CN116763911A

CN116763911A - 含结核分枝杆菌潜伏期分泌抗原HspX的亚单位疫苗

Info

Publication number: CN116763911A
Application number: CN202310338706.8A
Authority: CN
Inventors: 万康林; 刘海灿; 范雪亭; 李马超; 于晋杰
Original assignee: National Institute for Communicable Disease Control and Prevention of Chinese Center For Disease Control and Prevention
Current assignee: National Institute for Communicable Disease Control and Prevention of Chinese Center For Disease Control and Prevention
Priority date: 2023-03-31
Filing date: 2023-03-31
Publication date: 2023-09-19

Abstract

本发明涉及生物医药技术领域，尤其涉及含结核分枝杆菌潜伏期分泌抗原HspX的亚单位疫苗。结核亚单位疫苗包括：如SEQ ID NO.1所示的EsxH蛋白、如SEQ ID NO.2所示的CFP10蛋白、以及如SEQ ID NO.3所示的HspX蛋白。本发明发现选择EsxH、CFP10和HspX蛋白构建的结核亚单位疫苗，能够同时建立对活动期和潜伏期结核杆菌全面的免疫力，克服单一抗原免疫原性和保护性不足的缺点，诱导对结核分枝杆菌不同感染时期的免疫保护反应，产生更为广泛的保护性免疫应答、抑制分枝杆菌的生长。

Description

含结核分枝杆菌潜伏期分泌抗原HspX的亚单位疫苗

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，尤其涉及含结核分枝杆菌潜伏期分泌抗原HspX的亚单位疫苗。

背景技术

结核病是由结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)引起的慢性传染病，严重危害人类健康，已经成为严重的全球性公共卫生和社会问题。卡介苗(BCG)是目前唯一获准用于预防结核病的疫苗，但其在不同人群中对结核病的保护效果差异较大。BCG预防儿童的粟粒性结核病和结核性脑膜炎效果较好，但对青少年和成人肺结核基本无效，且不能用于免疫力低下的人群。卡介苗的应用已近一个世纪，但全球尚未研制出比BCG更有效的抗结核疫苗。因此，为了在全球范围内彻底消灭结核病，迫切需要研制更为有效的新型结核病疫苗。

目前结核疫苗主要分为病毒载体疫苗、分枝杆菌全菌或提取物疫苗、减毒活疫苗和重组蛋白/佐剂疫苗等。常用的腺病毒载体疫苗，免疫途径单一、副作用较为明显、且体内可能存在病毒载体的抗体，降低疫苗的免疫效果；灭活疫苗在制备过程中，其制备工艺的限制性会降低疫苗免疫活性，且有效成分含量较低、免疫保护机制不清晰；而减毒活疫苗可能存在残余毒力等安全性问题不适用于儿童和免疫力低下的人群。相对于其他疫苗，蛋白亚单位疫苗只使用某些具有诱导机体产生保护性免疫应答的蛋白抗原而非全菌抗原，其免疫后副作用明显减轻，而且其制备相对于传统疫苗也更加的安全和高效。

重组结核亚单位疫苗，特别是大肠杆菌中表达的亚单位疫苗，具有安全性高、保护性抗原集中、表达效率高等优势，已逐渐成为目前研制新型抗结核疫苗的优选方案，这其中蛋白抗原的选择是关键。目前已有多种结核蛋白亚单位疫苗进入临床期，但是不同蛋白亚单位疫苗诱导机体产生免疫保护反应的细胞因子表达谱差异悬殊，不能诱导较为全面的免疫反应。此外，已公布的结核蛋白亚单位疫苗大多只采用了结核分枝杆菌活动期的抗原，如Ag85B、ESAT-6、TB10.4等，很少采用潜伏期抗原，具有一定的局限性。而研究证实，切实有效的结核病疫苗不但要对活动期结核病具有保护作用，而且要能够针对潜伏期结核分枝杆菌感染起作用，才能更好的预防结核病的发生。因此，理想的结核亚单位疫苗应包含结核分枝杆菌活动期和潜伏期的多个抗原。

