CN107011418A - 检测结核分枝杆菌感染的抗原多肽池及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于检测结核分枝杆菌感染的抗原多肽池，该特异性抗原多肽池，特异性刺激结核分枝杆菌感染的新鲜全血能特异性的分泌IFN‑γ，增加检测灵敏度。本发明提供了一种新的可用于结核分枝杆菌感染检测的检测试剂，实验证明，本发明可直接利用外周血进行抗原刺激，无需分离外周血单个核细胞，实验数据显示用于结核分枝杆菌感染检测具有较高的灵敏度和特异性，且操作简便，成本较低，具有较高的临床应用价值。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体而言，涉及检测结核分枝杆菌感染的抗原多肽池及其应用。
背景技术
结核病是主要经呼吸道传播的、严重危害我国和全世界的重要传染病之一。据世界卫生组织，全世界有17-20亿的结核分枝杆菌感染者，每年至少200万人死于本病(谢建平，结核分枝杆菌功能基因组研究的方法学，微生物通报.2001.28(5):92-97)。因此，准确筛检感染者的方法在结核病的防治甚至最终的消灭中扮演极其重要的作用。
现有的诊断技术对结核分枝杆菌感染者的诊断非常难。近几十年来，临床上采用结核菌素试验(TST)来诊断结核分枝杆菌感染者。但TST活性成份是纯蛋白衍生物(purified protein derivative of tubercμLin，PPD)，是结核分枝杆菌培养上清液的粗提物，含有200多种成分，与卡介苗(Bacillus Calmette-Guerin，BCG)接种和环境分枝杆菌感染存在交叉反应。TST检测结果可被现在临床广泛使用的疫苗—卡介苗免疫所干扰[P.Andersen，et al.Lancet356(2000)1099-1104.]。从1921年及明卡介苗到现在为止，全世界已有35亿人接种卡介苗。因此TST对感染者的诊断价值受到很大的影响，导致TST诊断的准确性较低，因此，无法根据其结果判断是否真正存在结核分枝杆菌感染。
对结核病病人的诊断技术中，痰涂片抗酸染色或痰菌培养，培养困难，耗时较长；肺部x射线检查肺部病理改变，也仅在具有典型的临床症状后才能诊断；其他血清学诊断方法和分子诊断方法缺乏特异性，假阳性率较高。有关研究人员指出，不同诊断性检查方法的敏感性和特异性如下：分枝杆菌培养(分别为73％和100％)；PCR(分别为42％和100％)；胸部X线(分别为67％～77％和66％～76％)；结核菌素试验(分别为94％和20％)；血清学(分别为33％和87％)。由此可见，现有的结核分枝杆菌检测方法的敏感性和特异性无法同时达到最优。
结核分枝杆菌感染人体后，首先会被人体的免疫系统识别，激活机体的T细胞免疫应答，分泌产生γ干扰素(IFN-γ)，后者发挥抗结核感染作用。部分T细胞转化为免疫记忆细胞，当再次与结核分枝杆菌相遇后，会再次分泌产生IFN-γ，发挥抗结核感染作用。抗原特异的刺激产生IFN-γ及其产生量与机体是否感染或发病密切相关。因此，如果采用结核分枝杆菌特异的抗原在体外刺激感染者和患者的T细胞，可诱导这些T细胞产生高水平的结核分枝杆菌特异的IFN-γ，而非结核分枝杆菌感染者或非结核病患者产生的IFN-γ的量与未用抗原刺激产生的量相近，从而实现诊断的目的。由此可见，寻找并发现结核分枝杆菌特异性抗原，对发展新一代的检测试剂具有重要价值和意义。
1996年，Stover等通过减数杂交的方法确定了BCG在体外传代过程中丢失的域，定义为缺失区(Region of Difference，RD)，RD区域存在于结核分枝杆菌中，而在BCG和大多数环境分枝杆菌中缺失[程渝,李茂全.结核分枝杆菌的实验室诊断进展.国外医学临床生物化学和检验学分册.2002；23(6)：342-343.]。其中，RD1区域编码的早期分抗原靶6KD(early secreting antigen target 6KD，ESAT-6)和培养滤液蛋白10KD(cμLtufiltrateprotein 10KD，CFP-10)是两种小分子量分泌蛋白，它们是T细胞最主要的抗原之一，可以诱导较强的细胞免疫反应。
对于儿童或者免疫低下样本，有文献报道，仅以ESAT-6和CFP-10或其多肽作为刺激原，其灵敏度约为73.5％-88.9％(孙琳，ELISPOT检测技术在儿童结核病诊断中的应用，标记免疫分析与临床.2008.6:349-353；钟华清，干扰素-γ释放试验在儿童结核感染中的应用价值，检验医学.2016.3:176-179；李海，应用酶联免疫斑点法快速诊断儿童结核分枝杆菌感染的研究，中国妇幼保健，2012.11:1703-1706)。对于一些特殊样本，如儿童、免疫低下及新近感染样本，ESAT-6和CFP-10多肽及衍生物试剂盒结核分枝杆菌样本检出依然不高，出现假阴性或漏检，不能满足临床需求。
发明内容
针对现有检测方法对于一些特殊样本，如儿童、免疫低下及新近感染结核分枝杆菌样本的检出率不足，本发明的目的在于提供一种检测结核分枝杆菌感染的抗原多肽池，该抗原多肽池特异性刺激结核分枝杆菌感染的全血能特异性的分泌IFN-γ，增加检测灵敏度。
