CN116162141B - 一种结核分枝杆菌抗原epcra013及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及基因工程技术领域,具体公开了一种结核分枝杆菌抗原EPCRA013及其应用。本发明的结核分枝杆菌抗原EPCRA013,其包括EsxH、nPPE18、ESXB、nRipD和Ag85B五种抗原组分,是由EsxH、nPPE18、ESXB、nRipD和Ag85B五种抗原组分形成的融合蛋白EPCRA013f;或者是包括EsxH、nPPE18、ESXB、nRipD和Ag85B五种抗原组分的抗原组合物EPCRA013m。本发明的结核分枝杆菌抗原EPCRA013能诱导机体产生细胞免疫和体液免疫相互平衡的保护性免疫应答,可作为新型结核疫苗候选,具有重要的应用价值。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域,具体地说,涉及一种结核分枝杆菌抗原EPCRA013及其应用。
背景技术
结核病主要是由结核分枝杆菌复合群(Mycobacterium tuberculosis complex,MTBC)感染引起的一种慢性传染病,结核病患者基数大,同时面临着日益严重的耐药与艾滋病合并结核分枝杆菌感染的情况,已成为重要的公共卫生问题。
疫苗接种是预防和控制传染病最有效的手段,卡介苗(Bacillus CalmetteGuerin,BCG)是目前唯一批准用于预防人结核病的疫苗。BCG对新生儿的保护力最高可达80%【Fourth Report to the Medical Research Council by its TuberculosisVaccines Clinical Trials Committee,1972,Bull World Health Organ,46(3):371-85.】,但是随着接种者年龄的增长,BCG的保护力逐渐下降,不能有效地防止成人肺结核的发生。此外BCG作为一种减毒牛结核分枝杆菌活疫苗,在免疫功能缺陷人群中接种存在感染的风险,在多次传代后也出现保护性抗原丢失的问题。因此,亟需研发新型结核疫苗作为BCG的替代疫苗或加强型疫苗。
佐剂作为一种非特异性免疫增强剂,已被广泛应用于疫苗的成分配制【Ivins BEet al.,1988,European journal of epidemiology 4(1):12-9】,佐剂与亚单位疫苗联合使用能够最大化疫苗的免疫原性,使其保护效果更佳。铝盐佐剂是常用的商业化佐剂,具有良好的安全性和稳定性,在百白破三联疫苗、人乳头瘤病毒疫苗、H5N1禽流感疫苗和灭活脊髓灰质炎疫苗等多种疫苗中广泛使用。
联合佐剂应用的重组蛋白亚单位疫苗因其良好的安全性以及成分明确等优点而成为疫苗研发的热点。重组蛋白亚单位疫苗含有大量人T/B细胞表位,能够被人体MHCⅠ类和MHCⅡ类分子识别并刺激机体产生明显的保护性免疫反应,诱导T淋巴细胞和B淋巴细胞活化并分化为记忆性淋巴细胞,可以长期保护机体免受相应病原体感染。目前结核亚单位疫苗主要用于BCG接种后的增强免疫和作为治疗性疫苗保护活动性结核病患者及潜伏性结核感染患者。
此外,正在进行临床试验的新型结核疫苗主要分为以下几类:亚单位疫苗及病毒载体疫苗、重组BCG及减毒/灭活疫苗、DNA疫苗,其中ID93/GLA-SE、GamTBvac、M72/AS01E等亚单位疫苗,已经进入二期临床试验阶段。
目前新型结核疫苗的研发存在以下几点缺陷:第一,传统观点认为细胞免疫是机体抵抗结核分枝杆菌感染的主要途径,但最新的研究结果不断提示体液免疫和细胞免疫在机体抗结核免疫应答过程中同样发挥不可替代的作用,正在进行临床试验的十余种结核候选疫苗大多只能诱导机体产生细胞免疫应答、无法诱导针对结核分枝杆菌全面的免疫应答;第二,已进入临床期的亚单位疫苗普遍采用全长抗原作为疫苗组分,其中只有有限的抗原表位能够发挥免疫作用,其中冗余片段不能增强保护性免疫应答的强度。
因此,有必要对如何进一步提升疫苗效果进行进一步研究。
发明内容
本发明的目的主要在于提供一种能诱导机体产生更为有效的保护性免疫应答的结核分枝杆菌抗原。
本发明的具体技术方案如下:
第一方面,本发明提供一种结核分枝杆菌抗原EPCRA013,其包括EsxH、nPPE18、ESXB、nRipD和Ag85B五种抗原组分;nPPE18的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示,nRipD的氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示。
