CN113121703B - 一种具有结核杆菌免疫原性的融合蛋白及其应用 - Google Patents

一种具有结核杆菌免疫原性的融合蛋白及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种具有结核杆菌免疫原性的融合蛋白及其应用，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，其编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。其具有结核杆菌的免疫原性，相较于常用结核免疫原ESAT6该融合蛋白具有更明显的免疫原性，可作为结核免疫原蛋白初步筛选中的阳性标志物。从而为进一步结核病的早期诊断和新型疫苗的研制奠定了基础，具有广泛的应用前景。

Description

一种具有结核杆菌免疫原性的融合蛋白及其应用
技术领域
本发明涉及结核病技术领域，具体地，涉及一种具有结核杆菌免疫原性的融合蛋白及其应用。
背景技术
结核病是由结核分枝杆菌(MTB)感染引起的传染病，据WHO发布的2019年全球结核病报告数据显示，目前全世界1/4的人口感染了结核分枝杆菌，每年约有1000万新病例发生，HIV阴性人群中，结核病导致约120万人死亡。我国是世界上22个结核病高负担国家之一，因此，如何早期发现及预防结核病日益引起了世界范围的重视。
结核特异性免疫原蛋白应用于结核免疫学诊断、疫苗等方面。对于结核潜伏性感染患者，常用方法PPD皮试方法，但筛选特异性差、准确率较低。而抗原的外周血单核细胞刺激实验或γ干扰素释放实验明显提高了诊断的灵敏性。ESAT6和CFP10蛋白是结核早期分泌蛋白，作为抗原检测结核分枝杆菌潜伏感染优于TST；并且，ESAT6和CFP10的样品血液检测方法的敏感性和特异性优于PPD皮试；但是，ESAT6及CFP10这些常用免疫原的敏感性仍不是很高。因此，目前结核诊断检测方法有待进一步完善，急需特异性、敏感性更好的结核免疫原，结核免疫原筛选及阳性标志物的选择至关重要。
RD1区域基因编码的蛋白质是结核分枝杆菌主要的毒力因子，在结核疫苗研制开发和检测诊断方面都受到了广泛重视。Rv3872(PE35)、Rv3873(PPE68)是结核分枝杆菌RD1区域基因所编码的，是RD1区域免疫性重要的组成部分，是研究较多的结核免疫原，在血清诊断和细胞免疫学诊断方面展现出较好的前景。有研究证明Rv3872、Rv3873参与病原-宿主相互作用，与细胞免疫应答相关，依赖TLR2受体诱导THP-1巨噬细胞分泌IL-10和MCP-1并降低IL-12p70的分泌，抵御宿主清除。ELISA检测结核患者或BCG接种健康者血清中Rv3872抗体水平，结果表明，肺结核和肺外结核的敏感性分别为92％和89％，特异性分别为95％和91％。Rv3873可诱发T淋巴细胞免疫应答并产生高水平IFN-γ，可应用于结核诊断候选抗原，特异性为92.1％，敏感性为53％(杜凤娇,陈曦,刘菲,等.结核分枝杆菌RD1区编码蛋白在结核病诊断中的潜在价值[J].中国医学科学院学报,2009.)，。Rv3872、Rv3873可激发细胞免疫应答，已用于DNA菌苗的研制，可作为预防和治疗结核病的候选菌苗。
发明内容
本发明的目的是为了克服现有技术的上述不足，提供一种具有结核杆菌免疫原性的融合蛋白及其应用。该融合蛋白表达量高、上清表达、活性高；可作为在巨噬细胞结核免疫原蛋白筛选时阳性标志物应用，该融合蛋白具有较好的免疫原性，通过免疫原蛋白ESAT6与Rv3872-3873重组融合蛋白分别刺激巨噬细胞，其中ESAT6蛋白作为参考免疫原，检测细胞因子分泌情况，Rv3872-3873刺激巨噬细胞IFN-γ、IL-6、IL-8细胞因子含量有着明显变化，
为了实现上述目的，本发明是通过以下方案予以实现的：
本发明要求保护以下内容：
一种融合蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
一种融合蛋白的编码基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
一种重组载体，携带有所述的编码基因。
一种工程菌，携带有所述的重组载体。
本发明还要求保护所述的融合蛋白的制备方法，诱导培养所述的工程菌、收集菌体、破碎菌体、收集上清、经过镍柱亲和层析、G25层析柱除盐和DEAE阴离子交换层析，即得。
优选地，IPTG诱导培养权利要求4所述的工程菌，诱导条件为IPTG终浓度0.1～0.3mM，15～16℃，200～250rpm。
更优选地，诱导条件为IPTG终浓度0.1mM，16℃，220rpm。
优选地，6000～8000rpm离心10～20min收集菌体。
更优选地，8000rpm离心10min收集菌体。
优选地，800～1200bar进行高压匀质机破碎1～3次，破碎菌体。
更优选地，1000bar进行高压匀质机破碎2次，破碎菌体。
优选地，4～10℃6000～8000rmp离心30～60min,收集上清。