一种检测结核分枝杆菌感染的抗原多肽池，该抗原多肽池包括含有氨基酸序列如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.29中所示的任八条多肽或任八条以上多肽的组合。
如上所述的抗原多肽池，优选地，所述多肽是人工合成的或是天然分离的。
如上所述的抗原多肽池，优选地，所述抗原多肽池还包括ESAT-6和CFP-10。
如上所述的抗原多肽池，优选地，所述ESAT-6的氨基酸序列如SEQ ID NO.30所示，所述CFP-10的氨基酸序列如SEQ ID NO.31所示。
如上所述的抗原多肽池，优选地，所述抗原多肽池还包括ESAT-6-CFP-10。
如上所述的抗原多肽池，优选地，所述ESAT-6-CFP-10的氨基酸序列如SEQ IDNO.32所示。
如上所述的抗原多肽池，优选地，该抗原多肽池包括与所述SEQ ID NO.1～SEQ IDNO.29中任一所示序列具有85％同源性的多肽。
一种检测结核分枝杆菌感染的试剂盒，该试剂盒包括如上所述的抗原多肽池。
一种检测结核分枝杆菌感染的试剂盒，优选地，该试剂盒还包括IFN-γ的检测试剂。
如上所述的检测结核分枝杆菌感染的抗原多肽池的应用，采用所述抗原多肽池作为刺激剂刺激全血，检测产生的IFN-γ。
采用本发明提供的抗原多肽池与IFN-γ的特异性抗原蛋白(ESAT6和CFP10，ESAT6-CFP10)，用于检测结核分枝杆菌感染后的全血样本，具有以下特点：
(1)免疫低下样本阳性检出率高，灵敏度高。针对现有检测方法对于一些特殊样本，如儿童、免疫低下及新近感染样本或潜伏感染者的检出不足，本发明提供用于敏感性和特异性高的结核分枝杆菌感染的抗原多肽池，该多肽池合并ESAT-6和CFP-10可实现对结核病病人或早期感染者或潜伏感染者(未出现结核病病症)的快速、特异的检测，在阻断结核病的传播和流行，以及对结核病的控制具有重大意义。
(2)检测用时短，操作方便，诊断快速。与传统结核分枝杆菌检测相比，利用本发明提供的多肽池合并IFN-γ的特异性抗原蛋白检测用时短，诊断快速。传统结核分枝杆菌培养诊断需时间1-2月，TST检测需要3天，本发明全部检测时间在1-2天内可完成。
(3)对感染结核分枝杆菌能进行早期检测。由于结核分枝杆菌一旦感染人体，首先就被机体的免疫系统所识别，激活体液和细胞免疫应答，发病时间在感染后1-2个月，因此，利用本发明提供的多肽池合并全血IFN-γ的特异性抗原蛋白的细胞免疫学检测方法即可快速做出诊断，诊断出样本是否感染结核分枝杆菌。而现有的技术中，X光片诊断只有在感染者肺部出现明显的病理改变后才可做出诊断，这通常需要很长的时间。抗原抗体检测也只有在疾病症状处于活动期的情况下检测，但环境中分枝杆菌广泛存在，其与结核分枝杆菌的共同抗原，可干扰实验的诊断结果。可见，本发明对结核分枝杆菌新近感染或免疫低下者的早期检测有重要意义，对结核病的控制和消灭具有积极的意义。
本发明还提供了一种新的可用于结核分枝杆菌感染检测的检测试剂，实验证明，本发明可直接利用外周血进行抗原刺激，无需分离外周血单个核细胞，实验数据显示用于结核分枝杆菌感染检测具有较高的灵敏度和特异性，有效避免假阴性，且操作简便，成本较低，具有较高的临床应用价值。
具体实施方式
为了实现本发明的目的，发明人根据计算机软件进行多肽预测，综合优选合适的多肽，通过大量试验研究验证，最终获得氨基酸序列如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.29所示的多肽池，其中这些多肽的筛选研究是通过如下技术手段确定：
1、单多肽刺激有效性筛选：将初步筛得的多肽配制成一定浓度的多肽溶液，刺激新鲜全血，用γ干扰素检测试剂盒检测其是否感染结核分枝杆菌，选择对阳性样本有刺激效果，且对阴性样本无非特异性刺激的多肽。
2、多肽组合刺激效果：将筛选到有效的多肽随机8-20个配制成混合多肽溶液，刺激新鲜全血，37℃孵育20±4小时，离心收集上清，将上清加入人IFN-γ检测试剂盒(酶联免疫法)中进行检测，选择对阳性样本有刺激效果，且对阴性样本无非特异性刺激的混合多肽，确定能组合有效的混合多肽序列。
3、合并ESAT-6和CFP-10刺激效果：将筛选的有效混合多肽溶液合并ESAT-6和CFP-10配制成刺激剂溶液，刺激新鲜全血，37℃孵育20±4小时，离心收集上清，将上清加入人IFN-γ检测试剂盒(酶联免疫法)中进行检测，选择对阳性样本有刺激效果，且对阴性样本无非特异性刺激的混合多肽，确定能组合有效的混合多肽序列。
4、合并ESAT-6-CFP-10刺激效果：将筛选的有效混合多肽溶液合并ESAT-6-CFP-10配制成刺激剂溶液，刺激新鲜全血，37℃孵育20±4小时，离心收集上清，将上清加入人IFN-γ检测试剂盒(酶联免疫法)中进行检测，选择对阳性样本有刺激效果，且对阴性样本无非特异性刺激的混合多肽，确定能组合有效的混合多肽序列。
本发明中筛选的多肽为致病结核分枝杆菌的特异性蛋白质，这些蛋白质均能特异性刺激结核分枝杆菌感染的病人新鲜全血特异性的分泌IFN-γ。筛选这些蛋白质中能针对CD8+淋巴细胞的结合位点的多肽，通过反复的临床验证实验，这些多肽合并ESAT-6和CFP-10能提高检测灵敏度，该合并刺激剂可特异性作用于结核分枝杆菌感染样本的全血中的淋巴细胞表位，通过检测全血中释放的细胞因子IFN-γ，从而间接地反应机体是否感染过结核分枝杆菌。该方法提高结核分枝杆菌感染样本的检出率，特别是新近感染样本、儿童、免疫低下感染结核分枝杆菌样本的检出灵敏度，有效避免现有检测技术中易出现的漏检、错检问题。
