CN101687027B

CN101687027B - 包含结核分枝杆菌多肽及其融合的免疫原性组合物

Info

Publication number: CN101687027B
Application number: CN200880017215.7A
Authority: CN
Inventors: 史蒂文·G·里德; 格雷戈里·C·艾尔顿; 瑞·N·考勒尔; 西尔维·伯斯欧莱特
Original assignee: Infectious Disease Research Institute Inc
Current assignee: Advanced Medical Access Research Institute
Priority date: 2007-04-04
Filing date: 2008-04-04
Publication date: 2015-01-28
Anticipated expiration: 2028-04-04
Also published as: EP3199176B1; ES2621211T3; BRPI0809926A2; US8486414B2; CN101687027A; ZA200907316B; WO2008124647A3; JP2014058520A; US20100129391A1; EP2136836B8; EP3199176A1; US9822152B2; CN104815324A; EP2136836A2; BRPI0809926B1; JP2016145209A; DK2136836T3; PL2136836T3; US11897922B2; BRPI0809926B8

Abstract

本发明涉及含有至少两种分枝杆菌抗原的组合物和融合蛋白，以及编码所述组合物和融合蛋白的多核苷酸。本发明还涉及它们在结核病感染的治疗、预防和/或诊断中的使用方法。

Description

包含结核分枝杆菌多肽及其融合的免疫原性组合物

有关序列表的声明

与本申请相关的序列表以文本格式代替纸件提供，并通过引用并入本说明书。含有序列表的文本文件名为480239_403PC_SEQUENCE_LISTING.txt。该文本文件为515KB，制作于2007年4月4日，在提交本说明书同时经由EFS-Web电子提交。

背景

技术领域

本发明一般性地涉及包含结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)抗原的抗原性和/或免疫原性组合的组合物，及其在结核病的诊断、治疗和预防中的用途。

相关现有技术的描述

结核是一种由感染结核分枝杆菌和分枝杆菌的其他种引起的慢性传染病。它在发展中国家是一种严重的疾病，在世界上的发达地区也成为越来越严重的问题，每年新增几百万病例。虽然感染可能在相当长一段时间内没有症状，该病最常见的表现为急性肺部炎症，导致发烧和干咳。如果不给予治疗，一般会导致严重的并发症和死亡。

虽然采用长期的抗生素疗法通常可以控制结核病，这类治疗并不能有效地防止疾病的扩散。被感染的个体可能在一段时间内没有症状，但是有传染性。此外，虽然依从治疗方案是非常关键的，但很难监控患者的行为。某些患者不完成疗程，这就造成治疗无效和形成抗药性。

为了控制结核病的扩散，有效的接种和对疾病的准确的早期诊断非常重要。目前，接种活细菌是最广泛用于诱发保护性免疫的方法。最常用于这一目的的分枝杆菌是卡介苗(Bacillus Calmette-Guerin)(BCG)，它是牛分枝杆菌(Mycobacterium bovis)的一种无毒力菌株。但是，对BCG的安全性和有效性很有争议，在诸如美国的一些国家不给普通公众接种该药剂。

结核病的诊断一般是采用皮试来进行，包括皮下接触结核菌素PPD(纯化蛋白的衍生物)。抗原特异的T细胞反应导致注射后48-72小时在注射部位产生可测量的硬块，这表明接触过分枝杆菌抗原。但是，这种方法的敏感度和特异性一直是个问题，而且无法将接种过BCG的个体和被感染的个体区分开来。

因此，需要诊断、预防和治疗结核病的改进药剂和方法。本发明满足了这些需求，并能提供其他相关优势。

概述

本发明一般性地涉及包含至少两种异源抗原的组合物、包含所述抗原的融合多肽以及编码所述抗原的多核苷酸，其中所述抗原来自分枝杆菌的种，特别是结核分枝杆菌。本发明还涉及利用本发明所述的多肽和多核苷酸来诊断、治疗和预防分枝杆菌感染的方法。本发明的抗原在如文中所述联用时和/或作为融合多肽或多核苷酸时，提供提高的和意想不到的免疫原性水平，使得肺部细菌负荷下降，因此在疫苗开发方面尤其有用。

例如，本发明的一个方面提供了组合物，所述组合物包含免疫刺激剂和两种或多种结核分枝杆菌抗原或其免疫原片段的组合，其中所述抗原选自Rv0164(SEQ ID NO：1)、Rv0496(SEQ ID NO：6)、Rv2608(SEQ ID NO：26)、Rv3020(SEQ ID NO：36)、Rv3478SEQ ID NO：41)、Rv3619(SEQ ID NO：46)、Rv3620(SEQ ID NO：51)、Rv1738(SEQ IDNO：11)、Rv1813(SEQ ID NO：16)、Rv3810(SEQ ID NO：56)、Rv2389(SEQ ID NO：21)、Rv2866(SEQ ID NO：31)、Rv3876(SEQ ID NO：61)、Rv0054(SEQ ID NO：100)、Rv0410(SEQ ID NO：106)、Rv0655(SEQ IDNO：112)、Rv0831(SEQ ID NO：115)、Rv1009(SEQ ID NO：118)、Rv1099(SEQ ID NO：121)、Rv1240(SEQ ID NO：124)、Rv1288(SEQ IDNO：127)、Rv1410(SEQ ID NO：130)、Rv1569(SEQ ID NO：133)、Rv1789(SEQ ID NO：136)、Rv1818(SEQ ID NO：139)、Rv1860(SEQ IDNO：142)、Rv1886(SEQ ID NO：145)、Rv1908(SEQ ID NO：148)、Rv2220(SEQ ID NO：154)、Rv2032(SEQ ID NO：151)、Rv2623(SEQ IDNO：160)、Rv2875(SEQ ID NO：163)、Rv3044(SEQ ID NO：166)、Rv3310(SEQ ID NO：169)、Rv3881(SEQ ID NO：178)、Rv0577(SEQ IDNO：184)、Rv1626(SEQ ID NO：187)、Rv0733(SEQ ID NO：190)、Rv2520(SEQ ID NO：193)、Rv1253(SEQ ID NO：196)、Rv1980(SEQ IDNO：199)、Rv3628(SEQ ID NO：202)、Rv1884(SEQ ID NO：205)、Rv3872(SEQ ID NO：208)、Rv3873(SEQ ID NO：211)、Rv1511(SEQ IDNO：214)和Rv3875(SEQ ID NO：292)以及与上述序列具有至少80％、90％或95％同一性的抗原。

在某些实施方案中，两种或多种抗原的组合选自：

(a)包含Rv1813(SEQ ID NO：16)、Rv3620(SEQ ID NO：51)和Rv2608(SEQ ID NO：26)的组合；

(b)包含Rv2608(SEQ ID NO：26)和Rv3619(SEQ ID NO：46)的组合；以及

(c)包含Rv3478(SEQ ID NO：41)和Rv3619(SEQ ID NO：46)的组合。

在一个具体实施方案中，上述包含Rv2608(SEQ ID NO：26)、Rv1813(SEQ ID NO：16)和Rv3620(SEQ ID NO：51)的(a)组合物，还包含一种或多种选自下述的抗原：Rv1886(SEQ ID NO：145)、Rv2389(SEQ ID NO：21)、Rv3478(SEQ ID NO：41)、Rv2875(SEQ ID NO：163)、Rv2220(SEQ ID NO：154)、Rv0733(SEQ ID NO：190)、Rv0577(SEQ IDNO：184)、Rv3044(SEQ ID NO：166)、Rv1626(SEQ ID NO：187)、Rv3619(SEQ ID NO：46)和Rv3020(SEQ ID NO：36)。

在更具体的实施方案中，所述组合物包含Rv1813(SEQ ID NO：16)、Rv3620(SEQ ID NO：51)、Rv2608(SEQ ID NO：26)和Rv2389(SEQID NO：21)。

在相关具体实施方案中，所述组合物包含Rv2608(SEQ ID NO：26)、Rv1813(SEQ ID NO：16)、Rv3620(SEQ ID NO：51)和Rv3619(SEQID NO：46)。

在本发明的某些其他实施方案中，上述包含Rv2608(SEQ ID NO：26)和Rv3619(SEQ ID NO：46)的(b)组合物，还包含一种或多种选自下述的抗原：Rv1886(SEQ ID NO：145)、Rv2389(SEQ ID NO：21)、Rv1813(SEQ IDNO：16)、Rv2875(SEQ ID NO：163)、Rv2220(SEQ IDNO：154)、Rv0733(SEQ ID NO：190)、Rv0577(SEQ ID NO：184)、Rv3044(SEQ ID NO：166)、Rv1626(SEQ ID NO：187)、Rv3620(SEQ IDNO：51)、Rv3478(SEQ ID NO：41)和Rv3020(SEQ ID NO：36)。

在一个具体实施方案中，所述组合物包含Rv2608(SEQ ID NO：26)、Rv3619(SEQ ID NO：46)和Rv1886(SEQ ID NO：145)。

在另一个具体实施方案中，所述组合物还包含一种或多种选自下述的抗原：Rv2389(SEQ ID NO：21)、Rv1813(SEQ ID NO：16)、Rv2875(SEQ ID NO：163)、Rv2220(SEQ ID NO：154)、Rv0733(SEQ ID NO：190)、Rv0577(SEQ ID NO：184)、Rv3044(SEQ ID NO：166)、Rv1626(SEQ ID NO：187)、Rv3620(SEQ ID NO：51)和Rv3020(SEQ ID NO：36)。

在一个更具体的实施方案中，所述组合物包含Rv2608(SEQ ID NO：26)、Rv3619(SEQ ID NO：46)、Rv1813(SEQ ID NO：16)和Rv3620(SEQID NO：51)。

在本发明的某些其他实施方案中，上述包含Rv3478(SEQ ID NO：41)和Rv3619(SEQ ID NO：46)的(c)组合物，还包含一种或多种选自下述的抗原：Rv1886(SEQ ID NO：145)、Rv2389(SEQ ID NO：21)、Rv1813(SEQ ID NO：16)、Rv2875(SEQ ID NO：163)、Rv2220(SEQ IDNO：154)、Rv0733(SEQ ID NO：190)、Rv0577(SEQ ID NO：184)、Rv3044(SEQ ID NO：166)、Rv1626(SEQ ID NO：187)、Rv3620(SEQ IDNO：51)、Rv2608(SEQ ID NO：26)和Rv3020(SEQ ID NO：36)。

在一个具体实施方案中，所述组合物包含Rv3478(SEQ ID NO：41)、Rv3619(SEQ ID NO：46)和Rv1886(SEQ ID NO：145)。

在另一个实施方案中，所述组合物还包含一种或多种选自下述的抗原：Rv2389(SEQ ID NO：21)、Rv1813(SEQ ID NO：16)、Rv2875(SEQ ID NO：163)、Rv2220(SEQ ID NO：154)、Rv0733(SEQ ID NO：190)、Rv0577(SEQ ID NO：184)、Rv3044(SEQ ID NO：166)、Rv1626(SEQ ID NO：187)和Rv3020(SEQ ID NO：36)。

本文描述的两种或多种抗原的组合可以包含两种或多种分开的重组抗原，或者其抗原性/免疫原性片段的组合。可选择地，所述两种或多种抗原，或其抗原性/免疫原性片段可以以融合多肽的形式共价连接在一起。

根据本发明的另一方面，提供了分离的融合多肽，该多肽包含两种或多种共价连接的结核分枝杆菌抗原，或其免疫原片段的组合，其中所述抗原选自Rv0164(SEQ ID NO：1)、Rv0496(SEQ ID NO：6)、Rv2608(SEQ ID NO：26)、Rv3020(SEQ ID NO：36)、Rv3478(SEQ IDNO：41)、Rv3619(SEQ ID NO：46)、Rv3620(SEQ ID NO：51)、Rv1738(SEQ ID NO：11)、Rv1813(SEQ ID NO：16)、Rv3810(SEQ ID NO：56)、Rv2389(SEQ ID NO：21)、Rv2866(SEQ ID NO：31)、Rv3876(SEQ IDNO：61)、Rv0054(SEQ ID NO：100)、Rv0410(SEQ ID NO：106)、RvO655(SEQ ID NO：112)、Rv0831(SEQ ID NO：115)、Rv1009(SEQID NO：118)、Rv1099(SEQ ID NO：121)、Rv1240(SEQ ID NO：124)、Rv1288(SEQ ID NO：127)、Rv1410(SEQ ID NO：130)、Rv1569(SEQ IDNO：133)、Rv1789(SEQ ID NO：136)、Rv1818(SEQ ID NO：139)、Rv1860(SEQ ID NO：142)、Rv1886(SEQ ID NO：145)、Rv1908(SEQ IDNO：148)、Rv2220(SEQ ID NO：154)、Rv2032(SEQ ID NO：151)、Rv2623(SEQ ID NO：160)、Rv2875(SEQ ID NO：163)、Rv3044(SEQ IDNO：166)、Rv3310(SEQ ID NO：169)、Rv3881(SEQ ID NO：178)、Rv0577(SEQ ID NO：184)、Rv1626(SEQ ID NO：187)、Rv0733(SEQID NO：190)、Rv2520(SEQ ID NO：193)、Rv1253(SEQ ID NO：196)、Rv1980(SEQ ID NO：199)、Rv3628(SEQ ID NO：202)、Rv1884(SEQID NO：205)、Rv3872(SEQ ID NO：208)、Rv3873(SEQ ID NO：211)、Rv1511(SEQ ID NO：214)和Rv3875(SEQ ID NO：292)以及与上述序列中的任一种有至少80％、90％或95％同一性的抗原。

在某些实施方案中，所述融合多肽包含共价连接的抗原的组合，其中所述组合选自：

(b)包含Rv2608(SEQ ID NO：26)和Rv3619(SEQ ID NO：46)的组合；以及

(c)包含Rv3478(SEQ ID NO：41)和Rv3619(SEQ ID NO：46)的组合。

在一个具体实施方案中，上述包含Rv2608(SEQ ID NO：26)、Rv1813(SEQ ID NO：16)和Rv3620(SEQ ID NO：51)的(a)的融合多肽，还包含一种或多种选自下述的抗原：Rv1886(SEQ ID NO：145)、Rv2389(SEQ ID NO：21)、Rv1813(SEQ ID NO：16)、Rv2875(SEQ IDNO：163)、Rv2220(SEQ ID NO：154)、Rv0733(SEQ ID NO：190)、Rv0577(SEQ ID NO：184)、Rv3044(SEQ ID NO：166)、Rv1626(SEQ IDNO：187)、Rv3619(SEQ ID NO：46)、Rv3478(SEQ ID NO：41)和Rv3020(SEQ ID NO：36)。

在一个更具体的实施方案中，所述融合多肽包含Rv1813(SEQ IDNO：16)、Rv3620(SEQ ID NO：51)、Rv2608(SEQ ID NO：26)和Rv2389(SEQ ID NO：21)。

在一个相关具体实施方案中，所述融合多肽包含Rv1813(SEQ IDNO：16)、Rv3620(SEQ ID NO：51)、Rv2608(SEQ ID NO：26)和Rv3619(SEQ ID NO：46)。

本发明的某些其他实施方案中，上述包含Rv2608(SEQ ID NO：26)和Rv3619(SEQ ID NO：46)的(b)的融合多肽，还包含一种或多种选自下述的抗原：Rv1886(SEQ ID NO：145)、Rv2389(SEQ ID NO：21)、Rv1813(SEQ ID NO：16)、Rv2875(SEQ ID NO：163)、Rv2220(SEQ IDNO：154)、Rv0733(SEQ ID NO：190)、Rv0577(SEQ ID NO：184)、Rv3044(SEQ ID NO：166)、Rv1626(SEQ ID NO：187)、Rv3620(SEQ IDNO：51)、Rv3478(SEQ ID NO：41)和Rv3020(SEQ ID NO：36)。

在一个具体实施方案中，所述融合多肽包含Rv2608(SEQ ID NO：26)、Rv1813(SEQ ID NO：16)、Rv3619(SEQ ID NO：46)和Rv1886(SEQID NO：145)。

在另一个具体实施方案中，融合多肽还包含一种或多种选自下述的抗原：Rv2389(SEQ ID NO：21)、Rv1813(SEQ ID NO：16)、Rv2875(SEQ ID NO：163)、Rv2220(SEQ ID NO：154)、Rv0733(SEQ ID NO：190)、Rv0577(SEQ ID NO：184)、Rv3044(SEQ ID NO：166)、Rv1626(SEQ ID NO：187)、Rv3620(SEQ ID NO：51)和Rv3020(SEQ ID NO：36)。

在一个更具体实施方案中，所述融合多肽包含Rv2608(SEQ ID NO：26)、Rv3619(SEQ ID NO：46)、Rv1813(SEQ ID NO：16)和Rv3620(SEQID NO：51)。

在本发明的某些其他实施方案中，上述包含Rv3478(SEQ ID NO：41)和Rv3619(SEQ ID NO：46)的(c)的融合多肽，还包含一种或多种选自下述的抗原：Rv1886(SEQ ID NO：145)、Rv2389(SEQ ID NO：21)、Rv1813(SEQ ID NO：16)、Rv2875(SEQ ID NO：163)、Rv2220(SEQ IDNO：154)、Rv0733(SEQ ID NO：190)、Rv0577(SEQ ID NO：184)、Rv3044(SEQ ID NO：166)、Rv1626(SEQ ID NO：187)、Rv3620(SEQ IDNO：51)、Rv2608(SEQ ID NO：26)和Rv3020(SEQ ID NO：36)。

在一个具体实施方案中，所述融合多肽包含Rv3478(SEQ ID NO：41)、Rv3619(SEQ ID NO：46)和Rv1886(SEQ ID NO：145)。

在另一个实施方案中，融合多肽还包含一种或多种选自下述的抗原：Rv2389(SEQ ID NO：21)，Rv1813(SEQ ID NO：16)，Rv2875(SEQID NO：163)，Rv2220(SEQ ID NO：154)，Rv0733(SEQ ID NO：190)，Rv0577(SEQ ID NO：184)，Rv3044(SEQ ID NO：166)，Rv1626(SEQ IDNO：187)和Rv3020(SEQ ID NO：36)。

在某些具体实施方案中，提供的融合多肽包含选自：ID83(SEQ IDNO：91)、ID94(SEQ ID NO：95)、ID93(SEQ ID NO：226)、ID91(SEQID NO：236)、ID71(SEQ ID NO：245)、ID114(SEQ ID NO：251)、ID125(SEQ ID NO：257)的氨基酸序列。

根据本发明的另一方面，提供了编码本文描述的任意抗原和/或融合多肽的分离的多核苷酸。

应当理解，在许多实施方案中，优选将本发明的组合物、多肽和多核苷酸与一种或多种免疫刺激剂组合配制，从而提高本文描述的由抗原引发的免疫反应。已知本领域有许多免疫刺激剂和佐剂系统可以用于本发明的情景，其中的示例性实例包括AS-2、ENHANZYN^TM、MPL^TM、3D-MPL^TM、IFA、QS21、CWS、TDM、AGPs、含有CpG的寡核苷酸、Toll样受体激动剂(例如，TLR9激动剂、TLR7激动剂、TLR7/8激动剂、TLR5激动剂、TLR4激动剂、TLR2激动剂、TLR3激动剂等)、LeIF、皂甙、皂甙模拟物，以及生物和合成的脂质A、咪喹莫特(imiquimod)、gardiquimod、雷西莫特(resiquimod)、聚I:C、鞭毛蛋白或者它们的组合。

已发现本发明的融合多核苷酸、融合多肽或组合物是强抗原性的。因此，根据本发明的另一方面，提供了疫苗和通过给予有效量本文描述的组合物在个体中刺激保护性免疫反应的相关方法。分离的或纯化的多核苷酸可以用于体外产生重组融合多肽抗原，然后给予所述抗原作为疫苗。可选择地，可以将多核苷酸直接给予个体作为基于DNA的疫苗以引起个体中的抗原表达，以及随后诱发的抗结核分枝杆菌免疫反应。

此外，所述组合物、融合多肽和融合多核苷酸可以在可能已经感染了分枝杆菌的患者中用作诊断工具。例如，本发明的组合物、融合多肽和融合多核苷酸可以用于体外和体内分析法，检测用于诊断感染的抗结核分枝杆菌的体液抗体或细胞介导的免疫，监测疾病进展和/或用于治愈检测评价。

在一个实施方案中，提供了检测生物样品中结核分枝杆菌感染的诊断试剂盒，所述试剂盒包含(a)至少包含本文描述的抗原或融合多肽的免疫原部分的多肽，和(b)检测试剂。

在另一个实施方案中，提供了检测生物样品中是否存在结核分枝杆菌感染的方法，所述方法包括(a)用结合本文描述的抗原或融合多肽的单克隆抗体与生物样品进行接触，以及(b)检测生物样品中是否存在与所述单克隆抗体结合的结核分枝杆菌蛋白。

在再一个实施方案中，提供了检测生物样品中结核分枝杆菌感染的方法，所述方法包括(a)用本文描述的抗原组合或融合多肽与生物样品进行接触，以及(b)检测生物样品中存在的与所述抗原组合或融合多肽结合的抗体和/或T细胞。

在具体实施方案中，提供了检测生物样品中的结核分枝杆菌感染的方法，所述方法包括(a)用两种或多种抗原的组合与生物样品进行接触，所述抗原选自Rv0164(SEQ ID NO：1)、Rv0496(SEQ ID NO：6)、Rv2608(SEQ ID NO：26)、Rv3020(SEQ ID NO：36)、Rv3478(SEQ IDNO：41)、Rv3619(SEQ ID NO：46)、Rv3620(SEQ ID NO：51)、Rv1738(SEQ ID NO：11)、Rv1813(SEQ ID NO：16)、Rv3810(SEQ ID NO：56)、Rv2389(SEQ ID NO：21)、Rv2866(SEQ ID NO：31)、Rv3876(SEQ IDNO：61)、Rv0054(SEQ ID NO：100)、Rv0410(SEQ ID NO：106)、Rv0655(SEQ ID NO：112)、Rv0831(SEQ ID NO：115)、Rv1009(SEQ ID NO：118)、Rv1099(SEQ ID NO：121)、Rv1240(SEQ ID NO：124)、Rv1288(SEQ ID NO：127)、Rv1410(SEQ ID NO：130)、Rv1569(SEQ ID NO：133)、Rv1789(SEQ ID NO：136)、Rv1818(SEQ ID NO：139)、Rv1860(SEQ ID NO：142)、Rv1886(SEQ ID NO：145)、Rv1908(SEQ ID NO：148)、Rv2220(SEQ ID NO：154)、Rv2032(SEQ ID NO：151)、Rv2623(SEQ ID NO：160)、Rv2875(SEQ ID NO：163)、Rv3044(SEQ ID NO：166)、Rv3310(SEQ ID NO：169)和Rv3881(SEQ ID NO：178)、Rv0577(SEQ ID NO：184)、Rv1626(SEQ ID NO：187)、Rv0733(SEQ ID NO：190)、Rv2520(SEQ ID NO：193)、Rv1253(SEQ ID NO：196)、Rv1980(SEQ ID NO：199)、Rv3628(SEQ ID NO：202)、Rv1884(SEQ ID NO：205)、Rv3872(SEQ ID NO：208)、Rv3873(SEQ ID NO：211)、Rv1511(SEQ ID NO：214)和Rv3875(SEQ ID NO：292)，或者其免疫原部分；以及(b)检测生物样品中存在的与所述抗原或部分结合的抗体和/或T细胞。

在具体实施方案中，检测生物样品中的结核分枝杆菌感染的方法包括：用融合多肽与生物样品进行接触，所述融合多肽选自：DID85(SEQ ID NO：265)、DID92(SEQ ID NO：273)、DID108(SEQ ID NO：283)和DID93(SEQ ID NO：291)；以及检测生物样品中存在的与所述融合多肽结合的抗体和/或T细胞。

在另一个具体实施方案中，本发明提供了检测生物样品中的结核分枝杆菌感染的诊断试剂盒，所述试剂盒包含：(a)两种或多种抗原的组合，所述抗原选自Rv0164(SEQ ID NO：1)、Rv0496(SEQ ID NO：6)、Rv2608(SEQ ID NO：26)、Rv3020(SEQ ID NO：36)、Rv3478(SEQ IDNO：41)、Rv3619(SEQ ID NO：46)、Rv3620(SEQ ID NO：51)、RV1738(SEQ ID NO：11)、Rv1813(SEQ ID NO：16)、Rv3810(SEQ ID NO：56)、Rv2389(SEQ ID NO：21)、Rv2866(SEQ ID NO：31)、Rv3876(SEQ IDNO：61)、Rv0054(SEQ ID NO：100)、Rv0410(SEQ ID NO：106)、Rv0655(SEQ ID NO：112)、Rv0831(SEQ ID NO：115)、Rv1009(SEQ ID NO：118)、Rv1099(SEQ ID NO：121)、Rv1240(SEQ ID NO：124)、Rv1288(SEQ ID NO：127)、Rv1410(SEQ ID NO：130)、Rv1569(SEQ ID NO：133)、Rv1789(SEQ ID NO：136)、Rv1818(SEQ ID NO：139)、Rv1860(SEQ ID NO：142)、Rv1886(SEQ ID NO：145)、Rv1908(SEQ ID NO：148)、Rv2220(SEQ ID NO：154)、Rv2032(SEQ ID NO：151)、Rv2623(SEQ ID NO：160)、Rv2875(SEQ ID NO：163)、Rv3044(SEQ ID NO：166)、Rv3310(SEQ ID NO：169)和Rv3881(SEQ ID NO：178)、Rv0577(SEQ ID NO：184)、Rv1626(SEQ ID NO：187)、Rv0733(SEQ ID NO：190)、Rv2520(SEQ ID NO：193)、Rv1253(SEQ ID NO：196)、Rv1980(SEQ ID NO：199)、Rv3628(SEQ ID NO：202)、Rv1884(SEQ ID NO：205)、Rv3872(SEQ ID NO：208)、Rv3873(SEQ ID NO：211)、Rv1511(SEQ ID NO：214)和Rv3875(SEQ ID NO：292)，或其免疫原部分；以及(b)检测试剂。

在具体实施方案中，本发明用于检测生物样品中结核分枝杆菌感染的试剂盒包含：选自DID85(SEQ ID NO：265)、DID92(SEQ ID NO：273)、DID108(SEQ ID NO：283)和DID93(SEQ ID NO：291)的融合多肽，以及检测试剂。

附图简述

图1显示了抗原刺激的人PBMC释放的IFN-γ水平。PPD^-和PPD⁺PBMC在培养基、10μg/ml PHA、10μg/ml Mtb裂解物、50μg/ml Mtb重组蛋白中温育72小时。图中显示了PPD⁺(n＝18)和PPD^-(n＝7)PBMC的平均值(平均值_Ag-平均值_培养基)±SEM。

图2显示了用不同Mtb重组蛋白进行体外抗原刺激时TNF⁺脾细胞的水平。感染了低剂量有毒力的结核分枝杆菌H37Rv的小鼠被感染后第4周和12周采集脾细胞，通过ELISPOT检测其抗原特异性TNF细胞因子反应。脾细胞在培养基、10μg/ml Mtb裂解物或者10μg/ml Mtb重组蛋白中温育48小时。显示的数据是代表性实验中的平均值±SD(n＝2)。