现有技术CN 101745104A中以Ag85b、ESAT6、CFP10和HspX蛋白为疫苗抗原成份，以Al(OH)₃和BCG-CpG-DNA(BCG的DNA提取物)为复合佐剂制备结核亚单位疫苗。其虽然联合采用了潜伏期和活动期抗原蛋白，但是该疫苗所诱导产生的特异性细胞因子有限，因此，如何开发出一款疫苗，能够同时诱导产生更多种特异性细胞因子，以更好的发挥疫苗的全面保护作用，成为本领域亟待解决的技术难题。

发明内容

首先，本发明提供了一种结核亚单位疫苗，包括：如SEQ ID NO.1所示的EsxH蛋白、如SEQ ID NO.2所示的CFP10蛋白、以及如SEQ ID NO.3所示的HspX蛋白。

本发明通过大量抗原蛋白组合发现，选择潜伏期保护性抗原HspX与活动期抗原CFP10蛋白以及EsxH蛋白联合使用时，EsxH蛋白能够促进CFP10蛋白以及HspX蛋白的免疫原性，能够同时诱导产生更多种特异性细胞因子，从而诱导对结核分枝杆菌不同感染时期的免疫保护反应，有效清除或监视包括潜伏感染在内的结核分枝杆菌感染，预防成人结核病的发生。

在一些实施方案中，EsxH蛋白、CFP10蛋白和HspX蛋白以独立的蛋白形式存在。

在一些实施方案中，其含有等摩尔比例的EsxH蛋白、CFP10蛋白和HspX蛋白。

在一些实施方案中，EsxH蛋白、CFP10蛋白和HspX蛋白以融合蛋白形式存在。

在一些实施方案中，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示。

在所述融合蛋白中，以如SEQ ID NO.15所示的柔性肽段连接EsxH蛋白、CFP10蛋白和HspX蛋白。

各抗原间以上述疏水柔性肽段(linker)连接，能够增加融合蛋白的柔韧性，有利于三种蛋白的正确折叠。

在一些实施方案中，所述融合蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。

在一些实施方案中，所述EsxH蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；所述CFP10蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；所述HspX蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。

在一些实施方案中，所述结核亚单位疫苗还包括佐剂。

在一些实施方案中，佐剂为氢氧化铝佐剂。

进一步，本发明提供了上述结核亚单位疫苗在制备结核病诊断或治疗试剂中的应用。

与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

本发明发现选择EsxH、CFP10和HspX蛋白构建的结核亚单位疫苗，能够同时诱导产生更多种特异性细胞因子，能够同时建立对活动期和潜伏期结核杆菌全面的免疫力，克服单一抗原免疫原性和保护性不足的缺点，诱导对结核分枝杆菌不同感染时期的免疫保护反应，产生更为广泛的保护性免疫应答、抑制分枝杆菌的生长。

附图说明

图1是ECH004f及ECH004m所含单个蛋白纯化和表达的SDS-PAGE分析电泳图谱；其中，M表示marker，1～4分别表示ECH004f、EsxH、CFP10和HspX。

图2是ECH004f、ECH004m和BCG免疫BALB/c小鼠的血清IgG、IgG1和IgG2a亚型的测定结果；其中，图2A为血清IgG/IgG1/IgG2a抗体效价；图2B为IgG1/IgG2a比值图。

图3是免疫小鼠的脾细胞释放的抗原特异性IFN-γ和IL-4水平结果图。

图4是免疫小鼠的脾细胞释放的胞外抗原特异性细胞因子水平结果图。

图5是分枝杆菌生长抑制试验(MGIA)结果图。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例中未注明具体技术或条件者，均为常规方法或者按照本领域的文献所描述的技术或条件进行，或者按照产品说明书进行。所用试剂和仪器等未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购买得到的常规产品。