以下结合实施例对本发明作进一步说明，但是本发明的保护范围并不限于这些实施例。凡是不背离本发明构思的改变或等同替代均包括在本发明的保护范围之内。下列实施例中未注明具体条件的实验方法是按常规实验方法；试验试剂如无特别说明均为市售购买产品。
实施例1单多肽刺激有效性筛选
本发明的多肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.29所示，这些可通过人工合成的或是天然分离，本实施例及以下实施例中用的多肽是通过人工合成的，其中，SEQID NO.1～SEQ ID NO.5来自Ag85B、SEQ ID NO.6来自Mpt649、SEQ ID NO.7～SEQ ID NO.8来自RV1985C、SEQ ID NO.9～SEQ ID NO.10来自RV1989c、SEQ ID NO.11～SEQ ID NO.12来自Rv3425、SEQ ID NO.13～SEQ ID NO.15来自RV3615，SEQ ID NO.16～SEQ NO.19来自RV3873，SEQ ID NO.20～SEQ ID NO.22来自RV3878，SEQ ID NO.23来自RV3879c，SEQ IDNO.24～SEQ ID NO.26来自tb7.7、SEQ ID NO.27来自CFP-10，SEQ ID NO.28～SEQ IDNO.29来自ESAT-6。
SEQ ID NO.1：RLWVYCGNGTPNEL
SEQ ID NO.2：LMIGTAAAVVLPGL
SEQ ID NO.3：VQFQSGGNNSPAVY
SEQ ID NO.4：MPVGGQSSFYSDWY
SEQ ID NO.5：SAAIGLSMAGSSAM
SEQ ID NO.6：YQSAIPPRGTQAVV
SEQ ID NO.7：RKAFRRAITRPTHF
SEQ ID NO.8：MVDPQLDGPQLAAL
SEQ ID NO.9：LLFPAIYLADSAQA
SEQ ID NO.10：AVLDLTTPQAREAV
SEQ ID NO.11：RELAYSVETTAESL
SEQ ID NO.12：VSWTRSALSDLPRW
SEQ ID NO.13：ALGSSLHTAGVDLA
SEQ ID NO.14：RLGVLASHHDNAAV
SEQ ID NO.15：NVYLTAHNALGSSL
SEQ ID NO.16：ALAAVVELGSFDAA
SEQ ID NO.17：LMAGAGPAPMLAAA
SEQ ID NO.18：AALDAQAVELTARL
SEQ ID NO.19：LMSQLIEKPVAPSV
SEQ ID NO.20：KLAGLVFPQPPAPI
SEQ ID NO.21：QQAAQSAQGGSGPM
SEQ ID NO.22：VQMSQNASPIAQTI
SEQ ID NO.23：MSITRPTGSYARQM
SEQ ID NO.24：LLAAADELVGGPPV
SEQ ID NO.25：ALAARTLLAAADEL
SEQ ID NO.26：RAVAESHGVAAVLF
SEQ ID NO.27：AAVVRFQEAANKQKQEL
SEQ ID NO.28：VTSIHSLLDEGKQSL
SEQ ID NO.29：LLDEGKQSLTKL。
将制备的多肽用无菌低内毒素(内毒素应小于2.5EU/μg)PBS溶解到浓度为250μg/mL。
取10例临床确诊结核症状人群的新鲜血样，10例无结核症状健康人群的新鲜血样，用市售γ干扰素检测试剂盒(武汉海吉力生物科技有限公司)检测其是否感染结核分枝杆菌。同时取多肽溶液20μL于无菌培养管中(多肽的终浓度为100μg/mL)，每管加入1mL新鲜采集全血，混合均匀后于37℃烘箱20±4小时，混合血液后，6000rpm离心1min，取上清检测γ干扰素含量。
结果表明，本发明所设计的序列如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.29所示的多肽的对阳性样本有刺激效果，且对阴性样本均无非特异性刺激。。需要说明的是，与SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.29中任一多肽具有85％同源性的多肽也可实现上述目的。
实施例2合并刺激效果
