CN102757971B

CN102757971B - 一种结核分枝杆菌重组蛋白质及其制备方法

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Publication number: CN102757971B
Application number: CN 201210278711
Authority: CN
Inventors: 董梅; 孙彬; 吴纯; 杨采娥; 雷红; 孟祥红; 王迪
Original assignee: 309th Hospital of PLA
Current assignee: 309th Hospital of PLA
Priority date: 2012-08-07
Filing date: 2012-08-07
Publication date: 2013-09-11
Anticipated expiration: 2032-08-07
Also published as: CN102757971A

Abstract

本发明提供一种结核分枝杆菌重组蛋白质及其制备方法，涉及基因工程技术和诊断试剂、疫苗研制领域。本发明涉及一种可用于结核分枝杆菌感染临床诊断的结核分枝杆菌融合蛋白，编码该蛋白的核苷酸序列，包括该核苷酸序列的质粒和原核宿主细胞，本发明还包括制备该蛋白的方法的及其应用。该重组蛋白质具有高特异性、强免疫原性蛋白质序列，可提高检测试剂的敏感性和特异性，且该重组蛋白质采取了多抗原决定簇串联的重组蛋白质技术，可以简化提纯过程，提高工作效率。

Description

一种结核分枝杆菌重组蛋白质及其制备方法

技术领域

本发明涉及基因工程技术和诊断试剂、疫苗研制领域，特别是涉及一种结核分枝杆菌重组蛋白质及其制备方法。

背景技术

结核病（Tuberculosis，TB）是人类最古老的传染病之一，至今依然是单一感染因素引起死亡人数最多的疾病，严重威胁着人类健康。近年来随着艾滋病的蔓延及全球人口流动速度和数量的急速增长，结核病的发病率呈上升趋势，尤其是发展中国家贫困、落后、饥饿、人口拥挤、医疗卫生条件差等现象更使结核病难以得到控制。据WHO统计，全世界现有17.22亿人感染结核病菌，每年有900万新结核病人，其中约300万人死于结核病。我国是世界上22个结核病高负担国家之一，目前全国约有5.5亿人感染过结核菌，感染率达到44.5%，高于全球1/3的感染率水平，肺结核病人600多万，其中有严重传染性的病人150万，每年死于结核病的达25万人。据研究，受结核菌感染的人群中，10％的人会发展为结核病。结核病还是一种人畜共患传染病。因此，结核病的预防、早期诊断和及时治疗仍是我国乃至世界高度关注的课题。

结核病是由结核杆菌引起的，主要通过呼吸道传播，通常表现为肺部感染，而当人体抵抗力下降时，结核杆菌就迅速生长繁殖而引发肺结核，若病人的抵抗力继续下降或得不到及时治疗，结核杆菌就会通过淋巴、血液传播到身体各器官，并在该处引起结核病。常见的有肾结核、结脑、肠结核、淋巴结核等肺外结核。但是，由于结核病是一种慢性传染病，有些感染者历程症状不明显，因此常不引起患者注意而延误病情。故对结核病的早期诊断对有效控制结核病，降低该病的发生率及死亡率有着重大的临床意义。

目前常用的结核病诊断方法有胸部X光透视和主要依靠患者痰液、胸水、支气管肺泡液的显微镜直接涂片检查（AFP）以及培养法。X光常用作肺结核初步诊断，但特异性差，同时对感染有艾滋病病毒（HIV）的结核病人及肺外结核病人不适用。AFB涂片法灵敏度差（仅为20~30％），用固体培养基培养结核菌，虽然可以显著改善检测结果，但结核菌生长缓慢，一般得6－8周才能出检验报告，况且AFB涂片和培养法只能在检测方法只能在体液中存在细菌时方能检出，而对于不排菌的结核患者就检测不出，故认为上述检测方法已经不能适应临床诊断治疗及传染病控制的要求。为此，人们就企图利用血清学方法以快速诊断结核病。

近年来，随着结核分枝杆菌分子生物学与蛋白组学的研究不断发展，结核病的免疫学诊断亦有较大进展。目前已经发现、纯化和重组了多种结核分枝杆菌特异性的菌体和分泌蛋白质抗原。

