CN108948175B - 与人类蛋白smad2相互作用的结核蛋白及其应用 - Google Patents

与人类蛋白smad2相互作用的结核蛋白及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了与人类蛋白SMAD2相互作用的结核蛋白及其应用。本发明提供了人类蛋白SMAD2在如下任一中的应用：(A1)诊断结核病；(A2)制备用于诊断结核病的产品。本发明利用基于MTB结核分枝杆菌蛋白质组芯片的蛋白‑蛋白互作实验进行筛选和鉴定，获得与人类蛋白SMAD2相互作用的结核蛋白Rv2423、Rv3241c、Rv3153、Rv0577、Rv2499c和/或Rv2117。本发明可用于结核诊断或调节人类蛋白SMAD2活性。

Description

与人类蛋白SMAD2相互作用的结核蛋白及其应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及与人类蛋白SMAD2相互作用的结核蛋白及其应用。
背景技术
结核病仍然是严重威胁人类健康、流行性最广、死亡率最高的传染性疾病之一。据世界卫生组织估计,全球每年约有1000万新发病例，其中约200万人死于结核病，死亡人数居单一传染病之首。目前早期实验室诊断方法非常有限，同时由于结核分枝杆菌(mycobacterium t uberculosis,MTB)本身生长特点以及卡介苗(BCG)接种在我国的广泛使用,使得这些方法对结核病诊断存在各自的多种不足，抗酸杆菌涂片法检查阳性率低，结核菌培养法所需时间较长而且即使痰中有MTB也仍有10％～20％培养失败,分子生物学诊断法不仅存在假阳性干扰,而且与细菌学检查一样也存在受检验标本的约束等问题,并且相对成本较高假阳性率较高，酶联免疫吸附试验(ELISA)抗体检测方法的敏感性较高但特异性较差。因此,建立新的高灵敏度、高特异性的MTB感染诊断技术和方法显得尤为重要。由于缺乏快速、敏感的结核病诊断技术和方法，使早期发现结核病人困难，也难以及时进行结核病鉴别诊断，造成结核病人漏诊、诊断时间延长或误诊，对结核病防控非常不利。细菌学是诊断结核的金标准，但结核分枝杆菌生长极为缓慢其培养鉴定需要约两个月的时间，且阳性率取决于采集标本中细菌的数量，检测的灵敏度低，不利于各期诊断与治疗。而结核蛋白Rv2423、Rv3241c、Rv3153、Rv0577、Rv2499c、Rv2117是结核分枝杆菌的固有蛋白，通过检测这些结核蛋白可以鉴定结核分枝杆菌的存在，因此可以借助此来实现对结核感染或结核病的快速诊断。
SMAD2蛋白是一种介导分子，在信号转导过程中有着极其重要作用，主要介导TGF-β1的各种生物学功能。SMAD2属于受体激活的SMAD蛋白家族成员，SMAD2基因在多种肿瘤中发生突变，是一种可能的肿瘤抑制基因。SMAD2和SMAD3(SMAD2/3)蛋白是细胞信号转导过程的一个重要的组成部分，在细胞内部被激活，开启和关闭许多不同过程(涉及从胚胎发育和生长到激活免疫系统或癌症)所需的基因。SMAD2/3在不同的细胞中具有许多不同的功能，从控制某些细胞类型生长到控制其他细胞类型对应激作出反应。TGF-β1/smad信号通路参与胚胎发育、间质纤维化、肿瘤发生、发展和炎症修复反应等诸多生物学过程。SMAD2在细胞核中可形成转录活化复合体，以调控TGF-β对下游基因的表达。SMAD2的突变或表达缺失可使TGF-β信号传递中断，导致细胞逃脱TGF-β的生长抑制作用进而导致许多肿瘤的发生、发展。因此，调节SMAD2的活性将会对机体产生重要的影响，还可能在某些疾病的预防或治疗中发挥重要作用。调节SMAD2活性的一个重要途径可以依靠通过能够与SMAD2发生直接相互作用的蛋白质来实现。因此，能够与SMAD2发生直接相互作用的蛋白质，将具有重要的药用价值，可开发为某些疾病预防或治疗的蛋白药物。
发明内容
本发明的目的是提供与人类蛋白SMAD2相互作用的结核蛋白及其应用。
第一方面，本发明要求保护人类蛋白SMAD2在如下任一中的应用：
(A1)诊断结核病；
(A2)制备用于诊断结核病的产品。
第二方面，本发明要求保护人类蛋白SMAD2在如下任一中的应用：
(B1)检测结核分枝杆菌；
(B2)制备用于检测结核分枝杆菌的产品。
其中，(B1)中所述应用既可为非疾病诊断治疗中的应用(如纯粹用于科学研究)，也可为疾病诊断治疗中的应用。
第三方面，本发明要求保护人类蛋白SMAD2在如下任一中的应用：
(A1)检测结核蛋白Rv2423、Rv3241c、Rv3153、Rv0577、Rv2499c和/或Rv2117；
(A2)制备用于检测结核蛋白Rv2423、Rv3241c、Rv3153、Rv0577、Rv2499c和/或Rv2117的产品。
其中，(C1)中所述应用既可为非疾病诊断治疗中的应用(如纯粹用于科学研究)，也可为疾病诊断治疗中的应用。
