CN116041454B - 结核分枝杆菌蛋白抗原混合物、多抗原融合蛋白及编码基因、应用 - Google Patents

结核分枝杆菌蛋白抗原混合物、多抗原融合蛋白及编码基因、应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种结核分枝杆菌蛋白抗原混合物，所述结核分枝杆菌蛋白抗原混合物包括Rv3875蛋白抗原、Rv3874蛋白抗原和nRv0934蛋白抗原。通过对所述结核分枝杆菌蛋白抗原混合物的免疫原性和保护效果进行评价分析发现，与BCG相比，所述结核分枝杆菌蛋白抗原混合物可产生高水平的血清抗体效价；其刺激小鼠脾淋巴细胞分泌的IFN‑γ、IL‑4等广泛抗原特异性细胞因子较BCG均明显提高，可以诱导产生更显著的体液免疫、细胞免疫和广泛的免疫保护性细胞因子。

Description

结核分枝杆菌蛋白抗原混合物、多抗原融合蛋白及编码基因、 应用
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，尤其涉及一种结核分枝杆菌蛋白抗原混合物、多抗原融合蛋白及编码基因、应用。
背景技术
结核病(TB)是一种主要由结核分枝杆菌感染引起的慢性呼吸道传染病。近年来，由于耐多药结核病的增多以及结核合并人类免疫缺陷病毒(HIV)感染的流行，以及大量结核潜伏感染人群(约占全球总人口数的三分之一)等原因，导致结核病的发病率和病死率一直处于传染病的前列。疫苗接种是预防和控制传染病最有效和最经济的手段。卡介苗(BCG)是目前唯一被批准临床使用的预防性抗结核疫苗，对于粟粒性结核病及结核性脑膜炎、尤其对儿童具有较好的保护效果。然而，BCG对成人的保护效果不理想，其保护效率差异悬殊。同时，作为一种减毒活疫苗，对于患有免疫缺陷性疾病的人群，接种BCG可能导致致死性感染。因此，开发更安全、更有效的新型结核病疫苗尤为重要。
目前已有14种结核候选疫苗正在开展临床试验。这些候选疫苗主要分为减毒活疫苗、灭活疫苗、蛋白/佐剂疫苗和病毒载体疫苗。常用的腺病毒载体疫苗，免疫途径单一、副作用较为明显且体内可能存在病毒载体的抗体，降低疫苗的免疫效果；灭活全菌疫苗在制备过程中，其制备工艺的限制性会降低疫苗免疫活性，且其成分多而复杂，有效成分含量较低、免疫保护机制不清晰；减毒活疫苗可能存在残余毒力等安全性等问题，不适用于儿童和免疫力低下的人群。
蛋白亚单位疫苗其优势在于安全性高，生产质量可控和成本较低等。由于仅含蛋白成分的蛋白亚单位疫苗直接接种人体后易降解、导致免疫原性降低，通常需在蛋白亚单位疫苗中添加佐剂以提高其免疫原性。铝佐剂作为疫苗佐剂已有近80年的历史，它也是唯一被美国FDA认证的人用疫苗佐剂。基于结核分枝杆菌保护性蛋白抗原及免疫佐剂联合构建的重组亚单位疫苗，因其安全性高、成分明确，且可诱导机体产生持久的免疫记忆细胞、为机体提供牢固的免疫保护，已成为新型结核疫苗研发的趋势。目前已有多种结核亚单位蛋白疫苗进入临床期，但是不同亚单位蛋白疫苗诱导机体产生免疫保护反应的细胞因子表达谱差异悬殊，不能诱导全面的免疫保护反应。这也是目前亚单位疫苗尚不能替代BCG的一个主要原因。此外，已进入临床期的结核亚单位疫苗普遍采用单一的优势蛋白抗原全长作为疫苗组分，而事实上，真正发挥免疫作用的是抗原蛋白表面有限的抗原表位，其余冗杂片段并不能增强蛋白抗原的免疫原性和进而提高接种后的保护性。研究显示，通过对接种临床期亚单位疫苗H1:IC31、H56:IC31、M72/AS01E、ID93+GLA-SE的人群进行细胞因子的检测，发现均未产生IL-17，表示均未能成功诱导Th17型免疫保护应答。
发明内容
有鉴于背景技术中存在的技术问题，本发明提供了一种结核分枝杆菌蛋白抗原混合物，所述结核分枝杆菌蛋白抗原混合物可产生高水平的血清抗体效价；其刺激小鼠脾淋巴细胞分泌的IFN-γ、IL-4和广泛抗原特异性细胞因子较BCG均明显提高，可以诱导产生更显著的体液免疫、细胞免疫和广泛的免疫保护性细胞因子。
本发明提供了一种结核分枝杆菌蛋白抗原混合物，所述结核分枝杆菌蛋白抗原混合物包括Rv3875蛋白抗原、Rv3874蛋白抗原和nRv0934蛋白抗原；所述Rv3875蛋白抗原的氨基酸序列包括SEQ IDNO.6；所述Rv3874蛋白抗原的氨基酸序列包括SEQ ID NO.7；所述nRv0934蛋白抗原的氨基酸序列包括SEQ ID NO.8。
优选的，所述Rv3875蛋白抗原的基因核苷酸序列包括SEQ IDNO.3；所述Rv3874蛋白抗原的基因核苷酸序列包括SEQ ID NO.4；所述nRv0934蛋白抗原的基因核苷酸序列包括SEQ ID NO.5。
本发明提供了一种结核分枝杆菌多抗原融合蛋白，所述结核分枝杆菌多抗原融合蛋白包括所述的Rv3875蛋白抗原、Rv3874蛋白抗原和nRv0934蛋白抗原；且所述的Rv3875蛋白抗原、Rv3874蛋白抗原和nRv0934蛋白抗原顺次串连。
优选的，所述结核分枝杆菌多抗原融合蛋白的氨基酸序列包括SEQ ID NO.2。
本发明提供了所述结核分枝杆菌多抗原融合蛋白的编码基因，所述编码基因的核苷酸序列包括SEQ ID NO.1。