图3A-3D显示了抗结核分枝杆菌的保护作用和抗原特异性免疫反应。图3A显示用结核分枝杆菌进行气雾剂攻击后，免疫过的小鼠肺部的Log10 CFU。用CpG、三种不同Mtb Rv抗原或其组合免疫过的小鼠，在用50-100Mtb杆菌进行气雾剂攻击后四周采集肺。在琼脂板上体外生长两周后计数CFU。显示的数据是代表性实验中的平均值±SEM。图3B显示了血清IgG2c抗体终点滴度。用CpG、三种不同Mtb Rv抗原或其组合免疫过的小鼠(n＝3-6)，在第三次免疫后一周收集血清，经ELISA检测抗原特异性IgG2c抗体。来自CpG组的血清针对所有Rv抗原进行检测，而其他血清针对免疫时使用的Rv抗原进行检测。显示的数据是代表性实验的平均值±SD。图3C显示了抗原刺激的脾细胞释放的IFN-γ。用CpG、三种不同Mtb Rv抗原或其组合免疫过的小鼠，在第三次免疫后三周采集脾细胞，经ELISA测试抗原特异性IFN-γ细胞因子反应。所述脾细胞在培养基中，或10μg/ml用于免疫的Rv抗原温育72小时。显示的数据是代表性实验中的平均值±SD(n＝3)。图3D显示了应答抗原特异性刺激时TNF+脾细胞的相对频数。用CpG、三种不同Mtb Rv抗原或其组合免疫过的小鼠，在第三次免疫后三周采集脾细胞，经ELISPOT测试抗原特异性IFN细胞因子反应。所述脾细胞在培养基中，或10μg/ml用于免疫的Rv抗原中温育48小时。显示的数据是代表性实验中的平均值±SD(n＝3)。

图4A-4B显示了带有GLA-SE的ID83和ID93融合蛋白在C57BL/6小鼠中的免疫原性。图4A显示抗原特异性血清IgGI和1gG2c抗体终点滴度。用盐水、GLA-SE佐剂配方中的ID83或ID93融合蛋白免疫的小鼠在第三次免疫后一周收集血清，经ELISA检测ID83和ID93特异性IgGI和IgG2c抗体。显示的数据是代表性实验中的平均值±SD。图4B显示了抗原刺激的脾细胞释放的IFN-γ水平。用GLA-SE佐剂配方中的ID83或ID93免疫的小鼠在第三次免疫后三周收集脾细胞，经ELISA检测抗原特异性IFN-γ细胞因子反应。脾细胞在培养基、3μg/mlConA，或10μg/ml ID83或ID93融合蛋白中温育72小时。显示的数据是代表性实验中的平均值±SD(n＝3)。

图5A-5B显示了不同佐剂配方的ID83在C57BL/6小鼠中的免疫原性。图5A显示了抗原特异性血清IgGI和1gG2c抗体终点滴度。小鼠(n＝3-6)用盐水、不同佐剂配方的ID83融合蛋白免疫，在第三次免疫后一周收集血清，经ELISA检测ID83特异性IgGI和IgG2c抗体。显示的数据是代表性实验中的平均值±SD。图5B显示了抗原刺激的脾细胞释放的IFN-γ的水平。小鼠用盐水、或不同佐剂配方的ID83免疫，在第三次免疫后三周收集脾细胞，经ELISA检测抗原特异性IFN-γ细胞因子。脾细胞在培养基、3μg/ml ConA，或10μg/mlID83融合蛋白中温育72小时。显示的数据是代表性实验中的平均值±SD(n＝3)。

图6显示了经含有GLA/CpG-SE的ID83融合蛋白免疫的豚鼠，在用Mtb感染后的存活率。用单剂量的BCG或者三次剂量的含有GLA/CpG-SE佐剂的ID83免疫的豚鼠，在最后一次强化后四周，用低剂量结核分枝杆菌H37Rv气雾剂攻击。对存活率监测200天，直至安慰剂组(盐水)中3/4的动物死亡。

图7A-7B显示了Ad5-ID83特异性免疫反应和抗结核分枝杆菌攻击的保护作用。图7A显示了IFN-γ+脾细胞应答抗原特异性刺激的相对频数。用盐水、或5x10⁹ Ad5-ID83病毒颗粒免疫的小鼠，在第三次免疫后三周收集脾细胞，经ELISPOT检测抗原特异性IFN-γ细胞因子应答。脾细胞在培养基或10μg/ml ID83融合蛋白中温育48小时。显示的数据是代表性实验中的平均值±SD(n＝3)。图7B显示了用结核分枝杆菌进行气雾剂攻击后，免疫过的小鼠肺部的Log10 CFU。用盐水或5x10⁹ Ad5-ID83病毒颗粒免疫过的小鼠，在用50-100Mtb杆菌进行气雾剂攻击后四周采集肺。在琼脂板上体外生长两周后，计数CFU。显示的数据是代表性实验的平均值±SEM。

图8显示了感染结核分枝杆菌的SWR小鼠(n＝8)用抗生素(Rx，利福平(rifampin)+异烟肼(ioniazide)60天)和免疫疗法(注射三次含有Rv2608、Rv1813和Rv3620与GLA-SE的混合物)联合治疗，用抗生素单独治疗(Rx，利福平+异烟肼60天)或者不治疗(盐水)时，小鼠的存活率。结果显示药物+免疫疗法的组合延长了感染结核分枝杆菌的小鼠的存活率。

图9显示了ELISA实验的结果，其中分析了一组痰阳性、确诊为Tb的血清样品(n＝80-92)和一组Tb阴性的健康对照血清与选定Tb抗原的反应性。结果显示采用不同的抗原组合可以得到100％阳性反应。

序列标识符简述

SEQ ID NO：1代表Mtb Rv0164的预测的氨基酸序列。

SEQ ID NO：2代表PCR扩增的编码Mtb Rv0164的核酸序列的序列。

SEQ ID NO：3代表重组Mtb Rv0164的氨基酸序列，包括组氨酸标签。

SEQ ID NOs：4和5代表用于扩增Mtb Rv0164的引物。

SEQ ID NO：6代表Mtb Rv0496的预测的氨基酸序列。

SEQ ID NO：7代表PCR扩增的编码Mtb Rv0496的核酸序列的序列。

SEQ ID NO：8代表重组Mtb Rv0496的氨基酸序列，包括组氨酸标签。

SEQ ID NOs：9和10代表用于扩增Mtb Rv0496的引物。

SEQ ID NO：11代表Mtb Rv1738的预测的氨基酸序列。

SEQ ID NO：12代表PCR扩增的编码Mtb Rv1738的核酸序列的序列。

SEQ ID NO：13代表重组Mtb Rv1738的氨基酸序列，包括组氨酸标签。

SEQ ID NOs：14和15代表用于扩增Mtb Rv1738的引物。

SEQ ID NO：16代表Mtb Rv1813的预测的氨基酸序列。

SEQ ID NO：17代表PCR扩增的编码Mtb Rv1813的核酸序列的序列。

SEQ ID NO：18代表重组Mtb Rv1813的氨基酸序列，包括组氨酸标签。

SEQ ID NOs：19和20代表用于扩增Mtb Rv1813的引物。

SEQ ID NO：21代表Mtb Rv2389的预测的氨基酸序列。

SEQ ID NO：22代表PCR扩增的编码Mtb Rv2389的核酸序列的序列。

SEQ ID NO：23代表重组Mtb Rv2389的氨基酸序列，包括组氨酸标签。

SEQ ID NOs：24和25代表用于扩增Mtb Rv2389的引物。

SEQ ID NO：26代表Mtb Rv2608的预测的氨基酸序列。

SEQ ID NO：27代表PCR扩增的编码Mtb Rv2608的核酸序列的序列。

SEQ ID NO：28代表重组Mtb Rv2608的氨基酸序列，包括组氨酸标签。

SEQ ID NOs：29和30代表用于扩增Mtb Rv2608的引物。

SEQ ID NO：31代表Mtb Rv2866的预测的氨基酸序列。

SEQ ID NO：32和33代表用于扩增Mtb Rv2866的引物。

SEQ ID NO：34代表PCR扩增的编码Mtb Rv2866的核酸序列的序列。

SEQ ID NO：35代表重组Mtb Rv2866的氨基酸序列，包括组氨酸标签。

SEQ ID NO：36代表Mtb Rv3020的预测的氨基酸序列。

SEQ ID NO：37代表PCR扩增的编码Mtb Rv3020的核酸序列的序列。

SEQ ID NO：38代表重组Mtb Rv3020的氨基酸序列，包括组氨酸标签。

SEQ ID NOs：39和40代表用于扩增Mtb Rv3020的引物。

SEQ ID NO：41代表Mtb Rv3478的预测的氨基酸序列。

SEQ ID NO：42代表PCR扩增的编码Mtb Rv3478的核酸序列的序列。

SEQ ID NO：43代表重组Mtb Rv3478的氨基酸序列，包括组氨酸标签。

SEQ ID NOs：44和45代表用于扩增Mtb Rv3478的引物。

SEQ ID NO：46代表Mtb Rv3619的预测的氨基酸序列。

SEQ ID NO：47代表PCR扩增的编码Mtb Rv3619的核酸序列的序列。

SEQ ID NO：48代表重组Mtb Rv3619的氨基酸序列，包括组氨酸标签。

SEQ ID NOs：49和50代表用于扩增Mtb Rv3619的引物。

SEQ ID NO：51代表Mtb Rv3620的预测的氨基酸序列。

SEQ ID NO：52代表PCR扩增的编码Mtb Rv3620的核酸序列的序列。

SEQ ID NO：53代表重组Mtb Rv3620的氨基酸序列，包括组氨酸标签。

SEQ ID NOs：54和55代表用于扩增Mtb Rv3620的引物。

SEQ ID NO：56代表Mtb Rv3810的预测的氨基酸序列。

SEQ ID NO：57代表PCR扩增的编码Mtb Rv3810的核酸序列的序列。

SEQ ID NO：58代表重组Mtb Rv3810的氨基酸序列，包括组氨酸标签。

SEQ ID NOs：59和60代表用于扩增Mtb Rv3810的引物。

SEQ ID NO：61代表Mtb Rv3876的预测的氨基酸序列。

SEQ ID NO：62代表PCR扩增的编码Mtb Rv3876的核酸序列的序列。

SEQ ID NO：63代表重组Mtb Rv3876的氨基酸序列，包括组氨酸标签。

SEQ ID NOs：64和65代表用于扩增Mtb Rv3876的引物。

SEQ ID NO：66代表编码融合多肽Mtb36f.1的多核苷酸序列。

SEQ ID NO：67代表重组Mtb融合多肽Mtb36f.1的氨基酸序列，包括组氨酸标签。

SEQ ID NOs：68-71代表用于扩增和克隆Mtb36f.1的引物。

SEQ ID NO：72代表编码融合多肽ID58的多核苷酸序列。

SEQ ID NOs：73-78代表用于扩增和克隆ID58的引物。

SEQ ID NO：79代表重组Mtb融合多肽ID58的氨基酸序列，包括组氨酸标签。

SEQ ID NO：80代表编码融合多肽ID69的多核苷酸序列。

SEQ ID NOs：81-82代表用于扩增和克隆ID69的引物。

SEQ ID NO：83代表重组Mtb融合多肽ID69的氨基酸序列，包括组氨酸标签。

SEQ ID NO：84代表编码融合多肽ID83的多核苷酸序列。

SEQ ID NOs：85-90代表用于扩增和克隆ID83的引物。

SEQ ID NO：91代表重组Mtb融合多肽ID83的氨基酸序列，包括组氨酸标签。

SEQ ID NO：92代表编码融合多肽ID94的多核苷酸序列。

SEQ ID NOs：93-94代表用于扩增和克隆ID94的引物。

SEQ ID NO：95代表重组Mtb融合多肽ID94的氨基酸序列，包括组氨酸标签。

SEQ ID NO：96代表编码融合多肽ID95的多核苷酸序列。

SEQ ID NO：97代表重组Mtb融合多肽ID95的氨基酸序列，包括组氨酸标签。

SEQ ID NO：98代表编码融合多肽ID120的多核苷酸序列。

SEQ ID NO：99代表重组Mtb融合多肽ID120的氨基酸序列，包括组氨酸标签。

SEQ ID NO：100代表Rv0054的预测的氨基酸序列。

SEQ ID NO：101代表PCR扩增的编码Rv0054的核酸序列的序列。

SEQ ID NO：102代表重组Rv0054的氨基酸序列，包括组氨酸标签。

SEQ ID NO：103代表Rv0164的预测的氨基酸序列。

SEQ ID NO：104代表PCR扩增的编码Rv0164的核酸序列的序列。

SEQ ID NO：105代表重组Rv0164的氨基酸序列，包括组氨酸标签。

SEQ ID NO：106代表Rv0410的预测的氨基酸序列。

SEQ ID NO：107代表PCR扩增的编码Rv0410的核酸序列的序列。

SEQ ID NO：108代表重组Rv0410的氨基酸序列，包括组氨酸标签。

SEQ ID NO：109代表Rv0496的预测的氨基酸序列。

SEQ ID NO：110代表PCR扩增的编码Rv0496的核酸序列的序列。

SEQ ID NO：111代表重组Rv0496的氨基酸序列，包括组氨酸标签。

SEQ ID NO：112代表Rv0655的预测的氨基酸序列。

SEQ ID NO：113代表PCR扩增的编码Rv0655的核酸序列的序列。

SEQ ID NO：114代表重组Rv0655的氨基酸序列，包括组氨酸标签。

SEQ ID NO：115代表Rv0831的预测的氨基酸序列。

SEQ ID NO：116代表PCR扩增的编码Rv0831的核酸序列的序列。

SEQ ID NO：117代表重组Rv0831的氨基酸序列，包括组氨酸标签。

SEQ ID NO：118代表Rv1009的预测的氨基酸序列。

SEQ ID NO：119代表PCR扩增的编码Rv1009的核酸序列的序列。

SEQ ID NO：120代表重组Rv1009的氨基酸序列，包括组氨酸标签。

SEQ ID NO：121代表Rv1099的预测的氨基酸序列。

SEQ ID NO：122代表PCR扩增的编码Rv1099的核酸序列的序列。

SEQ ID NO：123代表重组Rv1099的氨基酸序列，包括组氨酸标签。

SEQ ID NO：124代表Rv1240的预测的氨基酸序列。

SEQ ID NO：125代表PCR扩增的编码Rv1240的核酸序列的序列。

SEQ ID NO：126代表重组Rv1240的氨基酸序列，包括组氨酸标签。

SEQ ID NO：127代表Rv1288的预测的氨基酸序列。

SEQ ID NO：128代表PCR扩增的编码Rv1288的核酸序列的序列。

SEQ ID NO：129代表重组Rv1288的氨基酸序列，包括组氨酸标签。

SEQ ID NO：130代表Rv1410的预测的氨基酸序列。

SEQ ID NO：131代表PCR扩增的编码Rv1410的核酸序列的序列。

SEQ ID NO：132代表重组Rv1410的氨基酸序列，包括组氨酸标签。

SEQ ID NO：133代表Rv1569的预测的氨基酸序列。

SEQ ID NO：134代表PCR扩增的编码Rv1569的核酸序列的序列。

SEQ ID NO：135代表重组Rv1569的氨基酸序列，包括组氨酸标签。

SEQ ID NO：136代表Rv1789的预测的氨基酸序列。

SEQ ID NO：137代表PCR扩增的编码Rv1789的核酸序列的序列。

SEQ ID NO：138代表重组Rv1789的氨基酸序列，包括组氨酸标签。

SEQ ID NO：139代表Rv1818的预测的氨基酸序列。

SEQ ID NO：140代表PCR扩增的编码Rv1818的核酸序列的序列。

SEQ ID NO：141代表重组Rv1818的氨基酸序列，包括组氨酸标签。

SEQ ID NO：142代表Rv1860的预测的氨基酸序列。

SEQ ID NO：143代表PCR扩增的编码Rv1860的核酸序列的序列。

SEQ ID NO：144代表重组Rv1860的氨基酸序列，包括组氨酸标签。

SEQ ID NO：145代表Rv1886的预测的氨基酸序列。

SEQ ID NO：146代表PCR扩增的编码Rv1886的核酸序列的序列。

SEQ ID NO：147代表重组Rv1886的氨基酸序列，包括组氨酸标签。

SEQ ID NO：148代表Rv1908的预测的氨基酸序列。

SEQ ID NO：149代表PCR扩增的编码Rv1908的核酸序列的序列。

SEQ ID NO：150代表重组Rv1908的氨基酸序列，包括组氨酸标签。

SEQ ID NO：151代表Rv2032的预测的氨基酸序列。

SEQ ID NO：152代表PCR扩增的编码Rv2032的核酸序列的序列。

SEQ ID NO：153代表重组Rv2032的氨基酸序列，包括组氨酸标签。

SEQ ID NO：154代表Rv2220的预测的氨基酸序列。

SEQ ID NO：155代表PCR扩增的编码Rv2220的核酸序列的序列。

SEQ ID NO：156代表重组Rv2220的氨基酸序列，包括组氨酸标签。

SEQ ID NO：157代表Rv2608的预测的氨基酸序列。

SEQ ID NO：158代表PCR扩增的编码Rv2608的核酸序列的序列。

SEQ ID NO：159代表重组Rv2608的氨基酸序列，包括组氨酸标签。

SEQ ID NO：160代表Rv2623的预测的氨基酸序列。

SEQ ID NO：161代表PCR扩增的编码Rv2623的核酸序列的序列。

SEQ ID NO：162代表重组Rv2623的氨基酸序列，包括组氨酸标签。

SEQ ID NO：163代表Rv2875的预测的氨基酸序列。

SEQ ID NO：164代表PCR扩增的编码Rv2875的核酸序列的序列。

SEQ ID NO：165代表重组Rv2875的氨基酸序列，包括组氨酸标签。

SEQ ID NO：166代表Rv3044的预测的氨基酸序列。

SEQ ID NO：167代表PCR扩增的编码Rv3044的核酸序列的序列。

SEQ ID NO：168代表重组Rv3004的氨基酸序列，包括组氨酸标签。

SEQ ID NO：169代表Rv3310的预测的氨基酸序列。

SEQ ID NO：170代表PCR扩增的编码Rv3310的核酸序列的序列。

SEQ ID NO：171代表重组Rv3310的氨基酸序列，包括组氨酸标签。

SEQ ID NO：172代表Rv3619的预测的氨基酸序列。

SEQ ID NO：173代表PCR扩增的编码Rv3619的核酸序列的序列。

SEQ ID NO：174代表重组Rv3619的氨基酸序列，包括组氨酸标签。

SEQ ID NO：175代表Rv3810的预测的氨基酸序列。

SEQ ID NO：176代表PCR扩增的编码Rv3810的核酸序列的序列。

SEQ ID NO：177代表重组Rv3810的氨基酸序列，包括组氨酸标签。

SEQ ID NO：178代表Rv3881的预测的氨基酸序列。

SEQ ID NO：179代表PCR扩增的编码Rv3881的核酸序列的序列。

SEQ ID NO：180代表重组Rv3881的氨基酸序列，包括组氨酸标签。

SEQ ID NO：181代表Rv0455的预测的氨基酸序列。

SEQ ID NO：182代表PCR扩增的编码Rv0455的核酸序列的序列。

SEQ ID NO：183代表重组Rv0455的氨基酸序列，包括组氨酸标签。

SEQ ID NO：184代表Rv0577的预测的氨基酸序列。

SEQ ID NO：185代表PCR扩增的编码Rv0577的核酸序列的序列。

SEQ ID NO：186代表重组Rv0577的氨基酸序列，包括组氨酸标签。

SEQ ID NO：187代表Rv1626的预测的氨基酸序列。

SEQ ID NO：188代表PCR扩增的编码Rv1626的核酸序列的序列。

SEQ ID NO：189代表重组Rv1626的氨基酸序列，包括组氨酸标签。

SEQ ID NO：190代表Rv0733的预测的氨基酸序列。

SEQ ID NO：191代表PCR扩增的编码Rv0733的核酸序列的序列。

SEQ ID NO：192代表重组Rv0733的氨基酸序列，包括组氨酸标签。

SEQ ID NO：193代表Rv2520的预测的氨基酸序列。

SEQ ID NO：194代表PCR扩增的编码Rv2520的核酸序列的序列。

SEQ ID NO：195代表重组Rv2520的氨基酸序列，包括组氨酸标签。

SEQ ID NO：196代表Rv1253的预测的氨基酸序列。

SEQ ID NO：197代表PCR扩增的编码Rv1253的核酸序列的序列。

SEQ ID NO：198代表重组Rv1253的氨基酸序列，包括组氨酸标签。

SEQ ID NO：199代表Rv1980的预测的氨基酸序列。

SEQ ID NO：200代表PCR扩增的编码Rv1980的核酸序列的序列。

SEQ ID NO：201代表重组Rv1980的氨基酸序列，包括组氨酸标签。

SEQ ID NO：202代表Rv3628的预测的氨基酸序列。

SEQ ID NO：203代表PCR扩增的编码Rv3628的核酸序列的序列。

SEQ ID NO：204代表重组Rv3628的氨基酸序列，包括组氨酸标签。

SEQ ID NO：205代表Rv1884的预测的氨基酸序列。

SEQ ID NO：206代表PCR扩增的编码Rv1884的核酸序列的序列。

SEQ ID NO：207代表重组Rv1884的氨基酸序列，包括组氨酸标签。

SEQ ID NO：208代表Rv3872的预测的氨基酸序列。

SEQ ID NO：209代表PCR扩增的编码Rv3872的核酸序列的序列。

SEQ ID NO：210代表重组Rv3872的氨基酸序列，包括组氨酸标签。

SEQ ID NO：211代表Rv3873的预测的氨基酸序列。

SEQ ID NO：212代表PCR扩增的编码Rv3873的核酸序列的序列。

SEQ ID NO：213代表重组Rv3873的氨基酸序列，包括组氨酸标签。

SEQ ID NO：214代表Rv1511的预测的氨基酸序列。

SEQ ID NO：215代表PCR扩增的编码Rv1511的核酸序列的序列。

SEQ ID NO：216代表重组Rv1511的氨基酸序列，包括组氨酸标签。

SEQ ID NO：217代表编码融合多肽ID93的多核苷酸序列。

SEQ ID NOs：218-225代表用于扩增和克隆ID93的引物。

SEQ ID NO：226代表重组Mtb融合多肽ID93的氨基酸序列，包括组氨酸标签。

SEQ ID NO：227代表编码融合多肽ID91的多核苷酸序列。

SEQ ID NOs：228-235代表用于扩增和克隆ID91的引物。

SEQ ID NO：236代表重组Mtb融合多肽ID91的氨基酸序列，包括组氨酸标签。

SEQ ID NO：237代表编码融合多肽ID71的多核苷酸序列。

SEQ ID NOs：238-244代表用于扩增和克隆ID71的引物。

SEQ ID NO：245代表重组Mtb融合多肽ID71的氨基酸序列，包括组氨酸标签。

SEQ ID NO：246代表编码融合多肽ID114的多核苷酸序列。

SEQ ID NOs：247-250代表用于扩增和克隆ID114的引物。

SEQ ID NO：251代表重组Mtb融合多肽ID114的氨基酸序列，包括组氨酸标签。

SEQ ID NO：252代表编码融合多肽ID125的多核苷酸序列。

SEQ ID NOs：253-256代表用于扩增和克隆ID125的引物。

SEQ ID NO：257代表重组Mtb融合多肽ID125的氨基酸序列，包括组氨酸标签。

SEQ ID NO：258代表编码融合多肽DID85的多核苷酸序列。

SEQ ID NOs：259-264代表用于扩增和克隆DID85的引物。

SEQ ID NO：265代表重组Mtb融合多肽DID85的氨基酸序列，包括组氨酸标签。

SEQ ID NO：266代表编码融合多肽DID92的多核苷酸序列。

SEQ ID NOs：267-272代表用于扩增和克隆DID92的引物。

SEQ ID NO：273代表重组Mtb融合多肽DID92的氨基酸序列，包括组氨酸标签。

SEQ ID NO：274代表编码融合多肽DID108的多核苷酸序列。

SEQ ID NOs：275-282代表用于扩增和克隆DID108的引物。

SEQ ID NO：283代表重组Mtb融合多肽DID108的氨基酸序列，包括组氨酸标签。

SEQ ID NO：284代表编码融合多肽DID93的多核苷酸序列。

SEQ ID NOs：285-290代表用于扩增和克隆DID93的引物。

SEQ ID NO：291代表重组Mtb融合多肽DID93的氨基酸序列，包括组氨酸标签。

SEQ ID NO：292代表Rv3875的预测的氨基酸序列。

SEQ ID NO：293代表PCR扩增的编码Rv3875的核酸序列的序列。

SEQ ID NO：294代表重组Rv3875的氨基酸序列，包括组氨酸标签。

SEQ ID NOs：295-296代表用于扩增和克隆Rv0577的引物。

SEQ ID NOs：297-298代表用于扩增和克隆Rv1626的引物。

SEQ ID NOs：299-300代表用于扩增和克隆Rv0733的引物。

SEQ ID NOs：301-302代表用于扩增和克隆Rv2520的引物。

SEQ ID NOs：303-304代表用于扩增和克隆Rv1253的引物。

SEQ ID NOs：305-306代表用于扩增和克隆Rv1980的引物。

SEQ ID NOs：307-308代表用于扩增和克隆Rv3628的引物。

SEQ ID NOs：309-310代表用于扩增和克隆Rv1844的引物。

SEQ ID NOs：311-312代表用于扩增和克隆Rv3872的引物。

SEQ ID NOs：313-314代表用于扩增和克隆Rv3873的引物。

SEQ ID NOs：315-316代表用于扩增和克隆Rv1511的引物。

SEQ ID NOs：317-318代表用于扩增和克隆Rv3875的引物。

发明详述

本发明涉及包含分枝杆菌抗原的强抗原性/免疫原性组合物。本发明的组合物通常包含结核复合菌群中的分枝杆菌菌种中的至少两种异源多肽。结核复合菌群中的分枝杆菌菌种包括那些传统上被认为导致结核病的菌种，以及在诸如AIDS患者的免疫缺陷患者中引起结核和肺部疾病的分枝杆菌的环境和机会致病菌，例如结核分枝杆菌(Mtb)、牛分枝杆菌或非洲分枝杆菌(Mycobacterium africanum)、BCG、鸟分枝杆菌(Mycobacterium avium)、胞内分枝杆菌(Mycobacteriumintracellulare)、隐藏分枝杆菌(Mycobacterium celatum)、日内瓦分枝杆菌(Mycobacterium genavense)、嗜血分枝杆菌(Mycobacteriumhaemophilum)、堪萨斯分枝杆菌(Mycobacterium kansasii)、猿分枝杆菌(Mycobacterium simiae)、母牛分枝杆菌(Mycobacterium vaccae)、偶发分枝杆菌(Mycobacterium fortuitum)和瘰疬分枝杆菌(Mycobacteriumscrofulaceum)(参见，例如Harrison′s Principles of Internal Medicine，volume 1，1004-1014和1019-1020页)。在优选实施方案中，按照本发明要预防、治疗或诊断的分枝杆菌种类是结核分枝杆菌(Mtb)。来自分枝杆菌种类的抗原的序列很容易获得。例如，在Cole et al.，Nature393：537(1998)中，以及诸如Wellcome Trust Sanger Institute和巴斯德研究所维护的网址可以找到结核分枝杆菌的序列。

A.分枝杆菌抗原及其融合物

本发明一方面提供了如本文描述的分离的分枝杆菌多肽(包括融合多肽)，以及含有所述多肽的组合物。通常，本发明的多肽是分离的多肽，并且可能是本文公开的氨基酸序列的片段(例如，抗原性/免疫原性部分)，或者可能包含本文公开的完整氨基酸序列。可以利用常规的重组和/或合成技术制备本发明的多肽、其抗原性/免疫原性片段，以及其他变体。

在某些优选实施方案中，本发明的多肽是抗原/免疫原性的，即它们与来自被感染个体的抗血清和/或T细胞在免疫分析(诸如ELISA或T细胞刺激分析法)中可检测地反应。利用本领域技术人员公知的技术可以对免疫原活性进行筛选。例如，利用诸如Harlow and Lane，Antibodies：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，1988中描述的那些方法可以进行这类筛选。在一个示范性实例中，可以将多肽固定在固体支撑物上，并与患者血清接触以便血清中的抗体与固定多肽结合。然后除去未结合的血清，利用例如¹²⁵I标记的蛋白A检测结合的抗体。