将任取8条多肽溶液合并ESAT-6和CFP-10(ESAT-6和CFP-10由大肠杆菌基因工程菌重组表达获得，ESAT-6序列为SEQ ID NO.30:MTEQQWNFAGIEAAASAIQGNVTSIHSLLDEGKQSLTKLAAAWGGSGSEAYQGVQQKWDATATELNNALQNLARTISEAGQAMASTEGNVTGMFA；CFP-10序列为SEQ IDNO.31:MAEMKTDAATLAQEAGNFERISGDLKTQIDQVESTAGSLQGQWRGAAGTAAQAAVVRFQEAANKQKQELDEISTNIRQAGVQYSRADEEQQQALSSQMGF，配制成刺激剂溶液，本实施例中仅列举优选的部分多肽的实验结果，编号为刺激剂1～刺激剂4(刺激剂1：SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.8+ESAT-6+CFP-10；刺激剂2：SEQ ID NO.9～SEQ ID NO.16+ESAT-6+CFP-10；刺激剂3：SEQ ID NO.17～SEQ ID NO.24+ESAT-6+CFP-10；刺激剂4：SEQ ID NO.22～SEQ ID NO.29+ESAT-6+CFP-10)，取结核分枝杆菌感染的阳性和未感染的阴性样本进行试验。
取同实施例1中的20例全血样本，用γ干扰素检测试剂盒检测其是否感染结核分枝杆菌。同时取刺激剂1～刺激剂4各20μL于无菌培养管中(各多肽的终浓度为100μg/mL)，每管加入1mL新鲜采集全血，混合均匀后于37℃烘箱20±4小时，混合血液后，6000rpm离心1min，取上清用γ干扰素检测试剂盒检测。检测方法同实施例1，检测结果见表1。其中，市售试剂盒为武汉海吉力生物科技有限公司的结核分枝杆菌特异性细胞免疫反应检测试剂盒(酶联免疫法),下同。
表1.混合多肽合并ESAT-6和CFP-10刺激结果统计
结果说明本发明制备的多肽池结合ESAT-6和CFP-10用于检测结核分枝杆菌感染的全血，提高了检测灵敏度，有效避免现有技术检测的假阴性和漏检。
实施例3合并刺激效果
将任取8条多肽溶液合并ESAT-6-CFP-10配制成刺激剂溶液，其中，ESAT-6-CFP-10由大肠杆菌基因工程菌重组表达获得，ESAT-6-CFP-10序列为SEQ ID NO.32：
MTEQQWNFAGIEAAASAIQGNVTSIHSLLDEGKQSLTKLAAAWGGSGSEAYQGVQQKWDATATELNNALQNLARTISEAGQAMASTEGNVTGMFANVAMAEMKTDAATLAQEAGNFERISGDLKTQIDQVESTAGSLQGQWRGAAGTAAQAAVVRFQEAANKQKQELDEISTNIRQAGVQYSRADEEQQQALSSQMGF，编号为刺激剂5～刺激剂8(刺激剂5：SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.8+ESAT-6-CFP-10；刺激剂6：SEQ ID NO.9～SEQ IDNO.16+ESAT-6-CFP-10；刺激剂7：SEQ ID NO.17～SEQ ID NO.24+ESAT-6-CFP-10；刺激剂8：SEQ ID NO.22～SEQ ID NO.29+ESAT-6-CFP-10)，取结核分枝杆菌感染的阳性和未感染的阴性样本进行试验，配制成刺激剂溶液，取同实施例1中的20例全血样本，用γ干扰素检测试剂盒检测其是否感染结核分枝杆菌。同时取刺激剂5～刺激剂8各20μL于无菌培养管中(各多肽的终浓度为100μg/mL)，每管加入1mL新鲜采集全血，混合均匀后于37℃烘箱20±4小时，混合血液后，6000rpm离心1min，取上清用γ干扰素检测试剂盒检测。检测方法同实施例1，检测结果见表2。
表2.混合多肽合并ESAT-6-CFP-10刺激结果
| 市售试剂盒 | 刺激剂5 | 刺激剂6 | 刺激剂7 | 刺激剂8 | |
| 10阳性样本检出例数 | 8 | 10 | 9 | 9 | 9 |
| 10阴性样本检出例数 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 |
结果说明本发明制备的多肽池结合ESAT-6-CFP-10用于检测结核分枝杆菌感染的全血，提高了检测灵敏度，有效避免现有技术检测的假阴性和漏检。
实施例4合并混合多肽检测灵敏度和特异性
样本：取20例临床确诊结核症状人群的新鲜血样，20例无结核症状健康人群的新鲜血样。
采集上述样本的全血样本，分别用刺激剂9(ESAT-6(10μg/mL)和CFP-10(10μg/mL)+混合多肽(SEQ ID NO.12～SEQ ID NO.19，各100μg/mL))、刺激剂10(ESAT-6-CFP-10(10μg/mL)+混合多肽(SEQ ID NO.12～SEQ ID NO.19，各100μg/mL))、刺激剂11(ESAT-6(10μg/mL)和CFP-10(10μg/mL))、刺激剂12(ESAT-6-CFP-10(10μg/mL))和刺激剂13(市售试剂盒：武汉海吉力生物科技有限公司的结核分枝杆菌特异性细胞免疫反应检测试剂盒(酶联免疫法))各20μL于无菌培养管中，每管加入1mL新鲜采集全血刺激，混合均匀后于37℃烘箱20±4小时，混合血液后，6000rpm离心1min，取上清用γ干扰素检测试剂盒检测，结果见表3。
表3.合并混合多肽灵敏度和特异性检测结果统计
结果说明本发明制备的多肽池结合ESAT-6和CFP-10或ESAT-6-CFP-10用于检测结核分枝杆菌感染的全血，其检测灵敏度可达95％，灵敏度和特异性较强，有效避免现有技术检测的假阴性和漏检。
实施例5试剂盒灵敏度和特异性检测