下述实施例中EsxH，CFP10和HspX的氨基酸序列依次如SEQ ID NO.1～3所示，核苷酸序列依次如SEQ ID NO.4～6所示；融合蛋白ECH004f的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示，核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示；linker的核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示。

实施例1融合蛋白ECH004f重组质粒及混合蛋白ECH004m各组分质粒的构建

在美国国家生物技术信息中心(NCBI)数据库中，检索得到编码EsxH，CFP10和HspX的基因序列。

融合蛋白ECH004f重组质粒的构建：借助基因合成技术，将EsxH，CFP10和HspX对应的三个基因依次串联，体外合成融合基因片段。为保证各蛋白之间在空间结构上互不影响，在各基因之间加入一段序列为“GGTGGTTCTGGCGGT”的linker，最外侧的基因两端连接NdeI和XhoI酶切位点，并克隆于pET43.1a载体。

混合蛋白ECH004m中单个蛋白对应质粒的构建：

以H37Rv基因组DNA为模板，通过特异性引物PCR扩增EsxH，CFP10和HspX对应的基因序列，引物的两端包括EcoRI和HindIII两个酶切位点，引物信息见表1。PCR反应体系和反应程序见表2和表3。PCR产物经EcoRI和HindⅢ双酶切之后，利用T4 DNA连接酶16℃反应过夜，然后分别克隆于pET32a载体，获得三个蛋白对应基因重组质粒。

将上述构建好的四种质粒转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，步骤为：10μL连接产物与大肠杆菌DH5α感受态细胞混匀后冰浴静置30min，42℃热激90s，冰浴静置2min，加入800μL无抗性的LB液体培养基，置于摇床37℃180rpm培养1h。培养结束后4000rpm离心1min，弃去600μl上清，将菌体沉淀吹打混匀后取200μl菌液涂布于含有氨苄青霉素的LB固体平板，37℃倒置培养12～16h。挑取单菌落于含有氨卞青霉素的LB液体培养基中增菌培养，次日吸取菌液进行PCR，鉴定基因重组质粒是否连接成功。随后进行DNA测序鉴定插入片段的正确性。取测序100％正确的阳性克隆菌体提取重组质粒并于-20℃保存。

表1引物扩增列表

注：____表示EcoR I和HindⅢ酶切位点

Rv0288/EsxH的上游引物如SEQ ID NO.9所示，下游引物如SEQ ID NO.10所示；Rv3874/CFP-10的上游引物如SEQ ID NO.11所示，下游引物如SEQ ID NO.12所示；Rv2031c/HspX的上游引物如SEQ ID NO.13所示，下游引物如SEQ ID NO.14所示。