更优选地，4℃8000rmp离心45min,收集上清。
优选地，镍柱亲和层析的方法为：层析柱挂Ni之后，用3～6mL/min流速的平衡缓冲液A处理，平衡至流出液pH值与平衡液相同，将破碎后的菌体上样，用4～8mL/min流速的洗涤缓冲液B洗涤样品，然后用4～8mL/min流速的洗脱缓冲液C洗脱，即得；
其中，平衡缓冲液A为10～30mM pH 7～8Tris-HCl+200～600mM NaCl+20～40mM咪唑，
洗涤缓冲液B：10～30mM pH 7～8Tris-HCl+200～600mM NaCl+60～80mM咪唑，
洗脱缓冲液C：10～30mM pH 7～8Tris-HCl+200～400mM咪唑。
更优选地，镍柱亲和层析的方法为：层析柱挂Ni之后，以5mL/min流速用平衡缓冲液A处理10倍柱体积，平衡至流出液pH值与平衡液相同，将破碎后的菌体以流速5mL/min上样，以流速5mL/min用洗涤缓冲液B洗涤样品，然后以流速5mL/min用洗脱缓冲液C洗脱，即得；
其中，平衡缓冲液A为20mM pH 8.0 Tris-HCl+500mM NaCl+30mM咪唑，
洗涤缓冲液B：20mM pH 8.0 Tris-HCl+500mM NaCl+60mM咪唑，
洗脱缓冲液C：20mM pH 8.0 Tris-HCl+300mM咪唑，
优选地，G25层析柱除盐的方法为：层析柱依次用3～8倍柱体积的10～30mM pH 7～8Tris-HCl处理，用0.5～1倍柱体积的0.1～0.5M NaOH处理，用10～30mM pH 7～8Tris-HCl平衡至流出液pH值与平衡液相同；经过镍柱亲和层析的产物上样，收集全峰。
更优选地，G25层析柱除盐的方法为：层析柱依次用10mM pH 8.0 Tris-HCl(5倍柱体积)处理，用0.5M NaOH(0.5倍柱体积)处理，用10mM pH 8.0 Tris-HCl平衡至流出液pH值与平衡液相同，流速为10mL/min，经过镍柱亲和层析的产物以流速为10mL/min上样，收集全峰。
优选地，DEAE阴离子交换层析的方法为：DEAE阴离子交换层析的方法为：层析柱依次用5～10倍柱体积平衡缓冲液D处理和3～5倍柱体积0.1～0.5M NaOH处理，用平衡缓冲液D平衡至流出液pH值与平衡液相同；之后，样品以流速3～5mL/min上样，3～10倍柱体积平衡缓冲液D以流速3～5mL/min进行平衡处理；用洗脱缓冲液E洗掉杂蛋白，目的蛋白在洗脱缓冲液F洗脱中；
其中，平衡缓冲液D为：pH 9～10 10～30mM Tris-HCl，
洗脱缓冲液E为：pH 9～10 10～30mM Tris-HCl+0.3～0.5M NaCl，
洗脱缓冲液F为：pH 9～10 10～30mM Tris-HCl+2～3M NaCl。
更优选地，DEAE阴离子交换层析的方法为：层析柱依次用10倍柱体积平衡缓冲液D处理和5倍柱体积0.5M NaOH处理，用平衡缓冲液D平衡至流出液pH值与平衡液相同；之后，样品以流速2.5mL/min上样，2倍柱体积平衡缓冲液D以流速2mL/min进行平衡处理；用洗脱缓冲液E洗掉杂蛋白，目的蛋白在洗脱缓冲液F洗脱中；
其中，平衡缓冲液D为：pH 9.5 10mM Tris-HCl，
洗脱缓冲液E为：pH 9.5 10mM Tris-HCl+0.5M NaCl，
洗脱缓冲液F为：pH 9.5 10mM Tris-HCl+2M NaCl。
本法发明还要求保护所述蛋白作为阳性标志物在制备结核免疫原蛋白筛选试剂盒中的应用。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明提供了一种Rv3872-3873重组融合蛋白，其具有结核杆菌的免疫原性，相较于常用结核免疫原ESAT6该融合蛋白具有更明显的免疫原性，可作为结核免疫原蛋白初步筛选中的阳性标志物。从而为进一步结核病的早期诊断和新型疫苗的研制奠定了基础，具有广泛的应用前景。
附图说明
图1为Rv3872-3873重组融合蛋白镍柱亲和层析电泳图；其中，1为上Ni柱前，2为Ni柱流穿，3为60mM咪唑洗涤，4为300mM咪唑洗脱。
图2为Rv3872-3873重组融合蛋白DEAE阴离子交换层析电泳图；其中，1为上样前，2为DEAE流穿，3-7为0.5M NaCl等度洗脱，8为2M NaCl洗脱，9为NaOH洗脱。
图3为Rv3872-3873重组融合蛋白的质量图。
具体实施方式
下面结合说明书附图及具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
实施例1 pET-28a-Rv3872-3873重组质粒的构建
一、实验方法
1、目的基因Rv3872和Rv3873的引物设计、合成及扩增