正如本领域技术人员会意识到的，本文公开的多肽的免疫原性部分也被本发明所涵盖。用于本文，“免疫原性部分”是指发明所述免疫原性多肽的片段，该片段本身即与识别所述多肽的B细胞和/或T细胞表面抗原受体有免疫反应性(即特异结合)。通常可以利用诸如Paul，Fundamental Immunology，3rd ed.，243-247(Raven Press，1993)及其中引用的参考文献中总结的那些公知技术来鉴定免疫原性部分。这类技术包括筛选具备与抗原特异性抗体、抗血清和/或T细胞系或克隆反应的能力的多肽。如本文所用，抗血清和抗体如果特异结合某抗原(即，它们在免疫分析中与该蛋白反应，而不与无关蛋白有可检测的反应)，它们是“抗原特异性的”。如本文所述，可以利用公知技术制备这类抗血清和抗体。

在具体实施方案中，本发明的多肽的抗原性/免疫原性部分是这样的部分，所述部分与抗血清和/或T细胞反应的水平不明显低于全长多肽的反应性(例如，在ELISA和/或T细胞反应分析中)。优选地，所述抗原性/免疫原性部分的免疫原活性水平是全长多肽的免疫原性的至少大约50％，优选至少约70％，最优选约90％以上。在某些情况中，要鉴定的优选免疫原性部分，其免疫原活性高于相应全长多肽的活性，例如具有超过大约100％或150％或更高的免疫原活性。

本发明的多肽组合物还可以包含一个或多个多肽，所述多肽与T细胞和/或本发明所述多肽(具体说是具有本文公开的氨基酸序列的多肽，或其免疫原性片段或变体)的抗体能够发生免疫反应。

在本发明的另一个实施方案中，提供的多肽包含一个或多个多肽，所述一个或多个多肽能够激发T细胞和/或抗体，所述抗体能与本文公开的一个或多个多肽、或者本文公开的多核苷酸序列包含的连续多核苷酸序列编码的一个或多个多肽或者其免疫原性片段或变体、或者与这些序列中的一个或多个在中度到高度严格条件下杂交的一个或多个多核苷酸序列发生免疫反应。

本发明还提供了多肽片段，包括抗原性/免疫原性片段，所述片段包含大约5、10、15、20、25、50或100个连续氨基酸或更多，包括本文给出的所有中等长度的多肽组合物，或者由本文给出的多核苷酸序列编码的那些片段。

本发明另一方面提供了文中描述的多肽组合物的变体。本发明广泛涵盖的多肽变体一般表现出与文中给出的多肽序列至少大约70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％或更高的同一性(如下文所述确定)。

名词多肽″变体″用于本文是指这样的多肽，所述多肽与文中具体公开的多肽一般有一个或多个取代、缺失、添加和/或插入不同。这类变体可以是天然存在的，或者是合成产生的，例如利用本领域公知的众多技术中的任一种，通过对本发明上述一个或多个多肽序列进行修饰，并如文中所述对其免疫原活性进行评价。

例如，本发明所述多肽的某些示例性变体包括那些去除了诸如N末端引导序列或者跨膜结构域的一个或多个部分的多肽。其他示例性变体包括从成熟蛋白的N和/或C末端去除了一小部分(例如大约1-30个氨基酸)的变体。

许多情况中，所述变体含有保守取代。“保守取代”是其中的氨基酸被另一个性质类似的氨基酸取代的那些取代，以致肽化学领域的技术人员会预期多肽的二级结构和亲水性基本不变。正如上文所述，可以在本发明所述多核苷酸和多肽的结构中进行修饰，而仍得到具有所需特性(例如免疫原特性)的编码变体或衍生多肽的功能分子。当需要对多肽的氨基酸序列进行改动来制备本发明所述多肽的等同体，或者甚至是改善的免疫原性变体或部分时，本领域技术人员一般会根据表1改变编码DNA序列中的一个或多个密码子。

例如，将蛋白质结构中的某些氨基酸取代为其他氨基酸，而没有可察觉地失去与诸如抗体的抗原结合区或者底物分子上的结合位点这样的结构的相互结合能力。因为蛋白质的生物功能活性是由蛋白质的相互作用能力和性质限定的，可以在蛋白质序列中，当然也可以在其DNA编码序列中进行某些氨基酸序列取代，而仍得到性能类似的蛋白质。因此预期在公开的组合物的肽序列中，或者在编码所述肽的相应DNA序列中进行各种改变，而不会可察觉地失去它们的生物用途或活性。

表1

在进行这类改变时，可能要考虑氨基酸的亲水指数。现有技术(Kyteand Doolittle，1982，通过引用并入本文)通常都理解亲水氨基酸指数在赋予蛋白质相互作用生物功能方面的重要性。公认氨基酸的相对亲水特征对所得蛋白质的二级结构有作用，蛋白质的二级结构又限定了该蛋白与其他分子，例如酶、底物、受体、DNA、抗体、抗原等之间的相互作用。根据其疏水性和电荷特性给每个氨基酸分配了亲水指数(Kyte and Doolittle，1982)。这些数值是：异亮氨酸(+4.5)、缬氨酸(+4.2)、亮氨酸(+3.8)、苯丙氨酸(+2.8)、半胱氨酸/胱氨酸(+2.5)、甲硫氨酸(+1.9)、丙氨酸(+1.8)、甘氨酸(-0.4)、苏氨酸(-0.7)、丝氨酸(-0.8)、色氨酸(-0.9)、酪氨酸(-1.3)、脯氨酸(-1.6)、组氨酸(-3.2)、谷氨酸(-3.5)、谷氨酰胺(-3.5)、天冬氨酸(-3.5)、天冬酰胺(-3.5)、赖氨酸(-3.9)和精氨酸(-4.5)。

本领域已知某些氨基酸可以被其他具有类似亲水指数或评分的氨基酸取代，仍得到生物活性类似的蛋白质，即仍得到生物功能等同的蛋白质。在进行这类改变时，优选取代亲水指数在±2以内的氨基酸，更优选在±1以内的氨基酸，还更优选的是±0.5以内的氨基酸。本领域还理解，可以根据疏水性有效地进行类似氨基酸的取代。

正如美国专利4,554,101中详细描述的，已给氨基酸残基分配了如下疏水值：精氨酸(+3.0)、赖氨酸(+3.0)、天冬氨酸(+3.0±1)、谷氨酸(+3.0±1)、丝氨酸(+0.3)、天冬酰胺(+0.2)、谷氨酰胺(+0.2)、甘氨酸(0)、苏氨酸(-0.4)、脯氨酸(-0.5±1)、丙氨酸(-0.5)、组氨酸(-0.5)、半胱氨酸(-1.0)、甲硫氨酸(-1.3)、缬氨酸(-1.5)、亮氨酸(-1.8)、异亮氨酸(-1.8)、酪氨酸(-2.3)、苯丙氨酸(-2.5)、色氨酸(-3.4)。可以理解，氨基酸可以被取代为另一个具有类似疏水值的氨基酸，仍得到生物等同体，特别是免疫学上的等同蛋白。在进行这类改变时，优选取代疏水值在±2以内的氨基酸，更优选在±1以内的氨基酸，还更优选的是±0.5以内的氨基酸。

正如以上概括，因此氨基酸取代通常是基于氨基酸侧链取代基团的相对类似性，例如它们的疏水性、亲水性、电荷、大小等等。将上述各种特征考虑在内的示例性的取代对本领域技术人员是公知的，包括：精氨酸和赖氨酸；谷氨酸和天冬氨酸；丝氨酸和苏氨酸；谷氨酰胺和天冬酰胺；以及缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸。

此外，任何多核苷酸都可以进一步修饰以提高其体内稳定性。可能的修饰包括，但不限于在5′和/或3′末端添加侧翼序列；在骨架中使用磷酸硫酯或2′O-甲基而不是磷酸二酯键连接；和/或包含诸如肌苷、Q核苷(queosine)和怀丁苷(wybutosine)以及腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、胸腺嘧啶和尿嘧啶的乙酰基、甲基、巯基和其他修饰形式等非常规碱基。

还可以根据残基的极性、电荷、溶解性、疏水性、亲水性和/或两亲性性质来进行氨基酸取代。例如，带负电荷的氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸；带正电荷的氨基酸包括赖氨酸和精氨酸；具有类似疏水值的不带电的极性头部基团的氨基酸包括亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸；甘氨酸和丙氨酸；天冬酰胺和谷氨酰胺；以及丝氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸。其他可以代表保守变化的氨基酸组包括：(1)ala、pro、gly、glu、asp、gln、asn、ser、thr；(2)cys、ser、tyr、thr；(3)val、ile、leu、met、ala、phe；(4)lys、arg、his；和(5)phe、tyr、trp、his。变体还可以，或者可选择地，含有非保守改变。在优选实施方案中，变体多肽与天然序列区别在于5个或更少个氨基酸的取代、缺失或添加。还可以(或者可选择地)通过例如缺失或添加对多肽的免疫原性、二级结构和亲水性影响最小的氨基酸来修饰变体。

正如上文提及的，多肽可以在蛋白质的N-末端包含信号(或引导)序列，所述序列共翻译或翻译后指导蛋白质的转移。还可以将多肽偶联到连接子或其他序列以方便多肽的合成、纯化或鉴定(例如，多His)，或者提高多肽与固体支持物的结合。例如，多肽可以偶联到免疫球蛋白Fc区。

如下文所述，当比较多肽序列时，如果将两个序列对位排列(align)以得到最大对应时，其氨基酸序列是一样的，就说这两个序列是“相同的”。两个序列之间的比较一般是通过在比较窗内鉴定和比较局部序列的类似度来进行的。“比较窗”用于本文是指至少大约20个连续位点、通常是30个到大约75个，40个到大约50个连续位点的区段，其中在两个序列最优对位排列后，将序列与具有相同连续位点数目的参照序列进行比较。

用于比较的最优序列对位排列可以利用生物信息学软件(DNASTAR，Inc.，Madison，W1)的Lasergene suite中的Megalign程序，采用缺省参数来执行。该程序体现了以下参考文献中描述的几种序列比对方案：Dayhoff，M.O.(1978)A model of evolutionary change inproteins-Matrices for detecting distant relationships(Dayhoff，M.O.(编)Atlas of Protein Sequence and Structure，National Biomedical ResearchFoundation，Washington DC Vol.5，Suppl.3，pp.345-358)；Hein J.(1990)Unified Approach to Alignment and Phylogenes pp.626-645 Methods inEnzymology vol.183，Academic Press，Inc.，San Diego，CA；Higgins，D.G.and Sharp，P.M.(1989)CABIOS 5：151-153；Myers，E.W.and MullerW.(1988)CABIOS 4：11-17；Robinson，E.D.(1971)Comb.Theor77：105；Santou，N.Nes，M.(1987)MoI.Biol.Evol.4：406-425；Sneath，P.H.A.and Sokal，R.R.(1973)Numerical Taxonomy-the Principles andPractice of Numerical Taxonomy，Freeman Press，San Francisco，CA；Wilbur，W.J.and Lipman，DJ.(1983)Proc.Natl Acad.，Sci.USA80：726-730。

可选择地，用于序列比较的最优对位排列可以通过以下方法来执行，所述方法包括Smith和Waterman(1981)(Add.APL.Math2：482)的局部同一性算法；Needleman和Wunsch(1970)(J.Mol.Biol.48：443)的同一性比对算法；Pearson和Lipman(1988)(Proc.Nat′l Acad.Sci.USA85：2444)的搜索相似性的方法；这些算法的计算机应用(WisconsinGenetics软件包(Genetics Computer Group(GCG)，575 Science Dr.，Madison，WI)中的GAP、BESTFIT、BLAST、FASTA和TFASTA)，或者通过目测。

适用于确定序列同一性百分数和序列相似性的算法的一个优选实例是Altschul et al.(1977)Nucl.Acids Res.25：3389-3402和Altschul et al.(1990)J.Mol.Biol.215：403-410中分别描述的BLAST和BLAST 2.0算法。可以例如以本文描述的参数利用BLAST和BLAST 2.0来确定本发明的多核苷酸和多肽的序列同一性百分数。公众可以由国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information)获得进行BLAST分析的软件。对于氨基酸序列，可以利用评分矩阵来计算累计分。当累积比对分从它达到的最大值减少数值X时；由于一个或多个负分残基比对的累积，累积分到了零或以下；或者达到任一序列的末端时，终止每个方向的字段命中(word hits)延伸。BLAST算法参数W、T和X决定了比对的灵敏度和速度。

在一个优选方法中，“序列同一性百分数”是通过在至少20个位点的比较窗内比较两个最佳对位排列的序列来确定的，其中与用于两个序列的最佳对位排列的参照序列(不包含添加或缺失)相比，比较窗内的多肽序列部分可以包含20％或以下的添加或缺失(即空位)，通常是5到15％，或者10到12％。所述百分数的计算是通过确定两个序列中相同氨基酸残基的位点数目得到匹配位点的数目，用参照序列中的位点总数(即比较窗大小)去除匹配位点数，将结果乘以100得到序列同一性百分数。

在本发明的某些优选实施方案中，提供了结核分枝杆菌融合多肽，编码所述融合多肽的多核苷酸。融合多肽和融合蛋白是指这样的多肽，所述多肽含有至少两个直接或者经由氨基酸连接子共价连接的诸如结核分枝杆菌多肽的异源分枝杆菌多肽。形成融合蛋白的多肽一般是C末端与N末端连接，虽然它们也可以C末端连接C末端，N末端连接N末端，或者N末端连接C末端。融合蛋白中的多肽可以是任意顺序。融合多肽或融合蛋白也可以包含保守修饰的变体、多态变体、等位体、突变体、亚序列、种间同源基因和组成融合蛋白的抗原的免疫原性片段。Cole et al.，Nature 393：537(1998)中描述了结核分枝杆菌抗原，该文献公开了结核分枝杆菌的整个基因组。利用例如文中描述的序列比较算法，或者其他本领域技术人员已知的方法(例如杂交分析和抗体结合分析)可以鉴定到与所述结核分枝杆菌抗原对应的来自其他分枝杆菌种的抗原。

本发明的融合多肽通常包含至少两个文中描述的抗原性多肽，还可以包含其他无关序列，诸如协助提供辅助性T细胞表位，优选人识别的辅助性T细胞表位的序列(免疫融合伴侣)，或者协助以高于天然重组蛋白的产量来表达蛋白的序列(表达增强子)。某些优选的融合伴侣既是免疫增强融合伴侣，也是表达增强融合伴侣。也可以选择其他融合伴侣来增加蛋白的溶解性或者使蛋白被靶向到所希望的胞内区域。另外，融合伴侣包括协助蛋白纯化的亲和标签。

通常可以利用标准技术来制备融合蛋白。优选地，将融合蛋白表达为重组蛋白。例如，可以将编码所需融合多肽的多肽组分的DNA序列分别组装，并连接到合适的表达载体中。将编码一个多肽组分的DNA序列的3′端，借助或者不借助肽连接子连接到编码第二个多肽组分的DNA序列的5′端，使所述序列的读码框相符。这就允许翻译成保持两个组成多肽的生物活性的单一融合蛋白。

如果需要，可以利用肽连接子序列将第一和第二多肽组分分隔开足够的距离以便每个多肽折叠成它自己的二级和三级结构。这类肽连接子序列可以利用本领域公知的标准技术整合到融合蛋白中。可以根据以下因素来选择特定肽连接子序列：(1)其采取柔性的延伸构象的能力；(2)其不会采取干扰第一和第二多肽上的功能表位的二级结构；以及(3)没有可能与多肽功能表位反应的疏水或带电荷残基。优选的肽连接子序列含有Gly、Asn和Ser残基。诸如Thr和Ala这样的其他接近中性的氨基酸也可以用于连接子序列。可能用作连接子的氨基酸序列包括Maratea et al.，Gene 40：3946(1985)；Murphy et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83：82588262(1986)；美国专利4,935,233和4,751,180中公开的那些。所述连接子序列通常长1到大约50个氨基酸。当第一多肽和第二多肽具有非关键的N末端氨基酸区域可以用来分隔功能结构域，防止立体干扰时，连接子序列不是必需的。

连接在一起的DNA序列可操纵地连接合适的转录或翻译调控元件。负责DNA表达的调控元件仅位于编码第一多肽的DNA序列的5′方向。类似地，停止翻译所需的终止密码子和转录终止信号仅出现在编码第二多肽的DNA序列的3′方向。

在优选实施方案中，用于本发明的融合多肽的免疫融合伴侣来源于蛋白D，该蛋白是革兰氏阴性细菌B型流感嗜血杆菌的一种表面蛋白(WO 91/18926)。优选地，蛋白D衍生物包含蛋白的将近前三分之一(例如，N末端的前100-110个氨基酸)，并且蛋白D衍生物可以是脂化的。在特定的优选实施方案中，N末端包含了脂蛋白D融合伴侣的前109个残基以便给多肽提供额外的外源T细胞表位，并提高在大肠杆菌中的表达水平(从而作为一个表达增强子)。脂质尾部保证抗原最好地递呈给抗原递呈细胞。其他融合伴侣包括来自流感病毒的非结构蛋白-NS1(血凝素)。虽然可以使用包含辅助性T细胞表位的不同片段，一般是使用N末端的81个氨基酸。

在另一个实施方案中，免疫融合伴侣包含来源于被称为LYTA的蛋白的氨基酸序列，或其一部分(优选C末端部分)。LYTA来源于肺炎链球菌，该菌能合成被称为酰胺酶LYTA的N-乙酰-L-丙氨酸酰胺酶(由LytA基因编码；Gene 43：265-292(1986))。LYTA是特异降解肽聚糖骨架中的特定键的自溶素。LYTA蛋白的C末端结构域负责对胆碱或者诸如DEAE的某些胆碱类似物的亲和性。这一特性已被利用开发出用于表达融合蛋白的大肠杆菌C-LYTA表达质粒。氨基端含有C-LYTA片段的杂交蛋白的纯化已有描述(参见Biotechnology10：795-798(1992))。在优选实施方案中，可以将LYTA的重复部分并入融合蛋白中。所述重复部分可见于起始于残基178的C末端区。特别优选的重复部分包含残基188-305。

通常，多肽和融合多肽(以及它们的编码多核苷酸)是分离的。“分离的”多肽或多核苷酸是从初始环境移走的多肽或多核苷酸。例如，天然发生的蛋白如果与其自然系统中的某些或全部共存物质分开，就是分离的。这类多肽优选至少大约90％纯，更优选至少约95％纯，最优选至少约99％纯。例如如果多核苷酸被克隆到不是其天然环境的一部分的载体中，该多核苷酸被认为是分离的。

B.多核苷酸组合物

本发明还提供了分离的多核苷酸，特别是编码本发明所述融合多肽的多核苷酸，以及包含这些多核苷酸的组合物。术语“DNA”、“多核苷酸”以及“核酸”用于本文是指不含特定物种的总基因组DNA的分离的DNA分子。因此，编码多肽的DNA片段是指这样的DNA区段：所述区段含有一个或多个编码序列，但基本上与获得该DNA区段的物种的总基因组DNA是分离的，或者经纯化不含所述总基因组DNA。术语“DNA区段”和“多核苷酸”所涵盖的是DNA区段和这类区段的更小片段，以及重组载体，包括例如质粒、粘粒、噬菌粒(phagemids)、噬菌体、病毒等。

正如本领域技术人员能够理解的，本发明的多核苷酸序列可以包括基因组序列、基因组外和质粒编码的序列，以及能够表达、或者经改造表达蛋白质、多肽、肽等的更小的工程化基因区段。所述基因区段可以是自然分离的，或者人工合成修饰的。

正如本领域技术人员认识到的，所述多核苷酸可以是单链(编码链或反义链)或者双链的，可以是(基因组、cDNA或合成的)DNA或者RNA分子。本发明的多核苷酸中还可以，但不是必须存在额外的编码或非编码序列，所述多核苷酸可以，但不必须连接到其他分子和/或支持材料。

多核苷酸可以包含天然序列(即，编码分枝杆菌抗原或其部分的内源序列)，或者包含这类序列的变体、或者生物或抗原功能等同体。多核苷酸变体可以如下文进一步描述的，含有一个或多个取代、添加、缺失和/或插入，优选所编码的多肽相对天然蛋白，不丧失免疫原性。对所编码的多肽之免疫原性的影响通常可以按照下文的描述进行评估。术语“变体”还涵盖异种来源的同源基因。

在其他实施方案中，本发明提供了分离的多核苷酸，所述多核苷酸包含与本文公开的一个或多个序列相同或互补的不同长度的连续序列。例如，本发明提供的多核苷酸包含本文公开的一个或多个序列中的至少大约15、20、30、40、50、75、100、150、200、300、400、500或1000或更多个连续核苷酸，以及它们之间的所有中间长度。很容易理解，在本文中“中间长度”意味着所引用的数值之间的任意长度，诸如16、17、18、19等；21、22、23等；30、31、32等；50、51、52、53等；100、101、102、103等；150、151、152、153等；包括所有200到500，500到1000以及其他数值之间的整数。

本发明的多核苷酸或其片段，无论编码序列自身的长度，都可以与诸如启动子、多腺嘌呤化信号、额外的限制酶位点、多克隆位点、其他编码区段等等的其他DNA序列组合，因此它们的总长可能变化很大。因此，预期可以采用几乎任何长度的多核苷酸片段，优选制备方便性和它在预期的重组DNA方案中的用途所限定的总长。

此外，本领域普通技术人员能够理解，由于遗传密码的简并性，有许多核苷酸序列编码本文公开的多肽。这些多核苷酸中的一些与任何天然基因的核苷酸序列都只有最小的同源性。但是，由于使用的密码子不同而变化的多核苷酸是本发明尤其考虑的，例如进行了人和/或灵长动物密码子选择最优化的多核苷酸。并且，包含本文提供的多核苷酸序列的基因的等位基因在本发明的范围内。等位基因是因为诸如核苷酸的缺失、添加和/或取代的一个或多个突变而被改变的内源基因。得到的mRNA和蛋白质可能，但不必然具有改变的结构或功能。利用标准技术(诸如杂交、扩增和/或数据库序列比较的)可以鉴定到等位基因。

分枝杆菌多核苷酸及其融合物可以利用本领域已知和现有的多种成熟技术来制备、操作和/或表达。

例如，编码本发明的多肽或融合蛋白或其功能等同体的多核苷酸序列及其片段可以用在重组DNA分子中指导多肽在合适的宿主细胞中的表达。由于遗传密码的固有简并性，可以制备编码基本上相同或功能等同的氨基酸序列的其他DNA序列，这些序列可以用于克隆和表达特定多肽。

正如本领域技术人员可以理解的，某些情况中产生具有非天然存在密码子的多肽编码核苷酸序列是有益的。例如，可以挑选具体原核或真核宿主优选的密码子来提高蛋白表达率或者产生具有所需特性的重组RNA转录物，所述特性是诸如比由天然存在的序列产生的转录物的半衰期长。

此外，因为种种原因要改变多肽编码序列时，可以利用本领域公知的方法对本发明的多核苷酸序列进行改造，包括但不限于，能够改变其克隆、加工、表达和/或基因产物的免疫原性的变化。

为了表达所需多肽，可以将编码所述多肽的核苷酸序列或者功能等同体插入合适的表达载体，即含有转录和翻译被插入编码序列所需要的元件的载体。可以采用本领域技术人员公知的方法来构建含有编码目的多肽的序列以及合适的转录和翻译调控元件的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、合成技术，以及体内基因重组。这类技术在Sambrook et al.，Molecular Cloning，A Laboratory Manual(1989)和Ausubel et al.，Current Protocols in Molecular Biology(1989)中有描述。

已知有多种表达载体/宿主系统，可以利用来装载和表达多核苷酸序列。这些包括，但不限于诸如转化了重组噬菌体、质粒或粘粒DNA表达载体的细菌，转化了酵母表达载体的酵母的微生物；感染了病毒表达载体(例如，杆状病毒)的昆虫细胞系统；转化了病毒表达载体(例如，花椰菜花叶病毒、CaMV、烟草花叶病毒、TMV)或者细菌表达载体(例如Ti或pBR322质粒)的植物细胞系统；或者动物细胞系统。

表达载体中存在的‘调控元件’或‘调控序列’是载体中不被翻译的区域，即增强子、启动子、5′和3′非翻译区，这些区域与宿主细胞蛋白相互作用从而实现转录和翻译。这类元件的强度和特异性可以变化。根据所用的载体系统和宿主，可以使用包括组成型和诱导型启动子的任何数量的合适转录和翻译元件。例如，在细菌系统中进行克隆时，可以使用诸如PBLUESCRIPT噬菌粒(Stratagene，La JoIIa，Calif.)或者PSPORT1质粒(Gibco BRL，Gaithersburg，Md.)中的杂交lacZ启动子等诱导型启动子。在哺乳动物细胞系统中，通常优选哺乳动物基因的启动子或者来自哺乳动物病毒的启动子。如果需要产生含有多拷贝编码多肽的序列的细胞系，可以有利地将基于SV40或EBV的载体与合适的可选择的标记一起使用。

在细菌系统中，根据所表达的多肽的预期用途，有许多表达载体可以选择。例如，需要量大时，可以使用指导易于纯化的融合蛋白的高水平表达的载体。这类载体包括，但不限于多功能大肠杆菌克隆和表达载体，诸如BLUESCRIPT(Stratagene)，其中编码目的多肽的序列可以被连接到载体中，与氨基末端Met和随后的D-半乳糖苷酶的7个残基的序列处于同一读框，从而产生杂交蛋白；pIN载体(Van Heeke &Schuster，J.Biol.Chem.264：55035509(1989))等。也可以用pGEX载体(Promega，Madison，Wis.)将外来多肽与谷胱甘肽S-转移酶(GST)一起表达为融合蛋白。一般来说，这类融合蛋白是可溶的，可以容易地通过吸附到谷胱甘肽-琼脂糖珠子上，然后在有游离谷胱甘肽的情况下进行洗脱从裂解细胞中纯化得到。在这种系统中制备的蛋白质可以设计成包含肝素、凝血酶或XA因子蛋白酶切割位点，从而可以按照意愿将克隆的目的多肽从GST部分释放。

在诸如酿酒酵母的酵母中，可以使用含有组成型启动子或者诸如α因子、醇氧化酶和PGH的诱导型启动子的许多载体。这方面的综述，参见Ausubel et al.(同前)和Grant et al.，Methods Enzymol.153：516-544(1987)。

在使用植物表达载体的情况中，多肽编码序列的表达可以由多种启动子中的任何一种来驱动。例如，可以将诸如CaMV的35S和19S启动子的病毒启动子单独使用或者与来自TMV的ω(omega)引导序列(Takamatsu，EMBO J.6：307-311(1987))组合使用。可选择地，可以使用诸如RUBISCO的小亚基的植物启动子或者热休克启动子(Coruzzi etal.，EMBO J.3：1671-1680(1984)；Broglie et al.，Science 224：838-843(1984)；以及Winter et al.，Results Probl.Cell Differ.17：85-105(1991))。可以通过直接DNA转化或病原菌介导的转染将这些构建体引入植物细胞。许多综述中描述了这类技术(参见例如Hobbs in McGraw Hill，Yearbook of Science and Technology，191-196页(1992))。

还可以使用昆虫系统来表达目的多肽。例如，在一个这样的系统中，核型多角体病毒(Autographa californica nuclearpolyhedrosis)(AcNPV)被用作载体在草地夜娥(Spodoptera frugiperda)细胞或在粉纹夜娥(Trichoplusia)幼虫中表达外来基因。可以将编码多肽的序列克隆到病毒的非关键区，诸如克隆到多角体蛋白基因中，置于多角体蛋白启动子的调控下。多肽编码序列的成功插入使得多角体蛋白基因失活，产生缺少衣被蛋白的重组病毒。然后可以用重组病毒感染例如草地夜娥细胞或粉纹夜娥幼虫，可以在其中表达目的多肽(Engelhard et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.97：3224-3227(1994))。