本发明提供了用于表达所述结核分枝杆菌多抗原融合蛋白的生物材料，所述生物材料包括表达载体和工程菌；所述生物材料包括所述编码基因。
本发明提供了所述结核分枝杆菌蛋白抗原混合物，或者所述结核分枝杆菌多抗原融合蛋白，或者所述编码基因，或者所述生物材料在制备结核分枝杆菌疫苗中的应用。
本发明提供了一种结核分枝杆菌疫苗，所述结核分枝杆菌疫苗的有效成分包括所述结核分枝杆菌蛋白抗原混合物，或者所述结核分枝杆菌多抗原融合蛋白，或者所述编码基因，或者所述表达载体表达得到的结核分枝杆菌多抗原融合蛋白，或者所述工程菌制备得到的结核分枝杆菌多抗原融合蛋白。
优选的，所述结核分枝杆菌疫苗的有效成分还包括铝盐佐剂。
本发明还提供了所述结核分枝杆菌蛋白抗原混合物，或者所述结核分枝杆菌多抗原融合蛋白，或者所述编码基因，或者所述表达载体，或者所述工程菌在制备结核分枝杆菌检测试剂或者治疗结核分枝杆菌疾病的药物中的应用。
有益效果：
本发明提供的结核分枝杆菌蛋白抗原混合物包括Rv3875(ESAT-6)、Rv3874(CFP-10)和nRv0934(nPstS1)。通过对所述结核分枝杆菌蛋白抗原混合物的免疫原性和保护效果进行评价分析发现，与BCG相比，所述结核分枝杆菌蛋白抗原混合物可产生高水平的血清抗体效价；其刺激小鼠脾淋巴细胞分泌的IFN-γ、IL-4和广泛抗原特异性细胞因子较BCG均明显提高，可以诱导产生更显著的体液免疫、细胞免疫和广泛的免疫保护性细胞因子。
附图说明
为了更清楚地说明本发明或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图进行说明。
图1是本发明实施例2中ECP001f融合蛋白和ECP001m中各单个蛋白的SDS-PAGE图谱；其中，M代表预染彩色蛋白标准分子量；样品1、2、3、4分别对应ECP001f、ESAT6，CFP10和nPstS1；
图2是本发明实施例3所述血清抗体效价检测结果图；
图3是本发明实施例3所述ELISPOT法检测IFN-γ和IL-4细胞因子分泌情况的结果图；
图4是本发明实施例3所述Luminex检测抗原特异性IL-2、IFN-γ、TNF-α、IL-4、IL-6、IL-10、IL-12、GM-CSF和IL-17共九种细胞因子的结果图；
图5是本发明实施例3所述体外保护性评价实验(分枝杆菌生长抑制试验，MGIA)的结果图。
具体实施方式
本发明提供了一种结核分枝杆菌蛋白抗原混合物ECP001m，所述结核分枝杆菌蛋白抗原混合物包括Rv3875蛋白抗原(ESAT-6)、Rv3874蛋白抗原(CFP-10)和nRv0934蛋白抗原(nPstS1)；所述Rv3875蛋白抗原的氨基酸序列包括SEQ ID NO.6；所述Rv3874蛋白抗原的氨基酸序列包括SEQ ID NO.7；所述nRv0934蛋白抗原的氨基酸序列包括SEQ ID NO.8。ESAT6蛋白抗原是一种结核分枝杆菌早期分泌蛋白，具有较强的免疫原性，可以在结核分枝杆菌感染期持续表达，诱导T细胞免疫应答。CFP10蛋白抗原是一种结核分枝杆菌培养滤液蛋白，能够有效激活T细胞免疫应答。PstS1蛋白属于三磷酸腺苷超家族(ATP bindingcassette，ABC)磷酸盐离子转运系统的蛋白之一，是一种磷酸盐离子转移受体，可介导细胞间的黏附，与巨噬细胞表面的甘露糖受体结合、促进吞噬；诱导淋巴细胞分泌IFN-γ、IL-1和IL-22等细胞因子，刺激机体产生较强的Th1型细胞免疫反应和体液免疫应答，具有较强的免疫原性。本发明利用TEpredict及IEDB数据库(http://www.iedb.org/)中的生物信息分析平台对PstS1氨基酸序列的T细胞表位进行预测，筛选与HLA-Ⅱ类分子(包括HLA-A*0201、*0202、*0203、*0206)结合较好的T细胞表位肽段，对应PstS1第57-135和第268-373位氨基酸序列，对表位富集区域进行定位、剪接：截取第57-135位和第268-373位氨基酸序列，将两个抗原表位富集区连接得到PstS1蛋白的T细胞表位集中区nPstS1，并通过PCR技术扩增编码nPstS1的基因片段(两端含有EcoRⅠ和HindⅢ酶切位点)，得到nPstS1蛋白。本发明经试探性筛选，最终从数百条结核分枝杆菌的抗原候选片段中，选用ESAT-6、CFP-10、和nPstS1作为所述结核分枝杆菌蛋白抗原混合物的组成成分。与BCG相比，所述结核分枝杆菌蛋白抗原混合物可产生高水平的血清抗体效价；其刺激小鼠脾淋巴细胞分泌的IFN-γ、IL-4和广泛抗原特异性细胞因子较BCG均明显提高，可以诱导产生更显著的体液免疫、细胞免疫和广泛的免疫保护性细胞因子。