以结核分枝杆菌H37Rv基因组为模板，利用引物Rv3872-F/R扩增Rv3872基因(引物Rv3872-F/R的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示，)，利用引物Rv3873-F/R扩增Rv3873基因(引物Rv3873-F/R的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示)，扩增产物经核酸凝胶电泳分离目的DNA片段，使用Omega公司胶回试剂盒回收目的DNA片段，回收后的DNA分别使用NcoI/BamHI、BamHI/EcoRI限制性内切酶酶切，并通过Omega公司Cycle-pure回收试剂盒回收酶切后的DNA，备用。
引物Rv3872-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示：
CATGCCATGGCAATGGAAAAAATGTCACATGATCCGATCGCTGCCGAC
引物Rv3872-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示：
CGCGGATCCAGATCCGCCACCTTCGGCGAAGACGCCGGCGGCGCCGT
引物Rv3873-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示：
CGCGGATCCGGTTCTGGTGGCGGAGTCGAGTTGACCGCGCGCCTGAA
引物Rv3873-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示：
CCGGAATTCTTAGTGGTGGTGGTGGTGGTGCCAGTCGTCCTCTTCGTC
2、pET-28a-Rv3872-3873重组质粒的构建
使用LB固体平板培养含pET-28a质粒的大肠杆菌DH5α菌株，Omega公司质粒抽提试剂盒抽提质粒，获得的pET-28a质粒，使用NcoI/EcoRI限制性内切酶酶切后进行核酸凝胶电泳，并使用Omega公司胶回收试剂盒回收线性化的质粒pET-28a。酶切回收的DNA片段和线性化质粒pET-28a，经T4 DNA连接酶16℃反应过夜，连接产物转化大肠杆菌BL21(DE3)(DE3)感受态细胞，并涂布LB固体平板(含100μg/mL硫酸卡那霉素)，平板放置37℃恒温培养箱培养过夜。挑取平板上长出的单克隆菌落接种LB液体培养基，37℃摇床200rpm震荡过夜培养，送菌液进行测序
二、实验结果
菌液测序验证序列无突变，重组融合蛋白Rv3872-3873的编码基的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，其编码的融合蛋白Rv3872-3873的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。然后使用Omega公司质粒抽提试剂盒抽提质粒，获得pET-28a-Rv3872-3873重组质粒。
实施例2 Rv3872-3873重组融合蛋白的表达与纯化
一、实验方法
1、Rv3872-3873重组融合蛋白的诱导表达
挑取单菌落，接种于5ml液体LB培养基(抗生素浓度为:100ug/ml卡那霉素)，37℃220rpm，培养(大约8h)。以1％比例接种到100ml液体LB培养基(抗生素浓度为100ug/ml卡那霉素)，37℃，100rpm过夜培养。将2代菌种以1％比例接种到1L液体LB培养基(抗生素浓度为15ug/m卡那霉素)，37℃220rpm培养至菌液OD值为0.6～0.8(约4～5h)，将摇床温度调节并降至16℃后，每瓶培养基加入终浓度为0.1mM的IPTG，16℃，220rpm，过夜诱导。
2、菌体的破碎
8000rpm离心10min收集菌体，于1000bar进行高压匀质机破碎2次。经破碎后菌体，4℃8000rmp离心45min,收集上清。
3、Rv3872-3873重组融合蛋白的纯化
重组融合蛋白的纯化依次经过镍柱亲和层析、层析除盐和阴离子交换层析3个步骤，具体如下：
(1)镍柱亲和层析：层析柱挂Ni之后，以5mL/min流速用平衡缓冲液A处理10CV，平衡至流出液pH值与平衡液相同。将破碎后的菌体以流速5mL/min上样，以流速5mL/min用洗涤缓冲液B洗涤样品，然后以流速5mL/min用洗脱缓冲液C洗脱，得到Rv3872-3873重组融合蛋白；
平衡缓冲液A：20mM PH 8.0 Tris-HCl+500mM NaCl+30mM咪唑
洗涤缓冲液B：20mM PH 8.0 Tris-HCl+500mM NaCl+60mM咪唑
洗脱缓冲液C：20mM PH 8.0 Tris-HCl+300mM咪唑
(2)G25层析除盐：层析柱用10mM pH 8.0 Tris-HCl(5CV)处理，用0.5M NaOH(0.5CV)处理，用10mM pH 8.0 Tris-HCl平衡至流出液pH值与平衡液相同，流速为10mL/min。将Ni柱洗脱缓冲液C洗脱下来的Rv3872-3873重组融合蛋白以流速为10mL/min上样，收集全峰。