在哺乳动物宿主细胞中，通常有多种基于病毒的表达系统可以利用。例如，在使用腺病毒作为表达载体的情况中，可以将编码目的多肽的序列连接到腺病毒中由晚期启动子和三重引导序列构成的转录/翻译复合体中。插入到病毒基因组的非关键E1或E3区可以用于获得能够在被感染的宿主细胞中表达所述多肽的活病毒(Logan & Shenk，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.87：3655-3659(1984))。此外，可以用诸如Rous肉瘤病毒(RSV)增强子的转录增强子来提高在哺乳动物宿主细胞中的表达。

还可以利用特异起始信号来实现编码目的多肽的序列的更有效地翻译。这类信号包括ATG起始密码子及其相邻序列。在编码多肽的序列、其起始密码子以及上游序列插入了合适的表达载体的情况中，可能不需要额外的转录或翻译调控信号。但是，在只插入了编码序列或其一部分的情况中，应当提供包含ATG起始密码子的外源翻译调控信号。而且，起始密码子应当处于正确的读码框以保证翻译全部插入物。外源翻译元件和起始密码子可以是天然或者合成的各种来源。通过包含诸如文献(Scharf.et al.，Results Probl.Cell Differ.20：125-162(1994))中描述的那些适合所用具体细胞系统的增强子，可以提高表达效率。

此外，可以根据其调控插入序列的表达的能力，或者以希望的方式加工所表达蛋白的能力来选择宿主细胞株。多肽的这类修饰包括，但不限于乙酰化、羰基化、糖基化、磷酸化、脂化和酰基化。对蛋白的前体形式进行切割的翻译后加工也可以用于促进正确的插入、折叠和/或发挥功能。可以选择诸如CHO、HeLa、MDCK、HEK293和W138的不同宿主细胞来保证对外来蛋白的正确修饰和加工，这些细胞具有用于这类翻译后行为的特异细胞机构和特征机制。

为了长期大量地产生重组蛋白，通常优选稳定的表达。例如，可以用表达载体来转化能够稳定表达目的多核苷酸的细胞系，所述表达载体在同一载体或者分开的载体上可能含有病毒复制原点和/或外源表达元件以及可选择的标记基因。导入载体后，允许细胞在加富培养基中生长1-2天，然后转移到选择性培养基中。可选择的标记的目的是赋予对选择的抗性，并且其存在允许成功表达了导入序列的细胞的生长和回收。可以利用适合细胞类型的组织培养技术来增殖稳定转化细胞的抗性克隆。

可以使用任何数目的选择系统来回收转化细胞系。这些系统包括，但不限于单纯疱疹病毒胸腺嘧啶激酶(Wigler et al.，Cell 77：223-232(1977))和腺嘌呤磷酸核糖转移酶(Lowy et al.，Cell 22：817-823(1990))基因，它们分别可以应用于tk-或aprt-细胞中。抗代谢物、抗生素或除草剂抗性也可以用作选择的基础，例如，赋予对甲氨蝶呤抗性的dhfr(Wigler et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.77：3567-70(1980))；赋予对氨基糖苷类抗生素、新霉素和G-418的抗性的npt(Colbere-Garapin etal.，J.Mol.Biol.750：1-14(1981))；以及分别赋予对氯磺隆(chlorsulfuron)和草丁膦乙酰转移酶的抗性的als或pat(Murry，同前)。其他可选择的基因也已有描述，例如trpB，该基因使细胞能够利用吲哚代替色氨酸；或者hisD，该基因使细胞利用histinol代替组氨酸(Hartman & Mulligan，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.85：8047-51(1988))。可视标记的利用逐渐流行，比如花青素、β-葡萄糖苷酸酶及其底物GUS、以及荧光素酶及其底物虫荧光素不仅被广泛用于鉴定转化子，还用于对由特定载体系统引起的瞬时或稳定蛋白表达进行定量(Rhodes et al.，Methods Mol.Biol.55：121-131(1995))。

利用多克隆抗体或者对产物特异的单克隆抗体，检测和测量多核苷酸编码的产物的表达的多种实验方案是本领域已知的。实例包括酶联免疫吸附分析(ELISA)、放射免疫分析(RIA)，以及荧光活化细胞分选术(FACS)。Hampton et al.，Serological Methods，a Laboratory Manual(1990)和Maddox et al.，J.Exp.Med.758：1211-1216(1983)以及其他地方描述了这些和其他分析法。

许多标记和偶联技术是本领域技术人员已知的，可以用于各种核酸和氨基酸分析中。制备用于检测与多核苷酸有关的序列的标记的杂交探针或PCR探针之手段包括利用标记的核苷酸进行寡核苷酸标记(oligolabeling)、切口平移、末端标记或者PCR扩增。可选择地，可以将所述序列或其部分克隆到载体中来产生mRNA探针。这类载体是本领域已知的，可以商购，并且可以通过添加合适的RNA聚合酶(诸如T7、T3或SP6)以及标记的核苷酸来体外合成RNA探针。可以利用多种商品试剂盒来进行这些程序。可以使用的合适的报告分子或标记包括放射性核；酶；荧光、化学发光或者生色试剂以及底物、辅助因子、抑制剂、磁性颗粒等。

可以在适合蛋白质的表达和从细胞培养物中回收蛋白质的条件下培养转化了目的多核苷酸序列的宿主细胞。根据序列和/或使用的载体，重组细胞产生的蛋白质可以是分泌的或者包含在胞内。正如本领域技术人员能够理解的，含有本发明的多核苷酸的表达载体可以设计成包含信号序列，所述信号序列能够引导编码的多肽跨过原核或真核细胞膜直接分泌。可以利用其他重组构建体将编码目的多肽的序列与编码易于溶解蛋白纯化的多肽结构域的核苷酸序列连接在一起。

除了重组制备方法，本发明的多肽及其片段可以利用固相技术通过直接的肽合成来制备(Merrifield，J.Am.Chem.Soc.85：2149-2154(1963))。可以利用人工操作技术或者通过自动化过程进行蛋白质的合成。自动合成可以利用例如Applied Biosystems 431 A PeptideSynthesizer(Perkin Elmer)实现。可选择地，可以单独地化学合成各个片段，并将其利用化学方法组合起来产生全长分子。

C.药物和疫苗组合物

本发明另一方面涉及本文公开的一种或多种多核苷酸、多肽或其他成分溶于药物可接受的或者生理可接受的溶液的制剂，所述制剂用于单独地或者与一种或多种其他治疗药征(modalities)组合给予细胞或动物。当与合适的免疫刺激剂/佐剂系统配制时，这类药物组合物尤其优选用作疫苗。所述组合物还适合用于诊断。

还应当理解，如果需要，本发明的组合物可以与诸如其他蛋白或多肽或者各种药物活性试剂的其他药剂联用。只要这些额外的药剂不会对本发明目的造成明显的不良效果，对其他也可以包含的成分几乎没有限制。

在某些优选实施方案中，本发明的组合物被用作疫苗，与一种或多种免疫刺激剂配制。免疫刺激剂可以是任何能够增强或加强对外源抗原的免疫反应(抗体和/或细胞介导的)的物质。免疫刺激剂的实例包括佐剂、生物可降解微球(例如，聚乳酸半乳糖(polylactic galactide))和脂质体(其中并入了化合物；参见例如Fullerton，美国专利4,235,877)。疫苗制备在例如Powell & Newman编辑，Vaccine Design(the subunitand adjuvant approach)(1995)中有概括性的描述。

多种免疫刺激剂中的任何一种都可以应用在本发明的疫苗中。例如，可以包含佐剂。许多佐剂含有被设计用于保护抗原不被快速代谢的物质(诸如氢氧化铝或矿物油)，以及诸如脂质A(天然或合成的)、百日咳杆菌或分枝杆菌或来源于分枝杆菌的蛋白质的免疫反应刺激剂。合适的佐剂的商品有例如，福氏不完全佐剂和完全佐剂(DifcoLaboratories，Detroit，Mich.)、Merck佐剂65(Merck and Company，Inc.，Rahway，N.J.)、AS-2及其衍生物(SmithKline Beecham，Philadelphia，Pa.)、CWS、TDM、Leif、诸如氢氧化铝胶(明矾)或磷酸铝的铝盐、钙盐、铁盐或锌盐、酰化酪氨酸的不溶悬浮液、酰基化糖、阳离子或阴离子化衍生多糖、聚磷腈、生物可降解微球、单磷酰基脂质A和quil A。诸如GM-CSF或白介素-2、-7或-12的细胞因子也可以作为佐剂。

在某些优选实施方案中，用于本发明的佐剂是未决美国专利申请序号11/862,122中描述的吡喃葡萄糖基(glucopyranosyl)脂质A(GLA)佐剂，将该申请的公开内容通过引用全文并入本文。例如，某些感兴趣的GLA化合物可以用以下通式表示：

其中：R¹、R³、R⁵和R⁶是C₁₁-C₂₀烃基；R²和R⁴是C₁₂-C₂₀烃基。在更具体的实施方案中，R¹、R²、R³、R⁴、R⁵和R⁶是C₁₄。

其他可用于本发明情境的示例性佐剂包括诸如TLR激动剂、TLR7/8激动剂等的Toll样受体激动剂。其他的示例性佐剂还包括咪喹莫特(IMQ)、gardiquimod(GDQ)、雷西莫特(RSQ)和相关的化合物。

某些优选的疫苗采用被设计成主要引发Th1型免疫反应的佐剂系统。高水平的Th1-型细胞因子(例如，IFN-γ、TNF、IL-2和IL-12)倾向于引发针对给予的抗原的细胞介导的免疫反应。相反，高水平的Th2-型细胞因子(例如，IL-4、IL-5、IL-6和IL-10)倾向于引发体液免疫反应。应用本文提供的疫苗后，患者能够产生包括Th1-和Th2-型反应的免疫反应。在优选实施方案中，当反应主要是Th1-型时，Th1-型细胞因子水平的增加程度大于Th2-型细胞因子水平的增加。利用标准分析可以容易地评估这些细胞因子的水平。关于细胞因子家族的综述，参见Mossman & Coffman，Ann.Rev.Immunol.7：145-173(1989)。

用于主要引发Th1-型反应的特定佐剂包括，例如单磷酰基脂质A，优选3-脱-O-酰化单磷酰基脂质A(3D-MPL)和铝盐(美国专利号4,436,727、4,877,611、4,866,034和4,912,094)的组合。含有CpG的寡核苷酸(其中CpG二核苷酸是未甲基化的)也主要诱发Th1反应。这类寡核苷酸是公知的，在例如WO 96/02555、WO 99/33488以及美国专利号6,008,200和5,856,462中有描述。例如Sato et al.，Science 273：352(1996)也描述了免疫刺激性的DNA序列。另外一种示例性佐剂包含皂甙，诸如Quil A或其衍生物，包括QS21和QS7(AquilaBiopharmaceuticals Inc.，Framingham，Mass.)；七叶树皂角素(Escin)；洋地黄皂苷(Digitonin)；或丝石竹属(Gypsophila)或茴藜(Chenopodiumquinoa)皂甙。其他示例性配方在本发明的佐剂组合中包含一种以上皂甙，例如QS21、QS7、Quil A、七叶树皂角素或洋地黄皂苷中的至少两种的组合。

在具体实施方案中，佐剂系统包含单磷酰基脂质A和皂甙衍生物的组合，诸如WO 94/00153中描述的QS21和3D-MPL^TM佐剂的组合，或者如WO 96/33739中描述的反应性较低的组合物，其中用胆固醇弱化QS21。其他制剂包含水包油乳剂和生育酚。WO 95/17210中描述了另一种水包油乳剂中采用QS21、3D-MPL^TM佐剂和生育酚的佐剂制剂。

WO 00/09159中描述的另外一种增强的佐剂系统涉及含有CpG的寡核苷酸和皂甙衍生物的组合。

其他示例性佐剂包括Montanide ISA 720(Seppic，France)、SAF(Novartis，Calif.，United States)、ISCOMS(CSL)、MF-59(Chiron)、SBAS佐剂系列(例如可以从GlaxoSmithKline，Rixensart，Belgium获得的SBAS-2、AS2’、AS2”、SBAS-4或SBAS6)、Detox、RC-529(GlaxoSmithKline，Hamilton，Mont.)和其他氨基烷基氨基葡糖苷4-磷酸(AGPs)，诸如未决的美国专利申请序列号08/853,826和09/074,720中描述的那些(将所述申请的公开内容通过引用全文并入本文)，以及诸如WO 99/52549A1中描述的聚氧乙烯醚佐剂。

本发明的组合物还可以，或者可选择地包含分枝杆菌抗原特异的T细胞。这类细胞通常可以采用常规程序，体外或离体制备。例如，可以从患者的骨髓、外周血或者骨髓或外周血的组分中分离T细胞。可选择地，T细胞可以来源于有关或无关的人、非人哺乳动物、细胞系或培养物。

可以用本发明的多肽、编码所述多肽的多核苷酸和/或表达该多肽的抗原递呈细胞(APC)刺激T细胞。进行这类刺激的条件和时间使得能够有效产生对所述多肽特异的T细胞。优选地，所述多肽或多核苷酸处于诸如微球的送递载体中以便促进特异性T细胞的产生。

如果T细胞能特异地增殖、分泌细胞因子或者杀死包被多肽或者表达编码所述多肽的基因的靶细胞，则认为T细胞是对本发明所述多肽特异的。利用多种常规技术中的任何一种都可以评价T细胞特异性。例如，在铬释放分析或增殖分析中，与阴性对照相比，裂解和/或增殖的刺激指数提高两倍以上表明T细胞特异性。这类分析可以按照例如Chen et al.，Cancer Res.54：1065-1070(1994))中的描述进行。可选择地，可以通过多种已知技术实现对T细胞增殖的检测。例如，可以通过测量DNA合成速度的提高(例如，通过用氚标记胸腺嘧啶核苷脉冲标记T细胞培养物，并测量整合到DNA中的氚标记胸腺嘧啶核苷)来检测T细胞增殖。与本发明的多肽(100ng/ml-100μg/ml，优选200ng/ml-25μg/ml)接触3-7天会导致T细胞增殖提高至少两倍。如上所述接触2-3小时会导致如标准的细胞因子分析法测量到的T细胞的活化，所述分析法中细胞因子(例如，TNF或IFN-γ)释放水平提高两倍表明T细胞的活化(参见Coligan et al.，Current Protocols in Immunology，vol.1(1998))。在应答多肽、多核苷酸或表达多肽的APC时活化的T细胞可以是CD4+和/或CD8+。利用常规技术可以将蛋白质特异的T细胞扩增。在优选实施方案中，所述T细胞来源于患者、相关供体或无关供体，在刺激和扩增之后给予患者。

在本发明的药物组合物中，药学上可接受的赋形剂和载体溶液的配制是本领域技术人员熟知的，在各种治疗方案中使用本文描述的具体组合物建立适宜的给药和治疗方案也是本领域技术人员熟知的，所述方案包括例如口服、经胃肠道、静脉内、鼻内、皮内、皮下和肌内给药和配方设计。

在某些应用中，本文公开的药物组合物可以经口服送递给个体。因此，这些组合物可以与惰性稀释剂或者可同化的可食用载体一起配制，或者可以将它们密封在硬壳或软壳胶囊中，或者可以将它们挤压成片剂，或者可以直接加入饮食中。

某些情况中，希望经胃肠道、静脉内、肌内或者甚至是如美国专利5,543,158、5,641,515和5,399,363(将每一专利全文通过引用特别地并入本文)中描述的腹膜内送递本文公开的药物组合物。以游离碱或药学上可接受的盐存在的活性化合物的溶液可以在适当地混合了诸如羟丙基纤维素的表面活性剂的水中制备。分散液也可以在甘油、液体聚乙二醇或其混合物以及油中制备。在通常的储存和使用条件下，这些制品含有防腐剂以阻止微生物的生长。

适合注射用的药物形式包括无菌水溶液或分散液，以及用于即时制备无菌注射溶液或分散液的无菌粉末(美国专利5,466,468，将其全文通过引用特别地并入本文)。在所有的情形下，所述形式都必须是无菌的，并且其流动程度必须方便注射。必须在制造和保存条件下是稳定的，必须能抗诸如细菌和真菌的微生物的污染。所述载体可以是溶剂或者含有例如水、乙醇、多醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等等)、其适当的混合物和/或植物油的分散介质。可以通过例如使用诸如卵磷脂的包被，在分散的情况中通过维持所需的颗粒大小，以及通过使用表面活性剂来维持合适的流动性。通过各种抗细菌和抗真菌试剂，例如羟基苯甲酸酯(parabens)、氯丁醇(chlorobutanol)、苯酚、山梨酸、硫柳汞(thimerosal)等等可以协助预防微生物的作用。在许多情形下，优选包含等渗剂，例如糖或氯化钠。通过在组合物中使用延迟吸收的试剂，例如单硬脂酸铝和果胶可以实现可注射组合物的延长的吸收。

对于例如水溶液的胃肠外给药，如果需要应当将所述溶液适当地缓冲，并用足够的盐水或葡萄糖首先将液体稀释使其等渗化。这些特别的水溶液尤其适合静脉内、肌内、皮下和腹膜内给药。就此而言，可以采用的无菌水介质根据本文的公开，是本领域技术人员已知的。例如，可以将一个剂量溶解在1ml等渗NaCl溶液中，添加至1000ml皮下灌注液中或者在计划的输注部位进行注射(参见，例如Remington：The Science and Practice of Pharmacy，20th Edition.Baltimore，MD：Lippincott Williams & Wilkins，2000)。根据接受治疗个体的状况有必要对剂量做一些变动。任何情形中，由负责给药的人确定各个体的合适剂量。而且，对于人类给药，制品应当满足FDA生物标准办公室(Officeof Biologies standards)要求的无菌、致热源性、以及一般的安全和纯度标准。

无菌注射溶液是通过将活性化合物，以及以上列举的各种其他成分加入到所需用量的合适溶剂中，然后经过滤除菌制备的。通常，分散液是通过将多种灭菌的活性成分加入到含有基础分散液介质和以上列举的其他必需成分的无菌载体中制备的。在无菌粉末配制无菌注射溶液的情况中，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥技术，这些技术产生活性成分加上任何其他所需成分的粉末，其中的其他成分来自其先前无菌过滤的溶液。

本文公开的组合物可以配制成中性或者盐形式。药学上可接受的盐，包括酸加成盐(由蛋白质的游离氨基基团形成的)以及用诸如例如盐酸或磷酸的无机酸或者诸如乙酸、草酸、酒石酸、扁桃酸等的有机酸形成的盐。由游离羰基形成的盐也可以来源于诸如例如钠、钾、铵、钙或氧化铁的无机碱，以及诸如异丙胺、三甲胺、组氨酸、普鲁卡因(procaine)等的有机碱。配制好后，以与剂型相容的方式以及治疗有效的量给予溶液。以各种剂型，诸如注射液、药物释放胶囊等，方便地给予制剂。

“载体”用于本文包括任何和全部溶剂、分散介质、媒介、包被、稀释剂、抗细菌和抗真菌剂、等渗和吸收延迟剂、缓冲液、载体溶液、悬浮液、胶体等。用于药物活性物质的这类介质和试剂是本领域公知的。除非任何常规介质或试剂与活性成分不相容，均可以用于治疗组合物中。补充性活性成分也可以并入所述组合物。

术语“药学上可接受的”是指给予人时，不产生过敏或类似的不良反应的分子实体和组合物。制备含有蛋白质作为活性成分的水性组合物是本领域公知的。一般来说，这类组合物被制备成可注射的液体溶液或者悬浮液。也可以制备成适合在注射前配成溶液或者悬浮液的固体形式。也可以将所述制品乳化。

某些实施方案中，所述药物组合物可以通过鼻内喷雾、吸入和/或气雾剂送递载体来送递。例如美国专利号5,756,353和美国专利号5,804,212(均通过引用全文并入本文)中描述了用于将基因、多核苷酸和肽组合物经鼻部气雾剂喷雾直接送递到肺部的方法。类似地，利用鼻内微粒树脂(Takenaga et al.，1998)和溶血磷脂酰甘油化合物(美国专利5,725,871，将其全文通过引用特别地并入本文)也是医药领域公知的。类似地，美国专利5,780,045(将其全文通过引用特别地并入本文)中描述了以聚四氟乙烯支持基质的形式进行的跨粘膜药物送递。

在某些实施方案中，可以利用脂质体、纳米颗粒、微球、脂质颗粒、囊泡等进行送递，将本发明的组合物导入合适的宿主细胞。具体来说，可以将本发明的组合物配制成包裹在脂质颗粒、脂质体、囊泡、纳米球、纳米颗粒等中进行送递。这类送递载体的配制和使用可以利用已知和常规技术实行。

D.诊断方法和试剂盒

正如上文提及的，所述组合物、融合多肽和多核苷酸还可以作为诊断试剂用于检测和/或监测患者中的结核分枝杆菌感染。例如，本发明的组合物、融合多肽和多核苷酸可以用于体外和体内分析来检测抗结核分枝杆菌的体液抗体或细胞介导的免疫，以便诊断感染、监测疾病的发展或者用于治愈检测评价。

因此，在某些实施方案中，本发明提供了基于血清学检验，用于区别诊断结核分枝杆菌感染的改进的诊断抗原，其中诊断中使用的分枝杆菌抗原选自Rv0164(SEQ ID NO：1)、Rv0496(SEQ ID NO：6)、Rv2608(SEQ ID NO：26)、Rv3020(SEQ ID NO：36)、Rv3478(SEQ IDNO：41)、Rv3619(SEQ ID NO：46)、Rv3620(SEQ ID NO：51)、Rv1738(SEQ ID NO：11)、Rv1813(SEQ ID NO：16)、Rv3810(SEQ ID NO：56)、Rv2389(SEQ ID NO：21)、Rv2866(SEQ ID NO：31)、Rv3876(SEQ IDNO：61)、Rv0054(SEQ ID NO：100)、Rv0410(SEQ ID NO：106)、RvO655(SEQ ID NO：112)、Rv0831(SEQ ID NO：115)、Rv1009(SEQID NO：118)、Rv1099(SEQ ID NO：121)、Rv1240(SEQ ID NO：124)、Rv1288(SEQ ID NO：127)、Rv1410(SEQ ID NO：130)、Rv1569(SEQ IDNO：133)、Rv1789(SEQ ID NO：136)、Rv1818(SEQ ID NO：139)、Rv1860(SEQ ID NO：142)、Rv1886(SEQ ID NO：145)、Rv1908(SEQ IDNO：148)、Rv2220(SEQ ID NO：154)、Rv2032(SEQ ID NO：151)、Rv2623(SEQ ID NO：160)、Rv2875(SEQ ID NO：163)、Rv3044(SEQ IDNO：166)、Rv3310(SEQ ID NO：169)和Rv3881(SEQ ID NO：178)、Rv0577(SEQ ID NO：184)、Rv1626(SEQ ID NO：187)、Rv0733(SEQ IDNO：190)、Rv2520(SEQ ID NO：193)、Rv1253(SEQ ID NO：196)、Rv1980(SEQ ID NO：199)、Rv3628(SEQ ID NO：202)、Rv1884(SEQ IDNO：205)、Rv3872(SEQ ID NO：208)、Rv3873(SEQ ID NO：211)、Rv1511(SEQ ID NO：214)和Rv3875(SEQ ID NO：292)，或者它们的免疫原性部分或变体，以单独的抗原混合的其任何组合，或者存在于融合基因构建体。正如本文显示的，文中公开的诊断抗原的组合为血清学诊断检测提供了更高的灵敏度。

诊断方法和试剂盒优选采用文中描述的两种或多种抗原的组合。在某些实施方案中，本发明的诊断方法中优选使用本文描述的多种抗原，例如三种或更多种，四种或更多种，五种或更多种，六种或更多种等。可以将所述抗原以基本上任何希望的分析形式使用，例如以单个抗原分开分析，以多种抗原同时分析，以固定在诸如芯片等的固体支持物上的抗原分析等。

在具体实施方案中，用于本文所述方法的诊断抗原选自Rv0164(SEQ ID NO：1)、Rv0496(SEQ ID NO：6)、Rv2608(SEQ ID NO：26)、Rv3020(SEQ ID NO：36)、Rv3478(SEQ ID NO：41)、Rv3619(SEQ IDNO：46)、Rv3620(SEQ ID NO：51)、Rv1738(SEQ ID NO：11)、Rv1813(SEQ ID NO：16)、Rv3810(SEQ ID NO：56)、Rv2389(SEQ ID NO：21)、Rv2866(SEQ ID NO：31)、Rv3876(SEQ ID NO：61)、Rv0054(SEQ IDNO：100)、Rv0410(SEQ ID NO：106)、Rv0655(SEQ ID NO：112)、RvO831(SEQ ID NO：115)、Rv1009(SEQ ID NO：118)、Rv1099(SEQID NO：121)、Rv1240(SEQ ID NO：124)、Rv1288(SEQ ID NO：127)、Rv1410(SEQ ID NO：130)、Rv1569(SEQ ID NO：133)、Rv1789(SEQ IDNO：136)、Rv1818(SEQ ID NO：139)、Rv1860(SEQ ID NO：142)、Rv1886(SEQ ID NO：145)、Rv1908(SEQ ID NO：148)、Rv2220(SEQ IDNO：154)、Rv2032(SEQ ID NO：151)、Rv2623(SEQ ID NO：160)、Rv2875(SEQ ID NO：163)、Rv3044(SEQ ID NO：166)、Rv3310(SEQ IDNO：169)和Rv3881(SEQ ID NO：178)、Rv0577(SEQ ID NO：184)、Rv1626(SEQ ID NO：187)、Rv0733(SEQ ID NO：190)、Rv2520(SEQ IDNO：193)、Rv1253(SEQ ID NO：196)、Rv1980(SEQ ID NO：199)、Rv3628(SEQ ID NO：202)、Rv1884(SEQ ID NO：205)、Rv3872(SEQ IDNO：208)、Rv3873(SEQ ID NO：211)、Rv1511(SEQ ID NO：214)和Rv3875(SEQ ID NO：292)，或其免疫原部分或变体，其存在于以单独的抗原混合的其任何组合，或者存在于融合基因构建体。

在一个实施方案中，提供了用于检测生物样品中的结核分枝杆菌感染的诊断试剂盒，所述试剂盒包含(a)多肽，所述多肽至少包含本文描述的抗原或融合多肽的免疫原性部分，以及(b)检测试剂。

在另一个实施方案中，提供了用于检测生物样品中的结核分枝杆菌感染的诊断试剂盒，所述试剂盒包含(a)抗体或其抗原结合片段，它们对至少包含本文描述的抗原或融合多肽的免疫原性部分的多肽是特异的，以及(b)检测试剂。

另一个实施方案中，提供了检测生物样品中存在的结核分枝杆菌感染的方法，包含(a)将生物样品与能够结合本文描述的抗原或融合多肽的单克隆抗体进行接触，以及(b)检测生物样品中存在的与所述单克隆抗体结合的结核分枝杆菌蛋白。

再一个实施方案中，提供了检测生物样品中存在的结核分枝杆菌感染的方法，包含(a)将生物样品与本文描述的抗原组合或融合多肽进行接触，以及(b)检测生物样品中存在的与所述抗原组合或融合多肽结合的抗体和/或T细胞。

本领域普通技术人员已知的许多分析形式使用纯化的抗原或融合多肽来检测样品中的抗体。参见例如，Harlow and Lane，Antibodies：ALaboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，1988。在一个实施方案中，所述分析涉及利用固定在固体支持物上的多肽来结合并移走样品中的抗体。然后可以利用检测试剂来探测被结合的抗体，所述检测试剂能够与抗体/肽复合体结合并且含有可检测的报告基团。适用的检测试剂包括能够结合抗体/多肽复合体和标记有报告基团的游离多肽的抗体(例如，在半竞争分析法中)。可选择地，可以利用竞争分析，其中能够与多肽结合的抗体标记有报告基团，并在将抗原与样品温育后，允许所述抗体与固定抗原结合。样品中的组分对标记的抗体与多肽的结合的抑制程度指示样品与固定的多肽的反应性。