进一步地，在上述第一方面中，具体可通过检测结核蛋白Rv2423、Rv3241c、Rv3153、Rv0577、Rv2499c和/或Rv2117实现对结核病的诊断。同样的，在上述第二方面中，具体可通过检测结核蛋白Rv2423、Rv3241c、Rv3153、Rv0577、Rv2499c和/或Rv2117实现对结核分枝杆菌的检测。
第三方面，本发明要求保护结核蛋白Rv2423、Rv3241c、Rv3153、Rv0577、Rv2499c和/或Rv2117在与人类蛋白SMAD2互作中的应用。
所述应用既可为非疾病诊断治疗中的应用(如纯粹用于科学研究)，也可为疾病诊断治疗中的应用。
第四方面，本发明要求保护结核蛋白Rv2423、Rv3241c、Rv3153、Rv0577、Rv2499c和/或Rv2117在如下任一中的应用：
(a1)调节人类蛋白SMAD2活性；
(a2)制备能够调节人类蛋白SMAD2活性的产品。
其中，(a1)中所述应用既可为非疾病诊断治疗中的应用(如纯粹用于科学研究)，也可为疾病诊断治疗中的应用。
第五方面，本发明要求保护结核蛋白Rv2423、Rv3241c、Rv3153、Rv0577、Rv2499c和/或Rv2117在如下任一中的应用：
(b1)预防和/或治疗与人类蛋白SMAD2相关疾病；
(b2)制备用于预防和/或治疗与人类蛋白SMAD2相关疾病的产品。
在上述各方面所述的应用中，结核蛋白Rv2423的氨基酸序列均具体可如SEQ IDNo.1所示，或该序列经缺失、替换或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。结核蛋白Rv3241c的氨基酸序列均具体可如SEQ ID No.2所示，或该序列经缺失、替换或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。结核蛋白Rv3153的氨基酸序列均具体可如SEQ ID No.3所示，或该序列经缺失、替换或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。结核蛋白Rv0577的氨基酸序列均具体可如SEQ ID No.4所示，或该序列经缺失、替换或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。结核蛋白Rv2499c的氨基酸序列均具体可如SEQ ID No.5所示，或该序列经缺失、替换或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。结核蛋白Rv2117的氨基酸序列均具体可如SEQ ID No.6所示，或该序列经缺失、替换或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。
在上述各方面所述的应用中，所述人类蛋白SMAD2的氨基酸序列均具体可如SEQID No.7所示，或该序列经缺失、替换或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。
本发明利用基于MTB结核分枝杆菌蛋白质组芯片的蛋白-蛋白互作实验进行筛选和鉴定，获得与人类蛋白SMAD2相互作用的结核蛋白Rv2423、Rv3241c、Rv3153、Rv0577、Rv2499c和/或Rv2117。本发明可用于结核诊断或调节人类蛋白SMAD2活性。
附图说明
图1为本发明于MTB结核分枝杆菌蛋白质组芯片的蛋白-蛋白互作实验研究与人类蛋白SMAD2互作的结核蛋白的技术流程图。
图2为透析后蛋白浓度通过SDS-PAGE检测结果。
图3为芯片杂交结果。其中，箭头1为阳性对照点，箭头2为阴性对照点，箭头3为阳性蛋白。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中所涉及的结核蛋白Rv2423的氨基酸序列具体如SEQ ID No.1所示；结核蛋白Rv3241c的氨基酸序列具体如SEQ ID No.2所示；结核蛋白Rv3153的氨基酸序列具体如SEQ ID No.3所示；结核蛋白Rv0577的氨基酸序列具体如SEQ ID No.4所示；结核蛋白Rv2499c的氨基酸序列具体如SEQ ID No.5所示；结核蛋白Rv2117的氨基酸序列具体如SEQID No.6所示；人类蛋白SMAD2的氨基酸序列具体如SEQ ID No.7所示。
实施例1、基于MTB结核分枝杆菌蛋白质组芯片的蛋白-蛋白互作实验研究与人类蛋白SMAD2互作的结核蛋白
MTB结核分枝杆菌蛋白质组芯片：公司产品：广州博翀生物科技有限公司，货号为TB-10001-102988。MTB结核分枝杆菌蛋白质组芯片包含4262个结核分枝杆菌重组蛋白质，是目前世界上第一张结核分枝杆菌蛋白质组芯片。该芯片适用于全局性地进行蛋白-蛋白互作、蛋白-核酸互作、蛋白-小分子互作以及蛋白翻译后修饰研究，同时适用于系统性地发现血清中自身抗体并用于诊断或其它表征的标志物的研究。
1、技术路线