机体针对结核分枝杆菌感染的免疫抵抗是一个复杂的过程,活动性结核患者和结核潜伏感染患者体内结核分枝杆菌的保护性抗原表达情况存在明显的差异,因此本发明采用的开发结核亚单位疫苗的策略是选取多种特定免疫优势抗原进行组合,以期诱导机体针对包括BCG接种人群、活动性结核患者和结核潜伏感染患者在内的广泛群体产生高效而特异的保护性免疫应答。本发明所用的结核抗原组分是结核分枝杆菌分泌蛋白和细胞膜/细胞壁蛋白成分,EsxH(Rv0288)、PPE18(Rv1196)、EsxB(Rv3874)、RipD(Rv1566c)和Ag85B(Rv1886c)。EsxH、ESXB和PPE18分别属于结核分枝杆菌毒力因子Esx和PE/PPE家族,RipD在结核潜伏感染过程中发挥作用,而Ag85B主要在结核分枝杆菌对数生长期表达,是细菌侵袭宿主细胞重要的毒力因子。
本发明通过特定选择五种结核分枝杆菌免疫优势抗原EsxH、nPPE18、ESXB、nRipD、Ag85B,构建了新的结核分枝杆菌抗原EPCRA013。具体地,本发明选取EsxH、ESXB、Ag85B抗原全长和PPE18、RipD各自的特定抗原表位肽富集区域nPPE18和nRipD共五种结核分枝杆菌保护性抗原片段形成新的抗原EPCRA013,进一步联合佐剂制备多组分亚单位疫苗并发现其具有理想的免疫保护效果。
具体地,本发明将纯化获得的EPCRA013与氢氧化铝佐剂混合后免疫BALB/c小鼠,采用酶联免疫吸附试验(ELISA)、酶联免疫斑点试验(ELISpot)、Luminex技术和分枝杆菌生长抑制实验(MGIA)四种实验技术检测免疫后小鼠的特异性抗体效价,IFN-γ(干扰素-γ)、IL-4(白介素4)、IL-2(白介素2)、IL-6(白介素6)、IL-10(白介素10)、IL-17(白介素17)、IL-12(白介素12)和GM-CSF(粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子)八种细胞因子以及脾淋巴细胞对分枝杆菌生长的抑制能力,评价了疫苗的免疫原性和保护性。
本发明在研发时,先依据GenBank公布的Mycobacterium tuberculosis H37Rv(NC_000962.3)株的基因注释信息,寻找其中注释为:膜蛋白、分泌蛋白、营养摄取和存活关键因子等相关的基因信息。然后,对IEDB数据库已经公开涉及相关基因的人T、B细胞表位情况进行检索分析;使用表位预测工具,基于前述基因的核酸序列,进行人T细胞表位和B细胞表位预测分析。随后,对检索获得和预测获得的表位序列在对应基因中进行精确定位,并基于表位序列的定位信息和表位序列的可靠程度,形成表位在基因区的分布图。之后,本发明基于基因中表位丰富程度和基因编码的蛋白产物类型,确定了进行人群免疫学验证的优先顺序:优选验证其中表位丰富的分泌性蛋白、其次是膜蛋白等其它蛋白。
若需要验证的基因序列较短,则采用全长蛋白克隆表达,纯化后进行免疫学验证。若基因序列较长,则选择对其中的表位丰富区区域进行选择,并克隆表达或化学合成多肽,进行免疫学验证。
在验证时,本发明先通过人群免疫学验证:分别使用建康人、结核病患者和其他肺部疾病患者的抗凝全血,使用ELISPOT、T-SPOT等体外免疫反应检测试剂进行筛选,获得相关抗原的抗原性。之后再进行动物免疫学验证:对于人群免疫学筛选验证中反应较好的蛋白、多肽,再进行动物实验初步验证,并通过检测淋巴细胞分类变化情况和关键细胞因子水平变化情况,评估相关抗原的免疫原性。最后,对经人群免疫学和动物免疫学验证,同时具有较好免疫原性和抗原性的抗原,本发明再对其基因进行特定密码子优化、联接臂选择等过程,以形成最终的串联序列。
本发明按照相关基因在基因组中的先后位置,初步确定抗原基因的排列顺序,同时结合AlphaFold2等结构预测工具,筛选判断具有能够将最多表位位置暴露的特定空间构型时的基因序列顺序,并综合考量结构稳定性,以形成最终的串联表达序列。若不采用本发明的连接顺序,则抗原结构稳定性不佳。
本发明中,结核分枝杆菌抗原EPCRA013是由EsxH、nPPE18、ESXB、nRipD和Ag85B五种抗原组分形成的融合蛋白EPCRA013f;或者,所述结核分枝杆菌抗原EPCRA013是包括EsxH、nPPE18、ESXB、nRipD和Ag85B五种抗原组分的抗原组合物EPCRA013m。
上述抗原组合方式包含各组分抗原以任何比例和/或任何次序形成的组合物,同时EsxH、nPPE18、ESXB、nRipD和Ag85B以任何次序连接形成的融合蛋白均在本发明保护范围内。
本发明中优选,所述融合蛋白EPCRA013f的核苷酸序列从N端到C端按照EsxH、nPPE18、ESXB、nRipD、Ag85B的核苷酸序列顺序以柔性连接臂顺次连接组成。
本发明研究发现,将特定EsxH、nPPE18、ESXB、nRipD和Ag85B五种抗原分别作为单独抗原混合后使用,或者将特定EsxH、nPPE18、ESXB、nRipD和Ag85B五种抗原组分通过柔性连接臂顺次连接形成一个融合蛋白使用,能诱导机体产生更为有效的保护性免疫应答。
