CN115184603B - EspC蛋白在制备结核分枝杆菌分离或富集产品中的应用 - Google Patents

EspC蛋白在制备结核分枝杆菌分离或富集产品中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了EspC蛋白在制备结核分枝杆菌分离或富集产品中的应用，涉及结核病检测技术领域。该应用中，通过EspC蛋白和结核分枝杆菌的固有蛋白结合实现；固有蛋白为Rv0577蛋白、Rv2293蛋白、Rv0497c蛋白和Rv0183蛋白中的至少一种。基于蛋白互作的原理，可以用于开发结核分枝杆菌检测产品。

Description

EspC蛋白在制备结核分枝杆菌分离或富集产品中的应用
技术领域
本发明涉及结核病检测技术领域，具体而言，涉及EspC蛋白在制备结核分枝杆菌分离或富集产品中的应用。
背景技术
结核病是一种严重危害人类健康的慢性传染病。据世界卫生组织报道，目前全球大约有20亿人感染结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)，2020年全球新发结核病987万例，发病率未127/10万。为实现世卫组织2035年“终止结核病”的宏伟目标，迫切需要开发出灵敏度高、准确性高、报告结果时间短且经济的结核病诊断工具。
结核分枝杆菌感染与发病机制是国内外结核病领域研究热点，阐明结核病感染的发生与发展过程，对于控制结核病的传播、减少感染者发病，以及提高治疗水平都具有重要意义。结核分枝杆菌VII型分泌系统(T7SS)ESX-1在结核杆菌发病过程中扮演着重要角色，其通过转位效应蛋白ESA-6(EsxA)和CFP-10(EsxB)侵袭宿主巨噬细胞进而引发结核分枝杆菌的侵袭和播散。其中，分泌蛋白EspC分布在结核分枝杆菌的多组分中，包括细菌培养的滤液上清、细胞膜和胞质，并参与毒力和效应蛋白ESA-6(EsxA)和CFP-10(EsxB)分泌。因此，EspC具有潜在的与结核分枝杆菌中不同定位蛋白相互作用的潜力，可以用来分离和富集结核分枝杆菌蛋白，有望成为结核分枝杆菌诊断的靶点。
鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供EspC蛋白在制备结核分枝杆菌分离或富集产品中的应用以解决上述技术问题。
本发明是这样实现的：
本发明提供了EspC蛋白在制备结核分枝杆菌分离产品或结核分支杆菌富集产品中的应用，该应用中，通过EspC蛋白和结核分枝杆菌的固有蛋白结合实现；
固有蛋白为Rv0577蛋白、Rv2293蛋白、Rv0497c蛋白和Rv0183蛋白中的至少一种。
Rv0577蛋白、Rv2293蛋白、Rv0497c是结核分枝杆菌的固有蛋白，发明人基于结核分枝杆菌蛋白质组芯片的蛋白-蛋白互作实验筛选和鉴定出与EspC蛋白互作的结核蛋白。结果表明，EspC蛋白可与Rv0577蛋白、Rv2293蛋白、Rv0497c、Rv0183蛋白中的任一个结合，即EspC蛋白可与Rv0577蛋白、Rv2293蛋白、Rv0497c、Rv0183蛋白中的任一种蛋白发生相互作用，从而可以用于结合或捕获其中的任一个蛋白。
利用EspC蛋白和结核分枝杆菌的固有蛋白结合原理，可以开发结核分枝杆菌的分离产品或富集产品。
例如，结核分枝杆菌分离产品包括不限于结核分枝杆菌分离试剂、试剂盒、分离柱、分离芯片、分离试纸条、分离磁珠或分离膜。
在一种可选的实施方式中，在固相载体上包覆EspC蛋白，然后将待分离菌株上固相载体，待分离菌株若含有结核分枝杆菌，则结核分枝杆菌可通过固有蛋白与固相载体上的EspC蛋白结合，从而分离出。
在一种可选的实施方式中，在固相载体上包覆Rv0577蛋白、Rv2293蛋白、Rv0497c蛋白、Rv0183蛋白中的至少一种，然后将待分离菌株上固相载体，待分离菌株若含有结核分枝杆菌，基于EspC蛋白分布于结核分枝杆菌的细胞膜和胞质，可通过EspC蛋白与固相载体上的Rv0577蛋白、Rv2293蛋白、Rv0497c蛋白或Rv0183蛋白结合，从而分离出。
同样地，也可采用上述方式进行结核分枝杆菌的富集。
EspC蛋白和上述四种固有蛋白的氨基酸序列可以通过NCBI等现有的数据库查询获得。
在本发明应用较佳的实施方式中，EspC蛋白在制备结核分枝杆菌检测产品中的应用，该应用中，通过EspC蛋白对待测样本的总蛋白进行分离和/或富集，然后检测分离和/或富集产物中是否含有固有蛋白；
或，该应用中，通过固有蛋白对待测样本的总蛋白进行分离和/或富集，然后检测分离和/或富集产物中是否含有EspC蛋白；
固有蛋白为Rv0577蛋白、Rv2293蛋白、Rv0497c蛋白和Rv0183蛋白中的至少一种。
上述蛋白均可与EspC蛋白发生相关作用。通过检测待检标本中固有蛋白之中的任一蛋白即可鉴定病原菌-结核分枝杆菌的存在，因此可以借此来实现对结核感染或结核病的快速诊断。
也可以以固有蛋白对待测总蛋白进行分离和/或富集，然后检测分离和/或富集产物中是否含有EspC蛋白，从而鉴定病原菌-结核分枝杆菌的存在。
在本发明应用较佳的实施方式中，结核分枝杆菌检测产品包括不限于检测试剂、检测试剂盒、检测试纸条、ELISA板或检测芯片。
相应地，在检测试剂、试剂盒中添加相应的辅料或助剂也在本发明的保护范围之内，例如添加保护剂以延长使用有效期限，添加助溶剂和稳定剂等成分以分别起到助溶和稳定蛋白成分的作用。
而为了更好的结合到ELISA板或检测芯片，在ELISA板或检测芯片表面预处理修饰上容易结合蛋白的活性基团也在本发明的保护范围之内。
本发明还提供了EspC蛋白在制备结核疫苗或抗结核药物中的应用，该应用中，通过EspC蛋白和结核分枝杆菌的固有蛋白结合实现；固有蛋白为Rv0577蛋白、Rv2293蛋白、Rv0497c蛋白和Rv0183蛋白中的至少一种。
