CN114671928A - 一种结核分枝杆菌T细胞表位蛋白Rv1566c-444的应用 - Google Patents

一种结核分枝杆菌T细胞表位蛋白Rv1566c-444的应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及分子生物学和免疫学技术领域，具体公开了一种结核分枝杆菌T细胞表位蛋白Rv1566c‑444的应用。本发明提供一种结核分枝杆菌T细胞表位蛋白Rv1566c‑444在制备结核病检测试剂和疫苗中的应用；其中，所述结核分枝杆菌T细胞表位蛋白Rv1566c‑444的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，或为该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有相同抗原性和免疫原性的氨基酸序列。本发明结核分枝杆菌T细胞表位蛋白Rv1566c‑444可减少因试剂盒固有蛋白抗原刺激T细胞造成的假阴性，从而提高检测灵敏度。细胞免疫反应佳，可广泛用于结核病的辅助诊断、流行病学监测与感染筛查等相关领域并为抗结核新疫苗的研制提供了新的思路。

Description

一种结核分枝杆菌T细胞表位蛋白Rv1566c-444的应用
技术领域
本发明涉及分子生物学和免疫学技术领域，具体地说，涉及一种结核分枝杆菌T细胞表位蛋白Rv1566c-444的应用。
背景技术
结核病是由结核分枝杆菌引起的一种人畜共患传染病。其发病率、患病率和致死率高、易产生耐药和多重耐药性，且耐药性不断增加。快速即时诊断检测、新疫苗或有效的预防性治疗是终止结核病流行需要优先解决的问题。
结核病的早期诊断对结核病的控制至关重要，快速、敏感和特异的诊断工具的缺乏对结核病的防治造成了巨大挑战。抗结核病的保护性免疫机制目前仍不完全清楚，细胞免疫尤其是循环及感染部位的T淋巴细胞免疫应答被认为起着重要作用。因此，能否有效地激发机体的T细胞免疫应答，尤其是CD4+T细胞免疫反应是机体成功对抗结核感染的关键。被病原菌致敏的T淋巴细胞，再次受到同种抗原刺激后，会释放γ干扰素，高水平的γ干扰素反应可以用来评估细胞介导的宿主免疫反应，因此，提示该病原菌的感染。近年来，免疫学方法在结核病或潜伏性结核病感染(LTBI)的诊断中发挥着越来越重要的作用，伴随着基因组学的发展，市面上出现了以T细胞为基础的体外γ干扰素释放试验(IGRA)(LoBue PA，2012，JAMA 308:241–2)，可用于结核病辅助诊断和结核感染筛查。以结核分枝杆菌基因组RD1区编码的结核特异性抗原6kDa早期分泌抗原靶标[ESAT-6]和培养滤液蛋白10[CFP-10]为刺激物的商品化IGRA试剂，如利用酶联免疫吸附实验(ELISA)技术检测的QuantiFERON-TB Gold test和利用固相酶联免疫斑点(ELISPOT)技术检测的T-SPOT.TB test，目前已经被用于检测外周血中结核特异性释放γ干扰素的T淋巴细胞，能够呈现较高的灵敏性和特异性。
卡介苗(BCG)是目前唯一获批用于人体的抗结核疫苗,其被证明能诱导人体产生保护性免疫，但确只对儿童结核具有有限的免疫保护作用。新的抗结核疫苗的开发策略主要是作为卡介苗的替代品以及卡介苗初免后的异种加免疫苗来预防结核感染，或者对潜伏感染者进行预防干预，或作为治疗性疫苗。混合佐剂的重组蛋白亚单位疫苗因其良好的安全性以及成分明确等优点而备受瞩目，在小鼠模型中，结核抗原Ag85B可以引发对抗结核分枝杆菌攻击的强Th1免疫反应(Ahmad F，2017，Front Immunol 8:1608)，因此免疫显性抗原Ag85B是可用于新型抗结核疫苗研发的重要抗原之一。
结核抗原的免疫原性对于以免疫显性抗原引起的免疫反应为基础发挥作用的结核诊断试剂与抗结核新疫苗的研发起决定性作用。因为结核分枝杆菌的独特胞内生存模式，在结核病患者体内主要是由T细胞介导针对结核分枝杆菌感染的保护性免疫应答，因此，能引起强烈T细胞免疫反应的结核抗原可以作为结核诊断试剂与抗结核新疫苗的候选组分。抗原表位是抗原的一部分，是抗原性的核心基础；抗原通过抗原表位与相应的淋巴细胞表面受体结合从而致敏淋巴细胞、引起免疫应答，即免疫反应的特异性是针对抗原表位，而不是针对整个抗原，抗原表位在抗原诱导免疫应答的过程中起着决定性作用。抗原的T细胞表位是决定抗原能够引起人体T细胞反应的特殊化学基团，富含T细胞表位的蛋白抗原在结核诊断试剂与抗结核新疫苗研发方面具有巨大潜力。
虽然目前的干扰素-γ释放试验分析技术在晚期或接种卡介苗或暴露于非结核分枝杆菌的人群中提高诊断结核分枝杆菌感染的特异性方面具有优势，但其无法准确区分潜伏结核感染和活动性结核，并且，这一技术主要以完整抗原作为相应的刺激源，抗原成分组成较为复杂、灵敏度和特异性有待提高，且相应试剂成本较高，不适合目前情况下的大范围应用。
尽管卡介苗在预防5岁以下儿童产生活动性结核病方面发挥着十分重要的作用，但卡介苗的保护一般只能维持5～10年，卡介苗的保护力随着时间增加逐渐减弱，以致对成人结核几乎无保护效果。所有的新型抗结核疫苗均还在临床试验期，没有一个真正能够投放市场，因此，对结核病新疫苗的需求十分急迫。因为市面上使用的结核诊断试剂以及现有的处于研究阶段的抗结核疫苗所含的蛋白抗原的免疫原性仍不能引起所需的足够的免疫保护反应，寻找具有良好免疫原性的抗原对于结核诊断试剂以及新疫苗的研发至关重要。
发明内容
本发明的目的是提供结核分枝杆菌抗原蛋白Rv1566c T细胞表位的一种结核分枝杆菌T细胞表位蛋白Rv1566c-444的应用。
具体地，本发明的技术方案如下：
第一方面，本发明提供一种结核分枝杆菌T细胞表位蛋白Rv1566c-444在制备结核检测试剂中的应用；其中，所述结核分枝杆菌T细胞表位蛋白Rv1566c-444的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，或为该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有相同免疫原性和相同抗原性的氨基酸序列。