在本发明优选的实施方案中，所述结核分枝杆菌蛋白抗原混合物以Mycobacterium tuberculosis H37Rv基因组DNA为模板，以特异性引物PCR扩增Rv3875、Rv3874和nRv0934基因序列，分别构建单个抗原的重组质粒，在大肠杆菌中表达后，再按照等摩尔比例混合得到；在本发明更优选的具体实施方案中，所述结核分枝杆菌蛋白抗原混合物以结核分枝杆菌参考菌株H37Rv的基因组为模板，通过PCR扩增两端带有EcoRⅠ和HindⅢ双酶切位点的基因序列，利用分子克隆技术将ESAT6、CFP10和nPstS1分别进行双酶切后连接至pET-32a质粒，分别构建ESAT6、CFP10和nPstS1重组质粒并转入大肠杆菌DH5α感受态细胞，测序验证后转入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞；构建成功的三种重组大肠杆菌在LB液体培养基中增菌培养，待吸光度(A)值达到0.6，使用异丙基β-d-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达，通过Ni亲和层析技术纯化获得目的蛋白；将制备的ESAT6、CFP10和nPstS1蛋白等摩尔比例混合，构成混合蛋白ECP001m。
本发明提供了一种结核分枝杆菌多抗原融合蛋白，所述结核分枝杆菌多抗原融合蛋白包括所述的Rv3875蛋白抗原、Rv3874蛋白抗原和nRv0934蛋白抗原；且所述的Rv3875蛋白抗原、Rv3874蛋白抗原和nRv0934蛋白抗原顺次串连。在本发明中，所述Rv3875蛋白抗原、Rv3874蛋白抗原和nRv0934蛋白抗原优选通过linker顺次串连，所述linker优选包括柔性连接臂，所述柔性连接臂的编码基因序列优选包括GGTGGTTCTGGCGGT(SEQ ID NO.17)。在本发明更优选的具体实施方案中，所述结核分枝杆菌多抗原融合蛋白为ECP001f，其氨基酸序列包括：
MTEQQWNFAGIEAAASAIQGNVTSIHSLLDEGKQSLTKLAAAWGGSGSEAYQGVQQKWDATATELNNALQNLARTISEAGQAMASTEGNVTGMFAGGSGGAEMKTDAATLAQEAGNFERISGDLKTQIDQVESTAGSLQGQWRGAAGTAAQAAVVRFQEAANKQKQELDEISTNIRQAGVQYSRADEEQQQALSSQMGFGGSGGGSTLLYPLFNLWGPAFHERYPNVTITAQGTGSGAGIAQAAAGTVNIGASDAYLSEGDMAAHKGLMNIALAISAQQVNYNNSSGNFLLPDAQSIQAAAAGFASKTPANQAISMIDGPAPDGYPIINYEYAIVNNRQKDAATAQTLQAFLHWAITDGNKASFLDQVHFQPLPPAVVKLSDALIATIS*(SEQ IDNO.2)。
由于人工串联的蛋白片段普遍存在空间构象问题，无法完整表达，或者无法达到预期的生物学效果，因此，虽然Rv3875(ESAT-6)和Rv3874(CFP-10)是目前已知具有较强免疫原性的抗原，nRv0934(nPstS1)是本发明构建的具有较强免疫原性的抗原。但现阶段并未发现将Rv3875(ESAT-6)、Rv3874(CFP-10)和nRv0934(nPstS1)进行融合的技术。本发明将Rv3875(ESAT-6)、Rv3874(CFP-10)和nRv0934(nPstS1)3种蛋白抗原顺次串连，表达得到结核分枝杆菌多抗原融合蛋白ECP001f(ESAT6-linker-CFP10-linker-nPstS1fusion)。ESAT6，CFP10和nPstS1三个优势抗原以柔性肽段顺序连接，仅需表达和纯化一个融合蛋白即能获得上述三种抗原组分，简化了重组蛋白表达和纯化的步骤、提高了生产效率和降低了生产成本。与BCG相比，所述核分枝杆菌多抗原融合蛋白可产生高水平的血清抗体效价；其刺激小鼠脾淋巴细胞分泌的IFN-γ、IL-4和广泛抗原特异性细胞因子较BCG均明显提高，可以诱导产生更显著的体液免疫、细胞免疫和广泛的免疫保护性细胞因子。
在本发明更优选的具体实施方案中，所述核分枝杆菌多抗原融合蛋白通过linker将三种蛋白对应的基因片段依次顺序连接构成融合基因的重组质粒，最外侧基因两端连接NdeⅠ和XhoⅠ酶切位点，双酶切后连接至pET43.1a质粒并转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，测序验证后转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞；构建成功的重组大肠杆菌在LB液体培养基中增菌培养，待吸光度(A)值达到0.6，使用异丙基β-d-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导重组蛋白表达，通过DEAE离子交换层析技术和疏水柱层析分离技术纯化获得目的蛋白ECP001f。
本发明提供了所述结核分枝杆菌多抗原融合蛋白的编码基因，所述编码基因包括Rv3875基因、Rv3874基因和nRv0934基因。在本发明更优选的具体实施方案中，所述Rv3875基因、Rv3874基因和nRv0934基因经密码子优化后顺次串连；所述编码基因的核苷酸序列包括：