所述固体支持物可以是本领域普通技术人员熟知的抗原能够附着其上的任何固体材料。例如，所述固体支持物可以是微量板中的测试孔或者硝酸纤维素膜或其他合适的膜。可选择地，所述支持物可以是珠或盘，诸如玻璃、纤维玻璃、橡胶或者是诸如聚苯乙烯或聚氯乙烯的塑料材料。支持物还可以是诸如例如美国专利号5,359,681中公开的那些磁性颗粒或者光学纤维传感器。

可以利用本领域已知的多种技术中的任何一种将多肽结合到固体支持物上。术语“结合”是指诸如吸附的非共价联结，以及共价连接(其可以是抗原和支持物上的功能性基团之间的直接连接，或者是借助交联剂的连接)。优选通过吸附到微量板中的孔或者膜上的结合。这些情况中，可以通过将溶于合适的缓冲液的多肽与固体支持物接触恰当的时间来实现吸附。

某些实施方案中，所采用的诊断分析是酶联免疫吸附分析法(ELISA)。这种分析法可以通过首先将已固定在固体支持物(通常是微量板的孔)上的多肽抗原与样品进行接触，从而样品中的多肽抗体能够与固定的多肽结合。然后从固定的多肽中移除未结合的样品，并加入能够结合固定的抗体-多肽复合体的检测试剂。然后利用适合所述特异性检测试剂的方法确定与固体支持物保持结合的检测试剂的量。

多肽一经固定到支持物上，一般要将支持物上的剩余蛋白结合位点封闭。可以使用本领域普通技术人员已知的诸如牛血清白蛋白或Tween 20^TM(Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO)的任何合适的封闭剂。然后将被固定的多肽与样品一起温育，使抗体(如果样品中存在)结合抗原。温育前，可以用诸如磷酸盐缓冲盐水(PBS)的合适稀释剂将样品稀释。通常，恰当的接触时间(即温育时间)是足以检测感染样品中存在的结核分枝杆菌抗体的时间段。优选地，所述接触时间足够使达到的结合水平是结合和未结合抗体取得平衡时达到的水平的至少95％。本领域普通技术人员会认识到，通过检验一段时间内随时间变化的结合水平可以容易地确定达到平衡所需的时间。室温下，大约30分钟的温育时间通常是足够的。

然后通过用诸如含有0.1％Tween 20^TM的PBS的合适缓冲液漂洗固体支持物来除去未结合的样品。然后将检测试剂加到固体支持物上。合适的检测试剂是任何可以结合固定的抗体-多肽复合体，并且可以通过本领域已知的多种手段中的任何一种来检测的化合物。所述检测试剂通常含有偶联了报告基团的结合剂(诸如，例如蛋白A、蛋白G、免疫球蛋白、血凝素或游离抗原)。示例性的报告基团包括酶(诸如辣根过氧化物酶)、底物、辅助因子、抑制剂、染料、放射性核、发光基团、荧光基团和生物素。结合剂与报告基团的偶联可以利用本领域普通技术人员已知的标准方法来实现。

然后将检测试剂与固定的抗体-多肽复合体一起温育一段时间，所述时间足以检测发生结合的抗体。合适的时间通常可以根据制造商的使用说明来确定，或者通过检验一段时间内发生的结合水平来确定。然后除去未结合的检测试剂，利用报告基团来检测结合的检测试剂。检测报告基团所采用的方法取决于报告基团的性质。对于放射性基团，闪烁计数或者放射自显影法通常是合适的。分光法可以用于检测染料、发光基团和荧光基团。生物素可以用偶联了不同的报告基团(常见的是放射性或者荧光基团或者酶)的链霉亲和素来检测。酶报告基团通常可以通过加入底物(通常反应一定的时间)，随后经过对反应产物进行分光或其他分析来检测。

为了确定样品中是否存在结核分枝杆菌抗体，通常将检测到的来自仍结合在固体支持物上的报告基团的信号与对应预先设定的临界值的信号进行比较。所述临界值优选是固定的抗原与来自未感染患者的样品温育时得到的信号平均值。一般来说，样品产生的信号比所述平均值高三个标准差，该样品即被认为是结核分枝杆菌抗体和结核分枝杆菌感染阳性的。在另一个实施方案中，临界值是根据Sackett等(Clinical Epidemiology：A Basic Science for Clinical Medicine，106-7页(Little Brown and Co.，1985))的方法，利用接受器工作特性曲线确定的。简单地说，在这个实施方案中，临界值可以由真阳性率(即灵敏度)和假阳性率(100％-特异性)对的图线来确定，对应诊断测试结果的每个可能的临界值。图线上最接近左上角(即包含最大面积的值)的临界值是最准确的临界值，产生的信号高于通过这种方法确定的临界值的样品被认为是阳性的。可选择地，临界值可以沿图线向左迁移以使假阳性率最小，或者向右迁移使假阴性率最小。一般来说，产生的信号高于用这种方法确定的临界值的样品认为是结核分枝杆菌感染阳性的。

另一个实施方案中，诊断检验可以以流过或者条带检验的方式进行，其中抗原或融合多肽固定在诸如硝酸纤维的膜上。在流过测试中，当样品流经膜时，样品中的抗体结合到固定的多肽上。然后当含有检测试剂的溶液流过膜时，检测试剂(例如蛋白A-胶体金)与抗体-多肽复合体结合。然后可以如上所述对结合的检测试剂进行检测。在条带检验的方式中，将结合有多肽的膜的一端浸入含有样品的溶液。样品沿膜迁移经过含有检测试剂的区域，达到固定的多肽的区域。检测试剂在多肽处的聚集表明样品中存在结核分枝杆菌抗体。这类检验一般可以用很小量(例如，一滴)的患者血清或血液进行。

再一个实施方案中，提供了使用本发明的一种或多种抗原、融合多肽和/或免疫原性部分的特异性抗体(可以是多克隆或单克隆抗体)和/或T细胞检测生物样品中的结核分枝杆菌的方法。

本说明书中引用的所有出版物和专利申请均通过引用的方式并入本文，如同各个出版物或专利申请被特别和单独地通过引用的方式并入本文。

尽管为了清楚理解的目的，通过说明和举例的方式对上述发明进行了相对详细的描述，对本领域普通技术人员显而易见的是，根据本发明的教导，可以对本发明做某些变化和改造而不背离所附权利要求的精神或范围。提供以下实施例仅用于说明而非限制。本领域技术人员容易认识到许多非关键参数可以变化或改造而产生实质上类似的结果。

可以将以上描述的各种实施方案组合从而提供其他实施方案。将本说明书中提及和/或申请信息页(Application Data Sheet)中列举的所有美国专利、美国专利申请公布、美国专利申请、外国专利、外国专利申请以及非专利出版物均通过引用的方式全文并入本文。如果需要可以应用各个专利、申请和出版物中的观念来改造实施方案的各方面，从而提供再进一步的实施方案。

实施例

实施例1

重组Rv0164的克隆和表达

用H37Rv基因组DNA作为模板，利用以下SEQ ID NO：4和5中列出的引物PCR扩增Rv0164：

引物5′-Rv0164-5his-NdeI：

TAGGATCCCATATGACGGCAATCTCGTGCTCAC(SEQ ID NO：4)

引物3′-Rv0164-3HindIII：

TAGAATTCAAGCTTTTAGCTGGCCGCCAGCTGCTC(SEQ IDNO：5)

使用如下扩增条件：94℃0.5分钟，55℃0.5分钟，68℃1分钟，进行30个循环得到SEQ ID NO：2中列出的产物。PCR产物用NdeI/HindIII消化并克隆到pET 28a中。含有Rv0164基因的质粒转化到表达宿主和Rosetta2pLysS中。培养物在摇瓶中添加了34mg/L氯霉素、35mg/L卡那霉素的2xYT培养基中于37℃生长至OD₆₀₀＝0.5-0.6，用1mM IPTG诱导3-4小时。以10000xg沉淀细胞糊浆，保存在-20℃。1L诱导物经超声裂解并将上清澄清化后，Rv0164蛋白保留在不溶组分中。然后将该组分在1％CHAPS去污剂、20mM Tris HCl(pH 8.0)中洗两次，然后溶解在8M尿素中。用两轮Ni-NTA亲和层析(Qiagen)在变性条件下进行提纯，用300mM咪唑洗脱Rv0164蛋白。SDS-PAGE分析后，含有纯化蛋白的组分对10mM Tris pH 8.0透析。经Bradford分析法确定蛋白浓度，经鲎试剂测定法(Llimulus Amoebcyte Assay)确定残留的内毒素水平。重组蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示。

实施例2

重组Rv0496的克隆和表达

用H37Rv基因组DNA作为模板，利用以下引物PCR扩增Rv0496：

5′-Rv0496-5his-NdeI

TAGGATCCCATATGGTCGATGCCCACCGCGGC(SEQ ID NO：9)

3′-Rv0496-3HindIII

TAGAATTCAAGCTTTCATGGTTTGCTGCCTCTCGA(SEQ IDNO：10)

在下述条件下进行扩增：94℃0.5分钟，55℃0.5分钟，68℃2分钟进行30个循环产生SEQ ID NO：7所示的产物。PCR产物用NdeI/HindIII消化并克隆到pET 28a中。Rv0496转化到表达宿主和Rosetta2pLysS中。1L诱导物裂解后，Rv0496进入内含体。在变性条件下进行两次Ni-NTA，然后对10mM Tris pH 10透析。重组蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：8所示。

实施例3

重组RV1738的克隆和表达

用H37Rv基因组DNA作为模板，利用以下引物PCR扩增Rv1738：

5′-Rv1738-5his-NdeI

CAATTACATATGCATCACCATCACCATCACATGTGCGGCGACCAGTCGGAT(SEQ ID NO：14)

3′-Rv1738-3EcoRI

CAATTAGAATTCTCAATACAACAATCGCGCCGG(SEQ ID NO：15)

扩增使用以下条件进行：95℃1分钟，58℃1分钟，72℃1分钟进行35个循环产生SEQ ID NO：12所示的产物。PCR产物用Ndel/EcoRI消化并克隆到pET 17b中。Rv1738转化到表达宿主BL-21 plysE和plysS中。裂解1L诱导物后，蛋白保留在可溶上清中。变性条件下进行Ni-NTA，然后对10mM Tris pH 8.0透析。重组蛋白的氨基酸序列示于SEQ ID NO：13。

实施例4

重组Rv1813的克隆和表达

用H37Rv基因组DNA作为模板，利用以下引物PCR扩增Rv1813：

5′-Rv1813-5his33-NdeI-

CAATTACATATGCATCACCATCACCATCACCATCTCGCCAACGGtTTCGATG(SEQ ID NO：19)

3′-Rv1813-3EcoRI-

CAATTAGAATTCTTAGTTGCACGCCCAGTTGAC(SEQ ID NO：20)

使用以下条件进行扩增：95℃1分钟，58℃1分钟，72℃1分钟进行35个循环产生SEQ ID NO：17所示的产物。PCR产物用NdeI/EcoRI消化并克隆到pET 17b中。Rv1813转化到表达宿主BL-21 plysE和Rosetta plysS中。裂解1L诱导物后，蛋白进入内含体。变性条件下进行Ni-NTA，然后对10mM Tris pH 8.0透析。重组蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：18所示。

实施例5

RV2389(R_PF-D)的克隆和表达

用H37Rv基因组DNA作为模板，利用以下引物PCR扩增Rv2389：

5′-Rv2389-5his50-NdeI-

CAATTACATATGCATCACCATCACCATCACGACGACATCGATTGGGACGCC(SEQ ID NO：24)

3′-Rv2389-3EcoRI-

CAATTAGAATTCTCAATCGTCCCTGCTCCCCGA(SEQ ID NO：25)

如下条件下进行扩增：95℃1分钟，58℃1分钟，72℃1分钟，进行35个循环得到SEQ ID NO：22所示的产物。PCR产物用NdeI/EcoRI消化并克隆到pET 17b(在第49位氨基酸开始的pET构建体)中。Rv2389转化到表达宿主BL-21plysE和Rosetta plysS中。1L诱导物裂解后，蛋白保留在可溶组分中。变性条件下进行Ni-NTA，然后对10mMTris pH 8.0透析。重组蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：23所示。

实施例6

重组Rv2608的克隆和表达

用H37Rv基因组DNA作为模板，利用以下引物PCR扩增Rv2608：

5′-Rv2608-5-NdeI-

TAGGATCCCATATGAATTTCGCCGTTTTGCCG(SEQ ID NO：29)

3′-Rv2608-3-HindIII-

TAGAATTCAAGCTTTTAGAAAAGTCGGGGTAGCGCC(SEQ IDNO：30)

利用以下条件进行扩增：94℃0.5分钟，55℃0.5分钟，68℃2分钟进行30个循环得到SEQ ID NO：27所示的产物。经凝胶纯化的PCR产物用NdeI/HindIII消化并克隆到表达载体pET28a(Clonetech)(从第1位氨基酸开始的pET构建体)中。Rv2608转化到表达宿主和Rosetta2pLysS中。培养物在摇瓶中添加34mg/L氯霉素、35mg/L卡那霉素的2xYT培养基中于37℃生长至OD₆₀₀＝0.5-0.6，用1mM IPTG诱导3-4小时。以10000xg沉淀细胞糊浆，保存在-20℃。1L诱导物经超声裂解并使上清澄清化后，Rv2608蛋白保留在不溶组分中。然后在1％CHAPS去污剂、10mM Tris HCl(pH 8.0)中将该组分洗两次，然后溶解在8M尿素中。用两轮Ni-NTA亲和层析(Qiagen)在变性条件下进行提纯，用300mM咪唑洗脱Rv2608蛋白。SDS-PAGE分析后，含有纯化蛋白的组分对10mM Tris pH 8.0透析。经BCA分析法确定蛋白浓度，经鲎试剂测定法确定残存的内毒素水平。重组蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：28所示。

实施例7

重组Rv2866的克隆和表达

利用以下引物，经PCR从基因组模板中扩增Rv2866：

5′-Rv2866-5NdeI-

CAATTACATATGCCTTCCACCGTGCCCTTCACC(SEQ ID NO：32)

3′-Rv2866-3HindIII-

CAATTAAAGCTTCTATCGGCGGTAGATGTCCGCGCG(SEQ IDNO：33)

使用以下扩增条件：94℃0.5分钟，66℃0.5分钟，68℃1.50分钟(35个循环)，得到SEQ ID NO：34所示的产物。产物用NdeI/HindIII消化并克隆到pET28.a载体中。Rv2866由宿主菌株BL-21 plysS表达。变性条件下，沉淀和上清与Ni树脂结合。透析在20mM Tris pH 6中进行。重组蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：35所示。

实施例8

重组Rv3020的克隆和表达

用H37基因组DNA作为模板，利用以下引物PCR扩增Rv3020：

5′-Rv3020-5his-NdeI-

TAGGATCCCATATGAGTTTGTTGGATGCCCATAT(SEQ ID NO：39)

3-Rv3020-3HindIII-

TAGAATTCAAGCTTTTAAAACCCGGTGTAGCTGGAC(SEQ IDNO：40)

采用以下扩增条件：94℃0.5分钟，55℃0.5分钟，68℃1分钟，进行30个循环，得到SEQ ID NO：37所示的产物。PCR产物用NdeI/HindIII消化并克隆到pET 28a中。含有Rv3020基因的质粒转化到表达宿主和Rosetta2 pLysS中。培养物在摇瓶中添加34mg/L氯霉素、35mg/L卡那霉素的2xYT培养基中于37℃生长至OD₆₀₀＝0.5-0.6，用1mM IPTG诱导3-4小时。以10000xg沉淀细胞糊浆，保存在-20℃。1L诱导物经超声裂解并将上清澄清化后，Rv3020蛋白保留在不溶组分中。然后将该组分在1％CHAPS去污剂、20mM Tris HCl(pH 8.0)中洗两次，然后溶解在8M尿素中。用Ni-NTA亲和层析(Qiagen)在变性条件下进行提纯，用250mM咪唑洗脱Rv3020蛋白。SDS-PAGE分析后，含有纯化蛋白的组分对10mM Tris pH 8.0透析。经Bradford分析法确定蛋白浓度，经鲎试剂测定法确定残存的内毒素水平。重组蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：38所示。

实施例9

重组Rv3478的克隆和表达

用H37Rv基因组DNA作为模板，利用以下引物扩增Rv3478：

5′-Rv3478-5his-NdeI-

TAGGATCCCATATGGTGGATTTCGGGGCGTTAC(SEQ ID NO：44)

3-Rv3478-3HindIII-

TAGAATTCAAGCTTCTATCCGGCGGCCGGTGTGCG(SEQ IDNO：45)

采用以下条件经聚合酶链式反应(PCR)扩增Rv3478：94℃0.5分钟，55℃0.5分钟，68℃2分钟，进行30个循环。经凝胶纯化的PCR产物(SEQ ID NO：42)用NdeI/HindIII消化并克隆到pET 28a(Clonetech)中。Rv3478转化到表达宿主和Rosetta2 pLysS中。培养物在摇瓶中添加34mg/L氯霉素、35mg/L卡那霉素的2xYT培养基中于37℃生长至OD₆₀₀＝0.5-0.6，用1mM IPTG诱导3-4小时。以10000xg沉淀细胞糊浆，保存在-20℃。1L诱导物经超声裂解并将上清澄清化后，Rv3478蛋白保留在不溶组分中。然后将该组分在1％CHAPS去污剂、10mM Tris HCl(pH 8.0)中洗两次，然后溶解在8M尿素中。用Ni-NTA亲和层析(Qiagen)在变性条件下提纯两次，用300mM咪唑洗脱Rv3478蛋白。SDS-PAGE分析后，含有纯化蛋白的组分对10mM TrispH 8.0透析。经BCA分析法确定蛋白浓度，经鲎试剂测定法确定残存的内毒素水平。重组蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：43所示。

实施例10

重组Rv3619的克隆和表达

用H37Rv基因组DNA作为模板，利用以下引物扩增Rv3619：

5′-Rv3619-5his-NdeI-

TAGGATCCCATATGACCATCAACTATCAATTCG(SEQ ID NO：49)

3-Rv3619-3HindIII-

TAGAATTCAAGCTTTTAGGCCCAGCTGGAGCCGAC(SEQ IDNO：50)

采用以下条件经聚合酶链式反应(PCR)扩增Rv3619：94℃0.5分钟，55℃0.5分钟，68℃1分钟，进行30个循环。经凝胶纯化的PCR产物(SEQ ID NO：47)用NdeI/HindIII消化并克隆到pET28a(Clonetech)中。

Rv3619转化到表达宿主和Rosetta2 pLysS中。培养物在摇瓶中添加34mg/L氯霉素、35mg/L卡那霉素的2xYT培养基中于37℃生长至OD₆₀₀＝0.5-0.6，用1mM IPTG诱导3-4小时。在10000xg沉淀成细胞浆，保存在-20℃。1L诱导物经超声裂解并净化上清后，Rv3619蛋白保留在不溶组分中。然后将该组分在1％CHAPS去污剂、10mMTris HCl(pH 8.0)中洗两次，然后溶解在8M尿素中。用Ni-NTA亲和层析(Qiagen)在变性条件下提纯，用300mM咪唑洗脱Rv3619蛋白。SDS-PAGE分析后，含有纯化蛋白的组分对10mM Tris pH 8.0透析。经Bradford分析法确定蛋白浓度，经鲎试剂测定法确定残存的内毒素水平。重组蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：48所示。

实施例11

重组Rv3620的克隆和表达

用H37Rv基因组DNA作为模板，利用以下引物PCR扩增Rv3620：

5′-Rv3620-5his-NdeI-

TAGGATCCCATATGACCTCGCGTTTTATGACG(SEQ ID NO：54)

3-Rv3620-3HindIII-

TAGAATTCAAGCTTTCAGCTGCTGAGGATCTGCTG(SEQ IDNO：55)

如下条件PCR扩增Rv3620：94℃0.5分钟，55℃0.5分钟，68℃1分钟，进行30个循环。PCR产物(SEQ ID NO：52)用NdeI/HindIII消化并克隆到pET28a中。将Rv3620转化到表达宿主Rosetta2 plysS中。1L诱导物裂解后，蛋白进入内含体。变性条件下进行Ni-NTA，然后纯化抗原对20mM Tris pH 8.0、50mM NaCl透析。重组蛋白的氨基酸序列示于SEQ ID NO：53。

实施例12

重组Rv3810的克隆和表达

用H37Rv基因组DNA作为模板，利用以下引物PCR扩增Rv3810：

5′-Rv3810-5his23-NdeI-

CAATTACATATGCATCACCATCACCATCACAGTCCTTGTGCATATTTTCTTGTC(SEQ ID NO：59)

3′-Rv3810-3XhoI-

CAATTACTCGAGTTAGGCGACCGGCACGGTGATTGG(SEQ IDNO：60)

Rv3810用以下条件进行PCR扩增：95℃1分钟，58℃1min.，72℃1.5分钟，进行35个循环。PCR产物(SEQ ID NO：57)用NdeI/XhoI消化并克隆到pET17b(从第23位氨基酸开始的pET构建体)中。Rv3810转化到表达宿主BL-21 plysE和Rosetta plysS中。1L诱导物裂解后，蛋白进入内含体。变性条件下进行Ni-NTA，然后对10mM Tris pH 8.0透析。重组蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：58所示。

实施例13

重组Rv3876的克隆和表达

利用以下扩增引物由基因组DNA通过PCR扩增Rv3876：

Rv3876F-Nde-5′：

GATCCCATGGGCATATGGCGGCCGACTACGAC(SEQ ID NO：64)

Rv3876R-EcoRI-3′：

GTCAGAATTCTCAACGACGTCCAGCCCT(SEQ ID NO：65)

使用以下条件进行扩增：94℃30秒，55℃30秒，72℃2分钟，进行30个循环。将PCR产物连接到穿梭载体pGemT中。通过蓝/白筛选在LB琼脂-x-gal平板上鉴定阳性菌落。Rv3876基因产物用NdeI/EcoRI消化并克隆到pET28a中。Rv3876c转化到表达宿主BL-21(DE3)plysS中。1L诱导物裂解后，蛋白保留在不溶组分中。变性条件下进行Ni-NTA，然后对20mM Tris pH 8.0透析。重组蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：63所示。

实施例14

重组融合蛋白MTB36F.1的克隆和表达

构建融合构建体Mtb36f.1使用了以下引物：

5′-Rv2389-5NdeI50-

CAATTACATATGGACGACATCGATTGGGACGCC(SEQ ID NO：68)

3′-Rv2389-3SacIgo-

CAATTAGAGCTCATCGTCCCTGCTCCCCGAACA(SEQ ID NO：69)

5′-Rv3810-5SacI23-

CAATTAGAGCTCAGTCCTTGTG]CATATTTTCTTG(SEQ ID NO：70)

3′-Rv3810-3HindIII-KpnI-

CAATTAAAGCTTTTAGGTACCGGCGACCGGCACGGTGATTGG(SEQ ID NO：71)

使用先前克隆的Rv2389和Rv3810的质粒DNA，采用如下条件PCR扩增Mtb36f.1组分：94℃30秒，58℃30秒，68℃1分钟，进行35个循环。5′Rv2389 PCR产物用NdeI/SacI消化并克隆到pET 28a中。3′Rv3810 PCR产物用SacI/HindIII消化并克隆到含有Rv2389的pET 28a构建体中。Mtb36f.1(SEQ ID NO：66)转化到表达宿主BL-21(DE3)plysS中。1L诱导物裂解后，蛋白保留在可溶组分中。天然条件下进行Ni-NTA，然后对20mM Tris pH 8.0透析。重组融合蛋白的氨基酸序列示于SEQ ID NO：67。

实施例15

重组融合蛋白ID58的克隆和表达

以下引物用于克隆融合构建体ID58，该构建体包含来源于MtbRv1813、Rv3620和Rv0496的融合伴侣：

5′：Rv1813mat-5NdeI-KpnI

CAATTACATATGGGTACCCATCTCGCCAACGGTTCGATG(SEQ ID NO：73)

3′：Rv1813mat-3SacIgo

CAATTAGAGCTCGTTGCACGCCCAGTTGACGAT(SEQ ID NO：74)

5′：Rv3620-5SacI

CAATTAGAGCTCATGACCTCGCGTTTTATGACG(SEQ ID NO：75)

3′：Rv3620-3SalIgo

CAATTAGTCGACGCTGCTGAGGATCTGCTGGGA(SEQ ID NO：76)

5′：Rv0496-5SalI

CAATTAGTCGACATGGTCGATGCCCACCGCGGC(SEQ ID NO：77)

3′：Rv0496-3ScaI-HindIII

CAATTAAAGCTTTTAAGTACTTGGTTTGCTGCCTCTCGATCG(SEQ ID NO：78)

由基因组模板DNA扩增Rv1813和Rv3620(94℃0.5分钟，58℃0.5分钟，58℃1.5分钟，35个循环)。Rv1813用NdeI/SacI消化并克隆到pET28.a载体中。Rv3620用SacI/SalI消化，然后连接到Rv1813pET构建体中。由质粒模板经PCR扩增Rv0496(94℃0:30；60℃0:30；68℃1:30；35个循环)。产物用SalI/HindIII消化并克隆到pET28.a-Rv1813-3620载体中。ID58-pET28.a带有一些点突变，因此用定点突变插入正确的核酸。ID58融合构建体具有SEQ ID NO：72所示的多核苷酸序列，编码SEQ ID NO：79所示的融合蛋白。在宿主BL-21plysS中表达(1L，2xYT生长培养基，37℃)ID58。用1mM IPTG在OD 0.471进行诱导，在OD 1.36时收集细胞。将细胞沉淀悬于裂解缓冲液(20mM Tris pH8，100mM NaCl，2mM PMSF)中并冷冻。ID58形成内含体，与ID83同样地处理。来自穿流结合物(flow through bind)的组分在20mM Tris pH 8.5中透析。

实施例16

重组融合蛋白ID69的克隆和表达

融合构建体ID69的克隆使用了以下引物，所述构建体包含来源于Rv2389、Rv1813、Rv3620和Rv0496的融合伴侣：

5′：Rv2389mat-5NdeI

CAATTACATATGGACGACATCGATTGGGACGCC(SEQ ID NO：81)

3’：Rv2389mat-3KpnI-HindIII

CAATTAAAGCTTTTAAGTACTTGGTTTGCTGCCTCTCGATCG(SEQ ID NO：82)

由基因组模板PCR扩增Rv2389(94℃0.5分钟，58℃0.5分钟，68℃1.5分钟，35个循环)，用NdeI/HindIII消化并连接到pET28.a中。ID58-pET28.a载体用KpnI/HindIII消化除去插入片段。将ID58连接到Rv2389-pET28.a载体(同样用KpnI/HindIII消化的)中。融合构建体具有SEQ ID NO：80所示的多核苷酸序列，其编码SEQ ID NO：83所示的融合蛋白。宿主BL-21plysS表达(1L，2xYT生长培养基，37℃)ID69。将细胞沉淀悬于裂解缓冲液(20mM Tris pH8，100mM NaCl，2mM PMSF)中并冷冻。ID69形成内含体，与ID83同样地纯化。

实施例17

重组融合蛋白ID83的克隆和表达

以下引物用于克隆融合构建体ID83，所述构建体包含来源于Rv1813、Rv3620和Rv2608的融合伴侣：

5′：Rv1813mat-5NdeI-KpnI

CAATTACATATGGGTACCCATCTCGCCAACGGTTCGATG(SEQ ID NO：85)

3′：Rv1813mat-3SacIgo

CAATTAGAGCTCGTTGCACGCCCAGTTGACGAT(SEQ ID NO：86)