第二方面，本发明提供一种结核分枝杆菌T细胞表位蛋白Rv1566c-444在制备结核疫苗中的应用；其中，所述结核分枝杆菌T细胞表位蛋白Rv1566c-444的氨基酸序列如SEQID NO.4所示，或为该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有相同免疫原性和相同抗原性的氨基酸序列。
第三方面，本发明提供一种结核分枝杆菌T细胞表位蛋白Rv1566c-444在制备治疗结核药物中的应用；其中，所述结核分枝杆菌T细胞表位蛋白Rv1566c-444的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，或为该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有相同免疫原性和相同抗原性的氨基酸序列。
本发明研究发现来自结核分枝杆菌的基因Rv1566c(RipD)所表达的T细胞表位蛋白在结核病的血清学诊断中有相当好的表现，经计算机软件对其进行预测共得到了29个人T细胞表位，作为潜在的免疫优势T抗原蛋白，Rv1566c在理论上具有良好的免疫原性。在Rv1566c中被预测出的29个人T细胞表位，可被分为六个表位集中区，在合成的相应六条表位集中区肽中仅肽段6(D6)在人群ELISPOT试验中产生阳性反应且肽段6在人群中的诊断灵敏度仅为5.8％。为了使Rv1566c更具免疫显性，本发明截取了Rv1566c中所有人T细胞表位并删除了冗余序列，形成的T细胞表位蛋白Rv1566c-444，其有希望取代Rv1566c发挥更好的免疫原性。本发明在对结核菌蛋白抗原及其表位充分分析、验证和比较研究的基础上最终获得了本发明方案。通过实验研究发现，本发明的T细胞表位蛋白Rv1566c-444具有相当于Rv1566c利用ELISPOT诊断活动性结核病的诊断性能，Rv1566c-444在人群中的灵敏度为44.44％，Rv1566c的诊断灵敏度为30.56％，T细胞表位蛋白Rv1566c-444大大提高了诊断的灵敏度，超过肽段6与Rv1566c。令人惊喜的是，Rv1566c-444还检测出了一个被T-SPOT.TB试剂盒误诊断为阴性的结核感染病例，将Rv1566c-444与T-SPOT.TB试剂盒提供的多肽(ESAT-6,CFP-10，Rv3615c)进行联合诊断时，可将T-SPOT.TB试剂盒的诊断灵敏度从94.44％提升至97.36％，而这一病例并未被Rv1566c检测出。除此之外，Rv1566c-444能够在小鼠体内引起明显强于Rv1566c的免疫反应。基于本发明的T细胞表位T细胞表位蛋白的检测试剂可广泛用于结核病的辅助诊断、抗结核新疫苗研发、流行病学监测与感染筛查等相关领域。
本发明中，编码所述结核分枝杆菌T细胞表位蛋白Rv1566c-444的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
基因Rv1566c-444n来自Rv1566c基因，包含Rv1566c基因中的所有29个人T细胞表位，基因Rv1566c序列含有693个碱基，基因Rv1566c-444n序列含有444个碱基。
第四方面，本发明提供一种结核诊断试剂，其包括结核分枝杆菌T细胞表位蛋白Rv1566c-444，或编码所述结核分枝杆菌T细胞表位蛋白Rv1566c-444的DNA分子，或由含有所述DNA分子的重组菌产生的重组蛋白；所述结核分枝杆菌T细胞表位蛋白Rv1566c-444的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，或为该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有相同免疫原性和相同抗原性的氨基酸序列，所述DNA分子的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
第五方面，本发明提供含有上述结核诊断试剂的结核特异伽马干扰素(IFN-γ)释放试验检测试剂盒。
本发明中，所述试剂盒中还含有：
①一抗：抗人或动物IFN-γ的小鼠IgG单克隆抗体；
②酶标试剂：辣根过氧化物酶标记的抗人或动物IFN-γ的IgG不同亚型单克隆抗体；
③标准品：含IFN-γ的阳性原料；
④培养板：含有PVDF膜或硝酸纤维素膜或酶联免疫反应的96孔微孔反应板，阳性对照孔中含有结核非特异性刺激抗原，阴性对照孔含有PBS或基底液。
第六方面，本发明提供一种结核疫苗，其包括有效成分和佐剂，所述有效成分包括结核分枝杆菌T细胞表位蛋白Rv1566c-444，或编码所述结核分枝杆菌T细胞表位蛋白Rv1566c-444的DNA分子，或由含有所述DNA分子的重组菌产生的重组蛋白；所述结核分枝杆菌T细胞表位蛋白Rv1566c-444的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，或为该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有相同免疫原性和相同抗原性的氨基酸序列，所述DNA分子的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
第七方面，本发明提供一种抗结核药物，其有效成分包括以结核分枝杆菌T细胞表位蛋白Rv1566c-444作为免疫原，辅以佐剂免疫实验动物，制备得到的多克隆抗体，或者以结核分枝杆菌T细胞表位蛋白Rv1566c-444作为免疫原，辅以佐剂免疫实验动物，采用杂交瘤技术或DNA重组技术，制备得到的识别所述结核分枝杆菌T细胞表位蛋白Rv1566c-444抗原的单克隆抗体，或者以结核分枝杆菌T细胞表位蛋白Rv1566c-444作为免疫原，辅以佐剂制备得到的治疗性生物制品；所述结核分枝杆菌T细胞表位蛋白Rv1566c-444的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，或为该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有相同免疫原性和相同抗原性的氨基酸序列。