ATGACAGAGCAGCAGTGGAATTTCGCGGGTATCGAGGCCGCGGCAAGCGCAATCCAGGGAAATGTCACGTCCATTCATTCCCTCCTTGACGAGGGGAAGCAGTCCCTGACCAAGCTCGCAGCGGCCTGGGGCGGTAGCGGTTCGGAGGCGTACCAGGGTGTCCAGCAAAAATGGGACGCCACGGCTACCGAGCTGAACAACGCGCTGCAGAACCTGGCGCGGACGATCAGCGAAGCCGGTCAGGCAATGGCTTCGACCGAAGGCAACGTCACTGGGATGTTCGCAGGTGGTTCTGGCGGTGCAGAGATGAAGACCGATGCCGCTACCCTCGCGCAGGAGGCAGGTAATTTCGAGCGGATCTCCGGCGACCTGAAAACCCAGATCGACCAGGTGGAGTCGACGGCAGGTTCGTTGCAGGGCCAGTGGCGCGGCGCGGCGGGGACGGCCGCCCAGGCCGCGGTGGTGCGCTTCCAAGAAGCAGCCAATAAGCAGAAGCAGGAACTCGACGAGATCTCGACGAATATTCGTCAGGCCGGCGTCCAATACTCGAGGGCCGACGAGGAGCAGCAGCAGGCGCTGTCCTCGCAAATGGGCTTCGGTGGTTCTGGCGGTGGTAGCACGCTGCTCTACCCGCTGTTCAACCTGTGGGGTCCGGCCTTTCACGAGAGGTATCCGAACGTCACGATCACCGCTCAGGGCACCGGTTCTGGTGCCGGGATCGCGCAGGCCGCCGCCGGGACGGTCAACATTGGGGCCTCCGACGCCTATCTGTCGGAAGGTGATATGGCCGCGCACAAGGGGCTGATGAACATCGCGCTAGCCATCTCCGCTCAGCAGGTCAACTACAACAATAGCTCTGGCAATTTCTTGTTGCCCGACGCGCAAAGCATTCAGGCCGCGGCGGCTGGCTTCGCATCGAAAACCCCGGCGAACCAGGCGATTTCGATGATCGACGGGCCCGCCCCGGACGGCTACCCGATCATCAACTACGAGTACGCCATCGTCAACAACCGGCAAAAGGACGCCGCCACCGCGCAGACCTTGCAGGCATTTCTGCACTGGGCGATCACCGACGGCAACAAGGCCTCGTTCCTCGACCAGGTTCATTTCCAGCCGCTGCCGCCCGCGGTGGTGAAGTTGTCTGACGCGTTGATCGCGACGATTTCCTAG(SEQ ID NO.1)。
本发明提供了所述结核分枝杆菌多抗原融合蛋白的生物材料，所述生物材料包括表达载体和工程菌；所述生物材料包括所述编码基因。本发明对所述表达载体的基础工程质粒来源和类别不作特别限定，本领域常规市售的商品化工程质粒均可。在本发明优选的具体实施方式中，所述表达载体包括pET43.1a-ECP001f，所述pET43.1a-ECP001f由包括所述编码基因的核苷酸序列连接到pET43.1a载体中得到。在本发明更优选的具体实施方式中，本发明将所述pET43.1a-ECP001f重组质粒转至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，得到ECP001f工程菌，所述ECP001f工程菌在37℃温度条件下，经IPTG诱导后，可获得大量的包涵体融合蛋白ECP001f，经纯化复性后，可获得具有活性的ECP001f蛋白。
本发明提供了所述结核分枝杆菌蛋白抗原混合物，或者所述结核分枝杆菌多抗原融合蛋白，或者所述编码基因，或者所述生物材料在制备结核分枝杆菌疫苗中的应用。
本发明提供了一种结核分枝杆菌疫苗，所述结核分枝杆菌疫苗的有效成分包括所述结核分枝杆菌蛋白抗原混合物，或者所述结核分枝杆菌多抗原融合蛋白，或者所述编码基因，或者所述表达载体表达得到的结核分枝杆菌多抗原融合蛋白，或者所述工程菌制备得到的结核分枝杆菌多抗原融合蛋白。
在本发明中，所述结核分枝杆菌疫苗的有效成分优选还包括铝盐佐剂；所述铝盐佐剂优选包括氢氧化铝佐剂。
在本发明更优选的具体实施方式中，所述结核分枝杆菌疫苗包括ECP001f/佐剂亚单位疫苗和/或ECP001m/佐剂亚单位疫苗。所述ECP001f/佐剂亚单位疫苗的构建方法为：融合蛋白ECP001f与氢氧化铝佐剂按体积比3:1混匀。所述ECP001m/佐剂亚单位疫苗的构建方法为：ESAT6、CFP10和nPstS1三种蛋白以等摩尔比例混合后与氢氧化铝佐剂按体积比3:1混匀。本发明获得结核分枝杆菌疫苗后，优选用所述结核分枝杆菌疫苗免疫BALB/C小鼠，再以BCG组作为阳性对照组、PBS组为阴性对照组、佐剂组为空白对照组；采用酶联免疫吸附试验(ELISA)、酶联免疫斑点试验(ELISpot)、Luminex技术和分枝杆菌体外生长抑制实验(MGIA)等方法评价所述结核分枝杆菌疫苗的免疫效果。
本发明还提供了所述结核分枝杆菌蛋白抗原混合物，或者所述结核分枝杆菌多抗原融合蛋白，或者所述的编码基因，或者所述表达载体，或者所述工程菌在制备结核分枝杆菌检测试剂或者治疗结核分枝杆菌疾病的药物中的应用。