5′：Rv3620-5SacI

CAATTAGAGCTCATGACCTCGCGTTTTATGACG(SEQ ID NO：87)

3′：Rv3620-3SalIgo

CAATTAGTCGACGCTGCTGAGGATCTGCTGGGA(SEQ ID NO：88)

5′：Rv2608-5Sall

CAATTAGTCGACATGAATTTCGCCGTTTTGCCG(SEQ ID NO：89)

3′：Rv2608-3ScaI-HindIII

CAATTAAAGCTTTTAAGTACTGAAAAGTCGGGGTAGCGCCGG(SEQ ID NO：90)

由基因组模板DNA通过PCR扩增Rv1813和Rv3620(94℃0.5分钟，58℃0.5分钟，58℃1.5分钟；35个循环)。Rv1813用NdeI/SacI消化，然后克隆到pET28.a载体中。Rv3620用SacI/SalI消化然后连接到Rv1813pET构建体中。Rv2608由质粒模板经PCR扩增(94℃0.5分钟，58℃0.5分钟，68℃1.5分钟；35个循环)。产物用SalI/HindIII消化并克隆到pET28.a-Rv1813-3620载体中。融合构建体具有SEQ ID NO：84所示的多核苷酸序列，其编码SEQ ID NO：91所示的融合蛋白。ID83在宿主BL-21 plysS中表达(2L，2xYT生长培养基，37℃)。在OD 0.77时用1mM IPTG诱导，在OD 1.93时收集。细胞沉淀悬于裂解缓冲液(20mM Tris pH8，100mM NaCl，2mM PMSF)中并冷冻。然后将细胞沉淀融化，经超声裂解，以7,000rcf转20分钟。ID83是内含体蛋白。沉淀用1％Chaps洗两次。沉淀溶于60ml结合缓冲液(8M尿素、20mM Tris pH 8、100mM NaCl)，室温下与16ml Ni-NTA树脂结合1小时。漂洗树脂(60mL 0.5％DOC 20分钟；80ml 60％IPA 30分钟，50mL 0.5％DOC冲洗)，然后将其用含300mM咪唑的结合缓冲液洗脱。将来自第一次结合的上清结合到另外的8mL树脂上，如上所述处理。前面提及的纯化过程除去分解产物。在160mL(含有50mMNaCl的结合缓冲液)中用32mL树脂于4℃过夜再进行一次Ni-NTA结合。将树脂如上清洗和洗脱。来自这次结合的组分在20mM Tris pH8中透析。

实施例18

重组融合蛋白ID94的克隆和表达

使用以下引物克隆融合构建体ID94，所述构建体包含来源于Rv2389、Rv1813、Rv3620和Rv2608的融合伴侣：

5′：Rv2389mat-5NdeI

CAATTACATATGGACGACATCGATTGGGACGCC(SEQ ID NO：93)

3′：Rv2389mat-3KpnI-HindIII

CAATTAAAGCTTTTAAGTACTTGGTTTGCTGCCTCTCGATCG(SEQ ID NO：94)

由基因组模板PCR扩增Rv2389(94℃0.5分钟，58℃0.5分钟，68℃1.5分钟，35个循环)，用NdeI/HindIII消化并连接到pET28.a中。ID83-pET28.a载体用KpnI/HindIII消化去掉插入片段。将ID83连接到Rv2389-pET28.a载体(同样用KpnI/HindIII消化)中。融合构建体具有SEQ ID NO：92所示的多核苷酸序列，编码SEQ ID NO：95所示的融合蛋白。ID94在宿主BL-21 plysS中表达(1L，2x YT生长培养基，37℃)。在OD 0.50时用1mM IPTG诱导表达，在OD 1.41时收集。将细胞沉淀悬于裂解缓冲液(20mM Tris pH8，100mM NaCl，2mMPMSF)中并冷冻。ID94形成内含体，与ID83同样地处理。ID94过夜结合不好，因此用8M尿素将体积加倍，BME加至10mM。将较不浓缩的溶液在室温下与Ni-NTA树脂结合2小时，然后在4℃过夜。漂洗树脂，并将其如前所述进行洗脱。来自该纯化过程的组分在20mMTris pH8中透析。

实施例19

重组融合蛋白ID95的克隆和表达

ID95是包含来源于Rv2389、Rv3810、Rv1813、Rv3620和Rv0496的融合伴侣的融合构建体。ID58-pET28.a载体用KpnI/HindIII消化来去掉插入片段。ID58插入片段连接到先前制备的36f.1-pET28.a载体(同样用KpnI/HindIII消化的)中。所述融合构建体具有SEQ ID NO：96所示的多核苷酸序列，编码SEQ ID NO：97所示的融合蛋白。ID95在宿主BL-21 plysS中表达(1L，2xYT生长培养基，37℃)。细胞沉淀悬于裂解缓冲液(20mM Tris pH8，100mM NaCl，2mM PMSF)并冷冻。ID95形成内含体，与ID83同样地纯化。

实施例20

重组融合蛋白ID120的克隆和表达

ID120是包含来源于Rv2389、Rv3810、Rv1813、Rv3620和Rv2608的融合伴侣的融合构建体。ID83-pET28.a载体用KpnI/HindIII消化来去掉插入片段。ID83插入片段连接到先前制备的36f.1-pET28.a载体(同样用KpnI/HindIII消化的)中。所述融合构建体具有SEQ ID NO：98所示的多核苷酸序列，编码SEQ ID NO：99所示的融合蛋白。ID120在宿主BL-21 plysS中表达(1L，2xYT生长培养基，37℃)。在OD 0.50时用1mM IPTG诱导表达，在OD 1.41时收集细胞。细胞沉淀悬于裂解缓冲液(20mM Tris pH8，100mM NaCl，2mM PMSF)并冷冻。ID120形成内含体，与ID83同样地处理。ID120过夜结合不好，因此用8M尿素将体积加倍，BME加至10mM。将较不浓缩的溶液在室温下与Ni-NTA树脂结合2小时，然后在4℃过夜。漂洗树脂，并将其如前所述进行洗脱。来自该纯化过程的组分在20mM Tris pH8中透析。

实施例21

PPD+人PBMC和来自MTB感染小鼠的脾细胞对MTB抗原的识别

本实施例显示了本发明的Mtb抗原在来自PPD+健康供体的人PBMC和分离自感染了结核分枝杆菌的小鼠的脾细胞中引发记忆回放反应。

材料&方法：

人PBMC体外刺激和细胞因子ELISA

PBMC由7个PPD-和15个PPD+健康供体，经分离术或者从肝素化血液纯化得到。PBMC以2-2.5x10⁵细胞/孔一式三份接种在96孔组织培养板中，用培养基PHA(10μg/ml)、结核分枝杆菌(Mtb)裂解物(10μg/ml)或者各种重组蛋白(50μg/ml)培养72小时。收集上清，按照制造商的实验方案用特异性mAb(eBioscience)，通过双夹心ELISA分析IFN-γ。

小鼠细胞因子ELISPOT

结核分枝杆菌感染的小鼠在感染后不同时间收集脾，并通过常规程序获得单个脾细胞悬浮液。利用ELISPOT分析法确定IFN-γ或表达TNF的脾细胞的相对数目。用10μg/ml大鼠抗小鼠IFN-γ、或TNF、捕获Ab(eBioscience)包被Multiscreen 96孔滤板(Millipore，Bedford，MA)，于4℃温育过夜。板用PBS洗，用RPMI 1640和10％FBS在室温封闭至少1小时，再次漂洗。将脾细胞以2x10⁵细胞/孔一式两份接种，并用特异性rAg以10μg/ml在37℃刺激48小时。随后将板用PBS和0.1％Tween洗，与偶联生物素的大鼠抗小鼠IFN-γ、或TNF、二级Ab(eBioscience)以5μg/ml在PBS、0.5％BSA和0.1％Tween中于4℃温育过夜。用Vectastain ABC抗生物素蛋白过氧化物酶偶联物和Vectastain AEC底物试剂盒(Vector Laboratories，Burlingame，CA)按照制造商的试验方案，将滤膜显影。用去离子水洗板来终止反应，板在暗处晾干，计数斑点。

结果：

人PD+PBMC对Mtb重组蛋白的识别

将来自PPD+和PPD-供体的PBMC与Mtb Rv0164、Rv0455、Rv0496、Rv2608、Rv3020、Rv3478、Rv3619、Rv3620、Rv1738、Rv1813、Rv3810、Rv2389、Rv2866、Rv3876、Rv0054、Rv0410、Rv0655、Rv0831、Rv1009、Rv1099、Rv1240、Rv1288、Rv1410、Rv1569、Rv1789、Rv1818、Rv1860、Rv1886、Rv1908、Rv2220、Rv2032、Rv2623、Rv2875、Rv3044、Rv3310、Rv3881、Rv0577、Rv1626、Rv0733、Rv2520、Rv1253、Rv1980、Rv3628、Rv1884和Rv1511重组蛋白培养72小时。关于这些重组抗原的制备在本文其他部分有描述。再分析细胞培养上清中的IFN-γ浓度。

除Rv1908外，所有测试的重组蛋白均被呈递到并活化来自PPD+供体的T细胞产生IFN-γ(图.1)。用来自PPD-对照的PBMC仅检测到应答这些抗原的背景水平的IFN-γ。与PPD-对照相比，来自PPD+供体的PBMC培养物中测量到IFN-γ浓度提高了5到70倍，表明之前接触过结核分枝杆菌或牛分枝杆菌(接种了BCG)的供体对这些重组蛋白有抗原特异识别。

来自结核分枝杆菌感染的小鼠的脾细胞对Mtb重组蛋白的识别

用结核分枝杆菌H37Rv菌株，通过低剂量气雾剂接触来感染小鼠，感染后不同时间采集脾。利用ELISPOT分析法确定48小时体外培养过程中，应答Mtb重组Rv0164、Rv0455、Rv0496、Rv2608、Rv3020、Rv3478、Rv3619、Rv3620、Rv1738、Rv1813、Rv3810、Rv2389、Rv2866、Rv0054、Rv0655、Rv0831、Rv1009、Rv1240、Rv1288、Rv1410、Rv1569、Rv1789、Rv1818、Rv1860、Rv1886、Rv1908、Rv2220、Rv2032、Rv2875、Rv3044、Rv3310、Rv3881、Rv0577、Rv1626、Rv0733、Rv1253、Rv1980、Rv3628、Rv1884、Rv3875、Rv1511和ID83蛋白时，表达TNF的脾细胞的相对数量。

感染后28天(图2，上方的板块)、60天(数据未显示)和90天(图2，下方的板块)，所有测试的重组和融合蛋白都使得来自感染结核分枝杆菌的小鼠的TNF+脾细胞数量增加。

这些数据一起表明小鼠中感染结核分枝杆菌诱发了对Mtb蛋白的免疫反应，所述Mtb蛋白包括Rv0164、Rv0455、Rv0496、Rv2608、Rv3020、Rv3478、Rv3619、Rv3620、Rv1738、Rv1813、Rv3810、Rv2389、Rv2866、Rv0054、Rv0655、Rv0831、Rv1009、Rv1240、Rv1288、Rv1410、Rv1569、Rv1789、Rv1818、Rv1860、Rv1886、Rv1908、Rv2220、Rv2032、Rv2875、Rv3044、Rv3310，Rv3881，Rv0577，Rv1626，Rv0733，Rv1253、Rv1980、Rv3628、Rv1884、Rv1511和ID83蛋白。

因此，自然接触有毒力的结核分枝杆菌的人和通过气雾剂攻击感染有毒力的结核分枝杆菌的小鼠，都加强了对细菌蛋白的免疫反应，对Mtb裂解物和PPD的回忆反应即为佐证。此外，受到体外刺激，应答Rv0164，Rv0455，Rv0496，Rv2608，Rv3020，Rv3478，Rv3619，Rv3620，Rv1738，Rv1813，Rv3810，Rv2389，Rv2866，Rv3876，Rv0054，Rv0410，Rv0655，Rv0831，Rv1009，Rv1099，Rv1240，Rv1288，Rv1410，Rv1569，Rv1789，Rv1818，Rv1860，Rv1886，Rv1908，Rv2220，Rv2032，Rv2623，Rv2875，Rv3044，Rv3310，Rv3881，Rv0577，Rv1626，Rv0733，Rv2520，Rv1253，Rv1980，Rv3628，Rv1884，Rv1511和ID83蛋白时IFN-γ和TNF细胞因子的增加表明这些抗原(1)被之前接触过的个体识别(存在记忆T细胞)，(2)可以作为免疫治疗剂或者(3)可以作为诊断剂。

实施例22

C57BL/6小鼠对MTB抗原的免疫反应和对MTB气雾剂攻击的保护

本实施例显示，用本发明的Mtb抗原接种小鼠产生免疫反应，可以提供对气雾剂结核分枝杆菌攻击的保护作用。

材料&方法：

重组抗原和佐剂制剂

如前所述制备重组蛋白。CpG 1826从Coley Pharmaceuticals(Wellesley，MA)获得。

免疫

雌性C57/BL6小鼠从Charles River获得，每个试验中年龄相当(5-7周龄)。小鼠用与25μg佐剂CpG配制的8μg重组Rv0164(SEQ IDNO：1)、Rv0496(SEQ ID NO：6)、Rv2608(SEQ ID NO：26)、Rv3020(SEQ ID NO：36)、Rv3478(SEQ ID NO：41)、Rv3619(SEQ ID NO：46)、Rv3620(SEQ ID NO：51)、Rv1738(SEQ ID NO：11)、Rv1813(SEQ IDNO：16)、Rv3810(SEQ ID NO：56)、Rv2389(SEQ ID NO：21)、Rv2866(SEQ ID NO：31)、Rv0831(SEQ ID NO：115)、Rv1288(SEQ ID NO：127)、Rv1569(SEQ ID NO：133)、Rv1789(SEQ ID NO：136)、Rv1818(SEQ ID NO：139)、Rv1860(SEQ ID NO：142)、Rv1886(SEQ ID NO：145)、Rv2220(SEQ ID NO：154)、Rv2032(SEQ ID NO：151)、Rv2623(SEQ ID NO：160)、Rv2875(SEQ ID NO：163)、Rv3044(SEQ ID NO：166)、Rv0577(SEQ ID NO：184)、Rv1626(SEQ ID NO：187)、Rv0733(SEQ ID NO：190)、Rv3628(SEQ ID NO：202)和Rv1884(SEQ ID NO：205)蛋白免疫三次(相隔3周)。盐水组、单独佐剂组的小鼠和BCG对照组的小鼠分别接受三个剂量的PBS、三个剂量的单独佐剂，或者单个剂量的5x10⁴BCG CFU。小鼠经皮下途径注射100μl/小鼠的总体积。

细胞因子ELISA

最后一次强化免疫后三周，收集用于免疫原研究的动物的脾，通过常规程序获得脾细胞。为了进行细胞因子分析，将脾细胞以2.5x10⁵细胞/孔一式两份接种于96孔组织培养板，用培养基、Con A 3μg/ml、PPD 10μg/ml、Mtb裂解物10μg/ml或者各种重组蛋白10μg/ml培养72小时。收集上清，利用特异性mAb(eBioscience)按照厂家的方案，经双夹心ELISA分析IFN-γ。

细胞因子ELISPOT

将MultiScreen 96孔滤板(Millipore，Bedford，MA)用10μg/ml大鼠抗小鼠IFN-γ或TNF捕获Ab(eBioscience)包被，于4℃温育过夜。滤板用PBS清洗，用RPMI 1640和10％FBS于室温封闭至少1小时，再次清洗。脾细胞以2x10⁵细胞/孔一式两份接种到板中，用培养基、Con A 3μg/ml、PPD 10μg/ml或者各重组蛋白10μg/ml于37℃刺激48小时。随后用PBS和0.1％Tween-20清洗滤板，与溶解在PBS、0.5％BSA和0.1％Tween-20中的5μg/ml偶联了生物素的大鼠抗小鼠IFN-γ或TNF二抗(eBioscience)温育2小时。用Vectastain ABC抗生物素蛋白过氧化物酶偶联物和Vectastain AEC底物试剂盒(VectorLaboratories，Burlingame，CA)按照制造商的方案将滤膜显影。用去离子水清洗滤板使反应终止，板在暗处干燥，在自动ELISPOT阅读器(C.T.L.Serie3A Analyzer，Cellular Technology Ltd，Cleveland，OH)上计数斑点，用(CTL Analyzer LLC)进行分析。

IgG同种型ELISA

最后一次免疫后一周，给动物取血并确定血清IgG1和IgG2c抗体滴度。用溶解在0.1M重碳酸盐缓冲液中的2μg/ml重组蛋白将Nunc-lmmuno Polysorb板于室温包被4小时，用PBS Tween-200.05％、BSA 1％于4℃封闭过夜，用PBS Tween-200.05％清洗，室温下与1∶50稀释的以及后续的5倍梯度稀释的血清温育2小时，清洗，与1∶2000稀释在PBS Tween-20 0.05％、BSA 0.1％中的抗IgG1-HRP或抗IgG2c-HRP温育1小时。清洗培养板，用SureBlue TMB底物(KPL Inc.，Gaithersburg，MD)显影。用1N H₂SO₄终止酶反应，30分钟内利用微量板ELISA阅读器(Molecular Devices，Sunnyvale，CA)和SoftMax Pro5于450nm处读板，参照滤光片设在650nm。用GraphPad Prism 4(GraphPad Software Inc.，San Diego，CA)确定终点滴度，临界值设为0.1。

保护试验

用8μg来自Mtb抗原亚组的各种重组蛋白，混合了佐剂CpG给小鼠皮下接种三次，每次间隔3周。阳性对照小鼠用BCG(5x10⁴CFU)在尾巴根部接种一次，阴性对照小鼠仅注射盐水或佐剂。最后一次免疫后30天，通过接触低剂量结核分枝杆菌H37Rv菌株(ATCC 35718；美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)，Manassas，VA)气雾剂来攻击小鼠，所用UW-Madison气雾剂接触室(Madison，W1)被校准成向肺部送递50-100个细菌。四周后，小鼠被实施安乐死，在PBS/Tween 80(0.05％)中制备肺和脾的匀浆。细菌计数的确定是将单个完整器官的梯度稀释液接种到营养Middlebrook 7H11Bacto琼脂(BD Biosciences，Cockeysville，MD)上，在湿润空气和5％CO₂中37℃温育14天后计数形成的细菌菌落。数据表示为回收细菌的平均值的Log10±SD以及CFU的Log10减少＝接种组的Log 10CFU-盐水处理组的Log 10CFU。

结果：

对辅佐有CpG的重组Mtb抗原的免疫反应

用与25μg佐剂CpG配制的重组Rv0164、Rv0455、Rv0496、Rv2608、Rv3020、Rv3478、Rv3619、Rv3620、Rv1738、Rv1813、Rv3810、Rv2389、Rv2866、Rv0831、Rv1818、Rv1886、Rv2032、Rv2623、Rv2875、Rv3044、Rv0577、Rv1626、Rv3628和Rv1884蛋白给C57BL/6小鼠免疫三次，每次间隔三周。最后一次免疫后一周和三周分别评估抗原特异性抗体和记忆性T淋巴细胞的存在。

通过将各重组蛋白包被到板上并梯度稀释不同的血清，经常规ELISA测量特异血清IgG同种型Ab反应。确定每个疫苗组的IgG2c∶IgG1终点滴度比率(表1)。盐水、单独的CpG佐剂或者BCG免疫未能诱导对所检测的任何一种Mtb重组蛋白有特异性的IgGI或IgG2c抗体反应(数据未显示)。用含有佐剂CpG的各种Mtb重组蛋白进行的免疫均诱发了抗原特异性IgG1和IgG2c。

表1.对Mtb抗原的免疫反应

^a每百万细胞的斑点形成单位(SD)。小鼠用Mtb抗原(Rv#)+CpG皮下免疫三次，每次间隔三周。最后一次注射后3周通过ELISPOT确定对抗原的细胞因子应答。

^bIgG2c∶IgG1比率，^*P＜0.05，Student′s t检验，

^cND，未做

最后一次免疫后三周，制备脾细胞，进行ELISPOT分析以便确定应答单独的培养基、促细胞分裂原ConA、PPD、Mtb裂解物和各种重组Mtb蛋白时，表达IFN-γ或TNF的脾细胞的相对数量。

注射盐水或单独CpG佐剂没有诱发对任何重组蛋白特异的IFN-γ或TNF反应(数据未显示)。

用含有佐剂CpG的各种Mtb重组蛋白进行的免疫诱使活化的脾细胞产生抗原特异性IFN-γ和/或TNF回忆应答(表1)。应答Mtb裂解物和PPD时，还观察到较低水平的IFN-γ(数据未显示)，这提示了这些蛋白天然存在于分枝杆菌裂解物中，特别是纯化的裂解物的衍生物中。

总之，这些结果表明用含有CpG的不同重组Mtb抗原进行的免疫诱发了主要是IgG2c、IFN-γ和TNF的Th1型记忆应答。

辅佐有CpG的不同Mtb重组蛋白抗Mtb H37Rv气雾剂攻击的保护作用

接种了含有CpG佐剂的Mtb重组蛋白Rv0496、Rv2608、Rv3020、Rv3478、Rv3619、Rv3620、Rv1813、Rv1569、Rv1789、Rv1860、Rv1886、Rv2220、Rv2875、Rv3044、Rv0577、Rv1626和Rv0733的小鼠，用～50CFU的有毒力的结核分枝杆菌H37Rv气雾剂攻击后4周确定其肺和脾中的活杆菌数量，以平均Log10 CFU表示。用不同重组蛋白免疫的小鼠的肺中的平均Log10 CFU，与从接受安慰剂(盐水)或目前唯一抗TB的疫苗BCG的小鼠获得的平均Log10 CFU进行比较。盐水组和接种组的平均Log10 CFU的差异表示为CFU的Log 10的减少。

用三个剂量的Rv3478+CpG或Rv2608+CpG给小鼠进行的免疫导致肺中的存活Mtb杆菌减少(分别是0.66，0.58)，接近接种BCG(0.78)的效果(表2)。用含有CpG佐剂的Rv0496、Rv3020、Rv3619、Rv3620、Rv1813、Rv1569、Rv1789、Rv1860、Rv1886、Rv2220、Rv2875、Rv3044、Rv0577、Rv1626和Rv0733分别进行的免疫也产生抗Mtb感染的某些保护作用。单独的CpG佐剂不能减少肺中的细菌负荷(-0.09)。

表2.疫苗诱导的对Mtb^a的保护

^a小鼠用8μgMtb抗原(Rv#)+25μg CpG经皮下免疫三次，每次间隔三周。

^b用低剂量的结核分枝杆菌H37Rv或Erdman菌株气雾剂攻击4周后，与用盐水免疫的小鼠相比肺中活杆菌数目(CFU)的减少。

这些结果显示的含有CpG佐剂的单个重组蛋白的3次剂量所达到的对Mtb感染的保护水平是令人惊讶的。

实施例23

C57BL/6小鼠中对MTB抗原混合物的免疫反应以及抗MTB气雾剂攻击的保护作用

本实施例显示，用本发明的Mtb抗原的混合物免疫小鼠产生免疫反应，可以提供抗结核分枝杆菌气雾剂攻击的保护作用。

材料&方法：

重组抗原和佐剂制剂

重组蛋白如上所述制备。CpG 1826从Coley Pharmaceuticals(Wellesley，MA)获得。

免疫

雌性C57/BL6小鼠获得自Charles River，每次试验中年龄相当(5-7周龄)。小鼠用与25μg佐剂CpG配制的6或8μg重组Rv2608、Rv3620和Rv1813蛋白免疫三次(每次间隔3周)。只有佐剂组和BCG对照组中的小鼠分别接受三个剂量的佐剂或者单个剂量的5x10⁴ BCG CFU。经皮下途径给小鼠注射100μl/小鼠的总体积。

细胞因子ELISA

最后一次强化免疫后三周，收集用于免疫原研究的动物的脾，通过常规程序获得脾细胞。为了进行细胞因子分析，将脾细胞以2.5x10⁵细胞/孔一式两份接种于96孔组织培养板，用培养基、Con A 3μg/ml、PPD 10μg/ml、Mtb裂解物10μg/ml或者各重组蛋白10μg/ml培养72小时。收集上清，按照制造商的方案利用特异性mAb(eBioscience)，经双夹心ELISA分析IFN-γ。

细胞因子ELISPOT

IgG同种型ELISA

最后一次免疫后一周，给动物取血并确定血清IgG1和IgG2c抗体滴度。用溶解在0.1M重碳酸盐缓冲液中的2μg/ml重组蛋白将Nunc-lmmuno Polysorb板于室温包被4小时，用PBS Tween-20 0.05％、BSA 1％于4℃封闭过夜，用PBS Tween-20 0.05％清洗，室温下与1∶50稀释的以及后续的5倍梯度稀释的血清温育2小时，清洗，与1∶2000稀释在PBS Tween-20 0.05％、BSA 0.1％中的抗IgG1-HRP或抗IgG2c-HRP温育1小时。将培养板清洗，用SureBlue TMB底物(KPL Inc.，Gaithersburg，MD)显影。用1N H₂SO₄终止酶反应，30分钟内利用微量板ELISA阅读器(Molecular Devices，Sunnyvale，CA)和SoftMax Pro5于450nm处读板，参照滤光片设在650nm。用GraphPad Prism 4(GraphPad Software Inc.，San Diego，CA)确定终点滴度，临界值设为0.1。

保护试验

用混合有佐剂CpG的6或8μg来自Mtb抗原亚组的各种重组蛋白，给小鼠皮下接种三次，每次间隔3周。阳性对照小鼠用BCG(5x10⁴CFU)在尾巴根部接种一次，阴性对照小鼠仅注射佐剂。最后一次免疫后30天，通过接触低剂量结核分枝杆菌H37Rv菌株(ATCC 35718；美国典型培养物保藏中心，Manassas，VA)气雾剂来攻击小鼠，所用UW-Madison气雾剂接触室(Madison，W1)被校准成向肺部送递50-100个细菌。四周后，小鼠被实施安乐死，在PBS/Tween 80(0.05％)中制备肺和脾的匀浆。细菌计数的确定是将单个完整器官的梯度稀释液接种到营养Middlebrook 7H11 Bacto琼脂(BD Biosciences，Cockeysville，MD)上，在湿润空气和5％CO₂中于37℃温育14天后计数形成的细菌菌落。数据表示为回收细菌的平均值的Log10±SD，以及CFU的Log10减少＝接种组的Log 10CFU-盐水处理组的Log 10CFU。

结果：

对辅佐有CpG的重组Mtb抗原混合物的免疫反应

用与25μg佐剂CpG配制的重组Rv2608、Rv3620和Rv1813蛋白单独(8μg)或者混合(各6μg)给C57BL/6小鼠免疫三次，每次间隔三周。最后一次免疫后一周和三周分别评估抗原特异性抗体和记忆性T淋巴细胞的存在。

通过将各重组蛋白包被到板上并梯度稀释不同的血清，利用常规ELISA测量特异性血清IgG同种型Ab反应。确定每个疫苗组的IgG2c终点滴度。单独的CpG佐剂或者BCG免疫未能诱导对所检测的任何一种Mtb重组蛋白有特异性的IgG1或IgG2c抗体反应(图3B，数据未显示)。用含有佐剂CpG的各种Mtb重组蛋白进行的免疫均诱发了抗原特异性IgG1(数据未显示)和IgG2c(图3B)。

最后一次免疫后三周，制备脾细胞，进行ELISA或ELISPOT分析以便确定应答单独的培养基、促细胞分裂原ConA、PPD、Mtb裂解物和各重组Mtb蛋白时，IFN-γ的相对水平或者表达TNF的脾细胞的数量。

