CN116410274A - 融合蛋白hp16118p及其在结核分枝杆菌潜伏感染鉴别诊断中的应用 - Google Patents

融合蛋白hp16118p及其在结核分枝杆菌潜伏感染鉴别诊断中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了融合蛋白HP16118P及其在结核分枝杆菌潜伏感染鉴别诊断中的应用。具体地公开了包括串联的HTL、CTL和B细胞表位、HBD‑3、PADRE和PSMα4的融合蛋白。本发明筛选出针对结核分枝杆菌的35个表位，其具有很好的免疫原性和抗原性且无毒性无致敏性等特点。进一步加入辅助肽HBD‑3和PADRE来提高融合蛋白的免疫原性，加入PSMα4赋予融合蛋白靶向递送功能。体外实验证明HP16118P能刺激人外周血单个核细胞产生免疫应答，是一种优势保护性抗原。HP16118P作为诊断分子具有制备方法简单、特异性好、灵敏度高、成本低等优点。本发明对于活动性结核和结核潜伏感染的鉴别诊断具有重大价值。

Description

融合蛋白HP16118P及其在结核分枝杆菌潜伏感染鉴别诊断中 的应用
技术领域
本发明属于免疫学领域，涉及融合蛋白HP16118P及其在结核分枝杆菌潜伏感染鉴别诊断中的应用，具体涉及源自于结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis，MTB)蛋白抗原的HP16118P重组多表位抗原及其在活动性结核和潜伏性结核感染的鉴别诊断中的应用。
背景技术
结核病(Tuberculosis，TB)是一种由结核分枝杆菌(Mycobacteriatuberculosis，MTB)感染引起的以呼吸道传播为主的慢性传染病。结核分枝杆菌感染分为潜伏性结核病感染(Latent tuberculosis infection，LTBI)和活动性结核病(Activetuberculosis，ATB)两种状态。MTB是一种细胞内寄生虫，属于放线菌目分枝杆菌科分枝杆菌属，主要通过攻击巨噬细胞并抑制其凋亡来引起长期感染。自20世纪90年代以来，世界卫生组织制定了一系列计划来阻止结核病、实现终结结核病的伟大目标。然而，自新冠疫情以来，2021年新诊断结核病患者的病例统计数量有所回升，达到640万。这些数据提示，结核病是继新型冠状病毒感染之后单一病原体导致死亡的第二大原因。
目前，LTBI的检测方法包括TST和IFN-γ释放试验(Interferon-γreleaseassays，IGRAs)，但这两类方法均无法鉴别诊断LTBI和ATB。因此，研究高效的LTBI诊断分子并将其应用于LTBI的鉴别诊断，提高LTBI诊断的灵敏度和特异度，减少结核分枝杆菌感染者发病概率，对TB的预防和控制具有十分重要的意义。在结核分支杆菌的杀菌机制中，表位在触发免疫反应中发挥着重要作用。同时，生物信息学和免疫信息学的发展为表位分子的研究提供了便利条件。因此，候选抗原和免疫优势表位的预测及筛选成为了诊断和预防LTBI的关键因素。拥有多个优势表位的多表位分子不仅能够被体内更多的MHC分子识别并高效提呈给T细胞，而且能更有效的弥补因某个优势表位变异引起的病原体的免疫逃逸等问题。
随着生物信息学和免疫信息学的快速发展，多肽分子已成为最具吸引力的诊断分子开发策略之一。通过低成本生产技术，从MTB抗原中鉴定出的肽可以准确地表征为化学实体(类似于经典药物)。此外，多肽是化学定义的化合物，具有良好的稳定性。肽的优良性质奠定了融合蛋白易于运输和保存的优势。
发明内容
本发明的目的是提供一种多肽融合蛋白及其在结核潜伏感染鉴别诊断中的应用。所要解决的技术问题不限于所描述的技术主题，本领域技术人员通过以下描述可以清楚地理解本文未提及的其它技术主题。
为了实现上述目的，本发明首先提供了融合蛋白，命名可为HP16118P，所述融合蛋白可包括串联多肽1、串联多肽2和串联多肽3，所述串联多肽1可包括氨基酸序列是SEQ IDNo.1的第75-89位、第95-111位、第117-133位、第139-151位、第157-170位、第176-193位、第199-213位、第219-233位、第239-256位、第262-276位、第282-299位、第305-320位、第326-339位、第345-360位、第366-381位和第387-401位所示的多肽；
所述串联多肽2可包括氨基酸序列是SEQ ID No.1的第405-413位、第417-425位、第429-438位、第442-451位、第455-464位、第468-476位、第480-488位、第492-500位、第504-512位、第516-524位和第528-536位所示的多肽；
所述串联多肽3可包括氨基酸序列是SEQ ID No.1的第539-591位、第594-618位、第621-658位、第661-690位、第693-714位、第717-749位、第752-779位和第782-844位所示的多肽。
进一步地，所述多肽之间可由氨基酸连接子连接。
所述串联多肽1可为串联的HTL表位，由16个HTL表位(氨基酸序列分别为SEQ IDNo.1的第75-89位、第95-111位、第117-133位、第139-151位、第157-170位、第176-193位、第199-213位、第219-233位、第239-256位、第262-276位、第282-299位、第305-320位、第326-339位、第345-360位、第366-381位和第387-401位)串联而得，具体地，16个HTL表位之间可用氨基酸连接子(如GPGPG)进行串联连接，所述串联多肽1的氨基酸序列具体可为SEQ IDNo.1的第75-401位。
所述串联多肽2可为串联的CTL表位，由11个CTL表位(氨基酸序列分别为SEQ IDNo.1的第405-413位、第417-425位、第429-438位、第442-451位、第455-464位、第468-476位、第480-488位、第492-500位、第504-512位、第516-524位和第528-536位)串联而得，具体地，11个CTL表位之间可用氨基酸连接子(如AAY)进行串联连接，所述串联多肽2的氨基酸序列具体可为SEQ ID No.1的第405-536位。
所述串联多肽3可为串联的B细胞表位，由8个B细胞表位(氨基酸序列分别为SEQID No.1的第539-591位、第594-618位、第621-658位、第661-690位、第693-714位、第717-749位、第752-779位和第782-844位)串联而得，具体地，8个B细胞表位之间可用氨基酸连接子(如KK)进行串联连接，所述串联多肽3的氨基酸序列具体可为SEQ ID No.1的第539-813位。
将串联多肽1(串联的HTL表位)、串联多肽2(串联的CTL表位)和串联多肽3(串联的B细胞表位)通过氨基酸连接子连接，得到多表位融合蛋白，该多表位融合蛋白即可作为活性成分用于构建诊断分子。
进一步地，所述融合蛋白从N端至C端依次可为所述串联多肽1、所述串联多肽2和所述串联多肽3。
进一步地，所述串联多肽之间可由氨基酸连接子连接。
进一步地，所述融合蛋白从N端至C端依次可为所述串联多肽1、氨基酸连接子、所述串联多肽2、氨基酸连接子和所述串联多肽3，具体地，所述融合蛋白从N端至C端依次可为所述串联多肽1、GPGPG、所述串联多肽2、AAY和所述串联多肽3。
进一步地，所述融合蛋白还可包括佐剂肽和/或辅助肽，优选地，所述融合蛋白还可包括氨基酸序列是SEQ ID No.1的第1-45位的辅助肽1、氨基酸序列是SEQ ID No.1的第51-69位的辅助肽2和/或氨基酸序列是SEQ ID No.1的第819-838位的佐剂肽。
所述辅助肽可为HBD-3和/或PADRE，所述佐剂肽可为TLR-2激动剂PSMα4。
具体地，所述辅助肽1可为HBD-3，辅助肽2可为PADRE。
所述辅助肽1(HBD-3)的氨基酸序列可为SEQ ID No.1的第1-45位，所述辅助肽2(PADRE)的氨基酸序列可为SEQ ID No.1的第51-69位，所述佐剂肽(PSMα4)的氨基酸序列可为SEQ ID No.1的第819-838位。