每一个样品使用1张MTB蛋白质芯片进行检测。样品与固定于芯片上的蛋白进行结合，并通过清洗去除未结合的样本。由于样本标记Cy3(CyDye Protein LabellingCY3MONO5-PACK，GE，PA23001)，故可以直接通过芯片扫描仪进行信号解读。信号的强弱与亲和力、数量呈正相关，技术路线流程图如图1所示。
2、样本基本信息
如表1所示。
表1样本基本信息
Figure BDA0001739661880000041
3、实验过程及步骤
(1)蛋白QC
根据样本信息，先通过SDS-PAGE对蛋白浓度、纯度进行初步检测。
(2)蛋白标记及标记效率检测
根据定量结果，对目的蛋白进行透析脱盐，然后标记荧光Cy3(CyDye ProteinLabellingCY3MONO 5-PACK，GE，PA23001)，标记终止后在经过透析处理去除游离的甘氨酸等成分，然后将SMAD2蛋白样本梯度点样于NC膜，Cy3-BSA为阳性对照，BSA为阴性对照。通过Dot blot定性评价荧光标记效率。
(3)蛋白透析并定量
透析完成后，通过SDS-PAGE，并设置标准品BSA浓度梯度，等体积上样，检测透析后蛋白浓度。
(4)芯片实验
根据所测得的蛋白浓度，将所有样本稀释芯片杂交所需浓度(4μg/ml)，并杂交芯片。芯片具体步骤如下：
A.准备以下溶液：
封闭液：3ml 10％(10g/100ml)BSA，加入7ml 1×PBS溶液；
孵育液：1ml 10％(10g/100ml)BSA，加入9ml 1×PBST溶液；
清洗液：1×PBST。
B.操作步骤：
a)封闭：使用芯片孵育盒，加入5ml封闭液，将芯片从-80℃取出，正面朝上置于孵育盒中；再横向放在侧摆摇床上，50-60rpm，4℃，3h；
b)样本孵育：倒弃封闭液，迅速加入预先准备好的样本孵育液(样本终浓度为4μg/ml，体积3ml)，侧摆摇床20-30rpm，4℃过夜孵育；
c)清洗：将芯片取出，置于加入有清洗液的芯片清洗盒，至于水平摇床上，60-70rpm，5min每次，清洗4次，此时注意避光操作；
d)完成后用ddH2O清洗2次，每次5min，注意避光操作；
e)干燥。将芯片置于芯片干燥机，离心干燥；
f)扫描，并提取数据。
4、实验结果
(1)蛋白QC；
样本于4℃冰箱冻融，离心，通过SDS-page检测，并设置相关BSA标准品浓度梯度，等体积上样，结果如下：
SMAD2蛋白浓度介于100～150ng/μl之间；
通过灰度值大致估算可得SMAD2浓度为145ng/μl，纯度>90％。
初步结果可知，SMAD2蛋白浓度符合标示浓度。
(2)透析后标记效率检测；
蛋白应该标记后，SMAD2蛋白样本灵敏度均小于1ng，表明蛋白标记效率较好。
(3)透析后蛋白浓度检测；
透析后蛋白浓度通过SDS-PAGE检测结果如图2所示。由图可知：
SMAD2蛋白样本标记透析后浓度介于75～100ng/μl之间；
通过灰度值估算，SMAD2蛋白样本标记透析后浓度为100ng/μl，
考虑到后续蛋白杂交芯片所需浓度及总量，蛋白符合实验要求。
(4)芯片实验：
结果如图3所示。由图可知：除阴性对照和阳性对照点外，SMAD2与结核分枝杆菌蛋白质组芯片杂交后有阳性信号点，表明筛查到对应的互作蛋白。
5、数据分析
对所提取出的芯片数据通过以下逻辑进行分析：
(1)为消除同一张芯片内不同蛋白点之间由于背景值不一致导致的信号不均一的情况，故通过背景归一化方法进行处理。实现方式为每个蛋白的前景值与背景值比值，即F/B，并此基础上定义SNR(信噪比)，即两个重复蛋白的F/B的均值；
(2)对于不同芯片，为消除不同实验样本及实验操作带来的系统性误差，故在数据比对前对SNR进行Z-score标准化处理；
(3)对归一化后数据，设置阳性cutoff阈值，通过阈值分别计算SMAD2芯片上的阳性点个数；定义cutoff＝2，即归一化后mean+2SD(此值是根据芯片结果设定，非标准值)。在此标准下，筛选潜在的阳性蛋白，其中SMAD2芯片上阳性点个数6个，即结核蛋白Rv2423、Rv3241c、Rv3153、Rv0577、Rv2499c、Rv2117。
其中重要的参数解释如下：
Block,column,Row：分别指阵列，列，行的编号，即位置。
Name,ID：蛋白质名称或基因名称。
F532Median：532nm通道下的信号前景值的中位数值，指每个信号点对应所有的像素点的强度中位值，用以表示信号强度。
B532Median：532nm通道下的背景值的中位数值，指每个信号点周围背景一定范围内的像素点的强度中位值，用以表示背景值。
<110> 首都医科大学附属北京胸科医院
<120> 与人类蛋白SMAD2相互作用的结核蛋白及其应用
<130> GNCLN181582
<160> 7
<170> PatentIn version 3.5
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<211> 348
