫苗大多只能诱导机体产生细胞免疫应答的缺陷。

ECMA019m包含的4个组分ESAT-6、CFP-10、Mpt83和Ag85B，各组分对应的氨基酸序列如SEQ ID NO.5,SEQ ID NO.6,SEQ ID NO.7,SEQ ID NO.8所示。

ECMA019f融合蛋白各组分由N端到C端的顺序为ESAT-6、CFP-10、Mpt83和Ag85B，各组分之间以柔性连接臂连接，将ECMA019f融合蛋白的基因序列进行密码子优化后的基因序列如SEQ ID NO.9所示，ECMA019f融合蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO.10所示。

本发明抗原组合方式包含各组分抗原以任何比例和/或任何次序形成的组合物，同时ESAT-6、CFP-10、Mpt83和Ag85B以任何次序连接形成的融合蛋白均在本发明保护范围内。

优选的，根据本发明所述抗原组合物，将ESAT-6、CFP-10、Mpt83和Ag85B四种抗原分别作为单独抗原直接混合后使用。

优选的，从N端到C端按照ESAT-6、CFP-10、Mpt83和Ag85B的顺序用柔性连接臂顺次连接。

本发明提供一种抗原组合物的制备方法，包括ECMA019m的四种单独的抗原组分以及ECMA019f融合蛋白的表达、纯化、复性和目的产物的收获。

本发明提供融合蛋白ECMA019m的构建方法，将抗原ESAT-6、CFP-10、Mpt83和Ag85B对应的基因片段分别连接至pET-32a质粒，构建ESAT-6、CFP-10、Mpt83和Ag85B重组质粒并转化大肠杆菌DH5α感受态细胞。

优选的，构建成功的ESAT-6、CFP-10、Mpt83和Ag85B四种工程菌在LB液体培养基中增菌培养后使用异丙基β-d-硫代半乳糖苷诱导重组蛋白表达，通过Ni亲和层析和DEAE离子交换层析技术纯化获得具有生理构象的目的蛋白。

在本发明的一些实施例中，ECMA019m各抗原组分的获得包括以下步骤：以结核分枝杆菌菌株H37Rv基因组为模板，通过PCR扩增两端带有EcoRI和HindⅢ双酶切位点的ESAT-6、CFP-10、Mpt83和Ag85B基因序列。利用分子克隆技术将ESAT-6、CFP-10、Mpt83和Ag85B基因片段分别进行双酶切后连接至pET-32a质粒，构建ESAT-6、CFP-10、Mpt83和Ag85B重组质粒并转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，抽提质粒并测序验证后转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞。构建成功的四种工程菌在LB液体培养基中增菌培养后使用异丙基β-d-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导重组蛋白表达，通过Ni亲和层析和DEAE离子交换层析技术纯化获得具有生理构象的目的蛋白。

在本发明的一些实施例中，ECMA019f融合蛋白抗原的获得包括以下步骤：利用基因合成技术合成两端带有NdeI和XhoI酶切位点的ECMA019f融合蛋白基因序列，双酶切后连接至pET-43.1a质粒并转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，抽提质粒并测序验证后转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞。构建成功的工程菌在LB液体培养基中增菌培养后使用异丙基β-d-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导重组蛋白表达，通过Ni亲和层析和DEAE离子交换层析技术纯化获得具有生理构象的目的蛋白。

本发明利用大肠杆菌表达系统表达外源蛋白并纯化，具有表达效率高、发酵工艺成熟、生产成本低等优点，适合大规模商业化生产。

本发明提供编码所述抗原组合物的DNA分子，包括SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQID NO.3、SEQ ID NO.4中的一项或几项。

本发明提供一种重组菌、重组表达载体或转基因细胞系，包括所述DNA分子。

本发明提供一种结核疫苗或结核感染检测及诊断试剂盒，利用抗原ESAT-6、CFP-10、Mpt83和Ag85B。

根据本发明提供所述结核疫苗或结核感染检测及诊断试剂盒，还包括佐剂。

根据本发明所述结核疫苗或结核感染检测及诊断试剂盒，所述佐剂为氢氧化铝。

本发明提供一种结核疫苗或结核感染检测及诊断试剂盒的制备方法，包括通过大肠杆菌表达系统表达ECMA019m各组分重组蛋白或ECMA019f融合蛋白，经纯化复性获得目的蛋白。