进一步地，所述融合蛋白从N端至C端依次可为所述辅助肽1、所述辅助肽2、所述串联多肽1、所述串联多肽2、所述串联多肽3和所述佐剂肽1。
进一步地，所述融合蛋白从N端至C端依次可为所述辅助肽1、氨基酸连接子、所述辅助肽2、氨基酸连接子、所述串联多肽1、氨基酸连接子、所述串联多肽2、氨基酸连接子、所述串联多肽3、氨基酸连接子和所述佐剂肽1。
具体地，所述融合蛋白从N端至C端依次可为所述辅助肽1、EAAAK、所述辅助肽2、GPGPG、所述串联多肽1、AAY、所述串联多肽2、KK、所述串联多肽3、EAAAK和所述佐剂肽1。
本领域技术人员熟知，氨基酸连接子(也称为间隔子、连接子)是存在于一种融合蛋白中的多肽之间的短肽序列，用连接子连接不同表位的目的是为了防止两个表位连接处形成新的表位，保护天然表位的结构和功能，因此任何能实现这一目的且不改变融合蛋白功能的连接子均可用来连接本发明所述的表位。
本文所述氨基酸连接子包括但不限于EAAAK、GPGPG、AAY、KK、KKK、GGGSGGG、GGSSGG、GSGSGSG、GSGSG、GGGGS和GSG。
在本发明的一个实施方案中，所述融合蛋白包括辅助肽HBD-3和PADRE、16个HTL表位、11个CTL表位、8个B细胞表位、PSMα4和6×His标签。
进一步地，所述融合蛋白HP16118P可为下述任一种：
A1)氨基酸序列是SEQ ID No.1的第1-838位的蛋白质；
A2)将SEQ ID No.1的第1-838位所示的氨基酸序列经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与A1)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且具有相同功能的蛋白质；
A3)在A1)或A2)的N端和/或C端连接标签或信号肽得到的具有相同功能的融合蛋白质；
A4)氨基酸序列是SEQ ID No.1的第75-813位的蛋白质；
A5)将SEQ ID No.1的第75-813位所示的氨基酸序列经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与A1)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且具有相同功能的蛋白质；
A6)在A4)或A5)的N端和/或C端连接标签或信号肽得到的具有相同功能的融合蛋白质。
所述A4)可为由串联多肽1(包括16个串联的HTL表位)、串联多肽2(包括11个串联的CTL表位)、和串联多肽3(包括8个串联的B细胞表位)通过氨基酸连接子连接而成的具有抗原活性的融合蛋白(SEQ ID No.1的第75-813位)。
所述A1)可为为了增强免疫原性，在A4)的N端融合辅助肽1(HBD-3)和辅助肽2(PADRE)，并在C端融合佐剂肽(PSMα4)而得到的融合蛋白(SEQ ID No.1的第1-838位)。
进一步地，A3)所述融合蛋白质可为在A1)的C端连接His标签得到的具有相同功能的融合蛋白质。
进一步地，A3)所述融合蛋白质包括氨基酸序列是SEQ ID No.1的蛋白质或将SEQID No.1所示的氨基酸序列经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与SEQ IDNo.1所示的蛋白质具有80％以上的同一性且具有相同功能的蛋白质。
本文所述取代可为保守性取代(也称为保守性替换)或非核心功能区的非保守性取代。本领域技术人员所公知，保守性取代或是在非核心功能区进行非保守取代，对蛋白质的功能通常不会产生质的影响。
本文所述标签包括但不限于：GST(谷胱甘肽巯基转移酶)标签蛋白、His标签蛋白(His-tag)、MBP(麦芽糖结合蛋白)标签蛋白、Flag标签蛋白、SUMO标签蛋白、HA标签蛋白、Myc标签蛋白、GFP(绿色荧光蛋白)、CFP(青色荧光蛋白)、YFP(黄绿色荧光蛋白)、mCherry(单体红色荧光蛋白)或AviTag标签蛋白。
本文中，同一性是指氨基酸序列或核苷酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定氨基酸序列的同一性，如NCBI主页网站的BLAST网页。例如，可在高级BLAST2.1中，通过使用blast作为程序，将Expect值设置为10，将所有Filter设置为OFF，使用BLOSUM62作为Matrix，将Gap existence cost，Per residue gap cost和Lambda ratio分别设置为11，1和0.85(缺省值)并进行检索以对氨基酸序列的同一性进行计算，然后即可获得同一性的值(％)。
本文中，所述80％以上的同一性可为至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。
本发明还提供了生物材料，所述生物材料可为下述任一种：
D1)编码本文中任一所述融合蛋白HP16118P的核酸分子；
D2)含有D1)所述核酸分子的表达盒；
D3)含有D1)所述核酸分子的重组载体、或含有D2)所述表达盒的重组载体；
D4)含有D1所述核酸分子的重组微生物、或含有D2)所述表达盒的重组微生物、或含有D3)所述重组载体的重组微生物；
D5)含有D1)所述核酸分子的重组宿主细胞、或含有D2)所述表达盒的重组宿主细胞、或含有D3)所述重组载体的重组宿主细胞。
上述生物材料中，D1)所述核酸分子可为下述任一种：
B1)编码序列是SEQ ID No.2、SEQ ID No.2的第1-2514位或SEQ ID No.2的第223-2439位的DNA分子；
B2)核苷酸序列是SEQ ID No.2、SEQ ID No.2的第1-2514位或SEQ ID No.2的第223-2439位的DNA分子。
进一步地，D2)所述表达盒、D3)所述重组载体、D4)所述重组微生物和D5)所述重组宿主细胞均可表达D1)所述核酸分子。
SEQ ID No.2所示的DNA分子可为编码氨基酸序列是SEQ ID No.1所示融合蛋白HP16118P的DNA分子。
SEQ ID No.2的第1-2514位所示的DNA分子可为编码氨基酸序列是SEQ ID No.1的第1-838位所示融合蛋白HP16118P的DNA分子。
SEQ ID No.2的第223-2439位所示的DNA分子可为编码氨基酸序列是SEQ ID No.1的第75-813位所示融合蛋白HP16118P的DNA分子。
所述核酸分子还可包括在SEQ ID No.2、SEQ ID No.2的第1-2514位或SEQ IDNo.2的第223-2439位所示核苷酸序列基础上经密码子偏好性改造得到的核酸分子。考虑到密码子的简并性以及不同物种密码子的偏爱性，本领域技术人员可以根据需要使用适合特定物种表达的密码子。
本文所述载体是指能够把外源DNA或目的基因运载进入宿主细胞进行扩增和表达的载体，所述载体可以是克隆载体也可以是表达载体，包括但不限于：质粒、噬菌体(如λ噬菌体或M13丝状噬菌体等)、黏粒(即柯斯质粒)、Ti质粒、病毒载体(如逆转录病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒等)。在本发明的一个或多个实施方案中，所述载体为载体pET-28a(+)。
本文所述微生物可为细菌、真菌、放线菌、原生动物、藻类或病毒。其中，所述细菌可来自埃希氏菌属(Escherichia sp.)、欧文氏菌属(Erwinia sp.)、土壤杆菌属(Agrobacterium sp.)、黄杆菌属(Flavobacterium sp.)、产碱菌属(Alcaligenes sp.)、假单胞菌属(Pseudomonas sp.)、芽胞杆菌属(Bacillus sp.)等但不限于此，例如所述细菌可为大肠杆菌(Escherichia coli)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)或短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)。在本发明的一个或多个实施方案中，所述微生物为大肠杆菌BL21(DE3)。