在本发明应用较佳的实施方式中，上述EspC蛋白为(1)或(2)：
(1)SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
(2)在SEQ ID NO：1所示的蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质。
SEQ ID NO：1序列如下所示：
MTENLTVQPERLGVLASHHDNAAVDASSGVEAAAGLGESVAITHGPYCSQFNDTLNVYLTAHNALGSSLHTAGVDLAKSLRIAAKIYSEADEAWRKAIDGLFT。
标签例如选自His标签、Epitope tags、Protease cleavage sites、Destabilizing domains、Detectiontags、Purification tags、Signal peptides、Cell-penetrating peptides、Fluorescentgenes、Linkers、Regulatory proteins、CAR-Tproteins等。
编码EspC蛋白的核酸分子在制备结核分枝杆菌分离试剂、结核分枝杆菌富集试剂、结核分枝杆菌检测试剂、结核疫苗和抗结核药物中至少一种的应用；
编码EspC蛋白的核酸分子为SEQ ID NO：2所示的DNA分子。
SEQ ID NO：2如下所示：
atgacggaaaacttgaccgtccagcccgagcgtctcggtgtactggcgtcgcaccatgacaacgcggcggtcgatgcctcctcgggcgtcgaagctgccgctggcctaggcgaatctgtggcgatcactcacggtccgtactgctcacagttcaacgacacgttaaatgtgtacttgactgcccacaatgccctgggctcgtccttgcatacggccggtgtcgatctcgccaaaagtcttcgaattgcggcgaagatatatagcgaggccgacgaagcgtggcgcaaggctatcgacgggttgtttacctga。
上述结核分枝杆菌检测试剂包括不限于根据编码EspC蛋白的核酸分子开发相应的检测引物、探针、靶向序列等。
本发明还提供了一种分离和/或富集结核分枝杆菌的方法，通过EspC蛋白和结核分枝杆菌固有蛋白结合实现；
结核分枝杆菌固有蛋白为Rv0577蛋白、Rv2293蛋白、Rv0497c蛋白和Rv0183蛋白中的至少一种。
本发明还提供了一种检测待测样本是否存在结核分枝杆菌的方法，包括如下步骤：
(1)取待测样本的总蛋白，采用EspC蛋白进行分离和/或富集；
(2)完成步骤(1)后，进行如下判断：如果分离和/或富集的产物含有固有蛋白，则待测样本存在结核分枝杆菌；如果分离和/或富集的产物不含有固有蛋白，则待测样本不存在结核分枝杆菌；
结核分枝杆菌固有蛋白为Rv0577蛋白、Rv2293蛋白、Rv0497c蛋白和Rv0183蛋白中的至少一种；上述方法用于非疾病的诊断。例如针对环境样本、法医鉴定、死亡的动物体等。
上述应用，分离和/或富集结核分枝杆菌的方法，或检测待测样本是否存在结核分枝杆菌的方法中，Rv0577蛋白为SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
Rv2293蛋白为SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
Rv0497c蛋白为SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
Rv0183蛋白为SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列组成的蛋白质。
在其他实施方式中，针对上述SEQ ID NO：1以及SEQ ID NO：3-6序列经缺失、替换或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列也是本领域的技术人员容易想到的。
本发明具有以下有益效果：
本发明基于结核分枝杆菌蛋白质组芯片的蛋白-蛋白互作实验筛选和鉴定出与EspC蛋白互作的结核蛋白。结果表明，EspC蛋白可与Rv0577蛋白、Rv2293蛋白、Rv0497c、Rv0183蛋白中的任一个结合，即EspC蛋白可与Rv0577蛋白、Rv2293蛋白、Rv0497c、Rv0183蛋白中的任一种蛋白发生相互作用，从而可以用于结合或捕获其中的任一个蛋白。
此外，基于EspC蛋白可与Rv0577蛋白、Rv2293蛋白、Rv0497c、Rv0183蛋白互作的机理，可以用于开发结核分枝杆菌检测产品。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为纯化后重组EspC蛋白的SDS-PAGE结果图(B3，B2，B1，C2和C1分别为离子交换柱子洗脱下来在24孔板的位置编号)；
图2为技术路线图；
图3为重组EspC蛋白的BCA定量结果图；
图4为芯片结果展示图；
图5为Espc互作阳性蛋白的芯片扫描图。
具体实施方式
现将详细地提供本发明实施方式的参考，其一个或多个实例描述于下文。提供每一实例作为解释而非限制本发明。实际上，对本领域技术人员而言，显而易见的是，可以对本发明进行多种修改和变化而不背离本发明的范围或精神。例如，作为一个实施方式的部分而说明或描述的特征可以用于另一实施方式中，来产生更进一步的实施方式。