本发明的有益效果至少在于：
本发明在使用来自相同的检测人群的外周血单个核细胞利用IGRA技术诊断是否感染的条件下，发现蛋白Rv1566c和/或其所包含的抗原T细胞表位T细胞表位蛋白Rv1566c-444均能成功诊断出结核感染，相比于T-SPOT.TB试剂盒，Rv1566c-444还检测出了一个被T-SPOT.TB试剂盒误诊断为阴性的结核感染病例，本发明提供了与以往试剂盒采用的抗原不同的T细胞表位蛋白抗原，与以往的检测手段相比，可减少因试剂盒固有抗原刺激T细胞造成的假阴性，从而提高检测灵敏度。
在使用相同的佐剂DDA与Poly I:C混合物免疫BALB/c小鼠进行免疫原性检测的条件下，蛋白Rv1566c免疫组能引起相当于Ag85B免疫组的细胞免疫反应，蛋白Rv1566c-444免疫组引起细胞免疫反应优于蛋白Rv1566c免疫组。
本发明利用原核表达系统表达纯化蛋白，适合大规模商业化生产，且成本较低。此外，本发明通过计算机软件预测了Rv1566c基因的人T细胞表位从而进一步选定了表位集中序列Rv1566c-444n，该序列表达的重组蛋白Rv1566c-444因为删除了原蛋白本身的冗余序列，而展现出了优于母本蛋白的诊断效果与在小鼠模型上所引起的细胞免疫反应，此举降低了全长蛋白合成的成本，克服了单抗原蛋白表位不够集中且存在冗余序列而造成的免疫原性不足的缺点。
本发明验证了Rv1566c和/或其所包含的T细胞表位蛋白Rv1566c-444可用于结核感染特异性检测，提供了一种抗原衍生的T细胞表位蛋白，并将这种T细胞表位蛋白应用于结核病例及健康志愿者的检测中。基于本发明的检测试剂可广泛用于结核病的辅助诊断、流行病学监测与感染筛查等相关领域并为抗结核新疫苗的研制提供了新的思路。
附图说明
图1为Rv1566c中的6个T细胞表位富集域分布。
图2为本发明重组蛋白Rv1566c-444和Rv1566c的纯化和表达的SDS-PAGE分析电泳图谱,M:预染彩色蛋白标准分子量,样品1为未诱导的转化大肠杆菌的pET32a-Rv1566c-444；样品2、3分别为经超声离心后的经诱导的pET32a-Rv1566c-444上清和沉淀物；样品4为纯化后的重组蛋白Rv1566c-444；样品5为未诱导的转化大肠杆菌的pET32a-Rv1566c；样品6、7分别为经超声离心后的经诱导的pET32a-Rv1566c上清和沉淀物；样品8为纯化后的重组蛋白Rv1566c。
图3为重组蛋白Rv1566c-444和Rv1566c在结核病患者和健康志愿者中的ELISPOT应答分析。其中，A是重组蛋白刺激受试者产生的效应T细胞散点图，B是重组蛋白的ROC曲线T-SPOT.TB代表T-SPOT.TB试剂盒，购自北京同生时代生物技术有限公司。
图4为Rv1566c-444、Rv1566c和Ag85B免疫BALB/c小鼠的血清IgG、IgG1和IgG2a亚型的测定。其中，A是各组总IgG、IgG1、IgG2a抗体滴度的比较结果，B是各组间的抗原IgG1/IgG2a比值的比较结果。
图5为免疫小鼠脾细胞释放的抗原特异性细胞因子水平。其中，A是IFN-γ细胞因子水平比较结果，B是IL-6细胞因子水平比较结果，C是IL-4细胞因子水平比较结果。Stimulated by代表刺激源，Immunized by代表免疫源，antigens/DP为抗原与DP佐剂的混合乳剂。
图6为免疫不同蛋白的小鼠脾脏中CD3+ CD4+ T细胞和CD3+ CD8+ T细胞的比例以及分泌不同细胞因子的CD4+或CD8+ T细胞的比例。其中，A是不同免疫组小鼠脾细胞中CD3+CD4+ T细胞和CD3+ CD8+ T细胞比例统计结果，B是CD4+ T细胞产生IFN-γ/TNF-α/IL-4的比例统计结果，C是CD8+ T细胞产生IFN-γ/TNF-α/IL-4的比例统计结果。
各图中(若相比较的两组间有具有统计学意义的差异)，*代表P<0.05，**代表P<0.01，***代表P<0.001，****代表P<0.0001。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
本发明利用计算机技术分析了结核分枝杆菌Rv1566c基因的人T细胞表位，并进一步选定了包含Rv1566c基因中的所有29个人T细胞表位的Rv1566c-444n。具体地说，本发明的技术方案是，利用计算机技术分析了Rv1566c基因的人T细胞表位，将29个T细胞表位分为了六个表位集中区，鉴定了表位多肽6的诊断效能,随后选取所有包含T细胞表位区序列，即Rv1566c-444n。以H37Rv基因组DNA为模板，采用聚合酶链反应(PCR)技术扩增Rv1566c基因的全序列和T细胞表位区序列Rv1566c-444n,经双酶切后分别连接到酶切后的pET-32a质粒，转化大肠杆菌BL21(DE3)，使用异丙基β-d-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导蛋白的表达。蛋白Rv1566c与Rv1566c-444经纯化后首先利用现有的T细胞γ干扰素释放试验技术对结核病例和健康志愿者体内结核感染特异性T细胞进行检测，从而评价该抗原与表位肽用于结核检测的灵敏度和特异性。随后使用蛋白Rv1566c与Rv1566c-444分别混合佐剂二甲基三十六烷基铵(DDA)与聚肌胞苷酸(Poly I:C)免疫BALB/c小鼠，进行蛋白的免疫原性检测。
实施例1 T细胞表位预测及富含T细胞表位序列的选择
结核分枝杆菌Rv1566c基因的序列来自美国国家生物技术信息中心(NCBI)，参见SEQ ID No.1，相应蛋白序列，参见SEQ ID No.2。T细胞表位预测软件TEpredict和IEDB-AR被用于预测Rv1566c基因中能与人HLA-A02超型等位基因(包括HLA-A*0201、*0202、*0203、*0206基序)结合的T细胞表位，在Rv1566c基因中共有29个人T细胞表位被预测出，可被分为六个表位集中区。本发明设计了一个包含于Rv1566c基因的保留所有29个T细胞表位的序列，该靶向DNA序列命名为Rv1566c-444n，参见SEQ ID No.3，位于Rv1566c基因的109～552核苷酸位置，对应的蛋白定义为Rv1566c-444，参见SEQ ID No.4。Rv1566c基因中的6个T细胞表位富集域分布参见图1。