样本：取100例临床确诊结核症状人群的新鲜血样，其中65岁年龄及以上样本37例，6岁以下年龄样本数23例，HIV样本33例，男61例，女39例。50例无结核症状健康人群的新鲜血样，其中65岁年龄及以上样本12例，6岁以下年龄样本数5例，HIV样本33例，男28例，女22例。
采集上述样本的全血样本，分别用刺激剂(ESAT-6(10μg/mL)和CFP-10(10μg/mL)+混合多肽(SEQ ID NO.15～SEQ ID NO.22，各100μg/mL)和市售试剂盒(武汉海吉力生物科技有限公司的结核分枝杆菌特异性细胞免疫反应检测试剂盒(酶联免疫法)刺激剂各20μL于无菌培养管中，每管加入1mL新鲜采集全血刺激，混合均匀后于37℃烘箱20±4小时，混合血液后，6000rpm离心1min，取上清用结核感染T细胞检测试剂盒(酶联免疫法)进行检测，市售试剂盒按其说明书进行操作。检测结果见表4和表5。
表4.结核分枝杆菌感染样本的酶联免疫法检测结果统计
表5.健康样本的酶联免疫法检测结果统计
结果说明本发明制备的多肽池结合ESAT-6和CFP-10及其衍生物可提高对一些特殊样本，如儿童、免疫低下及新近感染样本检出率，灵敏度和特异性较强，有效避免现有技术检测的假阴性和漏检。本发明对结核分枝杆菌新近感染或免疫低下者的早期检测有重要意义，对结核病的控制和消灭具有积极的意义。
SEQUENCE LISTING
<110> 武汉海吉力生物科技有限公司
<120> 检测结核分枝杆菌感染的抗原多肽池及其应用
<130>
<160> 32
<170> PatentIn version 3.5
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<212> PRT
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<212> PRT
<213> 人工合成
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Leu Met Ile Gly Thr Ala Ala Ala Val Val Leu Pro Gly Leu
1 5 10
<210> 3
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 3
Val Gln Phe Gln Ser Gly Gly Asn Asn Ser Pro Ala Val Tyr
1 5 10
<210> 4
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 4
Met Pro Val Gly Gly Gln Ser Ser Phe Tyr Ser Asp Trp Tyr
1 5 10
<210> 5
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 5
Ser Ala Ala Ile Gly Leu Ser Met Ala Gly Ser Ser Ala Met
1 5 10
<210> 6
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 6
Tyr Gln Ser Ala Ile Pro Pro Arg Gly Thr Gln Ala Val Val
1 5 10
<210> 7
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 7
Arg Lys Ala Phe Arg Arg Ala Ile Thr Arg Pro Thr His Phe
1 5 10
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<211> 14
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 8
Met Val Asp Pro Gln Leu Asp Gly Pro Gln Leu Ala Ala Leu
1 5 10
<210> 9
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 9
Leu Leu Phe Pro Ala Ile Tyr Leu Ala Asp Ser Ala Gln Ala
1 5 10
<210> 10
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<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 10
Ala Val Leu Asp Leu Thr Thr Pro Gln Ala Arg Glu Ala Val
1 5 10
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<213> 人工合成
<400> 11
Arg Glu Leu Ala Tyr Ser Val Glu Thr Thr Ala Glu Ser Leu
1 5 10
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<213> 人工合成