除非另外指明，否则实践本发明将采用细胞生物学、分子生物学(包含重组技术)、微生物学、生物化学和免疫学的常规技术，所述常规技术在本领域技术人员的能力范围内。文献中充分解释了这种技术，如《分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning:ALaboratory Manual)》，第二版(Sambrook等人，1989)；《寡核苷酸合成(OligonucleotideSynthesis)》(M.J.Gait编，1984)；《动物细胞培养(Animal Cell Culture)》(R.I.Freshney编，1987)；《酶学方法(Methods in Enzymology)》(学术出版社有限公司(Academic Press，Inc.)；《实验免疫学手册(Handbook of Experimental Immunology)》(D.M.Weir和C.C.Blackwell编)；《哺乳动物细胞用基因转移载体(Gene Transfer Vectors forMammalian Cells)》(J.M.Miller和M.P.Calos编，1987)；《当代分子生物学方法(CurrentProtocols in Molecular Biology)》(F.M.Ausubel等人编，1987)；《PCR:聚合酶链反应(PCR:The Polymerase Chain Reaction)》(Mullis等人编，1994)；以及《当代免疫学方法(Current Protocols in Immunology)》(J.E.Coligan等人编，1991)，所述文献中的每个文献均通过引用明确并入本文中。
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1
本实施例进行重组蛋白EspC的表达和纯化
(1)重组质粒pET24b-EspC的构建
EspC蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。编码EspC蛋白的基因(即EspC基因)的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。将pET24b载体的限制性内切酶Nde I和Xho I之间的DNA小片段替换为SEQ ID NO：1所示的DNA分子，并在3’端加入His-tag标签(由6个组氨酸残基组成)得到重组质粒pET24b-EspC，表达具有His-tag标签的融合蛋白，即重组蛋白EspC。
(2)重组蛋白EspC的表达
将重组质粒pET24b-EspC转化大肠杆菌BL21(DE3)，得到重组菌，将该重组菌命名为BL21/pET24b-EspC。
将重组菌BL21/pET24b-EspC以1：50转接到20mL卡那霉素抗性LB培养基中，37℃，200rpm，过夜培养。
于次日，以1：100比例转接到1L卡那霉素抗性LB培养基中，待细菌OD600到0.8-1.0，加入终浓度为0.5mMIPTG，于16℃诱导16-18小时，5000rpm,20min离心收集菌体沉淀。
(3)重组蛋白的纯化
1、镍柱亲和层析
①.每1L菌液最终用80mL蛋白纯化缓冲液重悬，加入1％PMSF混匀。
②.超声破碎，功率200W，工作5s，间歇3s，共15min。全程冰上进行，直至菌液变得澄清。
③.超声后菌液转移至50mL离心管，12000rpm，4℃离心80min。蛋白上清转移至新的50mL离心管中，放于冰上备用。
④.将上述裂解后蛋白加入镍柱中，中间留样。
⑤.冲洗杂蛋白，用20CV蛋白洗涤缓冲液(30mM咪唑)冲洗杂蛋白，中间留样。
⑥.洗脱蛋白：用梯度浓度的咪唑缓冲液(60mM，100mM，300mM)各10CV洗脱目的蛋白。
2、离子交换层析
①.离子交换层析的平衡：先用高盐缓冲液冲洗离子交换柱，目的是去除柱子上结合的杂蛋白，直到电导为80％～90％后，改用低浓度盐缓冲液平衡离子交换住，当电导达到10％后，开始蛋白上样。
②.重组蛋白的上样与洗脱：选择阴离子交换Q柱，采用低盐缓冲液上样，然后逐渐提高盐浓度洗脱。高盐缓冲液梯度范围为20％～80％，洗脱体积为25-30CV。
③.收集UV280峰对应的各个蛋白：从96孔收集板中取10μL样本，加入2μL 5×蛋白上样缓冲液，100℃加热金属浴5min后，进行SDS-PAGE蛋白凝胶电泳以及考马斯亮蓝染色及脱色，根据蛋白凝胶上蛋白条带位置确定样本收集范围。
④.选择上述目的蛋白条带位置，加入3Kd浓缩管进行离心浓缩。纯化后重组EspC蛋白的SDS-PAGE结果见图1。
实施例2
本实施例基于MTB结核分枝杆菌蛋白质组芯片的蛋白-蛋白互作实验筛选和鉴定与EspC蛋白互作的结核蛋白。
MtbProtTM结核分枝杆菌蛋白质组芯片：上海晶诺生物科技有限公司。包含4262个结核分枝杆菌重组蛋白质，包括结核分枝杆菌标准株H37Rv基因编码的3829个蛋白质和结核分枝杆菌致病菌CDC1551基因编码的433个蛋白质，整体覆盖率高达91％。是目前世界上第一张结核分枝杆菌蛋白质组芯片。该芯片适用于全局性地进行蛋白-蛋白互作、蛋白-核酸互作、蛋白-小分子互作以及蛋白翻译后修饰研究，同时适用于系统性地发现血清中自身抗体并用于诊断或其它表征的标志物的研究。
1、技术路线
每一个样品使用1张MtbProtTM结核分枝杆菌蛋白质组芯片进行检测。样品与固定于芯片上的蛋白进行结合，并通过清洗去除未结合的样本。由于样本标记Cy3(CyDyeProtein LabellingCY3MONO5-PACK，GE，PA23001)，故可以直接通过芯片扫描仪进行信号解读。信号的强弱与亲和力、数量呈正相关，技术路线流程图如图2所示。