本发明通过大肠杆菌表达系统表达EPCRA013m各组分重组蛋白以及EPCRA013f融合蛋白,经纯化复性获得目的蛋白,生产效率高,利于工业化生产。
具体地,本发明抗原EPCRA013的生产方法,包括EPCRA013m的五种单独抗原组分或者EPCRA013f融合蛋白的表达、纯化、复性和目的产物的收获。
作为一个具体实施方式,本发明抗原EPCRA013的生产方法如下:
1、EPCRA013m各抗原组分的获得:
①nPPE18和nRipD基因片段获取方法:
利用TEpredict表位分析软件和IEDB数据库(http://www.iedb.org/)中的在线分析工具对PPE18和RipD两个抗原氨基酸序列进行T细胞表位预测,选择PPE18中评分较高的特定表位集中区域:第201位氨基酸到第300位氨基酸并命名为nPPE18;选择RipD中评分较高的特定细胞表位集中区域:第37位氨基酸到第184位氨基酸并命名为nRipD。通过PCR技术扩增新的抗原表位肽nPPE18和nRipD基因片段(两端含有EcoRⅠ和HindⅢ酶切位点)。
②EsxH、ESXB、Ag85B基因序列获取方法:以结核分枝杆菌菌株H37Rv基因组为模板,通过PCR扩增两端带有EcoRⅠ和HindⅢ酶切位点的基因序列。
利用分子克隆技术将EsxH、nPPE18、ESXB、nRipD、Ag85B分别进行双酶切后连接至pET-32a质粒,构建EsxH、nPPE18、ESXB、nRipD、Ag85B重组质粒并转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,抽提质粒并测序验证后转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞。构建成功的五种重组大肠杆菌在LB液体培养基中增菌培养后使用异丙基β-d-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导重组蛋白表达,通过Ni亲和层析和DEAE离子交换层析技术纯化获得具有生理构象的目的蛋白。
2、EPCRA013f融合蛋白抗原的获得:利用基因合成技术合成两端分别带有NdeⅠ和XhoⅠ酶切位点的EPCRA013f融合蛋白基因序列,双酶切后连接至pET-43.1a质粒并转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,抽提质粒并测序验证后转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞。构建成功的重组大肠杆菌在LB液体培养基中增菌培养后使用异丙基β-d-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导重组蛋白表达,通过Ni亲和层析和DEAE离子交换层析技术纯化获得具有生理构象的目的蛋白。
本发明中,所述融合蛋白EPCRA013f的氨基酸序列如SEQ ID NO.12所示;
优选,所述融合蛋白EPCRA013f的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示。
本发明中,所述抗原组合物EPCRA013m中,EsxH、nPPE18、ESXB、nRipD和Ag85B五种抗原组分的摩尔比为1:1:1:1。
本发明中,EsxH的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示,ESXB的氨基酸序列如SEQ IDNO.8所示,Ag85B的氨基酸序列如SEQ ID NO.10所示;
和/或,EsxH的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示,nPPE18的核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示,ESXB的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示,nRipD的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示,Ag85B的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。
第二方面,本发明提供一种DNA分子,其核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
上述DNA分子可分别编码本发明的抗原表位肽nRipD。