实施例2 T细胞表位的验证
将Rv1566c的六个表位集中区基因序列送交上海生工生物技术有限公司合成相应的6个表位多肽，收集来自肺结核患者的外周血约20ml，分离外周血淋巴细胞，利用合成的6条多肽分别刺激来自10个肺结核患者的外周血淋巴细胞，使用购自北京金豪制药的结核分枝杆菌效应T细胞检测试剂盒(酶联免疫斑点法)依据说明书进行ELISPOT试验，若10个结果中有一个肺结核患者的ELISPOT结果依据试剂盒标准显示为阳性，则此条表位多肽确定为阳性人T细胞表位多肽。Rv1566c的六个表位多肽中的第六个多肽(图1中的D6)被确定为阳性人T细胞表位多肽。随后用51个肺结核患者和55个健康志愿者的血液样品进行ELISPOT实验，确定Rv1566c的T细胞表位多肽6在两种人群中的抗原性。
所涉及志愿者病例的筛选标准为：根据卫生部发布的《肺结核诊断标准》国家标准(WS288-2008)，临床表现症状、体征及胸部影像学检查诊断为肺结核的患者，或者经细菌学检查(痰涂片抗酸染色显微镜检查和/或罗氏固体培养基细菌固体培养)阳性或阴性的结核病患者；以及肺外结核(如骨结核、肾结核、肠结核、淋巴结核等)患者。健康志愿者的筛选标准：无结核临床症状、无结核病人密切接触史、无其他疾病或感染。入选的结核病患者和志愿者年龄在15-80岁之间，从到结核病室就诊的连续时间样本中随机选取。
Rv1566c的T细胞表位多肽6在人群中呈现的T细胞表位的诊断效能结果见表1。
表1
Figure BDA0003504799000000101
实施例3重组蛋白pET-32a-Rv1566c和pET-32a-Rv1566c-444的基因扩增、表达和纯化
以结核分枝杆菌H37Rv基因组DNA为模板，采用PCR技术扩增Rv1566c基因的全序列和表位区序列Rv1566c-444n。经EcoRI和hind酶切后分别连接到pET-32a质粒，转化大肠杆菌BL21(DE3)。在培养基中使用1mM异丙基β-d-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导蛋白的表达。37℃摇匀培养3.5h后，4℃(4000rpm,10min,4℃)离心收集细胞。用12％十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测Rv1566c和Rv1566c-444在大肠杆菌中的表达水平和形式，然后将包涵体蛋白使用8M尿素变性处理，用镍-次氮基三乙酸(Ni-NTA)层析纯化蛋白。然后使用低浓度尿素梯度透析，最后将透析液换为20mM Tris-HCL(pH 8.0)完成复性。最后用0.22μm过滤器无菌过滤，SDS-PAGE分析表明，Rv1566c-444和Rv1566c蛋白主要以包涵体蛋白的形式表达，分子量分别为约35kDa和45kDa，结果见图2。
实施例4抗原和/或其T细胞表位蛋白抗原应用于检测结核的ELISPOT检测试剂盒的开发
本发明的抗原及其T细胞表位肽可用于结核感染的检测，形成临床或实验室诊断用试剂盒。该试剂盒是基于双抗体夹心原理设计的，采用ELISPOT法检测抗原，实验过程为：PVDF膜上包被的一抗作为捕获抗体能够结合细胞上清中的IFN-γ，而IFN-γ又能被酶标二抗捕获、显色。两种抗体为识别IFN-γ不同抗原表位的单克隆抗体。
所述试剂盒基本组成如下：
1、实施例3制备的蛋白抗原Rv1566c/或实施例3合成的T细胞表位蛋白抗原Rv1566c-444；
2、一抗：抗人或动物IFN-γ的小鼠IgG单克隆抗体；
3、酶标试剂：辣根过氧化物酶标记的抗人或动物IFN-γ的IgG不同亚型单克隆抗体；
4、校准品：含IFN-γ的阳性原料；
5、培养板：含有PVDF膜或硝酸纤维素膜的96孔微孔反应板，阳性对照孔中含有结核非特异性刺激抗原(如PHA等)，阴性对照孔含有PBS或基底液。
6、其他ELISPOT检测所需的试剂及耗材。
实施例5蛋白抗原Rv1566c和/或T细胞表位蛋白抗原Rv1566c-444用于结核感染的临床检测
1.外周血淋巴细胞的分离：
本发明实施例所涉及志愿者病例的筛选标准见实施例2。
试验开始前，由试验者告知志愿者/结核病患者具体项目的目的、意义、试验流程及所需采集标本及其数量，经同意并签署知情同意书，由临床检验师对其进行采血。最终本项目共采集了36例结核病志愿者、44例健康志愿者的血液样本，采血时使用无内毒素的肝素抗凝真空采血管采集外周静脉血，每名志愿者采血约20ml。
1)样品于4小时内用Ficoll-Hypaque分离液分离PBMCs。
2)先将全血用RPMI-1640培养基1:1稀释混匀，在离心管中加入一定体积的分离液，将稀释后的血样平铺到分离液液面上方，保持两液面界面清晰，分离液、抗凝未经稀释全血、RPMI 1640培养基体积比为1:1:1，室温(18～26℃)，800g，离心20分钟。
3)离心结束后，管底是红细胞，中间层是分离液，最上层是血浆层，血浆层与分离液层之间是白色云雾状的单个核细胞(包括淋巴细胞和单核细胞)层。用吸管吸取白色云雾状细胞层并转移至15ml无菌离心管中，加入RPMI 1640培养基至10ml，室温条件下800g离心10分钟。
4)弃上清，重悬后加入7ml RPMI 1640培养基，700g离心10分钟。
5)弃上清加0.5ml AIM-V培养基重悬沉淀。
6)利用自动细胞计数仪对细胞计数，用AIM-V培养基配制500μL细胞浓度为2.5×106个/ml的细胞悬液。
2.抗原蛋白的准备
将实施例3中的抗原蛋白及T细胞表位蛋白抗原分别用含10％胎牛血清的RPIM1640培养基稀释至一定浓度后使用。
3.ELISPOT检测抗原特异性T细胞