2、样本基本信息
如下表1所示。
表1 样本基本信息
实验进行三个生物学重复，步骤如下：
3、蛋白样本检测
①.蛋白冻融：蛋白冻融离心后观察管底有无沉淀(参照图3中的A所示)；
②.浓度测定：BCA法；R2值为0.99，由此计算得出蛋白的浓度为480μg/mL；(结果参照图3中的B所示)
③.样本条带检测：SDS-PAGE检测；分子量约在10～15kD之间；根据灰度值估算，纯度约为85.9％(参照图3中的C所示)；可以满足后续的蛋白芯片的筛选要求。
4、样本标记及检测
标记：根据试剂盒CyDye Protein LabellingCY3 MONO 5-PACK，GE，PA23001说明，使用Cy3荧光素标记样本；Dot blot检测样本荧光标记效果。
5、芯片实验
①.封闭：将芯片从-80℃取出，加入封闭液，置于侧摆摇床，4℃，3hr；
②.样本孵育：弃尽封闭液，迅速加入样本孵育液(终浓度为5μg/mL)，置于侧摆摇床，4℃过夜孵育(从此步骤开始，注意避光操作)；
③.清洗：置于水平摇床，清洗液室温清洗3次，5min/次，完成后用超纯水，室温清洗2次，5min/次；
④.干燥；
⑤.扫描：按照扫描仪的操作规范和使用说明操作；用InnoScan 900扫描仪在532nm波长下进行芯片扫描(Cy3在532nm激发光下显示为红光)，获得芯片数据。
⑥.数据提取：通过GenePix Pro v6.0软件获取原始数据。数据读取结果见图4。以SNR>2,定于为阳性蛋白。与重组EspC互作的阳性蛋白见表2。
表2 与重组EspC互作的阳性蛋白
结果如图4所示。由图可知：除阴性对照和阳性对照点外，EspC与结核分枝杆菌蛋白质组芯片杂交后有阳性信号点，表明筛查到对应的互作蛋白。左图为芯片全局扫描图，右图为芯片局部(Block 23)放大图；红色箭头为阳性对照点(Cy3-BSA)，黄色箭头(位于红色箭头上方)为阳性点。
与Espc互作阳性蛋白的芯片扫描图参照图5所示，由此可见
6、数据分析
对所提取出的芯片数据通过以下逻辑进行分析：
(1)为消除同一张芯片内不同蛋白点之间由于背景值不一致导致的信号不均一的情况，故通过背景归一化方法进行处理。实现方式为每个蛋白的前景值与背景值比值，即F/B，并此基础上定义SNR(信噪比)，即两个重复蛋白的F/B的均值；
(2)对于不同芯片，为消除不同实验样本及实验操作带来的系统性误差，故在数据比对前对SNR进行Z-score标准化处理；
(3)对归一化后数据，设置阳性cutoff阈值，通过阈值分别计算EspC芯片上的阳性点个数；定义cutoff＝2，即归一化后mean+2SD(此值是根据芯片结果设定，非标准值)。在此标准下，筛选潜在的阳性蛋白，其中EspC芯片上阳性点个数4个，即结核蛋白Rv0577、Rv2293、Rv0497c和Rv0183。
其中重要的参数解释如下：
Block,column,Row：分别指阵列，列，行的编号，即位置。
Name,ID：蛋白质名称或基因名称。
F532Median：532nm通道下的信号前景值的中位数值，指每个信号点对应所有的像素点的强度中位值，用以表示信号强度。
B532Median：532nm通道下的背景值的中位数值，指每个信号点周围背景一定范围内的像素点的强度中位值，用以表示背景值。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 首都医科大学附属北京胸科医院 北京市结核病胸部肿瘤研究所
<120> EspC蛋白在制备结核分枝杆菌分离或富集产品中的应用
<160> 6
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 103
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 1
Met Thr Glu Asn Leu Thr Val Gln Pro Glu Arg Leu Gly Val Leu Ala
1 5 10 15
Ser His His Asp Asn Ala Ala Val Asp Ala Ser Ser Gly Val Glu Ala
20 25 30
Ala Ala Gly Leu Gly Glu Ser Val Ala Ile Thr His Gly Pro Tyr Cys
35 40 45
Ser Gln Phe Asn Asp Thr Leu Asn Val Tyr Leu Thr Ala His Asn Ala
50 55 60
Leu Gly Ser Ser Leu His Thr Ala Gly Val Asp Leu Ala Lys Ser Leu
65 70 75 80
Arg Ile Ala Ala Lys Ile Tyr Ser Glu Ala Asp Glu Ala Trp Arg Lys
85 90 95
Ala Ile Asp Gly Leu Phe Thr
100
<210> 2
<211> 312
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
atgacggaaa acttgaccgt ccagcccgag cgtctcggtg tactggcgtc gcaccatgac 60
aacgcggcgg tcgatgcctc ctcgggcgtc gaagctgccg ctggcctagg cgaatctgtg 120
gcgatcactc acggtccgta ctgctcacag ttcaacgaca cgttaaatgt gtacttgact 180