由于结核分支杆菌抗原的复杂性，在宿主体内表达的数量、种类或时机可能随病人的个体免疫背景和病程而异，表现出不同的抗体谱，检测时有的抗原不表达，未检测出相应的抗体，有的抗体含量高,有的则低。因此，单一抗原检测，往往检测的灵敏度并不近如人意。目前很多研究者试图用鸡尾酒式混合抗原来提高结核病感染的诊断效果，结果表明用多种特异性抗原可以在不影响特异性的情况下获得比单一抗原更高的敏感性。

发明内容

本发明的目的是提供一种结核分枝杆菌重组蛋白，本发明的另一目的是提供该结核分枝杆菌重组蛋白在制备检测试剂盒中的应用。

为了实现上述目的，本发明提供了一种编码结核蛋白的重组核酸，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。同时提供了由该重组DNA序列编码的蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明还提供了一种结核分枝杆菌蛋白的的表达载体pET-28a--ricR-rpoB-GyrB，它是将SEQ ID NO.1所示所述的核苷酸序列插入到质粒pET-28a上得到的重组质粒，其质粒图谱如附图2所示。将表达载体pET-28a--ricR-rpoB-GyrB导入大肠杆菌中，得到表达结核蛋白的工程菌株。

本发明利用SEQ ID NO.1所示核苷酸序列通过基因工程方法制备结核蛋白可以通过如下步骤实现：

1）获得具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；

2）将该核苷酸序列导入质粒，优选pET-28a质粒；

3）将该质粒导入原核宿主细胞，优选大肠杆菌宿主细胞，更优选BL21（DE3）菌株中；

4）在有利于所述核苷酸序列表达的条件下培养所述宿主细胞；

5）回收、纯化及复性所表达的重组蛋白。

本发明还提供包含本发明结核蛋白的组合物以及试剂盒。所述的组合物可作为检测结核感染的试剂。所述的组合物可作为检测结核分枝杆菌感染的试剂盒。

本发明提供的结核蛋白抗原具有高特异性、强免疫原性和尽量完整的抗原决定簇，因此，本领域技术人员可以想到，本发明的结核蛋白可以用来制备结核疫苗，如亚单位疫苗等，同样，本发明所公开的如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列也可用来制备DNA疫苗。因此本发明还涉及包含本发明结核蛋白或核酸的结核的疫苗。

以下将更详细的描述本发明的技术方案：

本发明公开了一种如SEQ ID NO:1所示的编码结核蛋白的重组核酸，利用该核苷酸序列制备结核分枝杆菌蛋白的方法，由该方法制备的包含SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的结核分枝杆菌蛋白，以及包含该蛋白的组合物和试剂盒，同时还公开了它们在检测结核分枝杆菌感染的应用。

SEQ ID NO:1所示核苷酸序列可以通过本领域常规的方法制备，选择其强抗原表位ricR蛋白（GenBank:GU726749.1）、rpoB（GenBank:GQ395623.1）和GyrB（GenBank:AJ564417.1）的DNA序列为模板，设计扩增引物。其中F1和R1用于扩增ricR基因的片段，F2和R2用于扩增rpoB基因的片段，F3和R3用于扩增GyrB基因的片段；引物F1和R3分别带有NdeI和XhoI的酶切位点，引物F2和R1顺序互补，并共同对应于rpoB基因片段的5’末端序列，引物F3和R2顺序互补，并共同对应于GyrB基因片段的5’末端序列；序列如下：

ricR扩增引物：

F1：ATCGCATATG ATGACAGCAGCACACGGCTACACGCAGCA

53.85% Tm=66.34

R1：AATCGCGCGCCTGGTTCGTTCCGGTGGTGGTGGTTGTTCTCGA

60.47% Tm=67.79

rpoB扩增引物：

F2：GGTGGTGGTGGTTGTTCTCGACCGCGCTT

62.07% Tm=61.06

R2：AGTCACCACCACCACCTCGCGGTTGTTCTGGATCAAA

54.05%,Tm=65.51

GyrB扩增引物：

F3：GGTGGTGGTGGTGACTCGGCCGGCGGTTCTGCAAAAA

62.16% Tm=65.54

R3：ATCGCTCGAG GTTCTTTAGCACCCGGTCGAT

53.13% Tm=62.97

本发明对上述核苷酸序列的核酸分子采用适当载体和宿主细胞表达时可以大大提高表达产率。

本发明的一个实施方案涉及应用如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列制备编码结核蛋白的方法。根据常规方法，可将含如SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的核酸分子连接到一个表达载体中，然后通过常规方法转化细胞。通常，优选原核生物用于DNA序列的起始克隆和用于本发明的载体构建。例如，大肠杆菌等肠科杆菌。