(3)DEAE阴离子交换层析：层析柱用平衡缓冲液D处理10CV，用0.5M NaOH处理5CV，用平衡缓冲液D平衡至流出液pH值与平衡液相同。将G25除盐后，样品以流速2.5mL/min上样，用平衡缓冲液D以流速2mL/min进行平衡处理2CV；洗脱方式：等度洗脱模式，以洗脱缓冲液E洗掉杂蛋白，洗脱缓冲液F洗脱目的蛋白。
平衡缓冲液D的配方为：pH 9.5、10mM Tris-HCl；
洗脱缓冲液E的配方为：pH 9.5、10mM Tris-HCl+0.5M NaCl；
洗脱缓冲液F的配方为：pH 9.5、10mM Tris-HCl+2M NaCl。
二、实验结果
重组融合蛋白Ni柱电泳图如图1所示，可以看出，样品过Ni柱后，用300mM咪唑洗涤、洗脱可获得较纯的Rv3872-3873重组融合蛋白(泳道4)；然后，收集样品4进行下一步的纯化。
Rv3872-3873重组融合蛋白DEAE阴离子交换层析电泳图如图2所示，可以看出，DEAE流穿、洗脱缓冲液E(泳道7)、洗脱缓冲液F(泳道8)都能够较好的纯化Rv3872-3873重组融合蛋白；然后，收集样品进行下一步实验，获得Rv3872-3873重组融合蛋白如图3所示。
实施例3 Rv3872-3873蛋白刺激巨噬细胞对细胞因子的影响
一、实验方法
1、THP-1细胞培养
THP-1细胞培养于含有10％FBS+1％P/S的RPMI-1640培养基中，培养环境为37℃，5％CO2。可以每隔3～4天加一些新鲜的培养基，或直接传代。
2、巨噬细胞的诱导和刺激
THP-1细胞(1640+10％FBS)完全培养基培养至细胞活力＞90％后，将细胞密度调节为2.5×105个/mL，铺12孔板中，每孔1mL，添加终浓度为5ng/mLPMA刺激培养至95％以上完全呈巨噬细胞形态，换完全培养基培养72h后，进行换液加样(100+900μl完全培养基)刺激，分别使用实施例2制备得到的Rv3872-3873重组融合蛋白和ESAT-6重组蛋白刺激细胞，24h后取样检测。
空白对照为：100μl PBS+900μl完全培养基；
实验样品为：100μl免疫原蛋白(含量500ng的实施例2制备得到的Rv3872-3873重组融合蛋白或ESAT-6重组蛋白)+900μl完全培养基。
3、细胞因子检测
在刺激24后，收集上清，分别检测IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10、TNF-α和IFN-γ6种细胞因子的分泌情况。
二、实验结果
细胞因子检测结果如表1所示。
表1细胞因子分泌检测：
Figure BDA0002960692070000071
结果显示：Rv3872-3873融合蛋白刺激巨噬细胞后，IFN-γ、IL-6、IL-8细胞因子的分泌量的明显升高，其它细胞因子无明显变化；与ESAT6免疫原蛋白刺激细胞相比，两种蛋白刺激细胞后IL-8含量升高一致，IFN-γ、IL-6的含量明显高于ESAT6刺激后含量。
其中IL-6是活化单核细胞产生的重要介质，诱导多种免疫细胞的活化和合成；IFN-γ增强细胞免疫应答，促进B细胞分化增殖，活化巨噬细胞，提高抗原提呈能力；IL-8趋化作用，吸引中性粒细胞，并使其活化从而吞噬消灭病原异物。
结果表明，Rv3872-3873融合蛋白作为结核免疫原蛋白初步筛选的阳性标志物相较于ESAT6具有更明显的效果，相较于ESAT6刺激巨噬细胞，IFN-γ、IL-6分泌量更高，具有更明显的免疫原性。Rv3872-3873融合蛋白刺激巨噬细胞，对细胞因子的分泌有明显变化，可刺激巨噬细胞发生免疫反应，作为巨噬细胞初步筛选免疫原方法的阳性标志物，具有明显的免疫性。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，对于本领域的普通技术人员来说，在上述说明及思路的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。
序列表
<110> 上海晶诺生物科技有限公司
<120> 一种具有结核杆菌免疫原性的融合蛋白及其应用
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 442
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Met Glu Lys Met Ser His Asp Pro Ile Ala Ala Asp Ile Gly Thr Gln
1               5                   10                  15
Val Ser Asp Asn Ala Leu His Gly Val Thr Ala Gly Ser Thr Ala Leu
            20                  25                  30
Thr Ser Val Thr Gly Leu Val Pro Ala Gly Ala Asp Glu Val Ser Ala
        35                  40                  45