gcccacaatg ccctgggctc gtccttgcat acggccggtg tcgatctcgc caaaagtctt 240
cgaattgcgg cgaagatata tagcgaggcc gacgaagcgt ggcgcaaggc tatcgacggg 300
ttgtttacct ga 312
<210> 3
<211> 261
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 3
Met Pro Lys Arg Ser Glu Tyr Arg Gln Gly Thr Pro Asn Trp Val Asp
1 5 10 15
Leu Gln Thr Thr Asp Gln Ser Ala Ala Lys Lys Phe Tyr Thr Ser Leu
20 25 30
Phe Gly Trp Gly Tyr Asp Asp Asn Pro Val Pro Gly Gly Gly Gly Val
35 40 45
Tyr Ser Met Ala Thr Leu Asn Gly Glu Ala Val Ala Ala Ile Ala Pro
50 55 60
Met Pro Pro Gly Ala Pro Glu Gly Met Pro Pro Ile Trp Asn Thr Tyr
65 70 75 80
Ile Ala Val Asp Asp Val Asp Ala Val Val Asp Lys Val Val Pro Gly
85 90 95
Gly Gly Gln Val Met Met Pro Ala Phe Asp Ile Gly Asp Ala Gly Arg
100 105 110
Met Ser Phe Ile Thr Asp Pro Thr Gly Ala Ala Val Gly Leu Trp Gln
115 120 125
Ala Asn Arg His Ile Gly Ala Thr Leu Val Asn Glu Thr Gly Thr Leu
130 135 140
Ile Trp Asn Glu Leu Leu Thr Asp Lys Pro Asp Leu Ala Leu Ala Phe
145 150 155 160
Tyr Glu Ala Val Val Gly Leu Thr His Ser Ser Met Glu Ile Ala Ala
165 170 175
Gly Gln Asn Tyr Arg Val Leu Lys Ala Gly Asp Ala Glu Val Gly Gly
180 185 190
Cys Met Glu Pro Pro Met Pro Gly Val Pro Asn His Trp His Val Tyr
195 200 205
Phe Ala Val Asp Asp Ala Asp Ala Thr Ala Ala Lys Ala Ala Ala Ala
210 215 220
Gly Gly Gln Val Ile Ala Glu Pro Ala Asp Ile Pro Ser Val Gly Arg
225 230 235 240
Phe Ala Val Leu Ser Asp Pro Gln Gly Ala Ile Phe Ser Val Leu Lys
245 250 255
Pro Ala Pro Gln Gln
260
<210> 4
<211> 246
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 4
Val Gly Ala Pro Leu Arg His Cys Leu Leu Val Ala Ala Ala Leu Ser
1 5 10 15
Leu Gly Cys Gly Val Ala Ala Ala Asp Pro Gly Tyr Val Ala Asn Val
20 25 30
Ile Pro Cys Glu Gln Arg Thr Leu Val Leu Ser Ala Phe Pro Ala Glu
35 40 45
Ala Asp Ala Val Leu Ala His Thr Ala Leu Asp Ala Asn Pro Val Val
50 55 60
Val Ala Asp Arg Arg Arg Tyr Tyr Leu Gly Ser Ile Ser Gly Lys Lys
65 70 75 80
Val Ile Val Ala Met Thr Gly Ile Gly Leu Val Asn Ala Thr Asn Thr
85 90 95
Thr Glu Thr Ala Phe Ala Arg Phe Thr Cys Ala Ser Ser Ile Ala Ile
100 105 110
Ala Ala Val Met Phe Ser Gly Val Ala Gly Gly Ala Gly Arg Thr Ser
115 120 125
Ile Gly Asp Val Ala Ile Pro Ala Arg Trp Thr Leu Asp Asn Gly Ala
130 135 140
Thr Phe Arg Gly Val Asp Pro Gly Met Leu Ala Thr Ala Gln Thr Leu
145 150 155 160
Ser Val Val Leu Asp Asn Ile Asn Thr Leu Gly Asn Pro Val Cys Leu
165 170 175
Cys Arg Asn Val Pro Val Val Arg Leu Asn His Leu Gly Arg Gln Pro
180 185 190