<400> 12
Val Ser Trp Thr Arg Ser Ala Leu Ser Asp Leu Pro Arg Trp
1 5 10
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<213> 人工合成
<400> 13
Ala Leu Gly Ser Ser Leu His Thr Ala Gly Val Asp Leu Ala
1 5 10
<210> 14
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 14
Arg Leu Gly Val Leu Ala Ser His His Asp Asn Ala Ala Val
1 5 10
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<213> 人工合成
<400> 15
Asn Val Tyr Leu Thr Ala His Asn Ala Leu Gly Ser Ser Leu
1 5 10
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<211> 14
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 16
Ala Leu Ala Ala Val Val Glu Leu Gly Ser Phe Asp Ala Ala
1 5 10
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<213> 人工合成
<400> 17
Leu Met Ala Gly Ala Gly Pro Ala Pro Met Leu Ala Ala Ala
1 5 10
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<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 18
Ala Ala Leu Asp Ala Gln Ala Val Glu Leu Thr Ala Arg Leu
1 5 10
<210> 19
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 19
Leu Met Ser Gln Leu Ile Glu Lys Pro Val Ala Pro Ser Val
1 5 10
<210> 20
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 20
Lys Leu Ala Gly Leu Val Phe Pro Gln Pro Pro Ala Pro Ile
1 5 10
<210> 21
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 21
Gln Gln Ala Ala Gln Ser Ala Gln Gly Gly Ser Gly Pro Met
1 5 10
<210> 22
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 22
Val Gln Met Ser Gln Asn Ala Ser Pro Ile Ala Gln Thr Ile
1 5 10
<210> 23
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 23
Met Ser Ile Thr Arg Pro Thr Gly Ser Tyr Ala Arg Gln Met
1 5 10
<210> 24
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 24
Leu Leu Ala Ala Ala Asp Glu Leu Val Gly Gly Pro Pro Val
1 5 10
<210> 25
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 25
Ala Leu Ala Ala Arg Thr Leu Leu Ala Ala Ala Asp Glu Leu
1 5 10
<210> 26
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 26
Arg Ala Val Ala Glu Ser His Gly Val Ala Ala Val Leu Phe
1 5 10
<210> 27
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 27
Ala Ala Val Val Arg Phe Gln Glu Ala Ala Asn Lys Gln Lys Gln Glu
1 5 10 15
Leu
<210> 28
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 28