本文所述宿主细胞(也称为受体细胞)可为植物细胞或动物细胞。所述宿主细胞可理解为不仅是指特定的受体细胞，而且也指这种细胞的后代，且由于天然的、偶然的或有意的突变和/或改变，该子代可以不必与原始的亲代细胞完全一致，但仍包括在宿主细胞的范围中。合适的宿主细胞为本领域已知的。
本文所述重组载体是指将外源目的基因与载体在体外连接构建而成的重组体DNA分子，可以任何合适的方式构建，只要构建的重组载体可携带外源目的基因进入受体细胞、并为外源目的基因提供在受体细胞的复制、整合、扩增和/或表达能力即可。
D3)所述重组载体可为pET-28a(+)-HP16118P。
重组载体pET-28a(+)-HP16118P是将pET-28a(+)载体的BamHI和XhoI识别位点间的片段(小片段)替换为核苷酸序列是序列表中SEQ ID No.2的DNA片段，保持pET-28a(+)载体的其他核苷酸序列不变，得到的重组表达载体。重组载体pET-28a(+)-HP16118P表达氨基酸序列如SEQ ID No.1所示的融合蛋白HP16118P。
D4)所述重组微生物可为BL21/pET-28a(+)-HP16118P。所述BL21/pET-28a(+)-HP16118P是将所述重组载体pET-28a(+)-HP16118P导入大肠杆菌BL21(DE3)得到的重组微生物。
所述导入可为通过化学转化法(如Ca2+诱导的转化法、聚乙二醇介导的转化法或金属阳离子介导的转化法)或电穿孔转化法等任何已知的转化方法将携带本发明DNA分子的载体转化宿主菌；也可为通过噬菌体转导的方法将本发明DNA分子转导进入宿主菌。所述导入还可为通过磷酸钙共沉淀法、脂质体介导法、电穿孔法或病毒载体法等任何已知的转染方法将携带本发明DNA分子的载体转染宿主细胞。
本发明还提供了本文中任一所述融合蛋白，或所述生物材料的下述任一种应用：
C1)在制备用于鉴别和/或诊断结核分枝杆菌潜伏感染的产品中的应用；
C2)在制备鉴别区分潜伏性结核感染者和活动性结核病患者的产品中的应用；
C3)在制备鉴别区分潜伏性结核感染者和健康受试者的产品中的应用；
C4)在制备鉴别区分活动性结核病患者和健康受试者的产品中的应用；
C5)在结核分枝杆菌感染引起的疾病防控中的应用；
C6)在制备结核分枝杆菌潜伏感染鉴别诊断的诊断分子中的应用；
C7)在制备针对结核分枝杆菌的保护性抗原中的应用；
C8)在筛选和/或开发结核分枝杆菌抗体中的应用。
所述保护性抗原是指结核分枝杆菌能刺激机体发生保护性免疫应答的抗原成分。
所述结核分枝杆菌抗体可包括全长抗体或抗原结合片段(如Fab片段、Fv片段、Fab′片段、F(ab′)2片段、单链抗体(ScFv)、纳米抗体(单域抗体)、双特异性抗体或最小识别单位(MRU)等但不限于此)。
上述应用中，所述结核分枝杆菌感染引起的疾病可为结核病。
进一步地，所述结核病可包括活动性结核病(Active tuberculosis，ATB)和潜伏性结核感染(Latent tuberculosis infection，LTBI)。
进一步地，上述应用中，所述应用可包括如下步骤：
H1)将受试者样本与刺激物共同培养，所述刺激物可为本文中任一所述的融合蛋白；
H2)检测样本中分泌的IL-5和/或IL-17F水平。
进一步地，所述应用还包括：根据所述IL-5水平鉴别和/或诊断结核分枝杆菌潜伏感染(即鉴别和/或诊断受试者是否为潜伏性结核感染者)。
进一步地，所述应用还包括：根据所述IL-5水平鉴别区分潜伏性结核感染者和活动性结核病患者，或根据所述IL-5水平鉴别区分潜伏性结核感染者和健康受试者。
进一步地，所述应用还包括：根据所述IL-17F水平鉴别区分活动性结核病患者和健康受试者，或根据所述IL-17F水平鉴别区分潜伏性结核感染者和健康受试者。
本文所述受试者样本可为血液样本或组织样本。
本发明还提供了用于结核分支杆菌潜伏感染鉴别和/或诊断的产品，所述产品可包括本文中任一所述的融合蛋白。
进一步地，所述产品还可包括用于检测IL-5和/或IL-17F的试剂。
本文所述产品可为诊断分子、药物组合物、试剂、试剂盒、芯片、试纸或检测卡。
所述诊断分子、药物组合物、试剂、试剂盒、芯片、试纸或检测卡可用于鉴别和/或诊断结核分枝杆菌潜伏感染，或鉴别区分潜伏性结核感染者和活动性结核病患者。
所述诊断分子、药物组合物、试剂的活性成分可包括本文中任一所述的融合蛋白。
所述诊断分子还可包括佐剂(adjuvant)。
所述佐剂可为一种可以刺激机体产生针对与其一同接种的抗原更强烈体液和/或细胞免疫应答的物质。本文所述佐剂可以是本领域技术人员公知的，包括但不限于：植物佐剂(如烷基胺、酚类成分、奎宁、皂角素、倍半萜、蛋白质、多肽、多糖、糖脂、植物血凝素等)、细菌佐剂(如霍乱毒素、大肠埃希菌不耐热毒素、细菌脂多糖等)、铝佐剂及其他无机成分佐剂(如钙佐剂)、细胞因子和核酸佐剂(如单核细胞克隆刺激因子、白细胞因子IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IFN-γ、CpG基序、核酸载体等)、乳剂佐剂(如弗氏佐剂)。所述佐剂可为药学上可以接受的佐剂。
所述药物组合物还可包括一种或者是多种药学上可接受的载体。所述药学上可接受的载体可为稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、吸附载体、表面活性剂或润滑剂但不限于此。
本发明还提供了本文中任一所述融合蛋白的制备方法，所述制备方法可包括使编码本文中任一所述融合蛋白的核酸分子在微生物或宿主细胞中进行表达得到所述融合蛋白。
进一步地，所述方法可包括如下步骤：
G1)构建含有编码本文中任一所述融合蛋白的核酸分子的重组表达载体；
G2)将所述重组表达载体导入微生物，得到重组微生物；
G3)培养所述重组微生物，经分离和/或纯化得到所述融合蛋白；
进一步地，G1)中所述核酸分子可为SEQ ID No.2、SEQ ID No.2的第1-2514位或SEQ ID No.2的第223-2439位所示的DNA分子。
进一步地，所述微生物可为大肠杆菌BL21(DE3)。
本文所述应用和方法的目的可以是疾病诊断目的、疾病预后目的和/或疾病治疗目的，它们的目的也可以是非疾病诊断目的、非疾病预后目的和非疾病治疗目的；它们的直接目的可以是获取疾病诊断结果、疾病预后结果和/或疾病治疗结果的中间结果的信息，它们的直接目的可以是非疾病诊断目的、非疾病预后目的和/或非疾病治疗目的。
本发明的发明人通过生物信息学和免疫信息学技术预测和筛选出了针对结核分枝杆菌的HTL、CTL和B细胞表位，这些表位具有很好的免疫原性和抗原性且无毒性无致敏性等特点。在此基础上，发明人在表位分子设计中加入了辅助肽HBD-3和PADRE来进一步提高表位诊断分子的免疫原性，加入TLR2激动剂PSMα4赋予诊断分子靶向递送的功能并增强诊断分子的免疫原性。进一步通过免疫信息学工具对该诊断分子的抗原性、免疫原性、理化参数、二级结构、三级结构、免疫反应等进行了预测和分析。结果表明，本发明所提供的多肽融合蛋白HP16118P的抗原性为0.7381和0.60063，免疫原性为6.43254，溶解度指数为0.382。二级结构预测显示，HP16118P的α-螺旋占41％，β-折叠占7％，无规则卷曲占50％。三级结构分析显示HP16118P的置信度分数(C-score)为-1.98。
本发明进一步制备了融合蛋白HP16118P，通过酶联免疫斑点试验(ELISPOT)和高通量液相蛋白分析实验分析免疫信息学和真实世界实验结果的一致性，免疫信息学和真实世界实验结果均表明，多肽融合蛋白HP16118P可诱导活性B淋巴细胞升高并产生了高水平的IgG和IgM抗体，诱导活性细胞毒性T细胞的数量增加并在刺激后第50天达到峰值，还诱导了高水平的IFN-γ和IL-2。同时体外实验结果证明了结核分枝杆菌的多肽融合蛋白HP16118P可以作为一种抗原蛋白，能够刺激人外周血单个核细胞(PBMCs)产生免疫应答，具有免疫原性，可诱导产生IFN-γ+T淋巴细胞及多种细胞因子，本发明可为结核潜伏感染的鉴别诊断提供新的候选靶标分子。