编码本发明蛋白的核酸与pET-28a形成的杂合质粒具有高度的稳定性，有利于本发明的蛋白的表达。

在本发明的一个实施方案中，如图2所示，制备含有SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的核酸分子和pET-28a质粒的表达构建体，并将该构建体转化BL21（DE3），经IPTG诱导培养后，收集菌体。可采用常规的纯化方法纯化所得到的蛋白。

本发明的一个实施方案涉及用上述方法制备、纯化的编码结核蛋白，该蛋白具有SEQ ID NO:2所示氨基酸序列。

本发明的一个实施方案涉及包含本发明编码结核蛋白的组合物和试剂盒。所述组合物或试剂盒可制备成检测结核分枝杆菌感染的试剂或试剂盒形式。

本文所述“试剂盒”是指利用本发明蛋白完成结核分枝杆菌感染检测而组配制成的成套试剂。本发明试剂盒可包括其它多个容器，其中可分别含有检测所用的标准品，抗体或经过标记的抗体、酶，底物或缓冲液等。在该试剂盒中，还包括标签和包装插页用以提供试剂盒的使用说明。还可包括符合用户需要的其它材料，如微量滴定板等。

在用于结核分枝杆菌感染检测的试剂盒中，本发明的蛋白也可以是经过标记的。具体可使用酶、金属螯合物等标记。优选的标记性酶例如，辣根过氧化物酶，过氧化物酶，碱性磷酸酶等。优选的金属物质有胶体金等。

（四）有益效果

与市场上的同类试剂盒相比，本发明的结核分枝杆菌蛋白制备的检测试剂盒具有特异性强、灵敏度高等优点，很好的满足了TB感染临床诊断的需要。

附图说明

图1PCR扩增产物的凝胶电泳图；

图2是表达质粒pET-28a--ricR-rpoB-GyrB的构建流程图；

图3是诱导后菌体12％SDS－PAGE电泳图，其中M表示Marker，1表示目的蛋白。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的保护范围。

实施例1 结核重组蛋白的制备

1.1结核蛋白抗原表位筛选及目的基因克隆

通过计算机分析TB H37RV基因组全序列，选择其强抗原表位ricR蛋白（GenBank:GU726749.1）、rpoB（GenBank:GQ395623.1）和GyrB（GenBank:AJ564417.1）的DNA序列为模板，设计扩增引物为：

ricR扩增引物：

F1：ATCGCATATG ATGACAGCAGCACACGGCTACACGCAGCA

53.85% Tm=66.34

R1：AATCGCGCGCCTGGTTCGTTCCGGTGGTGGTGGTTGTTCTCGA

60.47% Tm=67.79

rpoB扩增引物：

F2：GGTGGTGGTGGTTGTTCTCGACCGCGCTT

62.07% Tm=61.06

R2:：AGTCACCACCACCACCTCGCGGTTGTTCTGGATCAAA

54.05%,Tm=65.51

GyrB扩增引物：

F3：GGTGGTGGTGGTGACTCGGCCGGCGGTTCTGCAAAAA

62.16% Tm=65.54

R3：ATCGCTCGAG GTTCTTTAGCACCCGGTCGAT

53.13% Tm=62.97

结核分支杆菌H37RV的菌体，加100mL蛋白酶K（10mg/mL），置56℃水浴消化4小时，用常规酚/氯仿法纯化，用上述引物进行PCR扩增；

50mL扩增体系：ddH₂O 31.5mL，10×buffer 5.0mL，4×dNTP4.0mL，上、下游引物混液共4.0mL，DNA 1.5mL，Taqplus 0.2mL(1U)；

F1和R1用于扩增ricR基因的片段，F2和R2用于扩增rpoB基因的片段，F3和R3用于扩增GyrB基因的片段；引物F1和R3分别带有NdeI和XhoI的酶切位点，引物F2和R1顺序互补，并共同对应于rpoB基因片段的5’末端序列，引物F3和R2顺序互补，并共同对应于GyrB基因片段的5’末端序列。