Gln Leu Phe Val Gly Gly Asp Gly Ser Ser Ser Asp Lys Asn Asn Gly
195 200 205
Gln Ala Phe Pro Cys Ile Pro Asn Gly Gly Ser Val Phe Ala Ala Asn
210 215 220
Pro Val Val His Pro Ile Ala His Leu Ala Ile Pro Val Thr Phe Ser
225 230 235 240
Arg Arg Arg Asp Pro Gly
245
<210> 5
<211> 310
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 5
Met Thr Gly Pro His Pro Glu Thr Glu Ser Ser Gly Asn Arg Gln Ile
1 5 10 15
Ser Val Ala Glu Leu Leu Ala Arg Gln Gly Val Thr Gly Ala Pro Ala
20 25 30
Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Gly Asp Ser Asp Ala Ile Thr Val Ala
35 40 45
Glu Leu Thr Gly Glu Ile Pro Ile Ile Arg Asp Asp His His His Ala
50 55 60
Gly Pro Asp Ala His Ala Ser Gln Ser Pro Ala Ala Asn Gly Arg Val
65 70 75 80
Gln Val Gly Glu Ala Ala Pro Gln Ser Pro Ala Glu Pro Val Ala Glu
85 90 95
Gln Val Ala Glu Glu Pro Thr Arg Thr Val Tyr Trp Ser Gln Pro Glu
100 105 110
Pro Arg Trp Pro Lys Ser Pro Pro Gln Asp Arg Arg Glu Ser Gly Pro
115 120 125
Glu Leu Ser Glu Tyr Pro Arg Pro Leu Arg His Thr His Ser Asp Arg
130 135 140
Ala Pro Ala Gly Pro Pro Ser Gly Ala Glu His Met Ser Pro Asp Pro
145 150 155 160
Val Glu His Tyr Pro Asp Leu Trp Val Asp Val Leu Asp Thr Glu Val
165 170 175
Gly Glu Ala Glu Ala Glu Thr Glu Val Arg Glu Ala Gln Pro Gly Arg
180 185 190
Gly Glu Arg His Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly Thr Asp Val Glu Gly
195 200 205
Asp Gly Ala Ala Glu Ala Arg Val Ala Arg Arg Ala Leu Asp Val Val
210 215 220
Pro Thr Leu Trp Arg Gly Ala Leu Val Val Leu Gln Ser Ile Leu Ala
225 230 235 240
Val Ala Phe Gly Ala Gly Leu Phe Ile Ala Phe Asp Gln Leu Trp Arg
245 250 255
Trp Asn Ser Ile Val Ala Leu Val Leu Ser Val Met Val Ile Leu Gly
260 265 270
Leu Val Val Ser Val Arg Ala Val Arg Lys Thr Glu Asp Ile Ala Ser
275 280 285
Thr Leu Ile Ala Val Ala Val Gly Ala Leu Ile Thr Leu Gly Pro Leu
290 295 300
Ala Leu Leu Gln Ser Gly
305 310
<210> 6
<211> 279
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 6
Met Thr Thr Thr Arg Thr Glu Arg Asn Phe Ala Gly Ile Gly Asp Val
1 5 10 15
Arg Ile Val Tyr Asp Val Trp Thr Pro Asp Thr Ala Pro Gln Ala Val
20 25 30
Val Val Leu Ala His Gly Leu Gly Glu His Ala Arg Arg Tyr Asp His
35 40 45
Val Ala Gln Arg Leu Gly Ala Ala Gly Leu Val Thr Tyr Ala Leu Asp
50 55 60
His Arg Gly His Gly Arg Ser Gly Gly Lys Arg Val Leu Val Arg Asp
65 70 75 80
Ile Ser Glu Tyr Thr Ala Asp Phe Asp Thr Leu Val Gly Ile Ala Thr
85 90 95
Arg Glu Tyr Pro Gly Cys Lys Arg Ile Val Leu Gly His Ser Met Gly
100 105 110