使用实施例4的试剂盒，向预包被一抗的微孔板中加入以下试剂，每个病人分别设4个检测孔：阳性对照孔(加100μL植物血凝素PHA作为阳性刺激物)、阴性对照孔(加100μLPBS作为阴性对照)、检测孔(加100μL终浓度为20μg/ml的Rv1566c或Rv1566c-444)，每个孔中加入100μL上述稀释好的PBMC，使每孔中PBMC的数量达25万个，将抗原与PBMC细胞置于37℃，5％CO2的培养箱中培养20个小时。
4.洗板及结果判定
洗去PBMC细胞和抗原刺激物，加100μL一抗室温下孵育1小时，用PBS洗5遍，加二抗室温孵育1小时，再用PBS洗5遍，加底物避光显色7分钟后，用纯化水终止显色，将培养板放在通风口处晾干观察板上的斑点数。
实施例6 Rv1566c和/或Rv1566c-444用于诊断检测试剂盒的结果分析
使用蛋白Rv1566c和/或Rv1566c-444进行ELISPOT检测结核感染的诊断研究，其中共涉及经过严格按照标准筛选的结核病患者共计36例、健康志愿者44例，结果发现：
1、Rv1566c和/或Rv1566c-444在结核病患者中诱导的SFC均高于健康志愿者(P<0.05，P<0.01)，Rv1566c-444和Rv1566c在结核病患者中诱导的SFC无显著差异，结果见图3中的A；
2、Rv1566c的诊断灵敏度为30.56％，特异性为90.91％，当SFC>13时可诊断为结核病感染，蛋白Rv1566c-444的诊断灵敏度为44.44％，特异性为84.09％，当SFC>5时可诊断为结核病感染(阳性质控孔对照斑点数需≥20)，结果见图3中的B；
3、Rv1566c-444检测出了一个被T-SPOT.TB试剂盒误诊断为阴性的结核感染病例，将Rv1566c-444与T-SPOT.TB试剂盒提供的多肽(ESAT-6,CFP-10，Rv3615c)进行联合诊断时，可将T-SPOT.TB试剂盒的诊断灵敏度从94.44％提升至97.36％。
注：检测灵敏度表示为：(结核病患者检测阳性数/结核病患者总数)×100％；检测特异性表示为：(1-健康志愿者检测阳性数/健康志愿者总数)×100％。
实施例7使用小鼠模型免疫抗原的流程
特异性无病原体雌性BALB/c小鼠(6周龄)被用于免疫实验，小鼠共分为5组，每组6只。使用DDA和Poly I:C组成的DP混合液作为佐剂。DP混合佐剂被认为在接种BALB/c小鼠后可以诱导Th1/Th2混合免疫反应。使用Tris-HCl(pH 8.0)将DDA与poly I:C配置为终浓度为0.5mg/mL和2.5mg/mL的溶液，将50μL DDA与50μL poly I:C 1:1混匀，在100μL的DP混合液中乳化100μg抗原(Rv1566c-444、Rv1566c或本实验室纯化的Ag85B)制备疫苗。所有小鼠于第1、14、28天皮下接种该乳剂。阳性对照组小鼠用Ag85B免疫，阴性对照组小鼠给予Tris-HCl(pH 8.0)200μL或DP混合液200μL。第一次免疫后35天处死BALB/c小鼠，进行各项免疫检测评价抗原的免疫原性。
实施例8 Rv1566c和/或其T细胞表位蛋白Rv1566c-444的免疫原性检测
1、体液免疫原性检测：
A、血清的分离
将实施例7中免疫的小鼠眼球采血500μL，将血液置于37℃温箱中2小时，之后转入4℃冰箱中过夜。次日，将血液3000rpm离心5分钟后吸取上清。
B、血清抗体滴度ELISA检测
1)将酶标板用2μg/ml的Rv1566c-444或Rv1566c蛋白4℃过夜包被，次日，用PBST洗涤5遍。
2)用含2％BSA的PBS液37℃封闭2小时，用PBST洗涤5遍。
3)用PBS将各组血清按20000、40000、80000、160000、320000、640000、1280000、2560000倍稀释，每孔中加入100μL稀释后的血清，37℃孵育1小时后，用PBST洗5遍。
4)分别加入5000倍稀释的HRP标记的IgG、IgG1、IgG2a抗体，每孔100μL，37℃孵育1小时后，用PBST洗5遍。
5)加入TMB 37℃显色15分钟后，加入2M硫酸作为终止液。
6)酶标仪检测波长450nm的吸管光度值。
7)判断标准：OD≥2.1×OD(阴性对照)的判定为阳性。
2、细胞免疫原性检测：
A、ELISA法检测细胞因子IFN-γ、L-6、IL-4
1)将实施例7中免疫的小鼠处死后，在75％酒精中浸泡5分钟，将小鼠固定在超净台中的泡沫板上，剪开腹膜，分离出脾脏，将其置于装有1640培养基的平皿中。
2)在200目的尼龙网上，用注射器内芯轻轻研磨小鼠脾脏，将研磨的细胞通过滤网过滤。1000r/min离心5分钟弃上清，获得细胞。
3)将细胞轻轻振荡使其松动，按照2mL/只加入红细胞裂解液，混匀后，置于37℃温箱中孵育10分钟后，加入2倍体积于红细胞裂解液的1640培养基终止反应，1000r/min离心5分钟弃上清，获得脾细胞。
4)用1640培养基2ml/只重悬脾细胞，1000r/min离心5分钟弃上清，获得脾细胞。用细胞计数仪测定细胞浓度。
5)用含有10％FBS的1640培养基稀释脾细胞，使其浓度为2×106个/mL。每组取500μL脾细胞置于24孔培养板中，Tris-HCL组和DP佐剂组脾细胞分别用5μg/mL的Ag85B、Rv1566c-444和Rv1566c抗原刺激，Ag85B组用500μL 5μg/mL的Ag85B抗原孵育，Rv1566c组用500μL 5μg/mL的Rv1566c抗原孵育，Rv1566c-444组用500μL 5μg/mL的Rv1566c-444抗原孵育，每组加入500μL的无菌PBS和500μL浓度为5μg/mL的植物血凝素(PHA)作为阴性对照和阳性对照，每个检测孔都做2个重复。将脾细胞与相应的刺激物在37℃，5％CO2培养箱中孵育72小时后，收集细胞上清。
6)将IFN-γ单抗、IL-6单抗、IL-4单抗用碳酸包被液(pH＝9.6)，按照1:500倍稀释后，按100μL/孔加入到96微孔板中，4℃包被过夜。
7)用PBTS洗涤3遍后，拍干，加入10％FBS的PBS室温封闭1个小时。