第三方面,本发明提供一种结核分枝杆菌抗原,其氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示。
本发明提供了两条抗原表位肽nPPE18和nRipD(氨基酸序列如SEQ ID NO.7或SEQID NO.9所示)。其中nPPE18抗原表位肽具有结核分枝杆菌蛋白PPE18的第201到第300位氨基酸序列(从N端到C端),nRipD抗原表位肽具有结核分枝杆菌蛋白RipD的第37到第184位氨基酸序列(从N端到C端)。
本发明还保护SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列经替换、缺失、或添加一个或几个氨基酸残基后形成的具有同等功能的氨基酸序列,以及编码这些氨基酸序列的核苷酸序列。
第四方面,本发明提供上述DNA分子或结核分枝杆菌抗原在制备结核分枝杆菌抗原EPCRA013中的应用,所述结核分枝杆菌抗原EPCRA013如上所述。
第五方面,本发明提供上述结核分枝杆菌抗原EPCRA013在以下任一方面的应用:
(1)制备诊断结核分枝杆菌感染或结核分枝杆菌感染引起疾病的试剂;
(2)制备预防结核分枝杆菌感染疫苗;
(3)制备治疗结核分枝杆菌感染引起疾病的药物。
本发明的有益效果至少在于:
本发明提供的五个免疫优势抗原的组合,与单组份抗原相比主要有以下两个优点:第一,针对单个蛋白抗原表位数量有限导致的免疫原性不足、难以诱导机体产生针对BCG接种人群、活动性结核患者和结核潜伏感染患者在内的广泛群体产生有效保护性免疫应答的缺点,EPCRA013m和EPCRA013f选取EsxH、nPPE18、ESXB、nRipD、Ag85B五种特定结核分枝杆菌免疫优势抗原,能够诱导机体产生强烈而广泛的保护性免疫反应;第二,针对PPE18和RipD全长蛋白抗原中存在的细胞表位含量低的冗杂序列,本发明将原始PPE18和RipD基因序列进行细胞表位预测,根据分析结果剔除特定细胞表位含量低的序列后得到nPPE18和nRipD两个新的抗原表位肽,作为EPCRA013m的两种抗原组分和EPCRA013f融合蛋白的两个融合片段,整体效果好。此外,在EPCRA013m的基础上,利用基因合成技术构建了EPCRA013f融合蛋白,将EsxH、nPPE18、ESXB、nRipD、Ag85B五个组分用柔性连接臂顺次连接,仅需表达和纯化一个融合蛋白即能获得上述五种抗原组分,简化了重组蛋白表达和纯化的步骤、有利于生产方案的标准化。
将EPCRA013m和EPCRA013f亚单位疫苗免疫小鼠后进行免疫学评价,结果显示EPCRA013f/EPCRA013m均能诱导机体产生强烈的保护性免疫应答、抑制分枝杆菌生长的能力,可作为新型结核疫苗候选,具有重要的应用价值。此外,本发明利用大肠杆菌表达系统表达外源蛋白并纯化,具有表达效率高、发酵工艺成熟、生产成本低等优点,适合大规模商业化生产。
附图说明
图1为本发明重组蛋白SDS-PAGE鉴定结果,图中,M:标准蛋白分子量marker,泳道1、2、3、4、5、6分别对应纯化后的EPCRA013f、EsxH、nPPE18、ESXB、nRipD和Ag85B。
图2为本发明血清抗体效价检测结果,图中,A为血清IgG/IgG1/IgG2a抗体效价,B为IgG1/IgG2a比值。*代表p值<0.05,**代表p值<0.01。
图3为本发明ELISpot细胞因子检测结果,图中,A为抗原特异性IFN-γ分泌水平,B为IL-4分泌水平。*代表p值<0.05,**代表p值<0.01。
图4为本发明Luminex多重细胞因子检测结果,图中,A,B,C,D,E,F分别表示脾淋巴细胞和对应刺激物共培养后上清中IL-2,IL-6,GM-CSF,IL-12,IL-10和IL-17的测量值。*代表p值<0.05。
图5为本发明分枝杆菌生长抑制试验结果,其中,CFU为集落形成单位(colonyforming unit),adjuvant为佐剂。**代表p值<0.01。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的,并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下,可以对本发明进行各种修改和替换。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明,均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等,如无特殊说明,均可从商业途径得到。下述实施例中未注明具体技术或条件者,按照本领域内的文献所描述的技术或条件,或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者,均为可通过正规渠道购买得到的常规产品。