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Val Thr Lys His Ala Gly Asp Arg Glu Ser Asp Asp Ala Val Ser Ala
1 5 10 15
Cys Arg Val Ala Gly Ser Thr Val Gly Arg Arg Ile Leu Gln Arg Gly
20 25 30
Leu Trp Phe Glu Glu Phe Gln Ile Gly Thr Thr Tyr Leu His Arg Pro
35 40 45
Gly Arg Thr Val Thr Glu Ala Asp Asn Val Leu Phe Thr Thr Leu Thr
50 55 60
Met Asn Thr Gln Ser Leu His Leu Asp Ala Ala Trp Ala Gly Gln Gln
65 70 75 80
Pro Gly Phe Arg Gly Glu Arg Leu Val Asn Ser Met Phe Thr Leu Ser
85 90 95
Thr Met Val Gly Leu Ser Val Ala Gln Leu Thr Leu Gly Thr Ile Val
100 105 110
Ala Asn Leu Gly Phe Ser Glu Val Ser Phe Pro Lys Pro Val Phe His
115 120 125
Gly Asp Thr Leu Tyr Ala Glu Thr Val Cys Thr Gly Lys Arg Glu Ser
130 135 140
Lys Ser Arg Pro Gly Glu Gly Ile Val Thr Leu Glu His Ile Ala Arg
145 150 155 160
Asn Gln His Gly Glu Val Val Ala Arg Ala Val Arg Thr Thr Leu Val
165 170 175
Gln Lys Gln Ser Ile Lys Glu Ala Gln
180 185
<210> 6
<211> 97
<212> PRT
<213> M. tuberculosis
<400> 6
Met Trp Ile Gly Trp Leu Glu Phe Asp Val Leu Leu Gly Asp Val Arg
1 5 10 15
Ser Leu Lys Gln Lys Arg Ser Val Thr Arg Pro Leu Val Ala Glu Leu
20 25 30
Gln Arg Lys Phe Ser Val Ser Ala Ala Glu Thr Gly Ser His Asp Leu
35 40 45
Tyr Arg Arg Ala Gly Ile Gly Val Ala Val Val Ser Gly Asp Arg Ser
50 55 60
His Ala Val Asp Val Leu Asp Asn Ala Glu Arg Leu Val Ala Ala His
65 70 75 80
Pro Glu Phe Glu Leu Leu Ser Val Arg Arg Gly Leu His Arg Thr Asp
85 90 95
Asp
<210> 7
<211> 467
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 7
Met Ser Ser Ile Leu Pro Phe Thr Pro Pro Val Val Lys Arg Leu Leu
1 5 10 15
Gly Trp Lys Lys Ser Ala Gly Gly Ser Gly Gly Ala Gly Gly Gly Glu
20 25 30
Gln Asn Gly Gln Glu Glu Lys Trp Cys Glu Lys Ala Val Lys Ser Leu
35 40 45
Val Lys Lys Leu Lys Lys Thr Gly Arg Leu Asp Glu Leu Glu Lys Ala
50 55 60
Ile Thr Thr Gln Asn Cys Asn Thr Lys Cys Val Thr Ile Pro Ser Thr
65 70 75 80
Cys Ser Glu Ile Trp Gly Leu Ser Thr Pro Asn Thr Ile Asp Gln Trp
85 90 95
Asp Thr Thr Gly Leu Tyr Ser Phe Ser Glu Gln Thr Arg Ser Leu Asp
100 105 110
Gly Arg Leu Gln Val Ser His Arg Lys Gly Leu Pro His Val Ile Tyr