结核分枝杆菌是一种胞内寄生菌，其侵入机体后，主要导致细胞免疫反应。即机体对结核分枝杆菌的清理作用主要通过分泌细胞因子参与免疫调节或调理吞噬等过程实现，因此在整个免疫反应过程中细胞因子表达谱的范围及强度对免疫保护效果的作用至关重要。目前的研究发现，结核分枝杆菌感染人体后主要分泌的细胞因子包括IFN-r、IL-1α、IL-1β、IL-18、TNF-α、IL-2、IL-4、IL-6、IL-17等。γ干扰素释放试验是目前公认的诊断结核感染的高灵敏度、高特异性的检测方法；经结核分枝杆菌特异抗原刺激的T淋巴细胞释放γ干扰素，通过检测其释放强度来判断是否感染。经本发明所述抗原刺激后的样本其释放γ干扰素的能力及强度明显高于对照组，因此本发明中的抗原具备作为检测试剂的潜力。同理，目前多种细胞因子分泌水平的检测，如IL-2、IFN-γ、IL-4、IL-6、IL-12、IL-17等，均已纳入结核感染检测的分子标记物评估范围。经本发明所述抗原刺激后上述细胞因子的分泌水平与对照组比较均呈现明显变化，提示可用作潜在的分子检测标志物。保护性细胞因子的分泌水平是细胞免疫能力的最直接体现；经本发明所述抗原免疫后，无论是细胞因子分泌的水平、还是细胞因子分泌的种类，与对照组相比均有显著升高或不低于BCG组。该研究结果提示，当机体应用本发明所述抗原制备的药物后，机体能够分泌强度较高、更为广泛保护性细胞因子，或辅助免疫系统、调节免疫网络及细胞。
本发明采用原核表达系统表达蛋白，适合大规模商业化生产，且成本较低。基于本发明的检测试剂可广泛用于结核病的辅助诊断、流行病学监测与感染筛查等相关领域，为抗结核新疫苗的研制提供了新思路。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。若未特别指明，实施例中所使用的实验方法均为常规方法；所用的材料、试剂等均可从商业途径得到。
LB琼脂：购自北京陆桥技术股份有限公司。LB肉汤：购自北京陆桥技术股份有限公司。镍柱，DEAD柱填料：购自美国GE公司。4×SDS上样缓冲液：购自北京索莱宝科技有限公司。显色底物TMB：购自北京全式金生物技术有限公司。1640培养基：购自生工生物工程(上海)股份有限公司。青霉素琏霉素双抗溶液：购自Gibco Life technologies公司。淋巴细胞分离液：购自北京达科为生物技术有限公司。手持细胞计数仪：购自美国密理博公司。
实施例1融合蛋白ECP001f重组质粒及混合蛋白ECP001m中单个蛋白组分质粒的构建
在美国国家生物技术信息中心(NCBI)数据库中，检索得到编码ESAT6、CFP10和PstS1的基因序列，使用Teprdeict和IEDB等生物信息软件预测PstS1的T细胞表位，筛选与HLA-Ⅱ类分子(包括HLA-A*0201、*0202、*0203、*0206等)结合较好的T细胞表位肽段，对应PstS1第57-第135和第268-第373位氨基酸序列，将两段序列剪接后串联形成PstS1蛋白的T细胞表位集中区nPstS1，其对应的核苷酸序列串联形成表位富集区基因序列。
融合蛋白ECP001f重组质粒的构建：ECP001f重组质粒由ESAT6、CFP10和nPstS1对应的三个基因片段依次串联，为保证各蛋白之间在空间结构上互不影响，在各基因之间加入一段基因序列为“GGTGGTTCTGGCGGT”的linker，最外侧的基因两端连接NdeⅠ和XhoⅠ酶切位点，各基因连接之后克隆于pET43.1a载体。
混合蛋白ECP001m中单个蛋白对应质粒的构建：以H37Rv基因组DNA为模板，通过特异性引物PCR扩增ESAT6、CFP10和nPstS1对应的基因序列，引物的两端包括EcoRI和HindIII两个酶切位点，引物信息见表1。PCR反应体系和反应程序见表2和表3。
表1引物扩增列表
表2PCR扩增体系
表3PCR反应程序
PCR产物经EcoRⅠ和HindⅢ双酶切之后，利用T4 DNA连接酶16℃反应过夜，然后分别克隆于pET32a载体，获得三个蛋白对应基因重组质粒。
将上述构建好的四种质粒转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，步骤为：10μL连接产物与大肠杆菌DH5α感受态细胞混匀后冰浴静置30min，42℃热激90s，冰浴静置2min，加入800μL无抗性的LB液体培养基，置于摇床37℃180rpm培养1h。培养结束后4000rpm离心1min，弃去600μl上清，将菌体沉淀吹打混匀后取200μl菌液涂布于含有氨苄青霉素的LB固体平板，37℃倒置培养12～16h。挑取单菌落于含有氨苄青霉素的LB液体培养基中增菌培养，次日吸取菌液进行PCR，鉴定基因重组质粒是否连接成功。随后进行DNA测序鉴定插入片段的正确性。取测序100％正确的阳性克隆菌体提取重组质粒并于-20℃保存。
实施例2融合蛋白ECP001f及混合蛋白ECP001m各组分的原核表达及纯化
将实施例1中构建成功的重组质粒转入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，挑取单菌落接种至含氨苄青霉素(Amp+)的LB液体培养基中37℃、180rpm增菌培养，待吸光度(A)值达到0.6，加入终浓度为1Mmol/L的异丙基β-d-硫代半乳糖苷(IPTG)在相同条件下培养3小时诱导目的蛋白表达。诱导结束后4℃、4000rpm离心10min，收集菌体，用裂解液(20Mm Tris-Hcl+Triton100X)重悬菌体后使用超声破碎菌体(超声参数为220W，工作15s间隔20s，共15min)，超声结束后12000rpm离心10min分离上清和沉淀，利用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)鉴定重组蛋白表达水平和表达形式。