本发明提供所述抗原组合物在制备预防结核分枝杆菌感染疫苗或治疗结核分枝杆菌感染引起疾病的药物中的应用。

本发明提供所述抗原组合物在制备诊断结核分枝杆菌感染或结核分枝杆菌感染引起疾病的试剂中的应用。

将本发明纯化获得的ECMA019m各组分重组蛋白和ECMA019f融合蛋白分别与氢氧化铝佐剂混合后免疫BALB/c小鼠，采用酶联免疫吸附试验(ELISA)、酶联免疫斑点试验(ELISpot)、Luminex技术和分枝杆菌生长抑制实验(MGIA)四种实验技术检测免疫后小鼠的特异性抗体效价，IFN-γ(干扰素-γ)、IL-4(白介素4)、IL-2(白介素2)、IL-6(白介素6)、IL-10(白介素10)、IL-17(白介素17)、TNF-α(肿瘤坏死因子α)和GM-CSF(粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子)八种细胞因子以及脾淋巴细胞对分枝杆菌生长的抑制能力，评价疫苗的免疫原性和保护性，结果显示：

本发明提供的ECMA019m和ECMA019f两种亚单位疫苗包含四种结核分枝杆菌免疫优势抗原，针对单个蛋白抗原表位数量有限导致的免疫原性不足、难以诱导机体产生针对BCG接种人群、活动性结核患者和结核潜伏感染患者在内的广泛群体产生有效保护性免疫应答的缺点，ECMA019m和ECMA019f选取ESAT-6、CFP-10、Mpt83和Ag85B四种结核分枝杆菌免疫优势抗原，能够诱导机体产生强烈而广泛的保护性免疫反应。

此外，在ECMA019m的基础上，利用基因合成技术构建了ECMA019f融合蛋白，将ESAT-6、CFP-10、Mpt83和Ag85B四个组分用柔性连接臂顺次连接，仅需表达和纯化一个融合蛋白即能获得上述四种抗原组分，简化了重组蛋白表达和纯化的步骤、有利于生产方案的标准化。

将ECMA019m和ECMA019f两种亚单位疫苗免疫小鼠后进行免疫学评价，结果显示ECMA019f/ECMA019m均能诱导机体产生强烈的保护性免疫应答、抑制分枝杆菌生长的能力，可作为新型结核疫苗候选，具有重要的应用价值

附图说明

为了更清楚地说明本发明或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作一简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是本发明实例2重组蛋白SDS-PAGE鉴定结果；

注：1、2、3、4、5分别对应纯化后的ECMA019f、ESAT-6、CFP-10、Mpt83和Ag85B，其对应的分子量分别是77.8kD、27kD、28.8kD、40.1kD、52.6kD。

图2是本发明实例3血清抗体效价检测结果图；

注：A为血清IgG/IgG1/IgG2a抗体效价，B为IgG1/IgG2a比值。

图3是本发明实例3ELISpot细胞因子检测结果；

注：抗原特异性IFN-γ(A)和IL-4(B)分泌水平SFCs，斑点形成细胞(spot formingcells)，阴性对照采用佐剂(adjuvant)和PBS组的脾淋巴细胞。

图4是本发明实例3Luminex多重细胞因子检测结果；

注：A，B，C，D，E，F分别表示脾淋巴细胞和对应刺激物共培养后上清中IL-2，IL-6，IL-17，TNF-α，IL-10和GM-CSF的测量值。

图5是本发明实例3分枝杆菌生长抑制试验结果；

注：CFU，集落形成单位(colony forming unit)。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明中的附图，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实例1ECMA019m各组分及ECMA019f融合蛋白重组质粒的构建(1)引物设计