115 120 125
Cys Arg Leu Trp Arg Trp Pro Asp Leu His Ser His His Glu Leu Lys
130 135 140
Ala Ile Glu Asn Cys Glu Tyr Ala Phe Asn Leu Lys Lys Asp Glu Val
145 150 155 160
Cys Val Asn Pro Tyr His Tyr Gln Arg Val Glu Thr Pro Val Leu Pro
165 170 175
Pro Val Leu Val Pro Arg His Thr Glu Ile Leu Thr Glu Leu Pro Pro
180 185 190
Leu Asp Asp Tyr Thr His Ser Ile Pro Glu Asn Thr Asn Phe Pro Ala
195 200 205
Gly Ile Glu Pro Gln Ser Asn Tyr Ile Pro Glu Thr Pro Pro Pro Gly
210 215 220
Tyr Ile Ser Glu Asp Gly Glu Thr Ser Asp Gln Gln Leu Asn Gln Ser
225 230 235 240
Met Asp Thr Gly Ser Pro Ala Glu Leu Ser Pro Thr Thr Leu Ser Pro
245 250 255
Val Asn His Ser Leu Asp Leu Gln Pro Val Thr Tyr Ser Glu Pro Ala
260 265 270
Phe Trp Cys Ser Ile Ala Tyr Tyr Glu Leu Asn Gln Arg Val Gly Glu
275 280 285
Thr Phe His Ala Ser Gln Pro Ser Leu Thr Val Asp Gly Phe Thr Asp
290 295 300
Pro Ser Asn Ser Glu Arg Phe Cys Leu Gly Leu Leu Ser Asn Val Asn
305 310 315 320
Arg Asn Ala Thr Val Glu Met Thr Arg Arg His Ile Gly Arg Gly Val
325 330 335
Arg Leu Tyr Tyr Ile Gly Gly Glu Val Phe Ala Glu Cys Leu Ser Asp
340 345 350
Ser Ala Ile Phe Val Gln Ser Pro Asn Cys Asn Gln Arg Tyr Gly Trp
355 360 365
His Pro Ala Thr Val Cys Lys Ile Pro Pro Gly Cys Asn Leu Lys Ile
370 375 380
Phe Asn Asn Gln Glu Phe Ala Ala Leu Leu Ala Gln Ser Val Asn Gln
385 390 395 400
Gly Phe Glu Ala Val Tyr Gln Leu Thr Arg Met Cys Thr Ile Arg Met
405 410 415
Ser Phe Val Lys Gly Trp Gly Ala Glu Tyr Arg Arg Gln Thr Val Thr
420 425 430
Ser Thr Pro Cys Trp Ile Glu Leu His Leu Asn Gly Pro Leu Gln Trp
435 440 445
Leu Asp Lys Val Leu Thr Gln Met Gly Ser Pro Ser Val Arg Cys Ser
450 455 460
Ser Met Ser
465

Claims (1)

1.人类蛋白SMAD2在制备用于诊断结核病的产品中的应用；
所述应用中，通过检测结核蛋白Rv2423、Rv3241c、Rv3153、Rv0577、Rv2499c和/或Rv2117实现对结核病的诊断；
其中，结核蛋白Rv2423的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示；结核蛋白Rv3241c的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示；结核蛋白Rv3153的氨基酸序列如SEQ ID No.3所示；结核蛋白Rv0577的氨基酸序列如SEQ ID No.4所示；结核蛋白Rv2499c的氨基酸序列如SEQ ID No.5所示；结核蛋白Rv2117的氨基酸序列如SEQ ID No.6所示；所述人类蛋白SMAD2的氨基酸序列如SEQ ID No.7所示。
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