Gln Ala Ala Thr Ala Phe Thr Ser Glu Gly Ile Gln Leu Leu Ala Ser
    50                  55                  60
Asn Ala Ser Ala Gln Asp Gln Leu His Arg Ala Gly Glu Ala Val Gln
65                  70                  75                  80
Asp Val Ala Arg Thr Tyr Ser Gln Ile Asp Asp Gly Ala Ala Gly Val
                85                  90                  95
Phe Ala Glu Gly Gly Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Gly Gly Val Glu
            100                 105                 110
Leu Thr Ala Arg Leu Asn Ser Leu Gly Glu Ala Trp Thr Gly Gly Gly
        115                 120                 125
Ser Asp Lys Ala Leu Ala Ala Ala Thr Pro Met Val Val Trp Leu Gln
    130                 135                 140
Thr Ala Ser Thr Gln Ala Lys Thr Arg Ala Met Gln Ala Thr Ala Gln
145                 150                 155                 160
Ala Ala Ala Tyr Thr Gln Ala Met Ala Thr Thr Pro Ser Leu Pro Glu
                165                 170                 175
Ile Ala Ala Asn His Ile Thr Gln Ala Val Leu Thr Ala Thr Asn Phe
            180                 185                 190
Phe Gly Ile Asn Thr Ile Pro Ile Ala Leu Thr Glu Met Asp Tyr Phe
        195                 200                 205
Ile Arg Met Trp Asn Gln Ala Ala Leu Ala Met Glu Val Tyr Gln Ala
    210                 215                 220
Glu Thr Ala Val Asn Thr Leu Phe Glu Lys Leu Glu Pro Met Ala Ser
225                 230                 235                 240
Ile Leu Asp Pro Gly Ala Ser Gln Ser Thr Thr Asn Pro Ile Phe Gly
                245                 250                 255
Met Pro Ser Pro Gly Ser Ser Thr Pro Val Gly Gln Leu Pro Pro Ala
            260                 265                 270
Ala Thr Gln Thr Leu Gly Gln Leu Gly Glu Met Ser Gly Pro Met Gln
        275                 280                 285
Gln Leu Thr Gln Pro Leu Gln Gln Val Thr Ser Leu Phe Ser Gln Val
    290                 295                 300
Gly Gly Thr Gly Gly Gly Asn Pro Ala Asp Glu Glu Ala Ala Gln Met
305                 310                 315                 320
Gly Leu Leu Gly Thr Ser Pro Leu Ser Asn His Pro Leu Ala Gly Gly