实施例1EPCRA013m各组分及EPCRA013f融合蛋白重组质粒的构建
(1)引物设计
以细胞表位预测技术分析得到的两种抗原表位肽nPPE18和nRipD基因序列为模板,通过Primer Premier 5.0软件设计对应引物。以NCBI数据库中的结核分枝杆菌菌株H37Rv基因组中编码抗原EsxH、ESXB和Ag85B的基因序列为模板,通过Primer Premier 5.0软件设计引物,引物信息见表1。
表1引物信息(SEQ ID No.13-22)
注:表中下划线“_”部分表示EcoRⅠ和HindⅢ酶切位点。
(2)目的基因的获得
利用PCR技术扩增获得EsxH、nPPE18、ESXB、nRipD、Ag85B目的基因序列,PCR反应体系和反应程序见表2和表3。
ESAT-6、nPPE18、nPstS1和Ag85B目的基因的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:1,SEQID NO:2,SEQ ID NO:3,SEQ ID NO:4所示,各目的基因对应的氨基酸序列分别如SEQ IDNO:5,SEQ ID NO:6,SEQ ID NO:7,SEQ ID NO:8所示。
表2 PCR扩增体系
表3 PCR反应程序
目的基因 | PCR反应条件 |
nPPE18 | 95℃(10min)-[95℃(1min)-58℃(1min)-72℃(1min)](循环30次)-72℃(10min) |
nRipD | 95℃(10min)-[95℃(1min)-58℃(1min)-72℃(1min)](循环30次)-72℃(10min) |
EsxH | 95℃(10min)-[95℃(1min)-60℃(1min)-72℃(1min)](循环30次)-72℃(10min) |
ESXB | 95℃(10min)-[95℃(1min)-60℃(1min)-72℃(1min)](循环30次)-72℃(10min) |
Ag85B | 95℃(10min)-[95℃(1min)-59℃(1min)-72℃(1min)](循环30次)-72℃(10min) |
EPCRA013f融合蛋白的基因的获得:利用基因合成技术合成两端分别带有NdeⅠ和XhoⅠ酶切位点的EPCRA013f融合蛋白基因序列。
具体地,EPCRA013f融合蛋白的核苷酸序列由获得的EsxH、nPPE18、ESXB、nRipD和Ag85B目的基因序列组成,具体由N端到C端的顺序为EsxH、nPPE18、ESXB、nRipD和Ag85B目的基因序列,各目的基因序列之间以柔性连接臂连接,EPCRA013f融合蛋白的基因序列进行密码子优化后的基因序列如SEQ ID NO:11所示,EPCRA013f融合蛋白氨基酸序列如SEQ IDNO:12所示。
(3)重组质粒的构建
利用EcoRⅠ/NdeⅠ和HindⅢ/XhoⅠ限制性内切酶对目的基因和pET32a/pET43.1a载体进行双酶切(37℃、25min),酶切体系见表4。酶切产物回收。利用T4 DNA连接酶分别将回收的目的基因与载体连接,连接条件为25℃、30min,连接体系见表5。
表4 PCR产物和质粒酶切体系
表5连接体系
连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,步骤为:10μL连接产物与大肠杆菌DH5α感受态细胞混匀后冰浴静置30min,42℃热激90s,冰浴静置2min,加入800μL无抗性的LB液体培养基,置于摇床37℃140rpm培养1h。培养结束后4000rpm离心1min,弃去400μl上清,将菌体沉淀吹打混匀后取200μl菌液涂布于含有氨苄青霉素的LB固体平板,37℃倒置培养12~16h,挑取单菌落于含有氨苄青霉素的LB液体培养基中增菌培养,碱裂解法抽提质粒并进行Sanger测序验证,验证成功的重组质粒于-20℃保存。
实施例2EPCRA013m各组分及EPCRA013f融合蛋白的原核表达和纯化
将实施例1中构建成功的重组质粒以热休克法转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,挑取单菌落接种至含氨苄青霉素的LB液体培养基中37℃、180rpm增菌培养,加入1mM终浓度的异丙基β-d-硫代半乳糖苷(IPTG)在相同条件下培养3小时诱导目的蛋白表达。诱导结束后4℃、4000rpm离心10min收集菌体,PBS重悬菌体后使用超声破碎菌体(超声参数为220W,工作15s间隔20s,共15min),超声结束后12000rpm离心10min分离上清和沉淀,利用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)鉴定重组蛋白表达水平和表达形式。使用akta avant25全自动蛋白纯化仪通过Ni亲和层析和DEAE离子交换层析技术纯化目的蛋白,具体步骤为:
EPCRA013f和EPCRA013m的五种单个抗原组分先进行Ni亲和层析:
(1)装填Ni-IDA亲和层析填料并通入3倍柱体积的平衡缓冲液(可溶性表达的重组蛋白采用pH8.0的PBS平衡填料;包涵体表达的重组蛋白采用pH8.0的8M尿素平衡填料),待280nm紫外吸光度值稳定后调零。
(2)泵入样本并收集流穿液,再泵入重组蛋白对应的平衡缓冲液淋洗填料直至280nm紫外吸光度值稳定。
(3)进行0-300mM咪唑线性洗脱,收集所有洗脱峰,通过SDS-PAGE鉴定各样本中目的蛋白纯度,选择纯度最好的样本用于后续操作。
EPCRA013f、nRipD和Ag85B三个重组蛋白的Ni亲和层析纯化产物纯度较低,采用截留分子量为10kDa的透析袋透析除盐后进行DEAE离子交换层析。
(4)装填DEAE离子交换填料并通入3倍柱体积的平衡缓冲液(可溶性表达的重组蛋白采用10mM pH8.0的Tris缓冲液平衡填料;包涵体表达的重组蛋白采用pH8.0的8M尿素平衡填料),待280nm紫外吸光度值稳定后调零。
(5)泵入样本并收集流穿液,再泵入重组蛋白对应的平衡缓冲液淋洗填料直至280nm紫外吸光度值稳定。
(6)进行0-400mM氯化钠线性洗脱,收集所有洗脱峰,通过SDS-PAGE鉴定各样本中目的蛋白纯度,选择纯度最好的样本用于后续操作。
(7)纯化结束后将目的蛋白装入透析袋中梯度透析去除尿素、咪唑及其他小分子杂质,最后置于pH7.4的PBS中4℃透析2h,透析结束后超滤浓缩并用0.22μm滤器滤过除菌,分装后于-70℃保存。EPCRA013f重组蛋白和EPCRA013m各组分SDS-PAGE鉴定结果见图1。其中,泳道1、2、3、4、5、6分别对应纯化后的EPCRA013f、EsxH、nPPE18、ESXB、nRipD和Ag85B,其对应的分子量分别是82.4kDa、28.4kD、29.6kD、28.8kD、34.9kD和52.6kD。
实施例3EPCRA013m和EPCRA013f多组分亚单位疫苗的免疫学评价
1、EPCRA013m和EPCRA013f多组分亚单位疫苗的制备
EPCRA013m各抗原组分以等摩尔比混合后与氢氧化铝佐剂按体积比3:1混匀;EPCRA013f抗原组分直接与氢氧化铝佐剂按体积比3:1混匀制备疫苗。
2、小鼠免疫流程
6-8周龄SPF级雌性BALB/c小鼠用于免疫实验,小鼠随机分为5组:PBS组、佐剂组、EPCRA013f-佐剂组、EPCRA013m-佐剂组和BCG组(BCG活菌),每组6只。免疫流程见表6。
表6小鼠免疫流程
PBS组、佐剂组、EPCRA013f-佐剂组、EPCRA013m-佐剂组第三次免疫后10天处死小鼠,BCG组免疫后30天处死小鼠,进行各项免疫学检测并评价EPCRA013m和EPCRA013f多组分亚单位疫苗的免疫保护效果。
3、体液免疫评价
采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测血清特异性抗体效价:
(1)血清分离
免疫后的小鼠在处死前摘眼球采血,收集血液,室温静置2h,4000rpm离心10分钟收集血清。
(2)ELISA法检测血清抗体效价
1)使用包被缓冲液(50mM碳酸盐缓冲液,pH 9.0)调整目的蛋白浓度,EPCRA013m五种组分各调整至400ng/mL、EPCRA013f重组蛋白调整至2μg/mL,按照每孔100μL的量加入96孔板,4℃包被12h。
2)第二日用PBST(含0.5‰Tween-20的PBS)洗涤5遍,每孔加入含5%脱脂奶粉的PBST 100μL,37℃封闭2小时,PBST洗涤5遍并将孔内残余液体完全去除。
3)用PBS将各组血清进行倍比稀释,每孔加入100μL稀释后的血清,37℃孵育2小时,PBST洗涤5遍并将孔内残余液体完全去除。
4)用PBS按1:5000分别稀释HRP标记的羊抗鼠IgG、IgG1和IgG2a抗体,每孔加入100μL稀释后的抗体,37℃孵育1小时,用PBST洗涤5遍并将孔内残余液体完全去除。
5)加入TMB显色底物液100μL,37℃显色15分钟后加入100μL 2M硫酸终止反应。
6)用酶标仪检测450nm处的吸光度值。
7)抗体效价判断标准:若第2n倍稀释血清的OD值/PBS组OD值≥2.1且第2n+1倍稀释血清的OD值/PBS组OD值<2.1,则2n即该血清样本对应的抗体效价。