表2 PCR扩增体系

表3 PCR反应程序

实施例2融合蛋白ECH004f及混合蛋白ECH004m各组分的原核表达和纯化

将实施例1中构建成功的4种重组质粒转入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，挑取单菌落接种至含氨卞青霉素(Amp+)的LB液体培养基中37℃、180rpm增菌培养，待吸光度(A)值达到0.6，加入终浓度为1mmol/L的异丙基β-d-硫代半乳糖苷(IPTG)在相同条件下培养4小时诱导目的蛋白表达。诱导结束后4℃、4000rpm离心10min收集菌体，用裂解液(20mmol/LTris-Hcl+Triton100X)重悬菌体后使用超声破碎菌体(超声参数为220W，工作15s间隔20s，共15min)，超声结束后12000rpm离心10min分离上清和沉淀，利用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)鉴定重组蛋白表达水平和表达形式。通过Ni柱亲和层析和DEAE离子交换层析技术纯化目的蛋白，具体步骤为：ECH004m的三种单个抗原组分先进行Ni柱亲和层析：装填Ni柱亲和层析填料并通入3倍柱体积的平衡缓冲液(可溶性表达的重组蛋白采用pH8.0的20mmol/L Tris-Hcl；包涵体表达的重组蛋白采用pH8.0的8M尿素)，待280nm紫外吸光度值稳定后调零。泵入样本并收集流穿液，再泵入重组蛋白对应的平衡缓冲液淋洗直至280nm紫外吸光度值稳定。用不同浓度的咪唑洗脱(30mmol/L、60mmol/L、150mmol/L和300mmol/L)，收集不同浓度的洗脱液，通过SDS-PAGE鉴定各样本中目的蛋白纯度，选择纯度最好的样本用于后续操作。结果显示EsxH蛋白的Ni柱亲和层析纯化产物纯度较低，采用截留分子量为10kDa的透析袋透析除盐后进行DEAE离子交换层析。同时，融合蛋白ECH0004f也采用DEAE离子交换层析技术进行纯化。具体操作为：装填DEAE离子交换填料并通入3倍柱体积的平衡缓冲液(可溶性表达的重组蛋白采用pH8.0的20mmol/LTris-Hcl缓冲液平衡柱材；包涵体表达的重组蛋白采用pH8.0的8M尿素平衡柱材)，待280nm紫外吸光度值稳定后调零。泵入样本并收集流穿液，再泵入重组蛋白对应的平衡缓冲液淋洗填料直至280nm紫外吸光度值稳定。分别用不同浓度的Nacl洗脱(100mM、200mM和400mM)，收集所有洗脱液，通过SDS-PAGE鉴定各样本中目的蛋白纯度，选择纯度最好的样本用于后续操作。纯化结束后将目的蛋白装入透析袋中梯度透析去除尿素、咪唑及其他小分子杂质，最后置于pH7.4的Tris-Hcl中4℃透析2h，透析结束后超滤浓缩并用0.22μm滤器滤过除菌，分装后于-70℃保存。ECH004f重组蛋白和ECH004m各组分SDS-PAGE鉴定结果见图1，各蛋白表达条件和表达形式见表4。

表4蛋白表达条件和表达形式

实施例3免疫保护效果评价

1.免疫动物

ECH004f/佐剂亚单位疫苗的构建：融合蛋白ECH004f(500μg，PBS配成1.5mL)与氢氧化铝佐剂(氢氧化铝浓度40mg/mL，氢氧化镁浓度40mg/mL)500μL混匀。ECH004m/佐剂亚单位疫苗的构建：EsxH，CFP10和HspX三种蛋白以等摩尔比混合后制得混合蛋白，然后将混合蛋白(500μg，PBS配成1.5mL)与上述氢氧化铝佐剂500μL混匀。

选用SPF级6-8周龄的BABL/c雌性小鼠30只，随机分成5组，每组6只，分别为阴性对照组PBS组、空白对照组佐剂组、ECH004f/佐剂组、ECH004m/佐剂组以及阳性对照组BCG组，其中BCG组仅在第0天免疫一次，其余4组均在第0、10、20天分别进行皮下多点免疫，免疫抗原量为50μg/只，总剂量为200μl/只。具体分组见表5。

表5动物免疫分组

2.血液样本采集

初次免疫前以及小鼠处死前通过眼眶采血法采血，37℃静置2h，4000rpm离心10min，分离血清，分装后存放于-20℃备用。

3.体液免疫效果检测

采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测血清特异性抗体效价。

检测小鼠血清中特异性IgG、IgG1以及IgG2a的滴度，具体方法如下：

a.将酶标板用2μg/ml的ECH004f、ECH004m和BCG蛋白4℃过夜包被，次日，用PBST洗涤5遍；

b.用含2％BSA的PBS液37℃封闭2小时，用PBST洗涤5遍；

c.用PBS将各组血清按20000、40000、80000、160000、320000、640000、1280000、2560000倍稀释，每孔中加入100μL稀释后的血清，37℃孵育1小时后，用PBST洗5遍；