单独注射CpG佐剂没有诱发对任何重组蛋白特异的IFN-γ或TNF反应(图3C-D)。

用含有佐剂CpG的各Mtb重组蛋白进行的免疫诱使活化的脾细胞产生抗原特异性IFN-γ和TNF回忆应答(图3C-D)。当三种抗原混合使用时，观察到较低水平的细胞因子反应。

总之，这些结果表明用含有CpG的不同重组Mtb抗原单独或者混合进行的免疫诱发了主要是IgG2c、IFN-γ和TNF的Th1型记忆应答。

含有CpG佐剂的不同Mtb重组蛋白混合物抗Mtb H37Rv气雾剂攻击的保护作用

用含有CpG佐剂的Mtb重组蛋白Rv2608、Rv3620和Rv1813单独(8μg)或者混合(每种6μg)接种的小鼠，用～50CFU的有毒力的结核分枝杆菌H37Rv气雾剂攻击后4周确定其肺中的活杆菌数量，以平均Log10 CFU表示。用不同重组蛋白免疫的小鼠的肺中的平均Log10CFU，与从仅接受安慰剂(盐水)或目前唯一抗TB的疫苗BCG的小鼠获得的平均Log10 CFU进行比较。佐剂组和接种组的平均Log10 CFU的差异表示为CFU的Log 10减少。

小鼠用三个剂量的Rv2608+Rv3620+Rv1813+CpG免疫导致肺中的存活Mtb杆菌减少(CFU的Log 10减少为0.67)，接近接种BCG的效果(0.71)(图3A)。用含有CpG佐剂的Rv2608或Rv1813进行的免疫也产生抗Mtb感染的某些保护作用(分别为0.24和0.30)。用Rv3620+CpG或者单独的CpG佐剂不能减少肺中的细菌负荷。注射这三种Mtb抗原的混合物达到的CFU的减少比三个单独效果的加和高。

这些结果显示含有CpG佐剂的三种重组蛋白的混合物的3次剂量所达到的对Mtb感染的保护水平，与含有CpG的各个蛋白的3次剂量相比是令人惊讶的。

实施例24

C57BL/6小鼠中对ID83和ID93融合蛋白的免疫反应以及抗MTB气雾剂攻击的保护作用

本实施例显示，用本发明的融合蛋白免疫小鼠产生免疫反应，可以提供抗结核分枝杆菌气雾剂攻击的保护作用。

材料&方法：

融合蛋白和佐剂制剂

融合蛋白如上所述制备。CpG 1826从Coley Pharmaceuticals(Wellesley，MA)获得。吡喃葡萄糖基脂质A(GLA)从Avanti(Alabaster，AL)获得，Gardiquimod(GDQ)从Invivogen(San Diego，CA)获得。水包油稳定乳剂(-SE)通过标准技术制备。

免疫

雌性C57/BL6小鼠获得自Charles River，每个试验中年龄相当(5-7周龄)。小鼠用与20μg佐剂GLA-SE配制的8μg ID83和ID93融合蛋白，或者与20-25μg佐剂GLA-SE、GDQ-SE、CpG-SE、GLA/GDQ-SE、GLA/CpG-SE、CpG/GDQ-SE配制的8μg ID83融合蛋白免疫三次(每次间隔3周)。盐水组、只有佐剂组和BCG对照组中的小鼠分别接受三次剂量的PBS、三次剂量的单独佐剂，或者单次剂量的5x10⁴ BCGCFU。经皮下途径给小鼠注射100μl/小鼠的总体积。

细胞因子ELISA

最后一次强化免疫后三周，收集用于免疫原研究的动物的脾，通过常规程序获得脾细胞。为了进行细胞因子分析，将脾细胞以2.5x10⁵细胞/孔一式两份接种于96孔组织培养板，用培养基、Con A 3μg/ml、PPD 10μg/ml、Mtb裂解物10μg/ml或者各融合蛋白10μg/ml培养72小时。收集上清，按照制造商的方案利用特异性mAb(eBioscience)，经双夹心ELISA分析IFN-γ。

IgG同种型ELISA

最后一次免疫后一周，给动物取血并确定血清中的IgG1和IgG2c抗体滴度。用溶解在0.1M重碳酸盐缓冲液中的2μg/ml重组蛋白将Nunc-lmmuno Polysorb板于室温包被4小时，用PBS Tween-20 0.05％、BSA 1％于4℃封闭过夜，用PBS Tween-20 0.05％清洗，室温下与1∶50稀释的以及后续的5倍梯度稀释的血清温育2小时，清洗，与1∶2000稀释在PBS Tween-20 0.05％、BSA 0.1％中的抗IgG1-HRP或抗IgG2c-HRP温育1小时。将培养板清洗，用SureBlue TMB底物(KPL Inc.，Gaithersburg，MD)显影。用1N H₂SO₄终止酶反应，30分钟内利用微量板ELISA阅读器(Molecular Devices，Sunnyvale，CA)和SoftMax Pro5于450nm处读板，参照滤光片设在650nm。用GraphPad Prism 4(GraphPad Software Inc.，San Diego，CA)确定终点滴度，临界值设为0.1。

保护试验

用与指定佐剂配制的8μg融合蛋白给小鼠皮下免疫三次，每次间隔3周。阳性对照小鼠用BCG(5x10⁴CFU)在尾巴根部接种一次，阴性对照动物注射盐水或单独的佐剂。最后一次免疫后30天，通过接触低剂量结核分枝杆菌H37Rv菌株(ATCC 35718；American Type CultureCollection，Manassas，VA)气雾剂来攻击小鼠，所用UW-Madison气雾剂接触室(Madison，W1)被校准成向肺部送递50-100个细菌。四周后，小鼠被实施安乐死，在PBS/Tween 80(0.05％)中制备肺和脾的匀浆。细菌计数的确定是将单个完整器官的梯度稀释液接种到营养Middlebrook 7H11 Bacto琼脂(BD Biosciences，Cockeysville，MD)上，在湿润空气和5％CO₂中于37℃温育14天后计数形成的细菌菌落。数据表示为回收细菌的平均值的Log10±SD，以及CFU的Log10减少＝接种组的Log10CFU-盐水处理组的Log10CFU。

结果：

对辅佐有GLA-SE的ID83和ID93的免疫反应

用与20μg佐剂GLA-SE配制的ID83和ID93融合蛋白给C57BL/6小鼠免疫三次，每次间隔三周。最后一次免疫后一周和三周分别评估抗原特异性抗体和记忆性T淋巴细胞的存在。

通过将各重组蛋白包被到板上并梯度稀释不同的血清，利用常规ELISA测量特异性血清IgG同种型Ab反应。确定每个疫苗组的终点滴度。盐水(图4A)或者单独的GLA-SE佐剂(数据未显示)均未能诱导对ID83或ID93融合蛋白特异的IgG1或IgG2c抗体反应。用含有佐剂GLA-SE的ID83或ID93融合蛋白进行的免疫均诱发了抗原特异性IgG1和IgG2c。

最后一次免疫后三周，制备脾细胞，进行ELISA分析以便确定应答单独的培养基、促细胞分裂原ConA和各融合蛋白时，脾细胞产生的IFN-γ的相对水平。

注射盐水或单独GLA-SE佐剂没有诱发对ID83或ID93融合蛋白特异的IFN-γ反应(数据未显示)。

用含有佐剂GLA-SE的ID83或ID93融合蛋白进行的免疫诱使活化的脾细胞产生抗原特异性的IFN-γ回忆反应(图4B)。

总之，这些结果表明用含有GLA-SE的不同融合蛋白进行的免疫诱发了B和T细胞免疫应答。

与不同佐剂配制的ID83的免疫原性

用与20-25μg佐剂GLA-SE、GDQ-SE、CpG-SE、GLA/GDQ-SE、GLA/CpG-SE、CpG/GDQ-SE配制的ID83融合蛋白给C57BL/6小鼠免疫三次，每次间隔三周。最后一次免疫后一周和三周分别评估抗原特异性抗体和记忆性T淋巴细胞的存在。

通过将各重组蛋白包被到板上并梯度稀释不同的血清，利用常规ELISA测量特异性血清IgG同种型Ab反应。确定每个疫苗组的终点滴度。盐水未能诱导对ID83融合蛋白特异的IgGI或IgG2c抗体反应。用含有不同佐剂的ID83进行的免疫均诱发了抗原特异性IgG1和IgG2c(图5A)。

最后一次免疫后三周，制备脾细胞，进行ELISA分析以便确定应答单独的培养基、促细胞分裂原ConA和ID83融合蛋白时，脾细胞产生的IFN-γ的相对水平。

注射盐水未能诱发对ID83融合蛋白特异的IFN-γ反应。用含有不同佐剂的ID83融合蛋白进行的免疫诱发了由活化的脾细胞产生的抗原特异性IFN-γ回忆应答(图5B)。

总之，这些结果表明用含有各种佐剂的ID83融合蛋白进行的免疫诱发了B和T细胞免疫应答。

与佐剂GLA-SE配制的ID83和ID93融合蛋白赋予的抗Mtb H37Rv气雾剂攻击的保护作用

用含有佐剂GLA-SE的ID83或ID93融合蛋白接种的小鼠，在用～50CFU的有毒力的结核分枝杆菌H37Rv气雾剂攻击后4周确定其肺中的活杆菌数量，以平均Log10 CFU表示。

用不同融合蛋白免疫的小鼠肺中的平均Log10 CFU，与从只接受安慰剂(盐水)或BCG的小鼠获得的平均Log10 CFU进行比较。盐水组和接种组的平均Log10 CFU的差异表示为CFU的Log10减少。

小鼠用三次剂量的ID83+GLA-SE或ID93+GLA-SE免疫导致感染MtbD小鼠肺中的存活Mtb杆菌分别减少0.34和0.48Log10(表3)。这些结果显示三次剂量的含有GLA-SE佐剂的两种不同融合蛋白实现了对Mtb感染的保护作用。

表3.接种疫苗的小鼠肺中的存活杆菌数目

组	CFU^a	SD	差异^b	组	CFU	SD	差异
								盐水	5.79	0.09	N/A^c	盐水	5.94	0.15	N/A
BCG	5.06	0.18	0.73	BCG	5.07	0.20	0.87
								ID83+GLA-SE	5.45	0.23	0.34	ID93+GLA-SE	5.46	0.21	0.48

^aCFU＝菌落形成单位。数值代表被感染小鼠的肺中的存活杆菌数，表达为Log₁₀。

^b差异＝盐水组的Log₁₀ CFU-疫苗处理组的Log₁₀ CFU

^CN/A＝不适用

与不同佐剂配制的ID83在C57BU6小鼠中对Mtb H 37Rv气雾剂攻击的保护作用

与20-25μg佐剂GLA-SE、CpG-SE或GLA/CpG-SE配制的ID83融合蛋白接种的小鼠，用～50 CFU的有毒力的结核分枝杆菌H37Rv气雾剂攻击，4周后确定其肺中的活杆菌数量，以平均Log10 CFU表示。

用不同佐剂中的ID83免疫的小鼠肺中的平均Log10 CFU，与从只接受安慰剂(盐水)或BCG的小鼠获得的平均Log10 CFU进行比较。盐水组和接种组的平均Log10 CFU的差异表示为CFU的Log10减少。

小鼠用三次剂量的含有不同佐剂的ID83免疫导致感染MtbD的小鼠肺中的存活Mtb杆菌减少(表4)。这些结果很有前景，因为它们显示了三次剂量的辅佐有GLA-SE的两种不同融合蛋白都实现了对Mtb感染的保护作用。

表4.接种疫苗的小鼠肺中的活杆菌数目

组	CFU^a	SD^b	CFU减少^c	P值^d
					盐水	6.28	0.22
BCG	5.01	0.15	1.27	＜0.01
					ID83+GLA-SE	5.75	0.22	0.53	＜0.01
ID83+CpG-SE	5.79	0.12	0.49	＜0.01
					ID83+GLA/CpG-SE	5.62	0.22	0.66	＜0.01

^aCFU＝菌落形成单位。数值代表被感染小鼠的肺中的活杆菌数，表达为Log₁₀。

^bSD＝标准差

^cCFU减少＝盐水组的Log₁₀ CFU-疫苗处理组的Log₁₀ CFU

^dP值是通过单向ANOVA，随后经Dunnett’s多项比较检验计算得到的。P值＜0.05认为是统计学显著的。

总之，这些结果表明用含有CpG-SE，GLA-SE，or CpG/GLA-SE的ID83融合蛋白进行的接种减少了细菌负荷，部分地保护小鼠免于结核分枝杆菌感染。ID83+CpG/GLA-SE是减少Mtb感染的小鼠肺中的活杆菌数的最有效的制剂。

与GLA/CpG-SE配制的ID83，赋予豚鼠抗Mtb H 37Rv气雾剂攻击的保护作用

用与20/25μg佐剂GLA/CpG-SE配制的ID83接种的豚鼠，在用约50CFU有毒力的结核分枝杆菌H37Rv气雾剂攻击后，跟踪200天记录它们的存活期。

将溶于GLA/CpG-SE佐剂的ID83免疫的豚鼠的存活期与接受安慰剂(盐水)或BCG的豚鼠的存活期进行比较。

对豚鼠用三次剂量含有不同佐剂的ID83进行的免疫，使得Mtb感染的豚鼠的存活期延长(图6)。感染后200天，接种ID83+GLA/CpG-SE的动物有75％仍活着，而Mtb感染后200天安慰剂组的豚鼠存活率为25％，用BCG免疫的豚鼠存活率为62％。

这些结果显示，用与GLA/CpG-SE配制的ID83融合蛋白的三次剂量实现了抗Mtb感染的保护作用。此外，用ID83+GLA/CpG-SE进行的接种比BCG对感染Mtb的豚鼠的保护时间长。

总之，这些结果表明用辅佐有CpG-SE、GLA-SE或CpG/GLA-SE的ID83融合蛋白进行的接种减少了感染Mtb小鼠肺中的细菌负荷，并且部分保护豚鼠免于结核分枝杆菌感染。ID83+CpG/GLA-SE是减少感染Mtb的小鼠肺中的活细菌数量和延长感染Mtb豚鼠存活期的最有效的制剂。

用辅佐有GLA-SE的ID83或ID93融合蛋白给小鼠进行的接种诱导产生了抗体和Th1T细胞记忆反应，并且使感染了结核分枝杆菌的小鼠肺中的活杆菌计数减少。此外，观察到CpG和GLA-SE的组合是最具有免疫原性的，使得针对结核分枝杆菌攻击的保护作用增强。

实施例25

C57BL/6小鼠中对AD5-ID83的免疫反应，以及对气雾剂结核分枝杆菌攻击的保护作用

本实施例显示了用经改造的表达本发明所述ID83融合蛋白的腺病毒载体免疫小鼠在C57BL/6小鼠中产生免疫反应。

材料&方法：

病毒构建和纯化

利用AdEasy^TM XL腺病毒载体系统(AdenoviralVector System)(Stratagene#240010)构建Ad5-ID83。简而言之，利用PCR从质粒DNA中扩增ID83，经HindIII和EcoRV消化，连接到pShuttle-CMV中制得ID83-pShuttleCMV。用Pmel消化使ID83-pShuttleCMV线性化，经电穿孔(2.4kV，186ω，0.2cm gap cuvette)进入大肠杆菌BJ5183-AD-1电感受态细胞(Stratagene#200157)。通过用PacI消化鉴定重组Ad5-ID83质粒。利用Polyfect试剂(Invitrogen#301107)将PacI消化的Ad5-ID83质粒(4μg)转染到60mm平板上的AD-239细胞中。4天后，将细胞收集到3mL培养液中，经三轮冻/融裂解。用裂解物上清扩增病毒，用于经CsCl梯度离心进行纯化。

免疫

雌性C57/BL6小鼠获得自Charles River，每个试验中年龄相当(5-7周龄)。小鼠用5x10⁸ Ad5-ID83病毒颗粒免疫两次(间隔3周)。盐水组和BCG对照组中的小鼠分别接受PBS或者单次剂量的5x10⁴ BCGCFU。经肌肉途径给小鼠注射100μl/小鼠的总体积。

细胞因子ELISPOT

将MultiScreen 96孔滤板(Millipore，Bedford，MA)用10μg/ml大鼠抗小鼠IFN-γ或TNF捕获Ab(eBioscience)包被，于4℃温育过夜。滤板用PBS清洗，用RPMI 1640和10％FBS于室温封闭至少1小时，再次清洗。脾细胞以2x10⁵细胞/孔一式两份接种到板中，用培养基、Con A 3μg/ml、PPD 10μg/ml或者各重组蛋白10μg/ml于37℃刺激48小时。随后用PBS和0.1％Tween-20清洗滤板，与溶解在PBS、0.5％BSA和0.1％Tween-20中的5μg/ml偶联了生物素的大鼠抗小鼠IFN-γ或TNF二抗(eBioscience)温育2小时。用Vectastain ABC抗生物素蛋白过氧化物酶偶联物和Vectastain AEC底物试剂盒(VectorLaboratories，Burlingame，CA)按照制造商的实验方案将滤膜显影。用去离子水清洗滤板使反应终止，板在暗处干燥，在自动ELISPOT阅读器(C.T.L.Serie3A Analyzer，Cellular Technology Ltd，Cleveland，OH)上计数斑点，用(CTL Analyzer LLC)进行分析。

保护试验

用在指定佐剂中配制的8μg融合蛋白皮下免疫小鼠三次，每次间隔3周。阳性对照小鼠用BCG(5x10⁴CFU)在尾巴根部免疫一次，阴性对照动物注射盐水或单独的佐剂。最后一次免疫后30天，通过接触低剂量结核分枝杆菌H37Rv菌株(ATCC 35718；美国典型培养物保藏中心，Manassas，VA)气雾剂来攻击小鼠，所用UW-Madison气雾剂接触室(Madison，W1)被校准成向肺部送递50-100个细菌。四周后，小鼠被实施安乐死，在PBS/Tween 80(0.05％)中制备肺和脾的匀浆。细菌计数的确定是将单个完整器官的梯度稀释液接种到营养Middlebrook7H11 Bacto琼脂(BD Biosciences，Cockeysville，MD)上，在湿润空气和5％CO₂中于37℃温育14天后计数形成的细菌菌落。数据表示为回收细菌的平均值的Log10±SD，以及CFU的Log10减少＝接种组的Log10CFU-盐水处理组的Log10CFU。

结果：

对Ad5-ID83的免疫反应

C57BL/6小鼠用Ad5-ID83免疫两次，间隔三周。

最后一次免疫后三周，制备脾细胞，通过ELISPOT分析确定应答单独的培养基、促细胞分裂原ConA和各融合蛋白时表达IFN-γ的脾细胞的相对数量。

用Ad5-ID83进行的免疫诱导活化的脾细胞产生抗原特异性IFN-γ回忆应答(图7A)。注射盐水未能诱导对ID83特异的IFN-γ应答。

Ad5-ID83赋予的抗Mtb H37 Rv气雾剂攻击的保护作用

用5x10⁸ Ad5-ID83病毒颗粒接种的小鼠，用～50CFU的有毒力的结核分枝杆菌H37Rv气雾剂攻击，4周后确定其肺中的活杆菌数量，以平均Log10 CFU表示。

用Ad5-ID83免疫的小鼠肺中的平均Log10 CFU，与接受安慰剂(盐水)的小鼠获得的平均Log10 CFU进行比较。盐水组和接种组的平均Log10 CFU的差异表示为CFU的Log10减少。

小鼠用两次剂量的Ad5-ID83免疫导致感染Mtb的小鼠肺中的存活Mtb杆菌减少0.27(图7B)。这些结果很有前景，因为它们显示了仅两次剂量的Ad5-ID83即实现了对Mtb感染的保护作用。

总之，这些结果表明用Ad5-ID83进行的免疫诱发了T细胞免疫反应，并且部分保护小鼠免于结核分枝杆菌气雾剂攻击。

实施例26

含有佐剂GLA-SE的MTB RV1813、RV2608和RV3620重组蛋白的免疫疗法

本实施例表明，用本发明所述重组蛋白的混合物免疫小鼠，结合标准抗生素治疗能够延长感染结核分枝杆菌小鼠的寿命。

材料&方法：

重组蛋白和佐剂制剂

如上所述制备重组蛋白。吡喃葡萄糖基脂质A(GLA)从Avanti(Alabaster，AL)获得。制备了稳定的水包油乳剂(-SE)。

用结核分枝杆菌进行的气雾剂攻击

雌性SWR/J小鼠从Jackson Laboratories获得，每个实验中的小鼠年龄相当(5-7周龄)。通过接触低剂量结核分枝杆菌H37Rv菌株(ATCC35718；美国典型培养物保藏中心，Manassas，VA)气雾剂来攻击小鼠，所用UW-Madison气雾剂接触室(Madison，W1)被校准成向肺部送递50-100个细菌。感染后对小鼠的存活监测225天。

疗法

用结核分枝杆菌进行气雾剂攻击后两周，开始标准的抗生素治疗。在小鼠的饮用水中给予50mg/l利福平和85mg/l异烟肼60天。一些小鼠接受了另外的免疫疗法，在感染后第76、97和118天各用与20μg佐剂GLA-SE配制的6μgRv1813、Rv2608和Rv3620重组蛋白免疫。经皮下途径给小鼠注射100μl/小鼠的总体积。对小鼠的存活情况监测225天。

结果：

抗生素+含有GLA-SE的Rv1813、Rv2608和Rv3620免疫疗法的组合在感染结核分枝杆菌小鼠中提供的保护作用

小鼠用约50CFU有毒力的结核分枝杆菌H37Rv气雾剂攻击后，跟踪其存活情况225天，所述感染Mtb的小鼠用标准利福平+异烟肼抗生素(Rx)治疗，或者用Rx和免疫疗法(与20μg佐剂GLA-SE配制的Rv1813、Rv2608和Rv3620重组蛋白)联合治疗。

将Rx+免疫疗法治疗的小鼠的存活情况与仅接受Rx或者安慰剂(盐水)的小鼠的存活情况进行比较。

除了Rx，还用三次剂量的含有GLA-SE的Rv1813、Rv2608和Rv3620重组蛋白处理小鼠导致感染Mtb的小鼠的存活期延长(图8)。在感染后第225天，接种含有GLA-SE的Rv1813、Rv2608和Rv3620的小鼠有75％仍活着，而仅有抗生素(Rx)的处理组中0％小鼠活着，安慰剂组0％小鼠活着。

这些结果显示，抗生素+三次剂量的含有GLA-SE的Rv1813、Rv2608和Rv3620实现了抗Mtb感染的保护作用。此外，用抗生素+含有GLA-SE的Rv1813、Rv2608和Rv3620进行的治疗比单独的抗生素对感染Mtb的小鼠保护更长。

总之，这些结果表明用含有GLA-SE的Rv1813、Rv2608和Rv3620进行的免疫疗法加上抗生素诱发了帮助小鼠控制已建立的结核分枝杆菌感染的免疫反应。

实施例27

结核病的血清学诊断

本实施例鉴定了对结核病感染的血清学诊断具有增加的灵敏性和特异性的结核分枝杆菌抗原和抗原融合物。

将Polysorp 96孔板(Nunc，Rochester，NY)用溶于重碳酸盐缓冲液的2μg/ml重组抗原于4℃包被过夜，用含有1％(w/v)BSA的PBST于室温下在平板摇床上封闭2小时。将血清在含有0.1％BSA的PBST中适当地稀释到1/200，加入每孔中，将平板在室温下震荡温育2小时。用含有0.1％BSA的PBST清洗板，然后向每孔中加入以1∶10000稀释于PBST和0.1％BSA中的偶联HRP的IgG免疫球蛋白(Sigma，St.Louis，MO)，室温下震荡温育60分钟。清洗后，96孔板用过氧化物酶显色底物(KPL，Baltimore MD)显色，10分钟后加入1N H₂SO₄终止反应。利用微量板阅读器(Molecular Devices，Sunnyvale，CA)在450-570nm处读取每孔校正过的光密度。

图9中总结了这些实验的结果。分析一组痰阳性的、确诊结核病的血清样品(TB，N＝80-92)和一组结核病阴性的健康对照血清(NEC，N＝40-46)与选定结核病抗原的反应性。一种先前已表征的抗原TBF10作为阳性对照，发现它对92个结核病阳性血清样品中的53个产生血清阳性反应。图9显示了各个抗原的反应性，所有列出的抗原对结核病血清样品中的11-82个表现出反应性，而对健康对照有很低的或者没有反应性。给定抗原的反应性随血清组(panel)变化，因此可以通过选择合适的抗原组合来得到100％的阳性反应。

实施例28

重组RV0577的克隆和表达

用H37Rv基因组DNA作为模板，利用以下引物PCR扩增Rv0577：

5′-Rv0577-NdeI

CAATTACATATGAGAGTTTTGTTGCTGGGACCG (SEQ IDNO：295)

3′Rv0577-HindIII-

CAATTAAAGCTTCTACTTTCCAGAGCCCGCAACGC (SEQ IDNO：296)

在以下条件下进行扩增：94℃0.5分钟，55℃0.5分钟，68℃2分钟，进行30个循环得到SEQ ID NO：185所示的产物。PCR产物用NdeI/HindIII消化，克隆到pET28.a载体中。宿主菌株BL-21 plysS表达Rv0733。上清与Ni树脂在变性条件下结合。Ni-NTA纯化后进行阴离子交换纯化。在20mM Tris(pH 8)中透析。重组蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：186所示。

实施例29

重组RV1626的克隆和表达

用H37Rv基因组DNA作为模板，利用以下引物PCR扩增Rv1626：

5′-Rv1626-NdeI

CAATTACATATGACCGGCCCCACCACCGCGCC(SEQ IDNO：297)

3’-Rv1626-HindIII

CAATTAAAGCTTTCAGGTGTCTTTGGGTGTTCCGAG(SEQ IDNO：298)

在以下条件下进行扩增：94℃0.5分钟，55℃0.5分钟，68℃2分钟，进行30个循环得到SEQ ID NO：188所示的产物。PCR产物用NdeI/HindIII消化，克隆到pET28.a载体中。宿主菌株BL-21plysS表达Rv1626。上清与Ni树脂在变性条件下结合。将Ni-NTA纯化后进行阴离子交换纯化。在20mM Tris(pH 8)中透析。重组蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：189所示。

实施例30

重组RV0733的克隆和表达

用H37Rv基因组DNA作为模板，利用以下引物PCR扩增Rv0733：

5′-Rv0733-5NdeI

CAATTACATATGAGAGTTTTGTTGCTGGGACCG(SEQ IDNO：299)

3′-Rv0733-HindIII

CAATTAAAGCTTCTACTTTCCAGAGCCCGCAACGC(SEQ IDNO：300)

在以下条件下进行扩增：94℃0.5分钟，55℃0.5分钟，68℃2分钟，进行30个循环得到SEQ ID NO：191所示的产物。PCR产物用NdeI/HindIII消化，克隆到pET28.a载体中。宿主菌株BL-21 plysS表达Rv0733。上清与Ni树脂在变性条件下结合。将Ni-NTA纯化后进行阴离子交换纯化。在20mM Tris(pH 8)中透析。重组蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：192所示。

实施例31

重组RV2520的克隆和表达

用H37Rv基因组DNA作为模板，利用以下引物PCR扩增Rv2520：

5′-Rv2520-NdeI-6his

CAATTACATATGCATCACCATCACCATCACGTGGTGGACCGC GATCCCAATACC(SEQ ID NO：301)

3′-Rv2520-EcoRI

CAATTAGAATTCTCAGCGATTCCTGATCTTGTG(SEQ ID NO：302)

在以下条件下进行扩增：94℃0.5分钟，55℃0.5分钟，68℃2分钟，进行30个循环得到SEQ ID NO：194所示的产物。PCR产物用NdeI/EcoRI消化，克隆到失去上游6个组氨酸和5’连接子序列的改进的pET28a载体中。将Rv2520转化至表达宿主BL-21 plysS和RosettapLysS中。两种菌株表达相当，但继续使用的是BL-21 pLysS细胞菌株。细胞裂解后，上清组分与Ni-NTA树脂在变性条件下结合。将Ni-NTA纯化后进行阴离子交换纯化。将纯化组分透析至20mM Tris(pH 8)中。重组蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：195所示。