通过Ni柱亲和层析、DEAE离子交换层析技术和疏水柱层析分离技术纯化目的蛋白，具体步骤为：对ECP001m中的三种单个抗原组分分别进行Ni柱亲和层析：装填Ni柱亲和层析填料并通入3倍柱体积的平衡缓冲液(可溶性表达的重组蛋白采用pH8.0的20mmol/LTris-Hcl；包涵体表达的重组蛋白采用pH8.0的8M尿素)，待280nm紫外吸光度值稳定后调零。泵入样本并收集流穿液，再泵入重组蛋白对应的平衡缓冲液淋洗直至280nm紫外吸光度值稳定。用不同浓度的咪唑洗脱(30mmol/L、60mmol/L、150mmol/L和300mmol/L)，收集不同浓度的洗脱液，通过SDS-PAGE鉴定各样本中目的蛋白浓度和纯度，SDS-PAGE电泳结果显示：ESAT6蛋白在300Mm咪唑洗脱、CFP10蛋白在60Mm咪唑洗脱、nPstS1蛋白在30、60Mm咪唑洗脱时，电泳图无明显杂带且蛋白浓度较高。收集上述洗脱液样本用于后续操作。对融合蛋白ECP001f先进行DEAE离子交换层析。装填DEAE离子交换填料并通入3倍柱体积的平衡缓冲液(可溶性表达的重组蛋白采用pH8.0的20mmol/LTris-Hcl缓冲液平衡柱材；包涵体表达的重组蛋白采用pH8.0的8M尿素平衡柱材)，待280nm紫外吸光度值稳定后调零。泵入样本并收集流穿液，再泵入重组蛋白对应的平衡缓冲液淋洗填料直至280nm紫外吸光度值稳定。分别用不同浓度的NaCl洗脱(50mM、100mM、200mM和400mM)，收集所有洗脱液，通过SDS-PAGE鉴定各样本中目的蛋白浓度和纯度，选择纯度最好的样本用于后续操作。电泳结果显示：ECP001f重组蛋白在50mM NaCl洗脱时，目的蛋白含量较高，但有少许杂带，收集此洗脱液，再用疏水柱层析分离技术进行进一步纯化。具体操作为：收集样品与硫酸铵溶液混合至样品内的硫酸铵浓度为1M，使用10mM Tris-HCL冲洗疏水柱介质后，用1M硫酸铵溶液调PH值至平衡，样品溶液过疏水柱上样，随后用含硫酸铵终浓度为0.5M的10mM Tris-HCL，含硫酸铵终浓度为0.25M的10mM Tris-HCL，含硫酸铵终浓度为0M的10mM Tris-HCL依次洗脱。收集上述洗脱液进行电泳分析。电泳结果显示目的蛋白在流穿液中纯度和含量最高。将纯化结束后的目的蛋白装入透析袋中梯度透析去除尿素、咪唑及其他小分子杂质，最后置于pH7.4的Tris-Hcl中4℃透析2h，透析结束后超滤浓缩并用0.22μm滤器滤过除菌，分装后于-70℃保存。
ECP001f重组蛋白和ECP001m中各单个蛋白SDS-PAGE鉴定结果见图1，各蛋白表达条件和表达形式见表4。
表4：蛋白表达条件和表达形式
实施例3免疫保护效果评价
1、免疫动物
ECP001f/佐剂亚单位疫苗的构建：融合蛋白ECP001f与氢氧化铝佐剂按体积比3:1混匀。
ECP001m/佐剂亚单位疫苗的构建：ESAT6、CFP10和nPstS1三种蛋白以等摩尔比混合后与氢氧化铝佐剂按体积比3:1混匀。
健康雌性BALB/c小鼠30只，SPF级，6-8周龄，购自北京HFK生物科技有限公司，随机分成5组，每组6只，分别为PBS组、佐剂组、ECP001f/佐剂组、ECP001m/佐剂组以及BCG组，其中BCG组仅在第1天免疫一次，其余4组均在第1、11、21天分别进行皮下多点免疫，免疫抗原量为50μg/只，总剂量为200μl/只。具体分组见表5。
2、血液样本采集
初次免疫前以及小鼠处死前通过眼眶采血法采血，37℃静置2h，4000rpm离心10min，分离血清，分装后存放于-20℃备用。
3、体液免疫效果检测
采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测血清特异性抗体效价。
检测小鼠血清中特异性IgG、IgG1以及IgG2a的滴度，具体方法如下：
a.将酶标板用2μg/ml的ECP001f、ECP001m和BCG蛋白4℃过夜包被，次日，用PBST洗涤5遍。
b.用含2％ BSA的PBS液37℃封闭2小时，用PBST洗涤5遍。
c.用PBS将各组血清按20000、40000、80000、160000、320000、640000、1280000、2560000倍稀释，每孔中加入100μL稀释后的血清，37℃孵育1小时后，用PBST洗5遍。
d.分别加入5000倍稀释的HRP标记的IgG、IgG1、IgG2a抗体，每孔100μL，37℃孵育1小时后，用PBST洗5遍。
e.加入TMB 37℃显色15分钟后，加入2M硫酸作为终止液。
f.酶标仪检测波长450nm的吸光度值。
g.判断标准：若样本OD值≥2.1×阴性对照OD值，则判定为阳性。
4、细胞免疫效果检测
(1)小鼠脾脏淋巴细胞的分离(最后一次免疫后一周处死小鼠，无菌分离脾脏)
a.利用戊巴比妥钠麻醉小鼠至死亡，用75％医用酒精浸泡小鼠消毒，将小鼠无菌解剖并取出脾脏，放入RPMI 1640中(加有青霉素和链霉素双抗)，1h之内分离脾淋巴细胞。