以结核分支杆菌H37RV（购自中国药品生物制品检定所）基因组为模板，以引物F1和R1扩增ricR基因的片段，以引物F2和R2扩增rpoB基因的片段，以引物F3和R3扩增GyrB基因的片段。

产物经琼脂糖凝胶电泳纯化后切割，将含DNA条带的胶块按DNA快速纯化试剂盒（购自六合通-北京TAKARA公司，产品名称：TAKARAMiniBEST Plasmid purification）说明回收DNA。

然后再以ricR和GyrB基因片段为模板用连接PCR扩增ricR、rpoB和GyrB融合基因，中间以4个Gly（ggtggtggtggt）连接；即以第一轮PCR扩增得到的ricR目的DNA片段和rpoB目的DNA片段为模板，加入引物F1和R2，扩增ricR-rpoB目的DNA片段；以第二轮PCR扩增得到的ricR-rpoB和以第一轮PCR扩增得到的GyrB目的DNA片段为模板，加入引物F1和R3，扩增ricR-rpoB-GyrB目的DNA片段；得到完整的结核分枝杆菌重组融合蛋白DNA重组片段：ricR-rpoB-GyrB；扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测，结果如附图1所示。

质粒DNA和ricR-rpoB-GyrB均经内切酶切，50mL体系：10x buffer5.0mL，DNA 12mL，Xho Ⅰ和Nde Ⅰ各15U，ddH₂O补至50mL；37℃水浴6h。50mL酶切产物经琼脂糖凝胶电泳分离，切割DNA条带琼脂块，并按DNA快速纯化试剂盒说明回收DNA。

将融合基因片段克隆至pET-28a质粒（具有Xho Ⅰ和Nde Ⅰ酶切位点，购自华美生物公司），20mL连接体系：ddH₂O15.0m，10x buffer 2.0mL，PET-28a 2.0mL,Pab 1.0mL，T₄DNA连接酶20U；质粒自身连接对照，20mL连接反应体系：ddH₂O 16.0mL，10x buffer 2.0mL，PET-28a2.0mL，T4DNA连接酶20U；按上述加样后，混匀、稍离心，14℃-16℃连接过夜；转化E.coli涂平板（含有15微克/毫升卡那霉素的LB固体培养基）并挑克隆提质粒测序，确定序列正确的克隆。重组质粒的酶切(NdeI/XhoI)电泳图如附图2所示。

1.2产物测序

测序引物为：F1和R3及T7promoter和T7terminator的通用引物。所有扩增引物和测序引物的合成以及重组质粒序列pET-28a-ricR-rpoB-GyrB的测定都由华大基因公司提供服务。测得目的融合基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

1.3结核分枝杆菌重组融合蛋白的表达、纯化

将验证正确克隆的质粒（pET-28a-ricR-rpoB-GyrB），转化大肠杆菌BL21（DE3）（购自华美生物公司）宿主菌，目的蛋白在包含体内进行表达：将含有ricR-rpoB-GyrB基因的BL21（DE3）宿主菌培养到OD 0.6，用终浓度1mM IPTG诱导表达，4小时之后收集菌体、超声破碎、高速离心、收集沉淀。对收集的沉淀用Ni柱（Pharmcia公司chelating sephrose fastflow）进行纯化，用如下溶液洗脱：300mM咪唑，20mM Tris，500Mm NaCl，8M Urea。ricRa、rpoBa和GyrB融合基因表达蛋白共257个氨基酸，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

1.4结核分枝杆菌重组融合蛋白鉴定

1.4.1纯度和分子量的测定：经SDS－PAGE电泳检测（蛋白上样量10μg），为单一区带，薄层扫描鉴定纯度为95.8%。分子量约为29Kd，检测结果见附图3。

1.4.2浓度测定：经Folin-酚法测定，以牛血清白蛋白作为标准参比品，抗原蛋白浓度为3.5±0.12mg/mL。

1.4.3活性测定：用间接ELISA方法测定。包被量2.0μg/孔，使用内部质控血清测定OD值，结果见表1。

表1 结核分枝杆菌重组融合蛋白活性测定结果

抗原抗体反应：采用蛋白印记技术（Western Blot），以抗人结核IgG抗体阳性人血清测试TB融合蛋白抗原，可见阳性反应，SDS－PAGE并证实抗原的分子量为29KD。

1.4.4融合蛋白稳定性测定：

蛋白质浓度的稳定性测定，分三次测定保存的结核抗原溶液的蛋白质浓度的稳定性，结果见表2.