以NCBI数据库中的结核分枝杆菌菌株H37Rv基因组中编码抗原ESAT-6、CFP-10、Mpt83和Ag85B的基因序列为模板，通过Primer Premier 5.0软件设计引物，引物信息见表1

表1引物信息

注：__表示EcoRI和HindⅢ酶切位点

(2)目的基因的获得

利用PCR技术扩增ESAT-6、CFP-10、Mpt83和Ag85B基因序列，PCR扩增体系和反应程序见表2和表3。

表2PCR扩增体系

表3PCR反应程序

(3)重组质粒的构建

利用EcoRI/NdeI和HindⅢ/XhoI限制性内切酶对目的基因和pET32a/pET43.1a载体进行双酶切(37℃、25min)，酶切体系见表3。酶切产物回收。利用T4 DNA连接酶分别将回收的目的基因与载体连接，连接条件为25℃、30min，连接体系见表4。

表3PCR产物和质粒酶切体系

表4连接体系

连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，步骤为：10μL连接产物与大肠杆菌DH5α感受态细胞混匀后冰浴静置30min，42℃热激90s，冰浴静置2min，加入800μL无抗性的LB液体培养基，置于摇床37℃140rpm培养1h。培养结束后4000rpm离心1min，弃去400μl上清，将菌体沉淀吹打混匀后取200μl菌液涂布于含有氨苄青霉素的LB固体平板，37℃倒置培养12～16h。挑取单菌落于含有氨苄青霉素的LB液体培养基中增菌培养，取菌液进行PCR鉴定，PCR体系和程序见表2和表3。鉴定后的菌样在含氨苄青霉素的LB液体培养基中增菌培养，碱裂解法抽提质粒并于-20℃保存。

实例2ECMA019m各组分及ECMA019f融合蛋白的原核表达和纯化

将实例1中构建成功的重组质粒热休克法转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，挑取单菌落接种至含氨苄青霉素的LB液体培养基中37℃、180rpm增菌培养，加入1mM终浓度的异丙基β-d-硫代半乳糖苷(IPTG)在相同条件下培养3小时诱导目的蛋白表达。诱导结束后4℃、4000rpm离心10min收集菌体，PBS重悬菌体后使用超声破碎菌体(超声参数为220W，工作15s间隔20s，共15min)，超声结束后12000rpm离心10min分离上清和沉淀，利用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)鉴定重组蛋白表达水平和表达形式。使用aktaavant25全自动蛋白纯化仪通过Ni亲和层析和DEAE离子交换层析技术纯化目的蛋白，具体步骤为：

ECMA019f和ECMA019m的四种单个抗原组分先进行Ni亲和层析：

(1)装填Ni-IDA亲和层析填料并通入3倍柱体积的平衡缓冲液(可溶性表达的重组蛋白采用pH8.0的PBS平衡填料；包涵体表达的重组蛋白采用pH8.0的8M尿素平衡填料)，待280nm紫外吸光度值稳定后调零。

(2)泵入样本并收集流穿液，再泵入重组蛋白对应的平衡缓冲液淋洗填料直至280nm紫外吸光度值稳定。

(3)进行0-300mM咪唑线性洗脱，收集所有洗脱峰，通过SDS-PAGE鉴定各样本中目的蛋白纯度，选择纯度最好的样本用于后续操作。

ESAT-6、Mpt83和Ag85B三个重组蛋白的Ni亲和层析纯化产物纯度较低，采用截留分子量为10kDa的透析袋透析除盐后进行DEAE离子交换层析。

(4)装填DEAE离子交换填料并通入3倍柱体积的平衡缓冲液(可溶性表达的重组蛋白采用10mM pH8.0的Tris缓冲液平衡填料；包涵体表达的重组蛋白采用pH8.0的8M尿素平衡填料)，待280nm紫外吸光度值稳定后调零。