血清抗体效价检测结果见图2。实验结果显示EPCRA013m和EPCRA013f免疫后小鼠血清特异性IgG、IgG1和IgG2a抗体效价显著增高,其中EPCRA013m免疫组小鼠血清抗体效价最高;IgG1亚型和IgG2a亚型分别指示体液免疫应答和细胞免疫应答水平,通常用IgG1/IgG2a比值来衡量疫苗诱导机体产生的体液免疫和细胞免疫应答强度的高低关系。实验结果显示EPCRA013m和EPCRA013f免疫组的IgG1/IgG2a比值均在2.0左右,提示EPCRA013m和EPCRA013f均诱导机体产生细胞免疫和体液免疫相互平衡的保护性免疫应答。
4、细胞免疫评价
4.1、小鼠脾脏淋巴细胞的分离
1)小鼠取血后颈椎脱臼处死,75%酒精浸泡后分离脾脏。
2)将脾脏浸泡于小鼠淋巴细胞分离液(购自北京达科为生物技术有限公司)中,分离淋巴细胞、将脾淋巴细胞调整至终浓度1×106/mL溶液待用。
4.2、ELISpot法检测Th1型细胞因子IFN-γ和Th2型细胞因子IL-4
1)在预包被IFN-γ和IL-4抗体的ELISpot检测孔中加入200μL RPMI 1640培养基,室温静置10min活化预包被板。
2)每孔加入100μL脾淋巴细胞溶液,加入2μg对应的刺激物(EPCRA013f抗原,EPCRA013m抗原或BCG全菌裂解产物)。设立两个阴性对照孔(PBS和佐剂分别刺激)和阳性对照孔(5μg/mL刀豆蛋白),37℃、5% CO2培养箱中培养16~24小时。
3)培养结束后弃去孔中液体,用PBST洗涤5遍并将孔内残余液体完全去除。
4)以100μL/孔的量加入生物素标记的抗IFN-γ和抗IL-4抗体工作液,37℃孵育1h后弃去孔中液体,用PBST洗涤5遍并将孔内残余液体完全去除。
5)按100μL/孔的量加入链霉亲和素标记的HRP工作液,37℃孵育1h后弃去孔中液体,用PBST洗涤5遍并将孔内残余液体完全去除。
6)按100μL/孔的量加入ACE显色液并置于37℃避光孵育,待各检测孔内均有清晰明显的斑点出现后流水冲洗各孔终止显色反应,倒扣晾干孔内水分。
7)使用ELISpot读板仪检测各孔的SFCs值(spot-forming cells,斑点形成细胞数)。
检测结果见图3。实验结果显示EPCRA013f和EPCRA013m免疫后小鼠脾淋巴细胞经对应刺激物刺激之后分泌IFN-γ和IL-4的水平明显提高,其中EPCRA013f免疫组小鼠脾淋巴细胞的IFN-γ分泌能力和BCG组类似,但比EPCRA013m组强;此外EPCRA013f组小鼠脾淋巴细胞的IL-4分泌能力与EPCRA013m和BCG两组相比均强,提示EPCRA013m和EPCRA013f均能诱导机体产生体液免疫和细胞免疫二者平衡的免疫应答,其中EPCRA013f诱导机体产生的体液免疫和细胞免疫更强。
4.3、Luminex法检测IL-2,IL-6,IL-10,IL-12,IL-17和GM-CSF六种细胞因子
Luminex多重细胞因子检测试剂盒购自R&D Systems公司,具体操作如下:
1)96孔细胞培养板中按照每孔100μL的量加入调好浓度的脾淋巴细胞,再加入10μg对应的刺激物(EPCRA013f抗原蛋白,EPCRA013m抗原蛋白或BCG全菌裂解产物)。每组设立无菌PBS刺激的阴性对照孔和5μg/mL刀豆蛋白刺激的阳性对照孔各一,盖好板盖并在37℃、5% CO2培养箱中共培养16~24小时。
2)培养结束后将96孔细胞板4000rpm离心10min,取上清用于Luminex多重细胞因子检测,检测步骤按照说明书进行。
检测结果见图4。实验结果显示EPCRA013f和EPCRA013m免疫后小鼠脾淋巴细胞经刺激物刺激之后分泌IL-2,IL-6,IL-10,IL-12,IL-17和GM-CSF六种细胞因子的水平均明显升高,其中IL-2和IL-12属于Th1型细胞因子,诱导细胞免疫应答;IL-6和IL-10属于Th2型细胞因子,诱导体液免疫应答;IL-17和GM-CSF属于固有免疫相关的细胞因子,在机体的固有免疫中发挥作用。结果表明EPCRA013m诱导细胞免疫的能力较强,而EPCRA013f则诱导机体产生细胞免疫、体液免疫和固有免疫三者互相平衡的免疫应答。
5、EPCRA013f/EPCRA013m亚单位疫苗的保护性评价
采用体外分枝杆菌生长抑制试验(MGIA)评价免疫后小鼠脾淋巴细胞对结核分枝杆菌生长的抑制能力:
1)24孔板中每孔加入1ml调好浓度的脾淋巴细胞,接种50CFU(colony formingunit,菌落形成单位)的结核分枝杆菌H37Rv菌株,混匀并置于37℃、5% CO2培养箱中共培养4天。另设PBS组和佐剂组(adjuvant)作为阴性对照。
2)培养结束后将共培养物转移至离心管中,12000rpm离心10分钟并弃去900μL上清。
3)离心的同时在24孔板中每孔加入500μL无菌水,用移液器反复吹打底部和侧壁,静置5分钟后将孔内液体转移至对应离心管中,涡旋震荡以彻底裂解细胞并释放胞内的结核分枝杆菌。