                325                 330                 335
Ser Gly Pro Ser Ala Gly Ala Gly Leu Leu Arg Ala Glu Ser Leu Pro
            340                 345                 350
Gly Ala Gly Gly Ser Leu Thr Arg Thr Pro Leu Met Ser Gln Leu Ile
        355                 360                 365
Glu Lys Pro Val Ala Pro Ser Val Met Pro Ala Ala Ala Ala Gly Ser
    370                 375                 380
Ser Ala Thr Gly Gly Ala Ala Pro Val Gly Ala Gly Ala Met Gly Gln
385                 390                 395                 400
Gly Ala Gln Ser Gly Gly Ser Thr Arg Pro Gly Leu Val Ala Pro Ala
                405                 410                 415
Pro Leu Ala Gln Glu Arg Glu Glu Asp Asp Glu Asp Asp Trp Asp Glu
            420                 425                 430
Glu Asp Asp Trp His His His His His His
        435                 440
<210> 2
<211> 1329
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
atggaaaaaa tgtcacatga tccgatcgct gccgacattg gcacgcaagt gagcgacaac 60
gctctgcacg gcgtgacggc cggctcgacg gcgctgacgt cggtgaccgg gctggttccc 120
gcgggggccg atgaggtctc cgcccaagcg gcgacggcgt tcacatcgga gggcatccaa 180
ttgctggctt ccaatgcatc ggcccaagac cagctccacc gtgcgggcga agcggtccag 240
gacgtcgccc gcacctattc gcaaatcgac gacggcgccg ccggcgtctt cgccgaaggt 300
ggcggatctg gatccggttc tggtggcgga gtcgagttga ccgcgcgcct gaactctctg 360
ggagaagcct ggactggagg tggcagcgac aaggcgcttg cggctgcaac gccgatggtg 420
gtctggctac aaaccgcgtc aacacaggcc aagacccgtg cgatgcaggc gacggcgcaa 480
gccgcggcat acacccaggc catggccacg acgccgtcgc tgccggagat cgccgccaac 540
cacatcaccc aggccgtcct tacggccacc aacttcttcg gtatcaacac gatcccgatc 600
gcgttgaccg agatggatta tttcatccgt atgtggaacc aggcagccct ggcaatggag 660
gtctaccagg ccgagaccgc ggttaacacg cttttcgaga agctcgagcc gatggcgtcg 720
atccttgatc ccggcgcgag ccagagcacg acgaacccga tcttcggaat gccctcccct 780
ggcagctcaa caccggttgg ccagttgccg ccggcggcta cccagaccct cggccaactg 840
ggtgagatga gcggcccgat gcagcagctg acccagccgc tgcagcaggt gacgtcgttg 900
ttcagccagg tgggcggcac cggcggcggc aacccagccg acgaggaagc cgcgcagatg 960
ggcctgctcg gcaccagtcc gctgtcgaac catccgctgg ctggtggatc aggccccagc 1020
gcgggcgcgg gcctgctgcg cgcggagtcg ctacctggcg caggtgggtc gttgacccgc 1080