Val Thr Ser Ile His Ser Leu Leu Asp Glu Gly Lys Gln Ser Leu
1 5 10 15
<210> 29
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 29
Leu Leu Asp Glu Gly Lys Gln Ser Leu Thr Lys Leu
1 5 10
<210> 30
<211> 95
<212> PRT
<213> ESAT-6
<400> 30
Met Thr Glu Gln Gln Trp Asn Phe Ala Gly Ile Glu Ala Ala Ala Ser
1 5 10 15
Ala Ile Gln Gly Asn Val Thr Ser Ile His Ser Leu Leu Asp Glu Gly
20 25 30
Lys Gln Ser Leu Thr Lys Leu Ala Ala Ala Trp Gly Gly Ser Gly Ser
35 40 45
Glu Ala Tyr Gln Gly Val Gln Gln Lys Trp Asp Ala Thr Ala Thr Glu
50 55 60
Leu Asn Asn Ala Leu Gln Asn Leu Ala Arg Thr Ile Ser Glu Ala Gly
65 70 75 80
Gln Ala Met Ala Ser Thr Glu Gly Asn Val Thr Gly Met Phe Ala
85 90 95
<210> 31
<211> 100
<212> PRT
<213> CFP-10
<400> 31
Met Ala Glu Met Lys Thr Asp Ala Ala Thr Leu Ala Gln Glu Ala Gly
1 5 10 15
Asn Phe Glu Arg Ile Ser Gly Asp Leu Lys Thr Gln Ile Asp Gln Val
20 25 30
Glu Ser Thr Ala Gly Ser Leu Gln Gly Gln Trp Arg Gly Ala Ala Gly
35 40 45
Thr Ala Ala Gln Ala Ala Val Val Arg Phe Gln Glu Ala Ala Asn Lys
50 55 60
Gln Lys Gln Glu Leu Asp Glu Ile Ser Thr Asn Ile Arg Gln Ala Gly
65 70 75 80
Val Gln Tyr Ser Arg Ala Asp Glu Glu Gln Gln Gln Ala Leu Ser Ser
85 90 95
Gln Met Gly Phe
100
<210> 32
<211> 198
<212> PRT
<213> ESAT-6-CFP-10
<400> 32
Met Thr Glu Gln Gln Trp Asn Phe Ala Gly Ile Glu Ala Ala Ala Ser
1 5 10 15
Ala Ile Gln Gly Asn Val Thr Ser Ile His Ser Leu Leu Asp Glu Gly
20 25 30
Lys Gln Ser Leu Thr Lys Leu Ala Ala Ala Trp Gly Gly Ser Gly Ser
35 40 45
Glu Ala Tyr Gln Gly Val Gln Gln Lys Trp Asp Ala Thr Ala Thr Glu
50 55 60
Leu Asn Asn Ala Leu Gln Asn Leu Ala Arg Thr Ile Ser Glu Ala Gly
65 70 75 80
Gln Ala Met Ala Ser Thr Glu Gly Asn Val Thr Gly Met Phe Ala Asn
85 90 95
Val Ala Met Ala Glu Met Lys Thr Asp Ala Ala Thr Leu Ala Gln Glu
100 105 110
Ala Gly Asn Phe Glu Arg Ile Ser Gly Asp Leu Lys Thr Gln Ile Asp
115 120 125
Gln Val Glu Ser Thr Ala Gly Ser Leu Gln Gly Gln Trp Arg Gly Ala
130 135 140
Ala Gly Thr Ala Ala Gln Ala Ala Val Val Arg Phe Gln Glu Ala Ala
145 150 155 160
Asn Lys Gln Lys Gln Glu Leu Asp Glu Ile Ser Thr Asn Ile Arg Gln
165 170 175
Ala Gly Val Gln Tyr Ser Arg Ala Asp Glu Glu Gln Gln Gln Ala Leu
180 185 190
Ser Ser Gln Met Gly Phe
195
Claims (10)
1.一种检测结核分枝杆菌感染的抗原多肽池，其特征在于，该抗原多肽池包括含有氨基酸序列如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.29中所示的任八条多肽或任八条以上的多肽组合。