(5)泵入样本并收集流穿液，再泵入重组蛋白对应的平衡缓冲液淋洗填料直至280nm紫外吸光度值稳定。

(6)进行0-400mM氯化钠线性洗脱，收集所有洗脱峰，通过SDS-PAGE鉴定各样本中目的蛋白纯度，选择纯度最好的样本用于后续操作。

(7)纯化结束后将目的蛋白装入透析袋中梯度透析去除尿素、咪唑及其他小分子杂质，最后置于pH7.4的PBS中4℃透析2h，透析结束后超滤浓缩并用0.22μm滤器滤过除菌，分装后于-70℃保存。ECMA019f重组蛋白和ECMA019m各组分SDS-PAGE鉴定结果见图1。

实例3ECMA019m和ECMA019f多组分亚单位疫苗的免疫学评价

1、ECMA019m和ECMA019f多组分亚单位疫苗的制备

ECMA019m各抗原组分以等摩尔比混合后与氢氧化铝佐剂按体积比3:1混匀；ECMA019f抗原组分直接与氢氧化铝佐剂按体积比3:1混匀制备疫苗

2、小鼠免疫流程

6-8周龄SPF级雌性BALB/c小鼠用于免疫实验，小鼠随机分为5组：PBS组、佐剂组、ECMA019f-佐剂组、ECMA019m-佐剂组和BCG组，每组6只。免疫流程见表5

表5小鼠免疫流程

PBS组、佐剂组、ECMA019f-佐剂组、ECMA019m-佐剂组第3次免疫后10天处死小鼠，BCG组免疫后30天处死小鼠，进行各项免疫学检测并评价ECMA019m和ECMA019f多组分亚单位疫苗的免疫保护效果。

3、体液免疫评价

采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测血清特异性抗体效价

(1)血清分离

免疫后的小鼠在处死前摘眼球采血，收集血液，室温静置2h，4000rpm离心10分钟收集血清。

(2)ELISA法检测血清抗体效价

1)使用包被缓冲液(50mM碳酸盐缓冲液，pH 9.0)调整目的蛋白浓度，ECMA019m四种组分各调整至400ng/mL、ECMA019f重组蛋白调整至2μg/mL，按照每孔100μL的量加入96孔板，4℃包被12h。

2)第二日用PBST(含0.5‰Tween-20的PBS)洗涤5遍，每孔加入含5％脱脂奶粉的PBST 100μL，37℃封闭2小时，PBST洗涤5遍并将孔内残余液体完全去除。

3)用PBS将各组血清进行倍比稀释，每孔加入100μL稀释后的血清，37℃孵育2小时，PBST洗涤5遍并将孔内残余液体完全去除。

4)用PBS按1：5000分别稀释HRP标记的羊抗鼠IgG、IgG1和IgG2a抗体，每孔加入100μL稀释后的抗体，37℃孵育1小时，用PBST洗涤5遍并将孔内残余液体完全去除。

5)加入TMB显色底物液100μL，37℃显色15分钟后加入100μL2M硫酸终止反应。

6)用酶标仪检测450nm处的吸光度值。

7)抗体效价判断标准：若第2ⁿ倍稀释血清的OD值/PBS组OD值≥2.1且第2ⁿ⁺¹倍稀释血清的OD值/PBS组OD值＜2.1，则2ⁿ即该血清样本对应的抗体效价。

血清抗体效价检测结果见图2。实验结果显示ECMA019m和ECMA019f免疫后小鼠血清特异性IgG、IgG1和IgG2a抗体效价均显著增高，ECMA019m、ECMA019f两组小鼠和BCG组相比，血清IgG水平无显著差异，但IgG1和IgG2a水平均高于BCG组。IgG1亚型和IgG2a亚型分别指示体液免疫应答和细胞免疫应答水平，通常用IgG1/IgG2a比值来衡量疫苗诱导机体产生的体液免疫和细胞免疫应答强度的高低关系，实验结果显示ECMA019m、ECMA019f和BCG三组小鼠的血清IgG1/IgG2a比值均在1.5左右，提示ECMA019m和ECMA019f两种亚单位疫苗均诱导机体产生体液免疫和细胞免疫相互平衡的保护性免疫应答。