Gly Gly Ile Val Phe Ala Tyr Gly Val Glu Arg Pro Asp Asn Tyr Asp
115 120 125
Leu Met Val Leu Ser Ala Pro Ala Val Ala Ala Gln Asp Leu Val Ser
130 135 140
Pro Val Val Ala Val Ala Ala Lys Leu Leu Gly Val Val Val Pro Gly
145 150 155 160
Leu Pro Val Gln Glu Leu Asp Phe Thr Ala Ile Ser Arg Asp Pro Glu
165 170 175
Val Val Gln Ala Tyr Asn Thr Asp Pro Leu Val His His Gly Arg Val
180 185 190
Pro Ala Gly Ile Gly Arg Ala Leu Leu Gln Val Gly Glu Thr Met Pro
195 200 205
Arg Arg Ala Pro Ala Leu Thr Ala Pro Leu Leu Val Leu His Gly Thr
210 215 220
Asp Asp Arg Leu Ile Pro Ile Glu Gly Ser Arg Arg Leu Val Glu Cys
225 230 235 240
Val Gly Ser Ala Asp Val Gln Leu Lys Glu Tyr Pro Gly Leu Tyr His
245 250 255
Glu Val Phe Asn Glu Pro Glu Arg Asn Gln Val Leu Asp Asp Val Val
260 265 270
Ala Trp Leu Thr Glu Arg Leu
275

Claims (12)

1.EspC蛋白在制备结核分枝杆菌分离产品或结核分支杆菌富集产品中的应用，其特征在于，所述应用中，通过EspC蛋白和结核分枝杆菌的固有蛋白结合实现；
所述固有蛋白为Rv0577蛋白、Rv2293蛋白、Rv0497c蛋白和Rv0183蛋白中的至少一种；
所述EspC蛋白为（1）或（2）：
（1）SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
（2）在SEQ ID NO：1所示的蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；
所述Rv0577蛋白为SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
所述Rv2293蛋白为SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
所述Rv0497c蛋白为SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
所述Rv0183蛋白为SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列组成的蛋白质。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述结核分枝杆菌分离产品为结核分枝杆菌分离试剂盒。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述结核分枝杆菌分离产品为结核分枝杆菌分离柱、分离试剂、分离磁珠或分离膜。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述结核分枝杆菌分离产品为分离芯片或分离试纸条。
5.EspC蛋白在制备结核分枝杆菌检测产品中的应用，其特征在于，所述应用中，通过EspC蛋白对待测样本的总蛋白进行分离和/或富集，然后检测分离和/或富集产物中是否含有固有蛋白；
或，所述应用中，通过固有蛋白对待测样本的总蛋白进行分离和/或富集，然后检测分离和/或富集产物中是否含有EspC蛋白；
所述固有蛋白为Rv0577蛋白、Rv2293蛋白、Rv0497c蛋白和Rv0183蛋白中的至少一种；
所述EspC蛋白为（1）或（2）：
（1）SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
（2）在SEQ ID NO：1所示的蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；
所述Rv0577蛋白为SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
所述Rv2293蛋白为SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
所述Rv0497c蛋白为SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
所述Rv0183蛋白为SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列组成的蛋白质。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述结核分枝杆菌检测产品为检测试剂盒或检测芯片。
7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述结核分枝杆菌检测产品为检测试剂或ELISA板。
8.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述结核分枝杆菌检测产品为检测试纸条。