b.利用小鼠淋巴细胞分离液分离淋巴细胞。
c.分离淋巴细胞后测定淋巴细胞浓度，并调整至浓度为2×106cells/ml用于后续实验。
(2)ELISPOT法检测IFN-γ和IL-4细胞因子分泌情况
小鼠IFN-γ和IL-4ELISpot检测试剂盒为购置的商品化试剂盒，具体操作如下：
a.在预包被IFN-γ和IL-4对应捕获抗体的ELISpot检测孔中加入200μL RPMI1640培养基，室温静置10min活化预包被板。
b.每孔加入100μL调完浓度的脾淋巴细胞，每孔分别加入10μlECP001f和ECP001m抗原(终浓度为2μg/well)。每种抗原刺激物做3个复孔，每组设立无菌PBS刺激的阴性对照孔和刀豆蛋白(ConA)(5μg/mL)刺激的阳性对照孔各一，盖好板盖并在37℃、5％CO2培养箱中共培养16-24小时。
c.培养结束后弃去孔中液体，用PBST洗涤5遍并将孔内残余液体完全去除。
d.按100μL/孔加入生物素标记的抗IFN-γ和抗IL-4抗体工作液，37℃孵育1h后弃去孔中液体，用PBST洗涤5遍并将孔内残余液体完全去除。
e.按100μL/孔加入链霉亲和素标记的HRP工作液，37℃孵育1h后弃去孔内液体，用PBST洗涤5遍并将孔内残余液体完全去除。
f.按100μL/孔加入现配的ACE显色液并置于37℃避光孵育，根据孔内斑点形成情况终止孵育，流水冲洗终止反应，倒扣过夜晾干水分。
g.使用ELISpot读板仪检测各孔的CFU(斑点形成单位)数。
(3)Luminex法检测IL-2、IFN-γ、TNF-α、IL-4、IL-6、IL-10、IL-12、GM-CSF和IL-17九种细胞因子。Luminex多重细胞因子检测试剂盒为市售商品化试剂盒，具体操作如下：
a.96孔细胞培养板中按照每孔100μL的量加入调好浓度的脾淋巴细胞，再加入2μg对应的刺激物(ECP001f蛋白抗原，ECP001m蛋白抗原或BCG全菌裂解产物)。每组设立无菌PBS刺激的阴性对照孔和刀豆蛋白(ConA)(5μg/mL)刺激的阳性对照孔各一，盖好板盖并在37℃、5％ CO2培养箱中共培养16-24小时。
b.培养结束后将96孔细胞板4000rpm离心10min，取上清用于Luminex多重细胞因子检测，检测步骤按照说明书进行。
5.结核分枝杆菌体外生长抑制试验(MGIA)
用免疫后小鼠脾淋巴细胞对结核分枝杆菌的抑制能力来评价ECP001f/ECP001m亚单位疫苗的保护性。
a.24孔板中每孔加入调好浓度的脾淋巴细胞500μL和含50CFU的结核分枝杆菌标准株H37Rv 500μL，共1Ml。混匀并置于37℃、5％CO2培养箱中共培养4天。
b.培养结束后将共培养物转移至离心管中，12000rpm离心10分钟并弃净上清。
c.离心的同时在24孔板中每孔加入500μL无菌水，用移液器吹打底部和侧壁并静置5分钟后转移至对应离心管中，涡旋震荡后静置10min以彻底裂解细胞并释放胞内的结核分枝杆菌。
d.取50μL涂布7H10平板，同时将50μL H37Rv菌液直接涂板作为空白对照，将平板37℃倒置培养2-3周后进行菌落计数。
6.结果分析：
(1)体液免疫效果评价
血清抗体效价检测结果见图2。
结果显示，ECP001f和ECP001m均可以刺激机体产生特异性IgG；其中ECP001f和ECP001m的IgG1、IgG2a水平均高于BCG组；ECP001f组和ECP001m组的IgG1与IgG2a比值相当，无统计学差异，均高于BCG组。(IgG2a通常代表Th1型细胞免疫，以介导细胞免疫反应为主；IgG1通常代表Th2型细胞免疫，介导体液免疫反应为主，通过计算IgG1与IgG2a的比率来确定免疫反应的类型)结果表明ECP001f和ECP001m刺激产生的免疫反应偏向于体液免疫反应。
(2)细胞免疫效果评价
ELISPOT法检测IFN-γ和IL-4细胞因子分泌情况，结果见图3。
结果显示，ECP001f组和ECP001m组小鼠脾淋巴细胞分泌的IFN-γ和IL-4的水平均显著高于BCG组。Th1型细胞因子IFN-γ以介导细胞免疫反应为主，Th2型细胞因子IL-4以介导体液免疫反应为主。其中，ECP001f组分泌IFN-γ的能力最强，而ECP001m分泌IL-4的能力最强。结果表明相较于BCG，ECP001f和ECP001m均可以诱导产生更显著的体液免疫和细胞免疫，ECP001f组诱导产生细胞免疫反应的能力最强，ECP001m诱导产生体液免疫反应的能力最强。
免疫小鼠的脾细胞在体外被抗原刺激，Luminex检测抗原特异性IL-2、IFN-γ、TNF-α、IL-4、IL-6、IL-10、IL-12、GM-CSF和IL-17共九种细胞因子，结果见图4。
结果显示，与BCG组相比，ECP001f和ECP001m免疫小鼠后，分泌的9种细胞因子含量都明显高于BCG，说明两者均可刺激产生高水平细胞因子、诱导广泛而全面的免疫保护反应。除IL-4外，ECP001f刺激其他细胞因子分泌的能力均强于ECP001m，表明ECP001f能诱导产生更强、更广泛的免疫保护性细胞因子。
(3)体外保护性评价