进一步的诊断性能实验结果表明，利用IL-5和/或IL-17F作为ATB、LTBI以及HC之间鉴别诊断的生物标志物的有益效果为：(1)HP16118P诊断分子诱导的IL-5能够将LTBI人群从ATB(P＝0.0372,AUC＝0.8214,95％CI[0.5843to 1.000])和HC(P＝0.0026,AUC＝0.9643,95％CI[0.8770to 1.000])人群中区分出来，其鉴别诊断的敏感性和特异性分别为100％和71.43％(ATB vs.LTBI)，以及100％和85.71％(HC vs.LTBI)。(2)HP16118P诊断分子诱导的IL-17F能够将ATB人群从HC(P＝0.0088,AUC＝0.9184,95％CI[0.7716to 1.000])人群中区分出来，其鉴别诊断的敏感性和特异性分别为71.43％和85.71％；(3)HP16118P诊断分子诱导的IL-17F能够将LTBI人群从HC(P＝0.0038,AUC＝0.9464,95％CI[0.8299to1.000])人群中区分出来，其鉴别诊断的敏感性和特异性分别为87.50％和85.71％。
本发明多肽融合蛋白HP16118P可通过基因工程制备，用多肽融合蛋白HP16118P作为诊断分子，具有较强的抗原性和免疫原性并且其制备方法简单、特异性好、灵敏度高、成本低、产量高等优点。本发明对于活动性结核和结核潜伏感染的鉴别诊断及结核病的防控具有重大价值。
附图说明
图1为实施例1中筛选的最终用于构建多肽融合蛋白的HTL表位信息。
图2为实施例1中筛选的最终用于构建多肽融合蛋白的CTL表位信息。
图3为实施例1中筛选的最终用于构建多肽融合蛋白的B细胞表位信息。
图4为HP16118P的构建示意图和二级结构预测结果。
图5为HP16118P的三维模型。
图6为C-ImmSim Server对HP16118P诱导自然杀伤细胞(NK)、巨噬细胞(MA)、树突状细胞(DC)、上皮细胞和B细胞及其产生的抗体的预测结果。
图7为C-ImmSim Server对HP16118P诱导辅助性T(TH)细胞、细胞毒性T(TC)细胞和调节性T(TR)细胞的预测结果。
图8为C-ImmSim Server对HP16118P诱导的细胞细胞因子水平的预测结果。
图9为重组载体pET-28a(+)-HP16118P构建示意图和诊断分子体外克隆表达后SDS-PAGE纯化。
图10为酶联免疫斑点法(ELISPOT)检测IFN-γ+T淋巴细胞。使用HP16118P体外刺激健康对照(HC)、潜伏性结核感染(LTBI)和活动性结核(ATB)患者的外周血单个核细胞(PBMC)。采用人ELISPOT试剂盒检测IFN-γ+T淋巴细胞的斑点形成细胞(SFC)。根据正态性对数据进行非配对t检验或Mann-Whitney检验。数据以均值±SEM表示。p<0.05为差异有统计学意义。SEM，均值的标准误差。
图11为HP16118P诱导人外周血单个核细胞(PBMCs)产生的细胞因子水平。采用高通量液相蛋白分析技术检测HP16118P诱导的35种炎症细胞因子(G-CSF、GM-CSF、HGF、IFN-α、IFN-γ、IL-1α、IL-1β、IL-10、IL-12p70、IL-13、IL-117F、IL-2、IL-21、IL-22、IL-23、IL-3、IL-31、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-9、IP-10、MCP-1、MCP-3、MIG、MIP-1α、MIP-1β、PD-1、SDF-1α、TIM-3、TIMP-1、TNF-α、VEGF-A和VEGF-R2)水平。所有数据均显示为均值±SEM。SEM，均值的标准误差。细胞因子浓度以ng/ml表示。
图12为HP16118P诱导人外周血单个核细胞(PBMCs)产生的细胞因子在三组中的差异。用HP16118P体外刺激健康对照者(HC)、潜伏性结核感染者(LTBI)和活动性结核患者(ATB)的PBMCs。根据数据正态性和方差齐性，采用单因素方差分析或Kruskal-Wallis检验进行差异比较。所有数据均显示为均值±SEM。p<0.05为差异有统计学意义。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中的大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞购自上海晶诺生物科技有限公司。
下述实施例中的载体pET-28a(+)购自Novagen公司。
下述实施例中主要试剂的配制方法如下：
1、LB液体培养基的配制(1000ml)：
Figure SMS_1
加去离子水定容至1000ml，121℃，15min高压灭菌。
2、LB固体培养基的配制(1000ml)：
Figure SMS_2
加去离子水定容至1000ml，121℃，15min高压灭菌。
3、可溶性表达形式目的蛋白纯化所需缓冲液的配制：
(1)可溶性蛋白裂解缓冲液pH 8.0(1000ml)：
Figure SMS_3
用去离子水溶解并定容到1000ml，NaOH调节pH至8.0。
(2)包涵体表达形式目的蛋白纯化所需缓冲液的配制：
①包涵体蛋白裂解缓冲液pH 8.0(1000ml)：
Figure SMS_4
用去离子水溶解并定容到1000ml，NaOH调节pH至8.0。
②包涵体蛋白洗涤缓冲液pH 6.3(1000ml)：
Figure SMS_5
用去离子水溶解并定容到1000ml，NaOH调节pH至6.3。
③包涵体蛋白洗脱缓冲液pH 4.5(1000ml)：
Figure SMS_6
用去离子水溶解并定容到1000ml，NaOH调节pH至4.5。
下述实施例中涉及的HP16118P基因的核苷酸序列(SEQ ID No.2)如下所示：
GGTATTATCAACACCCTGCAGAAATATTATTGTCGTGTTCGCGGCGGCCGTTGCGCCGTTCTGAGTTGCCTGCCGAAAGAAGAACAGATTGGTAAATGTAGCACCCGTGGCCGTAAATGCTGTCGCCGTAAAAAAGAAGCCGCAGCCAAAGCAGGTCTGTTCCAGCGTCATGGTGAAGGCACCAAAGCCACCGTTGGCGAACCGGTGGGCCCGGGTCCTGGTGGTGCAGCATTCAGTTGGTATACCTATAGTCCGACCCGTGTGCGCGGTCCGGGTCCTGGCGTTGTTCTGGAATTCGCCGCAACCGTTGATCCGGAAGCCGGCCGTCGTCTGGGCCCTGGTCCTGGTTATGAAAGCCGCCTGCTGCGCATTGCCAGTCCGATGTTCCACTTCGGCATTGGCCCGGGCCCGGGCGCAGTTACACTGGCAAGCATTCTGCCGGTGCTGGCCGTTGGTCCGGGCCCTGGTATGGGCAGTTATGCCCTGCTGGTGTTCTTCGGCCTGTTCCTGGGTCCGGGCCCGGGTAGTGATCCGGCTTATAATATTAATATTAGCCTGCCGAGTTACTATCCGGATCAGGGTCCGGGTCCGGGCTTCCTGTTCTATAGCGGCTTCTATCTGCCGATGTATTGGAGTAGCGGTCCGGGTCCAGGTAGCTTCCTGTTCTACAGTGGCTTCTATCTTCCGATGTATTGGAGCGGCCCGGGTCCGGGTGATCTGCGTGTGCATGATCTGCGTCATAGCGGCGCCGTGCTGGCAGCCAGCACCGGTCCTGGTCCGGGTCAGAGCACCGCACGCTTCATTCTGGCCTATCTGCCGCGTTGGCAGGGTCCGGGCCCAGGTGCAGCTGCAGAACAGCTGCGCCTGATGTATAATAGTGCCAATATGACCGCAAAAGGCCCGGGTCCAGGCGTTGCACCGAGCGTTATGCCGGCCGCAGCCGCTGGTAGTAGTGCCACCGGTCCGGGCCCCGGTGGTCTTAGTGCCGCTGCTGCCAAACTGGCAGGTCTGGTGTTCGGCCCGGGCCCTGGAACCGGTGCAGGTGCACGTCCGGCAGCAAGCCCGCTGGCTGCTCCTGTGGGCCCTGGTCCAGGTACCGGTCGCGAAGCCGCACATCTGCGTGCATTCCGTGCCTATGCCGCCGGTCCGGGCCCTGGCGCAGCAGCAAGCGGTGTTCCGGGCGCTCGTGCAGCCGCTGCTGCAGCAGCATACTTCCACTTCGGTATTCTGGTGGTTATTGCAGCATATCTGTTCCGTCCGTATATTATCTATCGTGCAGCCTATCA