2.如权利要求1所述的抗原多肽池，其特征在于，所述多肽是人工合成的或是天然分离的。
3.如权利要求1所述的抗原多肽池，其特征在于，所述抗原多肽池还包括ESAT-6和CFP-10。
4.如权利要求3所述的抗原多肽池，其特征在于，所述ESAT-6的氨基酸序列如SEQ IDNO.30所示，所述CFP-10的氨基酸序列如SEQ ID NO.31所示。
5.如权利要求1所述的抗原多肽池，其特征在于，所述抗原多肽池还包括ESAT-6-CFP-10。
6.如权利要求5所述的抗原多肽池，其特征在于，所述ESAT-6-CFP-10的氨基酸序列如SEQ ID NO.32所示。
7.如权利要求1所述的抗原多肽池，其特征在于，该抗原多肽池包括与所述SEQ IDNO.1～SEQ ID NO.29中任一所示序列具有85％同源性的多肽。
8.一种检测结核分枝杆菌感染的试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括如权利要求1-7中任一所述的抗原多肽池。
9.权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，该试剂盒还包括IFN-γ的检测试剂。
10.如权利要求1-7任一所述的检测结核分枝杆菌感染的抗原多肽池的应用，其特征在于，采用所述的抗原多肽池作为刺激剂刺激全血，检测产生的IFN-γ。
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|---|---|---|---|---|
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| WO2023078438A1 (zh) * | 2021-11-08 | 2023-05-11 | 成都可恩生物科技有限公司 | 一种结核分枝杆菌融合蛋白及其制备方法和应用 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102175875A (zh) * | 2011-01-27 | 2011-09-07 | 武汉海吉力生物科技有限公司 | 一种诊断结核病的检测试剂盒 |
| CN104678097A (zh) * | 2015-03-10 | 2015-06-03 | 中国人民解放军军事医学科学院基础医学研究所 | 一种用于肺结核诊断的结核分枝杆菌组合抗原 |
| CN105954521A (zh) * | 2016-07-08 | 2016-09-21 | 广州华弘生物科技有限公司 | 一种结核分枝杆菌感染诊断试剂盒 |
-
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Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102175875A (zh) * | 2011-01-27 | 2011-09-07 | 武汉海吉力生物科技有限公司 | 一种诊断结核病的检测试剂盒 |
| CN104678097A (zh) * | 2015-03-10 | 2015-06-03 | 中国人民解放军军事医学科学院基础医学研究所 | 一种用于肺结核诊断的结核分枝杆菌组合抗原 |
| CN105954521A (zh) * | 2016-07-08 | 2016-09-21 | 广州华弘生物科技有限公司 | 一种结核分枝杆菌感染诊断试剂盒 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 谢莉等: "抗原刺激后外周血单个核细胞γ干扰素释放反应在结核分枝杆菌感染和结核病诊断中的意义", 《中华结核和呼吸杂志》 * |
Cited By (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN107144694A (zh) * | 2017-03-29 | 2017-09-08 | 武汉海吉力生物科技有限公司 | 用于检测结核感染t细胞的抗原、试剂盒及应用 |
| CN107219362A (zh) * | 2017-03-29 | 2017-09-29 | 武汉海吉力生物科技有限公司 | 用于检测结核感染t细胞的抗原、试剂盒及应用 |
| CN107219363A (zh) * | 2017-03-29 | 2017-09-29 | 武汉海吉力生物科技有限公司 | 用于检测结核感染t细胞的抗原、试剂盒及应用 |
| CN107144694B (zh) * | 2017-03-29 | 2019-06-14 | 武汉海吉力生物科技有限公司 | 用于检测结核感染t细胞的抗原、试剂盒及应用 |
| CN107219362B (zh) * | 2017-03-29 | 2019-08-09 | 武汉海吉力生物科技有限公司 | 用于检测结核感染t细胞的抗原、试剂盒及应用 |
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