4、细胞免疫评价：

4.1、小鼠脾脏淋巴细胞的分离

1)小鼠取血后颈椎脱臼处死，75％酒精浸泡后分离脾脏。

2)将脾脏浸泡于小鼠淋巴细胞分离液(购自北京达科为生物技术有限公司)中，分离淋巴细胞、将脾淋巴细胞调整至终浓度1×10⁶/mL溶液待用。

4.2、ELISpot法检测Th1型细胞因子IFN-γ和Th2型细胞因子IL-4

1)在预包被IFN-γ和IL-4抗体的ELISpot检测孔中加入200μLRPMI 1640培养基，室温静置10min活化预包被板。

2)每孔加入100μL脾淋巴细胞溶液，加入2μg对应的刺激物(ECMA019f抗原，ECMA019m抗原或BCG全菌裂解产物)。设立阴性对照孔(PBS刺激)和阳性对照孔(5μg/mL刀豆蛋白)各一，37℃、5％CO2培养箱中培养16～24小时。

3)培养结束后弃去孔中液体，用PBST洗涤5遍并将孔内残余液体完全去除。

4)以100μL/孔的量加入生物素标记的抗IFN-γ和抗IL-4抗体工作液，37℃孵育1h后弃去孔中液体，用PBST洗涤5遍并将孔内残余液体完全去除。

5)按100μL/孔的量加入链霉亲和素标记的HRP工作液，37℃孵育1h后弃去孔中液体，用PBST洗涤5遍并将孔内残余液体完全去除。

6)按100μL/孔的量加入ACE显色液并置于37℃避光孵育，待各检测孔内均有清晰明显的斑点出现后流水冲洗各孔终止显色反应，倒扣晾干孔内水分。

7)使用ELISpot读板仪检测各孔的SFCs值(spot-forming cells，斑点形成细胞数)。

检测结果见图3。IFN-γ是典型的Th1型细胞因子，在细胞免疫过程中发挥重要作用，而IL-4是典型的Th2型细胞因子，在体液免疫过程中发挥重要作用。实验结果显示ECMA019f和ECMA019m免疫后小鼠脾淋巴细胞经对应刺激物刺激之后分泌IFN-γ和IL-4的水平明显提高，其中ECMA019f组小鼠脾淋巴细胞的IFN-γ和IL-4分泌能力相当；ECMA019m组小鼠脾淋巴细胞的IFN-γ分泌能力最低，但IL-4分泌能力强于ECMA019f组和BCG组，提示ECMA019f诱导机体产生较强的体液免疫和细胞免疫二者平衡的保护性免疫应答，而ECMA019m诱导机体产生的免疫应答以体液免疫为主。

4.3、Luminex法检测IL-2,IL-6,IL-10,IL-12,IL-17和GM-CSF六种细胞因子

Luminex多重细胞因子检测试剂盒购自R&D Systems公司，具体操作如下：

1)96孔细胞培养板中按照每孔100μL的量加入调好浓度的脾淋巴细胞，再加入10μg对应的刺激物(ECMA019f抗原蛋白，ECMA019m抗原蛋白或BCG全菌裂解产物)。每组设立无菌PBS刺激的阴性对照孔和5μg/mL刀豆蛋白刺激的阳性对照孔各一，盖好板盖并在37℃、5％ CO₂培养箱中共培养16～24小时。

2)培养结束后将96孔细胞板4000rpm离心10min，取上清用于Luminex多重细胞因子检测，检测步骤按照说明书进行。

检测结果见图4。实验结果显示ECMA019f和ECMA019m免疫后小鼠脾淋巴细胞经刺激物刺激之后分泌IL-2,IL-6,IL-10,IL-12,IL-17和GM-CSF六种细胞因子的水平均明显升高，其中IL-2和IL-12属于Th1型细胞因子，诱导细胞免疫应答；IL-6和IL-10属于Th2型细胞因子，诱导体液免疫应答；IL-17和GM-CSF属于固有免疫相关的细胞因子，在机体的固有免疫中发挥作用。实验结果表明ECMA019m和ECMA019f相比能诱导机体产生更高水平的Th1和Th2型细胞因子，诱导保护性免疫应答的能力更强，但是在固有免疫方面ECMA019f能诱导产生更多GM-CSF(粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子)，有利于巨噬细胞的活化并吞噬结核菌。