d.分别加入5000倍稀释的HRP标记的IgG、IgG1、IgG2a抗体，每孔100μL，37℃孵育1小时后，用PBST洗5遍；

e.加入TMB 37℃显色15分钟后，加入2M硫酸作为终止液；

f.酶标仪检测波长450nm的吸光度值；

g.判断标准：样本OD值≥2.1×阴性对照OD值判定为阳性。

4.细胞免疫效果检测

4.1小鼠脾脏淋巴细胞的分离(最后一次免疫后一周处死小鼠后取脾脏)

a.利用戊巴比妥钠麻醉小鼠至死亡，用75％医用酒精浸泡小鼠消毒，将小鼠解剖取出脾脏，放入RPMI1640中，1h之内分离淋巴细胞；

b.利用小鼠淋巴细胞分离液分离淋巴细胞；

c.分离淋巴细胞后测定淋巴细胞浓度，并调整至浓度为2×10⁶cells/ml用于后续实验。

4.2ELISPOT法检测IFN-γ和IL-4细胞因子分泌情况

小鼠IFN-γ和IL-4ELISpot检测试剂盒为购置的商品化试剂盒，具体操作如下：

1)在预包被IFN-γ和IL-4对应捕获抗体的ELISpot检测孔中加入200μL RPMI1640培养基，室温静置10min活化预包被板；

2)每孔加入100μL调完浓度的脾淋巴细胞，再加入2μg对应的刺激物。每组设立无菌PBS刺激的阴性对照孔和刀豆蛋白(ConA)(5μg/mL)刺激的阳性对照孔各一，盖好板盖并在37℃、5％CO₂培养箱中共培养16～24小时；

3)培养结束后弃去孔中液体，用PBST洗涤5遍并将孔内残余液体完全去除；

4)按100μL/孔加入生物素标记的抗IFN-γ和抗IL-4抗体工作液，37℃孵育1h后弃去孔中液体，用PBST洗涤5遍并将孔内残余液体完全去除；

5)按100μL/孔加入链霉亲和素标记的HRP工作液，37℃孵育1h后弃去孔中液体，用PBST洗涤5遍并将孔内残余液体完全去除；

6)按100μL/孔加入现配的ACE显色液并置于37℃避光孵育，根据孔内斑点形成情况终止孵育，流水冲洗终止反应，倒扣过夜晾干水分；

7)使用ELISpot读板仪检测各孔的CFU(斑点形成单位)数。

4.3Luminex法检测IFN-γ、TNF-α、IL-4、IL-6、IL-10、IL-12和GM-CSF7种细胞因子。Luminex多重细胞因子检测试剂盒为市售商品化试剂盒，具体操作如下：

1)96孔细胞培养板中按照每孔100μL的量加入调好浓度的脾淋巴细胞，再加入2μg对应的刺激物(ECH004f抗原蛋白，ECH004m抗原蛋白或BCG全菌裂解产物)。每组设立无菌PBS刺激的阴性对照孔和刀豆蛋白(ConA)(5μg/mL)刺激的阳性对照孔各一，盖好板盖并在37℃、5％CO₂培养箱中共培养16～24小时；

2)培养结束后将96孔细胞板4000rpm离心10min，取上清用于Luminex多重细胞因子检测，检测步骤按照说明书进行。

5.结核分枝杆菌体外生长抑制试验(MGIA)

用免疫后小鼠脾淋巴细胞对结核分枝杆菌的杀灭能力来评价ECH004f/ECH004m亚单位疫苗的保护性。

1)24孔板中每孔加入调好浓度的脾淋巴细胞500μL，含50CFU的结核分枝杆菌标准株H37RvμL，共1mL。混匀并置于37℃、5％CO₂培养箱中共培养4天；

2)培养结束后将共培养物转移至离心管中，12000rpm离心10分钟并弃去900μL上清；

3)离心的同时在24孔板中每孔加入500μL无菌水，用移液器吹打底部和侧壁并静置5分钟后转移至对应离心管中，涡旋震荡后静置10min以彻底裂解细胞并释放胞内的结核分枝杆菌；