实施例32

重组RV1253的克隆和表达

用H37Rv基因组DNA作为模板，利用以下引物PCR扩增Rv1253：

5′-Rv1253-NdeI

CTGGATCCCATATGGCCTTCCCGGAATATTCGC(SEQ IDNO：303)

3′-Rv1253-EcoRI

CTAGCTGAATTCTCATCCGACGTGTTTCCGCCG(SEQ ID NO：304)

在以下条件下进行扩增：94℃0.5分钟，55℃0.5分钟，68℃2分钟，进行30个循环得到SEQ ID NO：197所示的产物。PCR产物用NdeI/EcoRI消化，克隆到pET28.a载体中。将Rv1511转化至表达宿主Rosetta plysS。裂解1L诱导液后，表达的重组蛋白在内含体沉淀中。在变性条件下进行Ni-NTA亲和纯化，然后对20mM Tris(pH 8)透析。重组蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：198所示。

实施例33

重组RV1980的克隆和表达

用H37Rv基因组DNA作为模板，利用以下引物PCR扩增Rv1980：

5′-Rv1980-NdeI-24

CAATTACATATGGCGCCCAAGACCTACTGCGAG(SEQ ID NO：305)3′-Rv1980-HindIII

CAATTAAAGCTTCTAGGCCAGCATCGAGTCGATCGC(SEQ IDNO：306)

在以下条件下进行扩增：94℃0.5分钟，55℃0.5分钟，68℃2分钟，进行30个循环得到SEQ ID NO：200所示的产物。PCR产物用NdeI/HindIII消化，克隆到pET28.a载体中。将Rv1980转化至表达宿主Rosetta plysS。裂解1L诱导液后，表达的重组蛋白在内含体沉淀中。在变性条件下进行Ni-NTA亲和纯化，然后对20mM Tris(pH 8)透析。重组蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：201所示。

实施例34

重组RV3628的克隆和表达

用H37Rv基因组DNA作为模板，利用以下引物PCR扩增Rv3628：

5′-Rv3628-Nde-6hisI

CAATTACATATGCATCACCATCACCATCACATGCAATTCGACGTGACCATC(SEQ ID NO：307)

3′-Rv3628-EcoRI

CAATTAGA47TCTCAGTGTGTACCGGCCTTGAAGCG(SEQ IDNO：308)

在以下条件下进行扩增：94℃0.5分钟，55℃0.5分钟，68℃2分钟，进行30个循环得到SEQ ID NO：203所示的产物。用H37Rv基因组DNA作为模板，以95℃1分钟、58℃1分钟、72℃1.5分钟，35个循环的条件PCR扩增Rv3628。PCR产物用NdeI/EcoRI消化，克隆到pET17b中。将Rv3628转化至表达宿主BL-21 plysE和Rosetta pLysS中。两种菌株表达相当，但继续使用的是pLysE构建体。裂解1L诱导液后，蛋白进入内含体。在变性条件下进行Ni-NTA，然后对20mM Tris(pH8)透析。重组蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：204所示。

实施例35

重组RV1844的克隆和表达

用H37Rv基因组DNA作为模板，利用以下引物PCR扩增Rv1844：

5′-Rv1884-NdeI-6his30

CAATTACATATGCATCACCATCACCATCACACTTCCGGCGAT ATGTCGAGC(SEQ ID NO：309)

3′-Rv1884-EcoRI

CAATTAGAATTCTCAGCGCGGAATACTTGCCTG(SEQ IDNO：310)

在以下条件下进行扩增：94℃0.5分钟，55℃0.5分钟，68℃2分钟，进行30个循环得到SEQ ID NO：206所示的产物。PCR产物用NdeI/EcoRI消化，克隆到pET17b中。将含有Rv1884基因的质粒转化至表达宿主BL-21 plysE和Rosetta pLysS中。两种菌株表达相当，但继续使用的是pLysE。裂解1L诱导液后，其保留在不溶的内含体组分中。在变性条件下进行Ni-NTA，然后对10mM Tris(pH 8)透析。重组蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：207所示。

实施例36

重组RV3872的克隆和表达

用H37Rv基因组DNA作为模板，利用以下引物PCR扩增Rv3872：

5′-Rv3872-NdeI

GTGCTAGCCATATGGAAAAAATGTCACATGATC(SEQ ID NO：311)

3′-Rv3872-HindIII

CTGGATCCAAGCTTCTATTCGGCGAAGACGCCGGC(SEQ IDNO：312)

在以下条件下进行扩增：94℃0.5分钟，55℃0.5分钟，68℃2分钟，进行30个循环得到SEQ ID NO：209所示的产物。PCR产物用NdeI/HindIII消化，克隆到pET28a载体中。将Rv3872转化至表达宿主Rosetta pLysS中。裂解1L诱导液后，重组蛋白表达在可溶的上清组分中。Ni-NTA亲和纯化在天然条件下进行两次，然后对20mMTris(pH 8)透析。重组蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：210所示。

实施例37

重组RV3873的克隆和表达

用H37Rv基因组DNA作为模板，利用以下引物通过PCR扩增Rv3873：

5′-Rv3873-NdeI

GTGCTAGCCATATGCTGTGGCACGCAATGCCAC(SEQ ID NO：313)

3′-3873-HindIII

CTGGATCCAAGCTTTCACCAGTCGTCCTCTTCGTC(SEQ ID NO：314)

在以下条件下进行扩增：94℃0.5分钟，55℃0.5分钟，68℃2分钟，进行30个循环得到SEQ ID NO：212所示的产物。PCR产物用NdeI/HindIII消化，克隆到pET28a载体中。将含有Rv3873基因的质粒转化至表达宿主Rosetta pLysS中。裂解1L诱导液后，重组蛋白表达在可溶的上清组分中。Ni-NTA亲和纯化在天然条件下进行两次，然后对20mM Tris(pH 8)透析。重组蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：213所示。

实施例38

重组RV1511的克隆和表达

用H37Rv基因组DNA作为模板，利用以下引物PCR扩增Rv1511：

5′-Rv1511-NdeI

CAATTACATATGCATCACCATCACCATCACGTGAAGCGAGCG CTCATCACC(SEQ ID NO：315)

3′-Rv1511-EcoRI

CAATTAGAATTCTCATGTCCGGCCGGCGATCATCG(SEQ IDNO：316)

在以下条件下进行扩增：94℃0.5分钟，55℃0.5分钟，68℃2分钟，进行30个循环得到SEQ ID NO：214所示的产物。PCR产物用NdeI/EcoRI消化，克隆到去除了5’连接子的pET28a中。将Rv1511转化至表达宿主BL-21 plysS和Rosetta pLysS中。两种菌株表达相当，但继续使用的是BL-21细胞。裂解1L诱导液后，重组蛋白表达在内含体沉淀中。在变性条件下进行Ni-NTA亲和纯化，然后对10mMTris(pH 9.5)透析。重组蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：215所示。

实施例39

重组融合蛋白ID93的克隆和表达

以下引物用于克隆融合构建体ID93，其包含来源于Rv3619、Rv1813、Rv3620和Rv2608的融合伴侣：

5′：Rv1813mat-5NdeI-KpnI

CAATTACATATGGGTACCCATCTCGCCAACGGTTCGATG(SEQ ID NO：218)

3′：Rv1813mat-3SacIgo

CAATTAGAGCTCGTTGCACGCCCAGTTGACGAT(SEQ IDNO：219)

5′：Rv3620-5Sacl

CAATTAGAGCTCATGACCTCGCGTTTTATGACG(SEQ ID NO：220)

3′：Rv3620-3SalIgo

CAATTAGTCGACGCTGCTGAGGATCTGCTGGGA(SEQ ID NO：221)

5′：Rv2608-5SalI

CAATTAGTCGACATGAATTTCGCCGTTTTGCCG(SEQ ID NO：222)

3′：Rv2608-3ScaI-HindIII

CAATTAAAGCTTTTAAGTACTGAAAAGTCGGGGTAGCGCCGG(SEQ ID NO：223)

5¹：Rv3619-5NdeI

CAATTACATATGACCATCAACTATCAATTC(SEQ ID NO：224)

3′：Rv3619-3KpnI

CAATTAGGTACCGGCCCAGCTGGAGCCGACGGC(SEQ ID NO：225)

由H37Rv基因组模板DNA通过PCR扩增Rv1813和Rv3620(94℃30秒；58℃30秒；58℃1.5分钟；35个循环)。Rv1813用NdeI/SacI消化，然后克隆到pET28.a载体中。Rv3620用SacI/SalI消化，然后连接到Rv1813pET构建体中。融合构建体具有SEQ ID NO：217显示的多核苷酸序列，编码SEQ ID NO：226所示的融合蛋白。Rv2608由质粒模板经PCR扩增(94℃30秒；58℃30秒；68℃1.5分钟；35个循环)。产物用SalI/HindIII消化并克隆到pET28.a-Rv1813-3620载体中。Rv3619同上扩增，用NdeI/KpnI消化，然后连接到ID83载体中。ID93在宿主BL-21 plysS中表达(2L，2x YT生长培养基，37℃)。在OD0.77时用1mM IPTG诱导，在OD1.93时收集。将细胞沉淀悬浮于裂解缓冲液(20mM Tris pH8，100mM NaCI，2mM PMSF)中，冷冻。然后将细胞沉淀融化，经超声裂解，7,000rcf旋转20分钟。ID83是内含体蛋白。沉淀用1％Chaps洗两次。将沉淀溶于60ml结合缓冲液(8M尿素，20mM Tris pH 8，100mM NaCl)，在室温与16ml Ni-NTA树脂结合1小时。漂洗(50ml 0.5％DOC，20分钟；80ml 60％IPA，30分钟；50ml0.5％DOC冲洗)树脂，然后用含有300mM咪唑的结合缓冲液洗脱。将来自第一次结合的上清与另外8mL树脂结合，如上所述处理。以上提到的纯化除去了降解产物。在160mL(含有50mM NaCI的结合缓冲液)中与32mL树脂在4℃过夜进行另一次Ni-NTA结合。如上所述对树脂进行漂洗和洗脱。来自这次结合的组分在20mM Tris pH8中透析。

实施例40

重组融合蛋白ID91的克隆和表达

以下引物用于克隆融合构建体ID91，其包含来源于Rv3619、Rv2389、Rv3478和Rv1886的融合伴侣：

5′-Rv3619-5NdeI

CAATTACATATGACCATCAACTATCAATTC(SEQ ID NO：228)

3′-Rv3619-3KpnI

CAATTAGGTA CCGGCCCAGCTGGAGCCGACGG(SEQ ID NO：229)

5′-Rv2389-KpnI

TGGGCCGGTACCGACGACATCGATTGGGACGCC(SEQ ID NO：230)

3′-Rv2389-BamHI

AATCCACCACGGATCCATCGTCCCTGCTCCCCGAAC(SEQ IDNO：231)

5′-Rv3478-BamHI

CAGGGACGATGGATCCGTGGTGGATTTCGGGGCGTTAC(SEQID NO：232)

3′-Rv3478-EcoRI

CCGGGAGAAGAATTCTCCGGCGGCCGGTGTGCGGG(SEQ IDNO：233)

5′-Rv1886-EcoRI

GCCGCCGGAGAATTCTTCTCCCGGCCGGGGCTGCC(SEQ IDNO：234)

3′-Rv1886matR HindIII

GATATCAAGCTTTCAGCCGGCGCCTAACGAAC(SEQ IDNO：235)

融合构建体具有SEQ ID NO：227所示的多核苷酸序列，编码SEQID NO：236所示的融合蛋白。

实施例41

重组融合蛋白ID71的克隆和表达

以下引物用于克隆融合构建体ID71，其包含来源于Rv3619、Rv2389、Rv3478(N180)和Rv1886的融合伴侣：

5′-Rv3619-5NdeI

CAATTACATATGACCATCAACTATCAATTC(SEQ ID NO：238)

3′-Rv3619-3KpnI

CAATTAGGTACCGGCCCAGCTGGAGCCGACGG(SEQ ID NO：239)

5′-Rv2389-KpnI

TGGGCCGGTACCGACGACATCGATTGGGACGCC(SEQ ID NO：240)

3′-Rv2389-BamHI

AATCCACCACGGATCCATCGTCCCTGCTCCCCGAAC(SEQ IDNO：241)

5′-Rv3478-N180-EcoRI

CGGCCGGGAGAAGAATTCCCCGCCGGGGTTGGTGATCAG(SEQ ID NO：242)

5′-Rv1886-EcoRI

GCCGCCGGAGAATTCTTCTCCCGGCCGGGGCTGCC(SEQ IDNO：243)

3′-Rv1886matR HindIII

GATATCAAGCTTTCAGCCGGCGCCTAACGAAC(SEQ ID NO：244)

融合构建体具有SEQ ID NO：237所示的多核苷酸序列，编码SEQID NO：245所示的融合蛋白。

实施例42

重组融合蛋白ID114的克隆和表达

以下引物用于克隆融合构建体ID114，其包含来源于Rv1813、Rv3620、Rv2608和Rv1886的融合伴侣：

5′：Rv2608-5SalI

CAATTAGTCGACATGAATTTCGCCGTTTTGCCG(SEQ ID NO：247)

3′：Rv2608-3ScaI-HindIII

CAATTAAAGCTTTTAAGTACTGAAAAGTCGGGGTAGCGCCGG(SEQ ID NO：248)

5′-Rv1886-2608-ScaI

CGGCGCTACCCCGACTTTTCAGTACTTTCTCCCGGCCGGGGCT GCCG(SEQ ID NO：249)

3′-Rv1886matR HindIII

GATATCAAGCTTTCAGCCGGCGCCTAACGAAC(SEQ ID NO：250)

从H37Rv基因组模板DNA中经PCR扩增Rv1813和Rv3620(94℃30秒；58℃30秒；58℃1.5分钟；35个循环)。融合构建体具有SEQ IDNO：246所示的多核苷酸序列，编码SEQ ID NO：251所示的融合蛋白。

实施例43

重组融合蛋白ID125的克隆和表达

以下引物用于克隆融合构建体ID125，其包含来源于Rv3619、Rv1813、Rv3620、Rv2608和Rv1886的融合伴侣：

5′：Rv2608-5SalI

CAATTAGTCGACATGAATTTCGCCGTTTTGCCG(SEQ ID NO：253)

3′：Rv2608-3ScaI-HindIII

CAATTAAAGCTTTTAAGTACTGAAAAGTCGGGGTAGCGCCGG(SEQ ID NO：254)

5′-Rv1886-2608-ScaI

CGGCGCTACCCCGACTTTTCAGTACTTTCTCCCGGCCGGGGCT GCCG(SEQ ID NO：255)

S′-Rv1886matR HindIII

GATATCAAGCTTTCAGCCGGCGCCTAACGAAC(SEQ ID NO：256)

融合构建体具有SEQ ID NO：252所示的多核苷酸序列，编码SEQID NO：257所示的融合蛋白。

实施例44

重组融合蛋白DID85的克隆和表达

以下引物用于克隆融合构建体DID85，其包含来源于Rv2032、Rv2875和Rv0831的融合伴侣：

5′-Rv2032-NdeI-6his

GATACACATATGCACCATCACCATCACCACATGCCGGACACC ATGGTGAC(SEQ ID NO：259)

3′-Rv2032-GGSGGS-BamHI

CATGGATCCGCTACCGCCAGAACCACCCCGGTGATCCTTAGC CCGAAC(SEQ ID NO：260)

5′-Rv2875-BamHI

GGTGGTTCTGGCGGTAGCGGATTCATGGGCGATCTGGTGAGC CCG(SEQ ID NO：261)

3′-Rv2875R-EcoRI

CATGAATTCAGAACCGCCGCTTCCGCCCGCCGGAGGCATTAG CACGC(SEQ ID NO：262)

5′-Rv0831F-EcoRI

GGCGGAAGCGGCGGTTCTGAATTCATGCTCCCCGAGACAAAT CAG(SEQ ID NO：263)

3′-Rv0831R-HindIII

TAGAATTCAAGCTTTTACTGGCGAAGCAGCTCATC(SEQ IDNO：264)

利用以上引物序列从已有质粒DNA经PCR扩增Rv2032、Rv2875和Rv0831的基因(94℃30秒；58℃30秒；58℃1.5分钟；30个循环)。扩增的三种PCR产物，用5′-Rv2032-NdeI-6his和3′-Rv0831R-HindIII引物进行第二轮PCR来扩增全长融合基因产物。得到的PCR产物用NdeI/HindIII消化并克隆到pET29a载体中。由宿主菌株BL-21 plysS表达DID85。融合构建体具有SEQ ID NO：258所示的多核苷酸序列，编码SEQ ID NO：265所示的融合蛋白。裂解1L诱导液后，蛋白进入内含体。变性条件下进行Ni-NTA，随后进行阴离子交换层析。纯化组分对10mM Tris pH 8.0透析。

实施例45

重组融合蛋白DID92的克隆和表达

以下引物用于克隆融合构建体DID92，其包含来源于Rv3044、Rv1009和Rv0614的融合伴侣：

5′-Rv3044-NdeI-6his

GATACACATATGCACCATCACCATCACCACATGGGCAGCAGC CATCATCATC(SEQ ID NO：267)

3′-Rv3044-NcoI

CATATCGAGCTCGTTGATCGGCGCGTCGACCC(SEQ ID NO：268)

5′-Rv1009-Ncol-GGSGGS连接子

ATCAACGAGCTCGGAGGTTCTGGTGGAAGCGCATGCAAAAC GGTGACGTTGAC(SEQ ID NO：269)

3′-Rv1009-EcoRI

CATATCGAATTCGCGCGCACCCGCTCGTGCAGC(SEQ ID NO：270)

5′-Rv0164-EcoRI-GGSGGS连接子

CATGTCGAATTCGGTGGAAGCGGAGGTTCTATGACGGCAATC TCGTGCTCAC(SEQ ID NO：271)

3′-Rv0164-HindIII

CATATCAAGCTTTTAGCTGGCCGCCAGCTGCTC(SEQ IDNO：272)

融合构建体具有SEQ ID NO：266所示的多核苷酸序列，编码SEQID NO：273所示的融合蛋白。

实施例46

重组融合蛋白DID108的克隆和表达

以下引物用于克隆融合构建体DID108，其包含来源于Rv3872、Rv3873、Rv3875和Rv3881的融合伴侣：

5′-Rv3872-NdeI-6his

GATACACATATGCACCATCACCATCACCACATGGAAAAAATG TCACATGATC(SEQ ID NO：275)

3′-Rv3872-SacI

GATACATGAGCTCTTCGGCGAAGACGCCGGCGGC(SEQ IDNO：276)

5′-Rv3873-SacI-GGSGGS连接子

GATACAGAGCTCGGAGGTTCCGGTGGAAGCATGCTGTGGCA CGCAATGCC(SEQ ID NO：277)

3′-Rv3873-EcoRI

GATACAGAATTCCCAGTCGTCCTCTTCGTCCCAG(SEQ ID NO：278)

5′-Rv3875-EcoRI-GGSGGS连接子

GACAGAATTCGGTGGCAGTGGAGGATCTATGACAGAGCAGC AGTGGAAT(SEQ ID NO：279)

3′-Rv3875-NheI

CATATCAGCTAGCTGCGAACATCCCAGTGACGTTG (SEQ IDNO：280)

5′-Rv3881-NheI-GGSGGS连接子

CATATCAGCTAGCGGAGGTTCCGGTGGAAGCATGACGCAGTCGCAGACCGTG(SEQ ID NO：281)

3′-Rv3881-HindIII

CATATCAAAGCTTTCACTTCGACTCCTTACTGTC(SEQ ID NO：282)

融合构建体具有SEQ ID NO：274所示的多核苷酸序列，编码SEQID NO：283所示的融合蛋白。

实施例47

重组融合蛋白DID93的克隆和表达

以下引物用于克隆融合构建体DID93，其包含来源于Rv1099、Rv0655和Rv0054的融合伴侣：

5′-Rv1099-NdeI

TAGGATCCCATATGGAGCTGGTCCGGGTGACC(SEQ ID NO：285)

3′-Rv1099-EcoRI-GGSGGS连接子

CACGAATTCGCTTCCACCAGAACCTCCGGGCAATGGGTACAC GGCGC(SEQ ID NO：286)

5′-Rv0655-EcoRI-GGSGGS连接子

GGAGGTTCTGGTGGAAGCGAATTCGTGCGATACAGTGACTCA TAC(SEQ ID NO：287)

3′-Rv0655-SacI

GCCACGAGCTCAGAACCGCCGCTTCCACCCTGGCCGATTTCG TGCACCGC(SEQ ID NO：288)

5′-Rv0054-SacI-GGSGGS连接子

GCCAGGGTGGAAGCGGCGGTTCTGAGCTCGTGGCTGGTGAC ACCACCATC(SEQ ID NO：289)

3′Rv0054-HindIII

CAATTAAAGCTTTCAGAATGGCGGTTCGTCATCGCC(SEQ IDNO：290)

融合构建体具有SEQ ID NO：284所示的多核苷酸序列，编码SEQID NO：291所示的融合蛋白。

实施例48

重组融合蛋白RV3875的克隆和表达

用H37Rv基因组DNA作为模板，利用以下引物PCR扩增Rv3875：

5′-Rv3875-6His-NdeI

CCATTACATATGCATCACCATCACCATCACATGACAGAGCAG CAGTGGAA(SEQ ID NO：317)

3′-Rv3875-EcoRI

CCATTAGAATTCCTATGCGAACATCCCAGTGAC(SEQ ID NO：318)

重组蛋白的氨基酸序列示于SEQ ID NO：294。

根据以上详细描述，可以对实施方案进行这些和其他改变。一般来说，在以下权利要求中，使用的术语不应理解为将权利要求限定到说明书和权利要求书中公开的具体实施方案，而应理解为包括所有可能的实施方案，以及这些权利要求对其享有权利的全部等同体。因此，权利要求不被公开内容所限制。

Claims

1.包含免疫刺激剂，以及结核分枝杆菌抗原的组合的组合物，其中所述抗原的组合为(1)由SEQ ID NO:26所示氨基酸序列组成的抗原、由SEQ ID NO:51所示氨基酸序列组成的抗原和由SEQ ID NO:16所示氨基酸序列组成的抗原；(2)由SEQ ID NO:26所示氨基酸序列组成的抗原、由SEQ ID NO:51所示氨基酸序列组成的抗原、由SEQ IDNO:16所示氨基酸序列组成的抗原以及由SEQ ID NO:21所示氨基酸序列组成的抗原；(3)由SEQ ID NO:26所示氨基酸序列组成的抗原、由SEQ ID NO:51所示氨基酸序列组成的抗原、由SEQ ID NO:16所示氨基酸序列组成的抗原以及SEQ ID NO:46所示氨基酸序列组成的抗原。

2.如权利要求1所述的组合物，其中所述抗原的组合以融合多肽的形式共价连接。

3.如权利要求1所述的组合物，其中所述免疫刺激剂选自GLA、单磷酰脂质A、3-脱O-酰化单磷酰脂质A、IFA、QS21、CWS、AGPs、含有CpG的寡核苷酸、Toll样受体激动剂、皂甙、皂甙模拟物以及生物的和合成的脂质A、咪喹莫特、gardiquimod、雷西莫特、聚I:C、鞭毛蛋白或其组合。

4.分离的融合多肽，其中所述融合多肽由选自SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:95、SEQ ID NO:226的氨基酸序列组成；或者所述融合多肽选自SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:95、SEQ ID NO:226的氨基酸序列，其中在每一序列中载体pET28a的His标签被去除。

5.组合物，其包含如权利要求4所述的融合多肽和免疫刺激剂。

6.如权利要求5所述的组合物，其中所述免疫刺激剂选自GLA、单磷酰脂质A、3-脱-O-酰化单磷酰脂质A、IFA、QS21、CWS、AGPs、含有CpG的寡核苷酸、Toll样受体激动剂、皂甙、皂甙模拟物以及生物的和合成的脂质A、咪喹莫特、gardiquimod、雷西莫特、聚I:C、鞭毛蛋白或其组合。

7.分离的多核苷酸，其编码权利要求4所述的融合多肽。

8.权利要求1-3和5-6中任一项所述的组合物在制备刺激个体针对结核分枝杆菌的保护性免疫反应的药物中的用途。

9.检测生物样品中结核分枝杆菌感染的诊断试剂盒，所述试剂盒包含:

(a)抗原的组合或其融合多肽，所述抗原为由SEQ ID NO:26所示氨基酸序列组成的抗原、由SEQ ID NO:51所示氨基酸序列组成的抗原和由SEQ ID NO:16所示氨基酸序列组成的抗原，以及任选地选自以下的其它抗原：由SEQ ID NO:1所示氨基酸序列组成的抗原、由SEQ ID NO:6所示氨基酸序列组成的抗原、由SEQ ID NO:36所示氨基酸序列组成的抗原、由SEQ ID NO:41所示氨基酸序列组成的抗原、由SEQ ID NO:46所示氨基酸序列组成的抗原、由SEQ ID NO:11所示氨基酸序列组成的抗原、由SEQ ID NO:56所示氨基酸序列组成的抗原、由SEQ ID NO:21所示氨基酸序列组成的抗原、由SEQ ID NO:31所示氨基酸序列组成的抗原、由SEQ ID NO:61所示氨基酸序列组成的抗原、由SEQ ID NO:100所示氨基酸序列组成的抗原、由SEQ IDNO:106所示氨基酸序列组成的抗原、由SEQ ID NO:112所示氨基酸序列组成的抗原、由SEQ ID NO:115所示氨基酸序列组成的抗原、由SEQ ID NO:118所示氨基酸序列组成的抗原、由SEQ ID NO:121所示氨基酸序列组成的抗原、由SEQ ID NO:124所示氨基酸序列组成的抗原、由SEQ ID NO:127所示氨基酸序列组成的抗原、由SEQ ID NO:130所示氨基酸序列组成的抗原、由SEQ ID NO:133所示氨基酸序列组成的抗原、由SEQ ID NO:136所示氨基酸序列组成的抗原、由SEQID NO:139所示氨基酸序列组成的抗原、由SEQ ID NO:142所示氨基酸序列组成的抗原、由SEQ ID NO:145所示氨基酸序列组成的抗原、由SEQ ID NO:148所示氨基酸序列组成的抗原、由SEQ ID NO:154所示氨基酸序列组成的抗原、由SEQ ID NO:151所示氨基酸序列组成的抗原、由SEQ ID NO:160所示氨基酸序列组成的抗原、由SEQ IDNO:163所示氨基酸序列组成的抗原、由SEQ ID NO:166所示氨基酸序列组成的抗原、由SEQ ID NO:169所示氨基酸序列组成的抗原、由SEQ ID NO:178所示氨基酸序列组成的抗原、由SEQ ID NO:184所示氨基酸序列组成的抗原、由SEQ ID NO:187所示氨基酸序列组成的抗原、由SEQ ID NO:190所示氨基酸序列组成的抗原、由SEQ ID NO:193所示氨基酸序列组成的抗原、由SEQ ID NO:196所示氨基酸序列组成的抗原、由SEQ ID NO:199所示氨基酸序列组成的抗原、由SEQID NO:202所示氨基酸序列组成的抗原、由SEQ ID NO:205所示氨基酸序列组成的抗原、由SEQ ID NO:214所示氨基酸序列组成的抗原和由SEQ ID NO:292所示氨基酸序列组成的抗原；以及

(b)检测试剂。

10.如权利要求9所述的诊断试剂盒，还包含SEQ ID NO:46所示氨基酸序列的结核分枝杆菌抗原。

11.如权利要求9所述的诊断试剂盒，还包含SEQ ID NO:21所示氨基酸序列的结核分枝杆菌抗原。