TGCAGCAGGTAGTCGCTTCGTTGAACTGGCCGCATATCGCCCGACCTTCGATACCCGTCTGATGCGTGCCGCCTATAATGTGATGGAAGAACATCAGGTTCGTCGTGCAGCCTACGTGGCACCGACCCTGGCCGCTGCTGTGGCAGCATATGCCAGTACCGCCCGTCGCGTTCATAAAGCCGCATATCTGCGTCCGACCGAAGTTGATAGTCTGGCAGCATATATGCATCCGATGATTCCGGCAGAATATGCCGCCTATCGCCAGCGTGGTCGTGGCGATGCCCTGGCTGCCTATGAAGCCGCACACCTGCGTGCATTCCGCAAAAAAGCAAATATTCGTGAACAGGCAATTGCCACCATGCCGCGTGGTGGCCCGGATGCTAGCTGGCTGGATCGCCGCTTCCAGACCGATGCACTGGAATATCTGGATCGCGATGATGTGCCGGATGAAGTGAAACAGAAAATTATTGGTGTTCTGGATCGTGTGAAAAAACTGGAAGATGAAATGAAAGAAGGCCGCTATGAAGTGCGCGCCGAACTGCCGGGCGTTGATCCGGATAAAGATGTTAAAAAAACCGCCGTTGGCGGTAGTCCGCCGACCCGTCGTTGTCCGGCAACCGAAGATCGTGCACCGGCAACCGTGGCAACCCCGAGTAGCACCGATCCGACCGCCAGTCGTGCCGTGAGTAAAAAAGCAATTGAAGATCATCTGCATAAGCATGTGAATCCGGGTCGTGAAAGCCTGCTGTTCCCGAGTGTTAATGATCCGAATCGCCATCTGGCAAAAAAACTGCGTGATGCCCCGTACTTCCGCCCGAATGCAGATCCGGTGCTGCCGCGTCTGAAAGCAGCAGCCAAAAAACTGATTCGCCGCGCAAGCACCTTCAATACCAGTCGCATTGATCATCTGTATGTGGACCCTCATCAGCCGGGCGCACGCCTGTTCCTGCATTATGGCGATAAAAAAGGCCTGGCAAATGCATATAATGATACCCGTCGTAAAGTGGTTCCGCCGGAAGAAATTGCAGCCAATCGTGAAGAACGCCGCCGTAAAAAGACCGATCAGCGTCTGCTGGATCTGCTGCCGCCGGCACCGGTTGATGTTAATCCGCCGGGCGATGAACGCCATATGCTGTGGTTCGAACTGATGAAAGAAGCCGCCGCCAAAATGGCAATTGTTGGTACCATTATTAAGATTATCAAGGCCATTATCGACATCTTCGCAAAACATCATCATCATCACCATTAA
实施例1、免疫优势表位的预测、筛选和确定
病原微生物入侵机体后会引发免疫应答反应，免疫应答反应并非针对整个外源物质，而仅仅是针对表位，通常是一段多肽。表位诊断分子就是利用基因工程手段，体外表达或人工合成病原微生物的抗原表位，将其作为诊断分子使用。表位诊断分子设计的关键是筛选表位。本实施例预测、筛选了15个候选抗原的HTL表位、CTL表位和B细胞表位，其目的是分别有效获得最佳的辅助性T淋巴细胞(HTL)识别的抗原表位、细胞毒性T细胞(CTL)识别的抗原表位和B细胞识别的抗原表位，进一步用于表位诊断分子的制备。
1、抗原的选择
Anat Zvi等通过文献检索和生物信息学方法从结核分枝杆菌(MTB)全基因组的3989个开放阅读框架中筛选出189个潜在的结核病(TB)候选分子。在之前的研究中，其中34种抗原已被确定为潜在的结核病诊断分子候选抗原。在34种抗原中，至少有5种抗原已进入临床试验，如Ag85A(Rv3804c)、Ag85B(Rv1886c)、ESAT-6(Rv3875)、MTB72F(Rv0125)和Rv1196。此外，已有10种抗原用于动物模型的保护研究。其余19种抗原也能诱导产生强烈的免疫反应。因此，我们选择了15个抗原进行表位预测和筛选。这15个候选抗原是Rv1736c、Rv1737c、Rv2626c、Rv2656c、Rv2659c、Rv1511、Rv1980c、Rv1981c、Rv3873、Rv3878、Rv3879c、Rv3425、Rv1978、Rv2031c和Rv3429。
2、HTL表位预测及筛选
采用IEDB中的主要组织相容性复合体(MHC)II服务器(http://tools.iedb.org/mhcii/)进行HTL表位预测。参数设置：采用IEDB推荐的2.22作为预测方法；物种选择人类；MHC等位基因选择人类白细胞抗原(HLA)总参考集(HLA-DR，HLA-DP，HLA-DQ)；表位长度设置为15。纳入标准：HTL表位百分位数排名<0.5；通过与SWISSPROT数据库中500万个15-mers(长度为15个氨基酸的肽段)的比较，获得肽分(与MHC II结合的表位分数越低表示亲和力越高)，通过与SWISSPROT数据库中500万个15-mers的比较，获得百分位数排名<0.5。VaxiJen v2.0(http://www.ddg-pharmfac.net/vaxijen/VaxiJen/VaxiJen.html)用于预测表位抗原性，阈值为0.4。自动交叉协方差(ACC)被用来转换选择目标，并预测对特定抗原具有保护性的概率。最后，IFN-γ表位服务器(http://crdd.osdd.net/raghava/ifnepitope/index.php)被用来预测表位的IFN-γ诱导性(阴性/阳性，诱导IFN-γ的阳性结果意味着该表位可以被进一步研究)。通过上述的预测及筛选，最终16个HTL免疫优势表位被确定为构建诊断分子的候选表位，具体表位序列等信息详见图1，使用AllerTOPv.2.0*和Aller FP*(即Allergen FP v.1.0*)来预测致敏性。1表示具有致敏性，2表示无致敏性。
2、CTL表位预测及筛选
IEDB MHC I服务器(http://tools.iedb.org/mhci/)被用来预测CTL表位。IEDB建议2020.09(NetMHCpanEL4.1)是主要限定条件，人类HLA等位基因的所有长度的表位是次要限定条件。百分位数<0.5的表位有资格进入下一步的分析。然后，I类免疫原性服务器(http://tools.iedb.org/immunogenicity/)被用来分析这些CTL表位的免疫原性，百分位数水平<0.5和免疫分数>0的表位被选入下一步骤。最后，VaxiJen v2.0服务器被用来预测抗原性，阈值为0.4。通过上述的预测及筛选，最终11个CTL免疫优势表位被确定为构建诊断分子的候选表位，具体表位序列等信息详见图2，使用AllerTOP v.2.0和Aller FP(即Allergen FP v.1.0)来预测致敏性。1表示具有致敏性，2表示无致敏性。
3、B细胞表位的预测及筛选