5、ECMA019f/ECMA019m亚单位疫苗的保护性评价

采用体外分枝杆菌生长抑制试验(MGIA)评价免疫后小鼠脾淋巴细胞对结核分枝杆菌生长的抑制能力

1)24孔板中每孔加入1ml调好浓度的脾淋巴细胞，接种50CFU(colony formingunit，菌落形成单位)的结核分枝杆菌H37Rv菌株，混匀并置于37℃、5％ CO₂培养箱中共培养4天。

2)培养结束后将共培养物转移至离心管中，12000rpm离心10分钟并弃去900μL上清。

3)离心的同时在24孔板中每孔加入500μL无菌水，用移液器反复吹打底部和侧壁，静置5分钟后将孔内液体转移至对应离心管中，涡旋震荡以彻底裂解细胞并释放胞内的结核分枝杆菌。

4)取50μL涂布7H10平板，同时将50μL H37Rv菌液直接涂板作为空白对照，将平板37℃倒置培养2～3周后进行菌落计数。

结果见图5。ECMA019m、ECMA019f组小鼠脾淋巴细胞和BCG组相比抑制结核分枝杆菌生长的能力较弱，但与阴性对照组比仍有显著性差异，ECMA019m和ECMA019f两种多组分亚单位疫苗诱导小鼠脾淋巴细胞对结核枝杆菌生长的抑制能力相当，实验结果表明ECMA019m和ECMA019f均能诱导机体产生针对结核分枝杆菌感染强烈的保护性免疫应答。

最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。

Claims (10)

1.一种抗原组合物，其特征在于，包括ESAT-6、CFP-10、Mpt83和Ag85B；

所述ESAT-6的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示；

所述CFP-10的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示；

所述Mpt83的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示；

所述Ag85B的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示。

2.根据权利要求1所述抗原组合物，其特征在于，将ESAT-6、CFP-10、Mpt83和Ag85B直接混合；

或，从N端到C端按照ESAT-6、CFP-10、Mpt83和Ag85B的顺序用柔性连接臂顺次连接。

3.融合蛋白ECMA019m的构建方法，其特征在于，将权利要求1中抗原ESAT-6、CFP-10、Mpt83和Ag85B对应的基因片段分别连接至pET-32a质粒，构建ESAT-6、CFP-10、Mpt83和Ag85B重组质粒并转化大肠杆菌DH5α感受态细胞；

优选的，构建的ESAT-6、CFP-10、Mpt83和Ag85B四种工程菌在LB液体培养基中增菌培养后使用异丙基β-d-硫代半乳糖苷诱导重组蛋白表达，通过Ni亲和层析和DEAE离子交换层析技术纯化获得具有生理构象的目的蛋白。

4.编码权利要求1所述抗原组合物的DNA分子，其特征在于，包括SEQ ID NO.1、SEQ IDNO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4中的一项或几项。

5.一种重组菌、重组表达载体或转基因细胞系，其特征在于，包括权利要求4所述DNA分子。

6.一种结核疫苗或结核感染检测及诊断试剂盒，其特征在于，利用权利要求1中的抗原ESAT-6、CFP-10、Mpt83和Ag85B。

7.根据权利要求6所述结核疫苗或结核感染检测及诊断试剂盒，其特征在于，还包括佐剂。

8.根据权利要求7所述结核疫苗或结核感染检测及诊断试剂盒，其特征在于，所述佐剂为氢氧化铝。

9.权利要求1所述抗原组合物在制备预防结核分枝杆菌感染疫苗或治疗结核分枝杆菌感染引起疾病的药物中的应用。

10.权利要求1所述抗原组合物在制备诊断结核分枝杆菌感染或结核分枝杆菌感染引起疾病的试剂中的应用。