8)用PBST洗涤5遍后，将IFN-γ、IL-6、IL-4的标准品按照对应的比例稀释成相应浓度，分别加入到每个ELISA板上，作为标准曲线。其余加入100μL需要检测的细胞上清，室温孵育2小时。
9)用PBST稀释5遍后，分别加入100μL IFN-γ、IL-6、IL-4各自的检测抗体+HRP标记的二抗，室温孵育1小时。
10)用PBST洗涤7遍后，加入TMB显色液100μL，室温孵育30分钟后，加入终止液50μL终止反应。
11)酶标仪测定波长450nm的吸光值，同时检测波长570nm的吸光值作为对照。
12)结果分析：根据细胞因子标准品制作标准曲线，然后将检测孔的OD值代入公式，计算每组小鼠各种细胞因子的终浓度。
B、流式细胞术分析细胞分型
1)将实施例7中免疫的小鼠按照上述ELISA法检测细胞因子的步骤1)-4)处理后，向细胞内加入主成分为莫能菌素的蛋白转运抑制剂(购自BD公司)并按上述步骤5)的描述进行蛋白刺激。
2)细胞在37℃5％CO2条件下培养8小时，用LIVE/DEAD Fixable DEAD Cell Stain染色，然后用anti-CD3、CD4和CD8进行表面染色。然后用抗IFN-γ、TNF-α和IL-4的抗体在细胞内染色。
3)4％多聚甲醛固定脾细胞，用流式细胞仪检测。
实施例9 Rv1566c和/或Rv1566c-444的免疫原性检测的结果分析
1、体液免疫原性检测结果分析：
Rv1566c，Rv1566c-444混合佐剂免疫小鼠后，使用ELISA法测定Rv1566c，Rv1566c-444的特异性血清IgG及IgG1、IgG2a亚型的效价与Ag85B特异性血清IgG及IgG1、IgG2a亚型的效价并进行比较。
结果表明，Rv1566c组与Ag85B组的IgG水平差异无统计学意义，但Rv1566c组的IgG1、IgG2a水平均高于Ag85B组,结果见图4中的A。Rv1566c-444、Rv1566c和Ag85B诱导的IgG1与IgG2a的比值无统计学差异,结果见图4中的B；
2、细胞免疫原性检测结果分析：
A、ELISA法检测Rv1566c、Rv1566c-444混合佐剂免疫小鼠的脾细胞经免疫抗原刺激后产生的th1型细胞因子IFN-γ、th2型细胞因子IL-4和IL-6水平并与Ag85B免疫组进行对比。
结果表明，与Rv1566c组和Ag85B组相比，Rv1566c-444免疫小鼠后，IFN-γ和IL-4的产量显著增加(P值均<0.01)，结果见图5中的A、C。Rv1566c组与Ag85B组的IFN-γ浓度无明显差异，结果见图5中的A。Rv1566c-444组IL-6分泌水平明显高于Rv1566c和Ag85B组(P值<0.0001)，结果见图5中的B。Rv1566c-444的IFN-γ/IL-4比值高于Rv1566c(25.61vs23.10,P<0.05)表明Rv1566c诱导的Th1反应与Ag85B相当，然而Rv1566c-444诱导的Th1反应强于Rv1566c；
B、使用流式细胞术对蛋白刺激的脾细胞进行分析，检测CD3+ CD4+ T细胞和CD3+CD8+ T细胞在脾细胞中的比例，以及分泌不同细胞因子的CD4+或CD8+ T细胞的比例。
结果表明，Rv1566c-444免疫组小鼠CD3+ CD4+ T细胞比例与Rv1566c组相似但显著高于Ag85B组(P<0.01)，结果见图6中的A；Rv1566c-444组的CD3+ CD8+ T细胞比例显著高于Rv1566c(P<0.001)和Ag85B组(P<0.05)，结果见图6中的A。与Ag85B和Rv1566c组相比，Rv1566c-444免疫小鼠中CD4+ TNF-α+ T细胞的比例显著升高(P<0.05,P<0.0001)，结果见图6中的B。在CD3+ CD8+ T细胞中，本发明发现Rv1566c-444组CD8+ T细胞表达IFN-γ的比例与Rv1566c组相似但显著低于Ag85B组(P<0.05)；Rv1566c-444组CD8+ T细胞表达IL-4的百分比低于Rv1566c组(P<0.05)与Ag85B组(P<0.01)，结果见图6中的C。Rv1566c诱导的细胞反应与Ag85B相当，然而Rv1566c-444诱导的细胞反应强于Rv1566c。
上述结果证明，蛋白Rv1566c和/或Rv1566c-444均能成功诊断出结核感染，Rv1566c-444与T-SPOT.TB试剂盒联用时还可以提高诊断的灵敏度；在用做免疫抗原时，蛋白Rv1566c免疫组能引起相当于Ag85B免疫组的细胞免疫反应，蛋白Rv1566c-444免疫组引起的细胞免疫反应优于蛋白Rv1566c免疫组。
综上所述，结核分枝杆菌蛋白抗原Rv1566c的T细胞表位蛋白抗原Rv1566c-444可以作为补充诊断试剂用于结核病的诊断检测，且Rv1566c和/或其T细胞表位蛋白Rv1566c-444均具有良好的免疫原性，能引起机体强烈的细胞免疫应答和体液免疫应答，为免疫优势抗原。相对于Rv1566c，其所包含的T细胞表位蛋白Rv1566c-444的序列更短，同时克服了单抗原因蛋白表位不够集中且存在冗余序列而造成的免疫原性不足的缺点，表现出了更强的免疫原性，可以用于结核疫苗的构建和制备。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110> 中国疾病预防控制中心传染病预防控制所
<120> 一种结核分枝杆菌T细胞表位蛋白Rv1566c-444的应用
<130> KHP221110480.9
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 693
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atgaaacgca gcatgaaaag cggctccttc gcgatcggtc tggcaatgat gctcgccccg 60
atggtggccg cgcccggtct tgcggccgca gacccggcca cgcggccggt ggattatcaa 120