B细胞在宿主对抗各种病毒的过程中发挥着重要作用。由于ABCpred服务器(https://webs.iiitd.edu.in/raghava/abcpred/ABC_submission.html)具有较高的准确性(65.93％)，所以被用来预测线性B细胞表位。表位长度被限制在20个，过滤阈值保持在默认的0.51(更高的阈值意味着更高的特异性，但灵敏度较低)。通过上述的预测及筛选，最终8个B细胞表位被确定为构建诊断分子的候选表位，具体表位序列等信息详见图3。
最终筛选确定了用于构建诊断分子活性成分(多肽融合蛋白)的16个HTL表位、11个CTL表位和8个B细胞表位，共35个表位，35个表位的氨基酸序列如表1所示：
表1、最终筛选确定的35个免疫优势表位的氨基酸序列
Figure SMS_7
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Figure SMS_8
实施例2、多肽融合蛋白的构建、理化特性及结构解析
1、多肽融合蛋白的构建
基于上述生物信息学工具预测和筛选的HTL、CTL和B细胞表位，最终选择Percentile rank、抗原性和IFN-γ评分最高、无毒性和无致敏性的HTL表位，Percentilerank、免疫原性和抗原性评分最高、无毒性和无致敏性的CTL表位以及预测分数最高的B细胞表位(共35个表位)构建多肽融合蛋白(如HP16118P)。
本发明所构建的结核新型多肽融合蛋白包括4个部分(HBD-3、PADRE、多表位融合蛋白、PSMα4)，命名为HP16118P(图4)。
首先，将所选的35个表位用氨基酸连接子(GPGPG、AAY、KK)连接，具体地本实施例中，16个HTL表位之间用GPGPG氨基酸连接子连接，得到串联的HTL表位(氨基酸序列为SEQID No.1的第75-401位)；11个CTL表位之间用AAY氨基酸连接子连接，得到串联的CTL表位(氨基酸序列为SEQ ID No.1的第405-536位)；8个B细胞表位之间用KK氨基酸连接子连接，得到串联的B细胞表位(氨基酸序列为SEQ ID No.1的第539-813位)。将串联后的HTL表位、CTL表位和B细胞表位通过氨基酸连接子连接，得到多表位融合蛋白，该多表位融合蛋白即可作为活性成分用于构建诊断分子，具体地本实施例中，多表位融合蛋白的连接方式如下：
多表位融合蛋白：串联的HTL表位-AAY-串联的CTL表位-KK-串联的B细胞表位。
然后，在多表位融合蛋白的起始(氨基末端)加入HBD-3辅助肽(GIINTLQKYYCRVRGGRCAVLSCLPKEEQIGKCSTRGRKCCRRKK，SEQ ID No.1的第1-45位)和PADRE辅助肽(AGLFQRHGEGTKATVGEPV，SEQ ID No.1的第51-69位)，来进一步提高表位诊断分子的免疫原性。此外，在多表位融合蛋白的末端(羧基末端)添加TLR2激动剂PSMα4(MAIVGTIIKIIKAIIDIFAK，SEQ ID No.1的第819-838位)作为佐剂赋予诊断分子靶向递送的功能并增强诊断分子的免疫原性。
最后，为了便于蛋白的纯化，在多肽融合蛋白的羧基末端添加了一个His标签(6×His)。
最终构建的多肽融合蛋白命名为HP16118P(图4)，多肽融合蛋白HP16118P的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，其编码基因命名为HP16118P基因，HP16118P基因的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。
在此基础上，采用VaxiJen v2.0、ANTIGENpro、allergtop v.2.0、Allergen FPv.1.0、IEDB immunogenicity server和Toxin Pred server对构建的多肽融合蛋白HP16118P进行抗原性、变应原性、免疫原性和毒性预测分析。结果显示，HP16118P诊断分子(即多肽融合蛋白HP16118P)由844个氨基酸组成。经Expasy Protparam服务器分析，其相对分子质量为90265.44Da，理论pI为9.84，预估半衰期为30小时(哺乳动物网织红细胞，体外)、20分钟(酵母，体内)、10小时(大肠杆菌，体内)，这说明HP16118P是一个比较稳定的蛋白分子。此外，我们还发现不稳定指数、脂肪族指数和亲水性总平均值(Grand average ofhydropathicity，GRAVY)分别为43.02、75.09和-2.7，其抗原性为0.7381和0.60063，免疫原性为6.43254。此外，通过Protein-Sol服务器预测的HP16118P的溶解度为0.382。这些结果表明，HP16118P是一个稳定的、亲水性的且具有中等溶解水平的偏碱性蛋白分子。
2、多肽融合蛋白二级和三级空间结构分析
使用Expasy Protparam服务器(https://web.expasy.org/protparam/)预测多肽融合蛋白的理化参数。它可以预测诊断分子的理化性质，如分子量、理论pI、氨基酸组成、原子组成、消光系数、估计半衰期、不稳定指数、脂肪族指数和亲水性总平均值(GRAVY)。蛋白质-溶胶(Protein-Sol)服务器(https://protein-sol.manchester.ac.uk/)用于预测多肽融合蛋白的溶解度。通过Protein-Sol服务器获得的单氨基酸序列与数据库中的数据进行比较。溶解度值大于0.45表示该蛋白具有较好的溶解度。利用PSIPRED服务器(http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/)构建多肽融合蛋白的二级结构。它可以有效识别跨膜拓扑结构、跨膜螺旋、折叠和结构域识别等。RaptorX Property(http://raptorx.uchicago.edu/StructurePropertyPred/predict/)预测多肽分子的二级结构特征，该服务器使用一种名为Deep CNF的不断进化的机器学习模型来连续计算二级结构(secondary structure，SS)、紊乱区域(disorder regions，DISO)和溶剂可及性(solventaccessibility，ACC)。二级结构包括α-螺旋、β折叠和无规则卷曲。溶剂可及性分为三种状态，隐藏状态为10％以下，暴露状态为40％以上，介质状态为10％～40％之间。有序/无序的预测是基于0.25的临界值。二级结构预测显示，HP16118P的α-螺旋占41％，β-折叠占7％，无规则卷曲占50％。三级结构分析显示HP16118P的C-score为-1.98(图5)。
实施例3、多肽融合蛋白的免疫刺激模拟分析
1、多肽融合蛋白的免疫模拟
宿主清除和杀灭结核分枝杆菌的过程中，特异性和非特异性免疫反应都发挥了重要作用。因此，本发明模拟分析了HP16118P诊断分子诱导的免疫反应。利用C-ImmSim服务器(https://150.146.2.1/C-IMMSIM/index.php)预测免疫模拟。该服务器可以评估模拟表位分子注射状态下B和T淋巴细胞(包括Th1和Th2淋巴细胞)的免疫应答。设置C-ImmSim服务器参数为随机种子＝12345，模拟体积＝10，模拟步骤＝1000，选择宿主等位基因HLA-A0101、A0201、B0702、B0801、DRB10101、DRB1501。最后，预测了HP16118P诱导的细胞免疫应答和细胞因子水平。
本发明发现HP16118P诊断分子可以激活NK细胞并使其数量维持在325-375cells/mm3之间(图6中A)。有意思的是，HP16118P诊断分子可以激活巨噬细胞和树突状细胞产生增殖和分化，可以诱导presenting-2型巨噬细胞(图6中B)和树突状细胞形成增殖高峰(图6中C)。与树突状细胞不同的是，HP16118P模拟免疫后第8天静息和活跃态巨噬细胞数目稳定在90cells/mm3(图6中B)。HP16118P可以诱导显著高水平的上皮细胞(图6中D)。与巨噬细胞和树突状细胞类似，HP16118P能够刺激B淋巴细胞分化和增殖，使得presenting-2在刺激后迅速出现峰值(520cells/mm3)，活动性B淋巴细胞数目在第5天(480cells/mm3)出现峰值(图6中E)。随后，诱导的活性B淋巴细胞产生高水平的IgG和IgM抗体(图6中F)。