9. EspC蛋白在制备结核疫苗或抗结核药物中的应用，其特征在于，所述应用中，通过EspC蛋白和结核分枝杆菌的固有蛋白结合实现；所述固有蛋白为Rv0577蛋白、Rv2293蛋白、Rv0497c蛋白和Rv0183蛋白中的至少一种；
所述EspC蛋白为（1）或（2）：
（1）SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
（2）在SEQ ID NO：1所示的蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；
所述Rv0577蛋白为SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
所述Rv2293蛋白为SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
所述Rv0497c蛋白为SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
所述Rv0183蛋白为SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列组成的蛋白质。
10.编码EspC蛋白的核酸分子在制备结核分枝杆菌分离试剂、结核分枝杆菌富集试剂、结核分枝杆菌检测试剂、结核疫苗和抗结核药物中至少一种的应用；
所述编码EspC蛋白的核酸分子为SEQ ID NO：2所示的DNA分子；
所述应用中，通过EspC蛋白和结核分枝杆菌的固有蛋白结合实现；
所述固有蛋白为Rv0577蛋白、Rv2293蛋白、Rv0497c蛋白和Rv0183蛋白中的至少一种；
所述EspC蛋白为（1）或（2）：
（1）SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
（2）在SEQ ID NO：1所示的蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；
所述Rv0577蛋白为SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
所述Rv2293蛋白为SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
所述Rv0497c蛋白为SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
所述Rv0183蛋白为SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列组成的蛋白质。
11.一种分离和/或富集结核分枝杆菌的方法，其特征在于，通过EspC蛋白和结核分枝杆菌固有蛋白结合实现；
所述结核分枝杆菌固有蛋白为Rv0577蛋白、Rv2293蛋白、Rv0497c蛋白和Rv0183蛋白中的至少一种；
所述EspC蛋白为（1）或（2）：
（1）SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
（2）在SEQ ID NO：1所示的蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；
所述Rv0577蛋白为SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
所述Rv2293蛋白为SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
所述Rv0497c蛋白为SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
所述Rv0183蛋白为SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列组成的蛋白质。
12.一种检测待测样本是否存在结核分枝杆菌的方法，包括如下步骤：
（1）取待测样本的总蛋白，采用EspC蛋白进行分离和/或富集；
（2）完成步骤（1）后，进行如下判断：如果分离和/或富集的产物含有固有蛋白，则待测样本存在结核分枝杆菌；如果分离和/或富集的产物不含有所述固有蛋白，则待测样本不存在结核分枝杆菌；
所述结核分枝杆菌固有蛋白为Rv0577蛋白、Rv2293蛋白、Rv0497c蛋白和Rv0183蛋白中的至少一种；
所述方法用于非疾病的诊断；
所述EspC蛋白为（1）或（2）：
（1）SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
（2）在SEQ ID NO：1所示的蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；
所述Rv0577蛋白为SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
所述Rv2293蛋白为SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
所述Rv0497c蛋白为SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
所述Rv0183蛋白为SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列组成的蛋白质。
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