cagatcaccg acgtcgtgat cgcgcgcggg ctgtcgcagc gcggcgtgcc gttctcctgg 180
gccggcggcg gcatcagcgg ccccacgcgc ggcaccggta ccggcatcaa caccgtcggg 240
ttcgacgcct ccggtttgat ccagtacgcc tatgccggtg ccgggctaaa gctgccgcgt 300
tcttccggcc agatgtacaa ggttgggcaa aaggtcctgc cgcagcaagc gcgcaagggc 360
gacctgatct tctacggccc cgaaggcacg caaagcgtcg cgttatacct cgggaagggc 420
cagatgctgg aggtgggcga cgtcgtccag gtttcgccgg tgcgcaccaa cggcatgacg 480
ccttacctgg tccgggttct cgggacccag ccgacgcccg tccaacaggc gccggtccag 540
ccagcgccgg tccagcaagc gcccgtccag caagcgcccg tccaacaggc gcccgtccaa 600
caggcgccgg tccaacaggc gccggtccag caagcgcccg tccagcaagc gcccgtccag 660
ccgcctccct tcggcaccgc gcgctcacgc taa 693
<210> 2
<211> 230
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Met Lys Arg Ser Met Lys Ser Gly Ser Phe Ala Ile Gly Leu Ala Met
1 5 10 15
Met Leu Ala Pro Met Val Ala Ala Pro Gly Leu Ala Ala Ala Asp Pro
20 25 30
Ala Thr Arg Pro Val Asp Tyr Gln Gln Ile Thr Asp Val Val Ile Ala
35 40 45
Arg Gly Leu Ser Gln Arg Gly Val Pro Phe Ser Trp Ala Gly Gly Gly
50 55 60
Ile Ser Gly Pro Thr Arg Gly Thr Gly Thr Gly Ile Asn Thr Val Gly
65 70 75 80
Phe Asp Ala Ser Gly Leu Ile Gln Tyr Ala Tyr Ala Gly Ala Gly Leu
85 90 95
Lys Leu Pro Arg Ser Ser Gly Gln Met Tyr Lys Val Gly Gln Lys Val
100 105 110
Leu Pro Gln Gln Ala Arg Lys Gly Asp Leu Ile Phe Tyr Gly Pro Glu
115 120 125
Gly Thr Gln Ser Val Ala Leu Tyr Leu Gly Lys Gly Gln Met Leu Glu
130 135 140
Val Gly Asp Val Val Gln Val Ser Pro Val Arg Thr Asn Gly Met Thr
145 150 155 160
Pro Tyr Leu Val Arg Val Leu Gly Thr Gln Pro Thr Pro Val Gln Gln
165 170 175
Ala Pro Val Gln Pro Ala Pro Val Gln Gln Ala Pro Val Gln Gln Ala
180 185 190
Pro Val Gln Gln Ala Pro Val Gln Gln Ala Pro Val Gln Gln Ala Pro
195 200 205
Val Gln Gln Ala Pro Val Gln Gln Ala Pro Val Gln Pro Pro Pro Phe
210 215 220
Gly Thr Ala Arg Ser Arg
225 230
<210> 3
<211> 444
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gtggattatc aacagatcac cgacgtcgtg atcgcgcgcg ggctgtcgca gcgcggcgtg 60
ccgttctcct gggccggcgg cggcatcagc ggccccacgc gcggcaccgg taccggcatc 120
aacaccgtcg ggttcgacgc ctccggtttg atccagtacg cctatgccgg tgccgggcta 180
aagctgccgc gttcttccgg ccagatgtac aaggttgggc aaaaggtcct gccgcagcaa 240
gcgcgcaagg gcgacctgat cttctacggc cccgaaggca cgcaaagcgt cgcgttatac 300
ctcgggaagg gccagatgct ggaggtgggc gacgtcgtcc aggtttcgcc ggtgcgcacc 360
aacggcatga cgccttacct ggtccgggtt ctcgggaccc agccgacgcc cgtccaacag 420
gcgccggtcc agccagcgcc ggtc 444
<210> 4
<211> 148
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Val Asp Tyr Gln Gln Ile Thr Asp Val Val Ile Ala Arg Gly Leu Ser
1 5 10 15
Gln Arg Gly Val Pro Phe Ser Trp Ala Gly Gly Gly Ile Ser Gly Pro