表2.结核分枝杆菌重组融合蛋白抗原的浓度测定

测试结果显示，-85℃保存的结核抗原溶液的蛋白质浓度非常稳定。

实施例2 酶联免疫法（ELISA）检测结核分枝杆菌抗体IgG的建立

采用间接ELISA方法检测结核分枝杆菌抗体IgG，可用于TB抗原活性的鉴定和TB感染的辅助诊断。本实施例以实施例1制得的结核分枝杆菌重组融合蛋白做抗原；为确定抗原包被量和酶标二抗工作浓度，以阳性和阴性参考品为测试样品，采用方阵滴定法选择最佳抗原包被量和相应的酶标二抗工作浓度，见下表3。

表3 最佳抗原包被量和相应的酶标二抗工作浓度的选择

根据测试结果，在抗原包被量为2.0μg/孔，酶标二抗使用浓度为4mg/ml时，检测结果最佳，故以TB重组抗原2.0μg/孔包被微孔板和4mg/ml酶标二抗IgG，建立结核分枝杆菌抗体IgG酶联免疫检测法（间接ELISA）。

实施例3结核分枝杆菌IgG抗体检测试剂盒（酶联免疫法）的性能检定

将实施例1制得的重组TB蛋白包被微孔板，用ELISA法测定TB IgG抗体。

3.1该试剂盒原理和组分如下：

1）试剂盒原理：本品系用基因工程重组TB抗原包被的微孔板，辣根过氧化物酶（HRP）标记抗人IgG为示踪物，TMB显色系统，应用间接法原理检测人血清或血浆中的抗TB IgG抗体。

2）试剂盒主要组成成分：

预包被板、酶结合物、阴性对照、阳性对照、浓缩洗液（20×）、底物液A、底物液B、中止液。

3.2试剂盒性能检定

特异性测定：按间接ELISA测定方法，检测几种其他血清物质，观察反应特异性。结果显示，使用本发明试剂盒检测15份阴性血清（临床已确定），符合率为100％；检测30份类风湿因子阳性血清标本、30份抗核抗体阳性血清标本，无一阳性，表明类风湿因子等基本不会造成试剂盒的假阳性，特异性很好。

灵敏度测定：按间接ELISA测定方法，检测本试剂盒的灵敏性。使用本发明试剂盒检测15份阳性血清（临床已确定），符合率为100％。

精密性测定：按间接ELISA测定方法，检测本试剂盒的精密性。使用本试剂盒对2份抗TB强阳性血清、1份阳性血清、1份阴性血清以及试剂盒的阳性对照、阴性对照进行每板双孔，共10板的检测，结果如表4，可见试剂盒的重复性良好，对不同血清检测的CV均低于15%。

表4 试剂盒的精密性

与国内外同类产品的比较试验：本发明试剂盒与北京万泰生物药业股份有限公司试剂盒检测300份血清样本的比较实验结果如表4。

表5 与现有的结核杆菌IgG抗体检测试剂盒（酶联免疫法）的比较测试结果

检测总符合率=（72+222）/300=98.0％，初步表明本试剂盒达到市场同类试剂盒的标准。

Claims

1.一种编码结核分枝杆菌蛋白的重组核酸，其序列如SEQ ID NO.1所示。

2.一种结核分枝杆菌蛋白，其特征在于它由权利要求1所述的重组核酸编码，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.一种含有权利要求1所述核酸的结核分枝杆菌蛋白的表达载体，其特征在于它是将权利要求1所述的重组核酸序列插入到质粒pET-28a上得到的重组质粒pET-28a-ricR-rpoB-GyrB。

4.一种表达结核分枝杆菌蛋白的工程菌株，其特征在于它含有权利要求3所述的表达载体pET-28a-ricR-rpoB-GyrB，宿主菌为大肠杆菌。

5.一种检测结核分枝杆菌感染的试剂盒，其特征在于其组分中的抗原是根据权利要求2所述的重组结核蛋白，抗原包被量为2.0μg/孔，酶标二抗使用浓度为4mg/ml。

6.权利要求2所述的结核分枝杆菌蛋白在制备检测试剂盒中的应用。