除此之外，我们还分析了HP16118P对特异性免疫细胞的免疫作用。结果表明，HP16118P模拟免疫可以诱导记忆性辅助T淋巴细胞数目形成的峰值可高达5500cells/mm3(图7中A)。此外，我们还发现HP16118P模拟注射后能够刺激活性辅助T淋巴细胞数目于第10天达到峰值(图7中B)。与辅助T淋巴细胞不同，HP16118P刺激免疫系统形成记忆性细胞毒性T淋巴细胞的能力较弱(图7中C)，活跃态的细胞毒性T淋巴细胞在免疫后第15天时达到峰值(1000cells/mm3)；而静息态的细胞毒性T淋巴细胞呈现完全相反的变化趋势(图7中D)。令人兴奋的是，我们发现HP16118P可以诱导T淋巴细胞向Th1型淋巴细胞分化，介导强劲的Th1型免疫反应(图7中E)。此外，我们还观察到HP16118P可以诱导调节性T细胞在免疫后第二天迅速升高然后达到峰值(140cells/mm3)(图7中F)。最后，我们还分析了HP16118P诱导免疫细胞产生IFN-γ的能力，结果发现HP16118P免疫可以诱导细胞因子IFN-γ(400000ng/ml)和IL-2(100000ng/ml)形成峰值(图8)。
实施例4、多肽融合蛋白重组质粒构建及其体外表达
1、将实施例2中所述HBD-3、PADRE、16个HTL表位、11个CTL表位、8个B细胞表位、PSMα4以及6×His标签以EAAAK、GPGPG、AAY和KK等连接子相连接组成多肽融合蛋白HP16118P(氨基酸序列如SEQ ID No.1所示)，将如图4中A所示的各部分相对应的基因序列由EAAAK、GPGPG、AAY和KK等连接子相对应的基因序列前后连接成完整的基因，即为HP16118P基因(核苷酸序列如SEQ ID No.2所示)。在HP16118P基因(SEQ ID No.2)的两端增加BamHI和XhoI识别位点，得到DNA片段1(GGATCC+SEQ ID No.2+CTCGAG)，随后送上海生工进行目的基因的合成。
2、用限制性内切酶BamHI和XhoI双酶切步骤1中人工合成的DNA片段1，回收酶切产物。
3、用限制性内切酶BamHI和XhoI双酶切载体pET-28a(+)，回收载体骨架。
4、将步骤2所得的酶切产物与步骤3所得的载体骨架进行连接，得到重组质粒(即重组载体)，将该重组载体命名为pET-28a(+)-HP16118P(图9中A)。
5、重组载体结构描述如下：
重组载体pET-28a(+)-HP16118P是将pET-28a(+)载体的BamHI和XhoI识别位点间的片段(小片段)替换为核苷酸序列是序列表中SEQ ID No.2的DNA片段，保持pET-28a(+)载体的其他核苷酸序列不变，得到的重组表达载体。重组载体pET-28a(+)-HP16118P表达氨基酸序列如SEQ ID No.1所示的融合蛋白HP16118P。
6、将重组载体pET-28a(+)-HP16118P导入大肠杆菌BL21(DE3)，得到重组菌BL21/pET-28a(+)-HP16118P。重组菌的验证方法：将菌株接入LB固体培养基平板(含100ug/ml卡那霉素)，挑取单克隆并转接入LB液体培养基，37℃培养并提取质粒进行测序，如果提取的质粒为重组质粒pET-28a(+)-HP16118P，即为目的重组菌。
7、多肽融合蛋白的表达
将重组菌BL21/pET-28a(+)-HP16118P接入LB液体培养基(含15ug/ml卡那霉素)，37℃、220r/min培养过夜。次日按照1％(体积百分含量)的接种量转接入相同抗生素浓度的LB液体培养基中，在37℃、220r/min条件下培养至OD600值≈0.6时，加入IPTG诱导剂至终浓度为0.1mM后，在16℃、220r/min条件下继续进行诱导表达过夜，得到发酵液。
8、多肽融合蛋白的纯化
(1)取步骤7的发酵液100ml，5000rpm离心10min，收集菌体沉淀。
(2)用30ml可溶性蛋白裂解缓冲液重悬步骤(1)中得到的菌体，吹打混匀后冰浴条件下进行超声，超声条件为：工作4.5sec，间隔9sec，共超声60min，功率为125W。将超声裂解物以12,000×g离心20min，弃去上清，将10ml包涵体蛋白裂解缓冲液加入沉淀部分，并且充分吹打混匀，室温放置过夜。
(3)翌日，将步骤(2)中得到的过夜混合物与2ml Ni-NTA混合，室温200rpm振荡混匀4h，使得目的蛋白(多肽融合蛋白)与Ni-NTA充分结合，然后将混合物移入纯化柱内，用包涵体蛋白洗涤缓冲液洗涤3次，每次10ml(流速控制为3ml/min)。然后用包涵体蛋白洗脱缓冲液洗脱5次，每次500ul(流速控制为3ml/min)，合并收集的洗脱液并测蛋白浓度，得到目的蛋白溶液(多肽融合蛋白溶液)。
9、多肽融合蛋白的鉴定
将多肽融合蛋白溶液进行12％聚丙烯酰胺凝胶电泳，结果见图9中B。多肽融合蛋白溶液只显示一条约90.26kDa的条带，与预期相符合。
实施例5、体外实验验证HP16118P诊断分子诱导的细胞免疫反应
本实施例中的健康对照者(HC)、潜伏性结核感染者(LTBI)和活动性结核患者(ATB)来源于解放军总医院第八医学中心结核病医学部，样本采集均经解放军总医院第八医学中心伦理委员会批准，批准编号：309202204080808。
1、HP16118P诊断分子ELISPOT实验
采集健康对照者(HC，n＝23)、潜伏性结核感染者(LTBI，n＝24)和活动性结核患者(ATB，n＝19)的外周血各5ml，分离外周血单个核细胞(PBMCs)。将部分分离的PBMCs加入96孔ELISPOT培养板(2.5×105细胞/孔)，用50μl HP16118P(100μg/ml)刺激，50μl PBS作为阴性对照。将培养板在37℃的CO2培养箱中孵育。24h后，采用Human IFN-γELISpotPRO试剂盒(MABTECH公司产品，货号3420-2HPT-2)检测γ-干扰素阳性(IFN-γ+)T细胞斑点数。结果发现，在HC、LTBI感染者和ATB患者的PBMCs中，HP16118P诊断分子诱导的IFN-γ+T细胞数量高于PBS诱导的数量(图10)，表明HP16118P能够在三组人群中刺激IFN-γ+T细胞增殖，具有很好的免疫原性。
2、HP16118P诊断分子的高通量液相蛋白分析实验
将其余PBMCs添加到96孔细胞培养板(2.5×105细胞/孔)(Mabtech AB,NackaStrand，瑞典)。用50μl HP16118P(100μg/ml)刺激PBMCs，37℃CO2培养箱孵育48h。同时，用PBS刺激HC的PBMCs作为阴性对照。将PBMCs细胞培养液混合物转移到新的管中，500g离心10min，最后将上清液缓慢转移到另一管中，用高通量液相蛋白分析技术检测HP16118P诱导的35种炎症细胞因子(G-CSF、GM-CSF、HGF、IFN-α、IFN-γ、IL-1α、IL-1β、IL-10、IL-12p70、IL-13、IL-117F、IL-2、IL-21、IL-22、IL-23、IL-3、IL-31、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-9、IP-10、MCP-1、MCP-3、MIG、MIP-1α、MIP-1β、PD-1、SDF-1α、TIM-3、TIMP-1、TNF-α、VEGF-A和VEGF-R2)的水平。