20 25 30
Thr Arg Gly Thr Gly Thr Gly Ile Asn Thr Val Gly Phe Asp Ala Ser
35 40 45
Gly Leu Ile Gln Tyr Ala Tyr Ala Gly Ala Gly Leu Lys Leu Pro Arg
50 55 60
Ser Ser Gly Gln Met Tyr Lys Val Gly Gln Lys Val Leu Pro Gln Gln
65 70 75 80
Ala Arg Lys Gly Asp Leu Ile Phe Tyr Gly Pro Glu Gly Thr Gln Ser
85 90 95
Val Ala Leu Tyr Leu Gly Lys Gly Gln Met Leu Glu Val Gly Asp Val
100 105 110
Val Gln Val Ser Pro Val Arg Thr Asn Gly Met Thr Pro Tyr Leu Val
115 120 125
Arg Val Leu Gly Thr Gln Pro Thr Pro Val Gln Gln Ala Pro Val Gln
130 135 140
Pro Ala Pro Val
145

Claims (9)

1.一种结核分枝杆菌T细胞表位蛋白Rv1566c-444在制备结核检测试剂中的应用；其中，所述结核分枝杆菌T细胞表位蛋白Rv1566c-444的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，或为该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有相同免疫原性和相同抗原性的氨基酸序列。
2.一种结核分枝杆菌T细胞表位蛋白Rv1566c-444在制备结核疫苗中的应用；其中，所述结核分枝杆菌T细胞表位蛋白Rv1566c-444的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，或为该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有相同免疫原性和相同抗原性的氨基酸序列。
3.一种结核分枝杆菌T细胞表位蛋白Rv1566c-444在制备治疗结核药物中的应用；其中，所述结核分枝杆菌T细胞表位蛋白Rv1566c-444的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，或为该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有相同免疫原性和相同抗原性的氨基酸序列。
4.根据权利要求1-3任一项所述的应用，其特征在于，编码所述结核分枝杆菌T细胞表位蛋白Rv1566c-444的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
5.一种结核诊断试剂，其特征在于，包括结核分枝杆菌T细胞表位蛋白Rv1566c-444，或编码所述结核分枝杆菌T细胞表位蛋白Rv1566c-444的DNA分子，或由含有所述DNA分子的重组菌产生的重组蛋白；所述结核分枝杆菌T细胞表位蛋白Rv1566c-444的氨基酸序列如SEQID NO.4所示，或为该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有相同免疫原性和相同抗原性的氨基酸序列，所述DNA分子的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
6.含有权利要求5所述的结核诊断试剂的结核特异伽马干扰素释放试验检测试剂盒。
7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还含有：
①一抗：抗人或动物IFN-γ的小鼠IgG单克隆抗体；
②酶标试剂：辣根过氧化物酶标记的抗人或动物IFN-γ的IgG不同亚型单克隆抗体；
③标准品：含IFN-γ的阳性原料；
④培养板：含有PVDF膜或硝酸纤维素膜或酶联免疫反应的96孔微孔反应板，阳性对照孔中含有结核非特异性刺激抗原，阴性对照孔含有PBS或基底液。
8.一种结核疫苗，其特征在于，包括有效成分和佐剂，所述有效成分包括结核分枝杆菌T细胞表位蛋白Rv1566c-444，或编码所述结核分枝杆菌T细胞表位蛋白Rv1566c-444的DNA分子，或由含有所述DNA分子的重组菌产生的重组蛋白；所述结核分枝杆菌T细胞表位蛋白Rv1566c-444的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，或为该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有相同免疫原性和相同抗原性的氨基酸序列，所述DNA分子的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
9.一种抗结核药物，其特征在于，其有效成分包括以结核分枝杆菌T细胞表位蛋白Rv1566c-444作为免疫原，辅以佐剂免疫实验动物，制备得到的多克隆抗体，或者以结核分枝杆菌T细胞表位蛋白Rv1566c-444作为免疫原，辅以佐剂免疫实验动物，采用杂交瘤技术或DNA重组技术，制备得到的识别所述结核分枝杆菌T细胞表位蛋白Rv1566c-444抗原的单克隆抗体，或者以结核分枝杆菌T细胞表位蛋白Rv1566c-444作为免疫原，辅以佐剂制备得到的治疗性生物制品；所述结核分枝杆菌T细胞表位蛋白Rv1566c-444的氨基酸序列如SEQID NO.4所示，或为该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有相同免疫原性和相同抗原性的氨基酸序列。
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