体外保护性评价实验结果见图5。
结果显示，与PBS和佐剂组相比，ECP001f、ECP001m和BCG均对结核分枝杆菌有很强的抑制效果，ECP001f组和ECP001m组抑制结核分枝杆菌的能力不低于BCG免疫组，表明两者均可以产生与BCG同等或更高的保护效力。
本发明将编码ESAT6、CFP10两种抗原全长和PstS1的抗原表位集中区(nPstS1)进行的序列融合，中间以柔性肽段顺序连接，进行基因重组、构建表达质粒，在大肠杆菌中表达和纯化后，获得了一种新的融合蛋白抗原(ESAT6-linker-CFP10-linker-nPstS1)，命名为ECP001f(ECP001 fusion)；并将编码ESAT6、CFP10和nPstS1的基因片段分别进行重组，构建表达质粒，在大肠杆菌中表达，纯化后，等摩尔比例混合，获得了一种新的混合蛋白抗原，命名为ECP001m(ECP001 mixture)。将ECP001f和ECP001m分别与铝佐剂联合构建两种结核亚单位疫苗，并通过动物模型评价其接种后的免疫原性和保护效果。本发明制备的两种结核分枝杆菌亚单位疫苗ECP001f/佐剂和ECP001m/佐剂。体液免疫效果显示，ECP001f和ECP001m均可产生高水平的血清抗体效价，两者刺激产生的免疫反应偏向于体液免疫反应；细胞免疫效果显示，ECP001f和ECP001m刺激小鼠脾淋巴细胞分泌的IFN-γ、IL-4和广泛抗原特异性细胞因子较BCG均明显提高，相较于BCG，ECP001f和ECP001m均可以诱导产生更显著的体液免疫、细胞免疫和广泛的免疫保护性细胞因子；体外保护性评价结果显示，ECP001f和ECP001m与BCG抑菌效果相当，两者均能产生不低于BCG的免疫保护效果，表明两者均可以产生与BCG同等或更高的保护效力。以上实验结果说明两者均具有作为独立结核疫苗或卡介苗加强型疫苗的内在潜力。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，便于具体和详细地理解本发明的技术方案，但并不能因此而理解为对发明专利保护专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。

Claims (9)

1.结核分枝杆菌蛋白抗原混合物，其特征在于，所述结核分枝杆菌蛋白抗原混合物包括Rv3875蛋白抗原、Rv3874蛋白抗原和nRv0934蛋白抗原；所述Rv3875蛋白抗原的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示；所述Rv3874蛋白抗原的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示；所述nRv0934蛋白抗原的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示。
2.根据权利要求1所述结核分枝杆菌蛋白抗原混合物，其特征在于，所述Rv3875蛋白抗原的基因核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述Rv3874蛋白抗原的基因核苷酸序列如SEQID NO.4所示；所述nRv0934蛋白抗原的基因核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。
3.结核分枝杆菌多抗原融合蛋白，其特征在于，所述结核分枝杆菌多抗原融合蛋白包括权利要求1所述的Rv3875蛋白抗原、Rv3874蛋白抗原和nRv0934蛋白抗原；且所述的Rv3875蛋白抗原、Rv3874蛋白抗原和nRv0934蛋白抗原顺次串连；所述结核分枝杆菌多抗原融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
4.权利要求3所述结核分枝杆菌多抗原融合蛋白的编码基因，其特征在于，所述编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
5.用于表达权利要求3所述结核分枝杆菌多抗原融合蛋白的生物材料，所述生物材料包括表达载体和工程菌；所述生物材料包括权利要求4所述编码基因。
6.权利要求1或2所述结核分枝杆菌蛋白抗原混合物，或者权利要求3所述结核分枝杆菌多抗原融合蛋白，或者权利要求4所述编码基因，或者权利要求5所述生物材料在制备结核分枝杆菌疫苗中的应用。
7.结核分枝杆菌疫苗，其特征在于，所述结核分枝杆菌疫苗的有效成分包括权利要求1或2所述结核分枝杆菌蛋白抗原混合物，或者权利要求3所述结核分枝杆菌多抗原融合蛋白，或者权利要求5所述生物材料制备得到的结核分枝杆菌多抗原融合蛋白。
8.根据权利要求7所述的结核分枝杆菌疫苗，其特征在于，所述结核分枝杆菌疫苗的有效成分还包括铝盐佐剂。
9.权利要求1或2所述结核分枝杆菌蛋白抗原混合物，或者权利要求3所述结核分枝杆菌多抗原融合蛋白，或者权利要求4所述编码基因，或者权利要求5所述生物材料在制备结核分枝杆菌检测试剂或者治疗结核分枝杆菌疾病的药物中的应用。
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