为了评估HP16118P诊断分子在计算机模拟和体外诱导的免疫应答的一致性，我们对收集自HC、LTBI患者和ATB患者的PBMCs进行了细胞因子检测。首先，HP16118P诱导PBMCs细胞分泌35种细胞因子水平，结果显示(图11)，浓度大于10000pg/ml的细胞因子有TIMP-1；大于1000pg/ml有GM-CSF、IL-6、IL-8、MCP-1、MIP-1β和TNF-α；大于100pg/ml有IL-1α、IL-10、IL-23、TIM-3和VEGF-A。浓度小于10pg/ml的细胞因子有：IFN-α、IL-12p70、IL-17F、IL-31。这些数据说明，HP16118P具有较强的免疫原性，具有诱导免疫细胞产生各种细胞因子的能力。进一步分析HP16118P诱导的细胞因子在三组之间的差异，结果显示(图12)，HP16118P诱导的细胞因子IL-1α(P＝0.0020)、IL-1β(P＝0.0106)、IL-17F(P＝0.0076)、IL-2(P＝0.0004)、IL-5(P＝0.0009)、MIG(P＝0.0151)、HGF(P＝0.0065)、TNF-α(P＝0.0117)在LTBI组均显著低于HC组；HP16118P诱导的细胞因子IL-17F(P＝0.0171)和TIM-3(P＝0.0224)在ATB组均显著低于HC组；HP16118P诱导的细胞因子IL-5(P＝0.0372)在LTBI组显著低于ATB组。
实施例6、HP16118P诊断分子的诊断性能
基于实施例5中图12结果，进一步选择IL-5和IL-17F作为ATB、LTBI以及HC之间鉴别诊断的生物标志物。结果发现(表2)：(1)HP16118P诊断分子诱导的IL-5能够将LTBI人群从ATB(P＝0.0372,AUC＝0.8214,95％CI[0.5843to 1.000])和HC(P＝0.0026,AUC＝0.9643,95％CI[0.8770to 1.000])人群中区分出来，其鉴别诊断的敏感性和特异性分别为100％和71.43％(ATB vs.LTBI)，以及100％和85.71％(HC vs.LTBI)。(2)HP16118P诊断分子诱导的IL-17F能够将ATB人群从HC(P＝0.0088,AUC＝0.9184,95％CI[0.7716to1.000])人群中区分出来，其鉴别诊断的敏感性和特异性分别为71.43％和85.71％；(3)HP16118P诊断分子诱导的IL-17F能够将LTBI人群从HC(P＝0.0038,AUC＝0.9464,95％CI[0.8299to1.000])人群中区分出来，其鉴别诊断的敏感性和特异性分别为87.50％和85.71％。
表2、HP16118P诱导的IL-5和IL-17F细胞因子诊断ATB和LTBI的敏感性和特异性
Figure SMS_9
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。

Claims (10)

1.融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白包括串联多肽1、串联多肽2和串联多肽3，所述串联多肽1包括氨基酸序列是SEQ ID No.1的第75-89位、第95-111位、第117-133位、第139-151位、第157-170位、第176-193位、第199-213位、第219-233位、第239-256位、第262-276位、第282-299位、第305-320位、第326-339位、第345-360位、第366-381位和第387-401位所示的多肽；
所述串联多肽2包括氨基酸序列是SEQ ID No.1的第405-413位、第417-425位、第429-438位、第442-451位、第455-464位、第468-476位、第480-488位、第492-500位、第504-512位、第516-524位和第528-536位所示的多肽；
所述串联多肽3包括氨基酸序列是SEQ ID No.1的第539-591位、第594-618位、第621-658位、第661-690位、第693-714位、第717-749位、第752-779位和第782-844位所示的多肽。
2.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白从N端至C端依次为权利要求1中所述串联多肽1、所述串联多肽2和所述串联多肽3。
3.根据权利要求1或2所述的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白还包括佐剂肽和/或辅助肽，优选地，所述融合蛋白还包括氨基酸序列是SEQ ID No.1的第1-45位的辅助肽1、氨基酸序列是SEQ ID No.1的第51-69位的辅助肽2和/或氨基酸序列是SEQ ID No.1的第819-838位的佐剂肽。
4.根据权利要求1-3中任一所述的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白为下述任一种：
A1)氨基酸序列是SEQ ID No.1的第1-838位的蛋白质；
A2)将SEQ ID No.1的第1-838位所示的氨基酸序列经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与A1)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且具有相同功能的蛋白质；
A3)在A1)或A2)的N端和/或C端连接标签或信号肽得到的具有相同功能的融合蛋白质；
A4)氨基酸序列是SEQ ID No.1的第75-813位的蛋白质；
A5)将SEQ ID No.1的第75-813位所示的氨基酸序列经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与A1)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且具有相同功能的蛋白质；
A6)在A4)或A5)的N端和/或C端连接标签或信号肽得到的具有相同功能的融合蛋白质。
5.生物材料，其特征在于，所述生物材料为下述任一种：
D1)编码权利要求1-4中任一所述融合蛋白的核酸分子；
D2)含有D1)所述核酸分子的表达盒；
D3)含有D1)所述核酸分子的重组载体、或含有D2)所述表达盒的重组载体；
D4)含有D1所述核酸分子的重组微生物、或含有D2)所述表达盒的重组微生物、或含有D3)所述重组载体的重组微生物；
D5)含有D1)所述核酸分子的重组宿主细胞、或含有D2)所述表达盒的重组宿主细胞、或含有D3)所述重组载体的重组宿主细胞。
6.根据权利要求5所述的生物材料，其特征在于，D1)所述核酸分子为下述任一种：
B1)编码序列是SEQ ID No.2、SEQ ID No.2的第1-2514位或SEQ ID No.2的第223-2439位的DNA分子；
B2)核苷酸序列是SEQ ID No.2、SEQ ID No.2的第1-2514位或SEQ ID No.2的第223-2439位的DNA分子。
7.权利要求1-4中任一所述融合蛋白，或权利要求5或6所述生物材料的下述任一种应用：
C1)在制备用于鉴别和/或诊断结核分枝杆菌潜伏感染的产品中的应用；
C2)在制备鉴别区分潜伏性结核感染者和活动性结核病患者的产品中的应用；
C3)在制备鉴别区分潜伏性结核感染者和健康受试者的产品中的应用；
C4)在制备鉴别区分活动性结核病患者和健康受试者的产品中的应用；
C5)在结核分枝杆菌感染引起的疾病防控中的应用；
C6)在制备结核分枝杆菌潜伏感染鉴别诊断的诊断分子中的应用；
C7)在制备针对结核分枝杆菌的保护性抗原中的应用；
C8)在筛选和/或开发结核分枝杆菌抗体中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，特征在于，所述结核分枝杆菌感染引起的疾病为结核病。
9.用于结核分支杆菌潜伏感染鉴别和/或诊断的产品，其特征在于，所述产品包括权利要求1-4中任一所述的融合蛋白。
10.权利要求1-4中任一所述融合蛋白的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括使编码权利要求1-4中任一所述融合蛋白的核酸分子在微生物或宿主细胞中进行表达得到所述融合蛋白。
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