4)取50μL涂布7H10平板,同时将50μL H37Rv菌液直接涂板作为空白对照,将平板37℃倒置培养2~3周后进行菌落计数。
结果见图5。EPCRA013m、EPCRA013f组小鼠脾淋巴细胞和阴性对照相比,与H37Rv共培养后表现出较强的抑制结核分枝杆菌生长的能力,而EPCRA013m、EPCRA013f和BCG三组对应的脾淋巴细胞体外抑制结核分枝杆菌生长的能力相当,实验结果表明EPCRA013m和EPCRA013f能诱导机体产生针对结核分枝杆菌感染强烈的保护性免疫应答。
虽然,上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述,但在本发明基础上,可以对之作一些修改或改进,这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此,在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进,均属于本发明要求保护的范围。
Claims (5)
1.一种结核分枝杆菌抗原EPCRA013,其特征在于,包括EsxH、nPPE18、ESXB、nRipD和Ag85B五种抗原组分;nPPE18的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示,nRipD的氨基酸序列如SEQID NO.9所示;EsxH的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示,ESXB的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示,Ag85B的氨基酸序列如SEQ ID NO.10所示;
所述结核分枝杆菌抗原EPCRA013是由EsxH、nPPE18、ESXB、nRipD和Ag85B五种抗原组分形成的融合蛋白EPCRA013f;所述融合蛋白EPCRA013f的氨基酸序列如SEQ ID NO.12所示;或者,所述结核分枝杆菌抗原EPCRA013是包括EsxH、nPPE18、ESXB、nRipD和Ag85B五种抗原组分的抗原组合物EPCRA013m;所述抗原组合物EPCRA013m中,EsxH、nPPE18、ESXB、nRipD和Ag85B五种抗原组分的摩尔比为1:1:1:1:1;
所述融合蛋白EPCRA013f的编码核苷酸序列从N端到C端按照EsxH、nPPE18、ESXB、nRipD、Ag85B的编码核苷酸序列顺序以柔性连接臂的编码核苷酸序列顺次连接组成。
2.根据权利要求1所述的结核分枝杆菌抗原EPCRA013,其特征在于,所述融合蛋白EPCRA013f的编码核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示。
3.根据权利要求1-2任一项所述的结核分枝杆菌抗原EPCRA013,其特征在于,EsxH的编码核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示,nPPE18的编码核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示,ESXB的编码核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示,nRipD的编码核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示,Ag85B的编码核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。
4.核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示的DNA分子或氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示的结核分枝杆菌抗原在制备结核分枝杆菌抗原EPCRA013中的应用,所述结核分枝杆菌抗原EPCRA013如权利要求1-3任一项所述。
5.权利要求1-3任一项所述的结核分枝杆菌抗原EPCRA013在以下任一方面的应用:
(1)制备诊断结核分枝杆菌感染或结核分枝杆菌感染引起疾病的试剂;
(2)制备预防结核分枝杆菌感染疫苗。
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PB01 | Publication | ||
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GR01 | Patent grant | ||
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