4)取50μL涂布7H10平板，同时将50μL H37Rv菌液直接涂板作为空白对照，将平板37℃倒置培养2～3周后进行菌落计数。

6.结果分析：

1)体液免疫效果评价

血清抗体效价检测结果见图2。结果显示，ECH004f和ECH004m均可以刺激机体产生特异性IgG；ECH004f和ECH004m组的IgG1与IgG2a比值均高于BCG组(IgG2a通常代表Th1型细胞免疫，以介导细胞免疫反应为主；IgG1通常代表Th2型细胞免疫，介导体液免疫反应为主，通过计算IgG1与IgG2a的比率来确定免疫反应的类型)，即ECH004m和ECH004f组刺激产生的体液免疫反应的强度均优于BCG。

2)细胞免疫效果评价

2.1ELISPOT法检测IFN-γ和IL-4细胞因子分泌情况。如图3，结果显示，ECH004f组小鼠淋巴细胞分泌的IFN-γ高于BCG组，ECH004m和ECH004f组小鼠淋巴细胞分泌的IL-4的水平均显著高于BCG组。Th1型细胞因子IFN-γ以介导细胞免疫反应为主，Th2型细胞因子IL-4以介导体液免疫反应为主。即相较于BCG组，ECH004f组免疫小鼠后可诱导更强的免疫保护反应。

2.2免疫小鼠的脾细胞在体外被抗原刺激，Luminex检测抗原特异性IFN-γ、TNF-α、IL-4、IL-6、IL-10、IL-12和GM-CSF共7种细胞因子。如图4，结果显示，与BCG组相比，ECH004f和ECH004m免疫小鼠后，7种细胞因子表达量均高于BCG，表明两者均可刺激产生高水平细胞因子、诱导更全面的免疫保护反应。

3)体外保护性评价

如图5，结果显示：与PBS和佐剂组相比，ECH004f、ECH004m和BCG均可对结核分枝杆菌产生较强的抑制效果，即ECH004f、ECH004m免疫后均可以针对结核分枝杆菌感染产生有效的保护。

综上，本发明中制备的两种结核分枝杆菌亚单位疫苗ECH004/佐剂和ECH004m/佐剂，两者的体液免疫效果均优于BCG、均可刺激产生高水平细胞因子、诱导更全面的细胞免疫反应。体外保护性评价结果显示：两者均可以针对结核分枝杆菌感染产生较强的保护效力，说明两者均具有作为独立结核疫苗或卡介苗加强型疫苗的内在潜力。

最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。

Claims

1.一种结核亚单位疫苗，其特征在于，包括：如SEQ ID NO.1所示的EsxH蛋白、如SEQ IDNO.2所示的CFP10蛋白、以及如SEQ ID NO.3所示的HspX蛋白。

2.根据权利要求1所述的结核亚单位疫苗，其特征在于，EsxH蛋白、CFP10蛋白和HspX蛋白以独立的蛋白形式存在。

3.根据权利要求2所述的结核亚单位疫苗，其特征在于，其含有等摩尔比例的EsxH蛋白、CFP10蛋白和HspX蛋白。

4.根据权利要求1所述的结核亚单位疫苗，其特征在于，EsxH蛋白、CFP10蛋白和HspX蛋白以融合蛋白形式存在。

5.根据权利要求4所述的结核亚单位疫苗，其特征在于，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示。

6.根据权利要求1所述的结核亚单位疫苗，其特征在于，所述EsxH蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；所述CFP10蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；所述HspX蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。

7.根据权利要求5所述的结核亚单位疫苗，其特征在于，所述融合蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。

8.根据权利要求1～7中任一项所述的结核亚单位疫苗，其特征在于，还包括佐剂。

9.根据权利要求8所述的结核亚单位疫苗，其特征在于，所述佐剂为氢氧化铝佐剂。

10.权利要求1～9中任一项所述的结核亚单位疫苗在制备结核病诊断或治疗试剂中的应用。