acgccgctga tgtctcagct gatcgaaaag ccggttgccc cctcggtgat gccggcggct 1140
gctgccggat cgtcggcgac gggtggcgcc gctccggtgg gtgcgggagc gatgggccag 1200
ggtgcgcaat ccggcggctc caccaggccg ggtctggtcg cgccggcacc gctcgcgcag 1260
gagcgtgaag aagacgacga ggacgactgg gacgaagagg acgactggca ccaccaccac 1320
caccactaa 1329
<210> 3
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
catgccatgg caatggaaaa aatgtcacat gatccgatcg ctgccgac 48
<210> 4
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
cgcggatcca gatccgccac cttcggcgaa gacgccggcg gcgccgt 47
<210> 5
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
cgcggatccg gttctggtgg cggagtcgag ttgaccgcgc gcctgaa 47
<210> 6
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
ccggaattct tagtggtggt ggtggtggtg ccagtcgtcc tcttcgtc 48

Claims (9)

1.一种融合蛋白，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO .1所示。
2.一种融合蛋白的编码基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO .2所示。
3.一种重组载体，其特征在于，携带有权利要求2所述的编码基因。
4.一种工程菌，其特征在于，携带有权利要求3所述的重组载体。
5.权利要求1所述的融合蛋白的制备方法，其特征在于，诱导培养权利要求4所述的工程菌、收集菌体、破碎菌体、收集上清、经过镍柱亲和层析、G25层析柱除盐和DEAE阴离子交换层析，即得。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，IPTG诱导培养权利要求4所述的工程菌，诱导条件为IPTG终浓度0.1～0.3mM，15～16℃，200～250rpm。
7.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，镍柱亲和层析的方法为：层析柱挂Ni之后，用3～6mL/min流速的平衡缓冲液A处理，平衡至流出液pH值与平衡液相同，将破碎后的菌体上样，用4～8mL/min流速的洗涤缓冲液B洗涤样品，然后用4～8mL/min流速的洗脱缓冲液C洗脱，即得；
其中，平衡缓冲液A为10～30mM pH 7～8Tris-HCl+200～600mM NaCl+20～40mM咪唑，洗涤缓冲液B：10～30mM pH 7～8Tris-HCl+200～600mM NaCl+60～80mM咪唑，洗脱缓冲液C：10～30mM pH 7～8Tris-HCl+200～400mM咪唑。
8.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，G25层析柱除盐的方法为：层析柱依次用3～8倍柱体积的10～30mM pH 7～8Tris-HCl处理，用0 .5～1倍柱体积的0.1～0.5MNaOH处理，用10～30mM pH 7～8Tris-HCl平衡至流出液pH值与平衡液相同；经过镍柱亲和层析的产物上样，收集全峰。
9.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，DEAE阴离子交换层析的方法为：层析柱依次用5～10倍柱体积平衡缓冲液D处理和3～5倍柱体积0.1～0.5M NaOH处理，用平衡缓冲液D平衡至流出液pH值与平衡液相同；之后，样品以流速3～5mL/min上样，3～10倍柱体积平衡缓冲液D以流速3～5mL/min进行平衡处理；等度洗脱模式，以洗脱缓冲液E洗掉杂蛋白，洗脱缓冲液F洗脱目的蛋白；
其中，平衡缓冲液D为：pH 9～10 10～30mM Tris-HCl，
洗脱缓冲液E为：pH 9～10 10～30mM Tris-HCl+0 .3～0 .5M NaCl，
洗脱缓冲液F为：pH9～10 10～30mM Tris-HCl+2～3M NaCl。
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