CN110423279B

CN110423279B - 结核分枝杆菌重组融合蛋白eecc及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN110423279B
Application number: CN201910538486.7A
Authority: CN
Inventors: 张鹏飞; 杨晰朦; 王化楠; 任永峰; 崔颖杰; 李福胜; 林兆新; 胡瞬; 张青乐; 王国治
Original assignee: Amplification Biotechnology Beijing Co ltd
Current assignee: Amplification Biotechnology Beijing Co ltd
Priority date: 2019-06-20
Filing date: 2019-06-20
Publication date: 2021-07-27
Anticipated expiration: 2039-06-20
Also published as: CN110423279A

Abstract

本发明涉及生物技术领域，具体涉及结核分枝杆菌重组融合蛋白EECC及其制备方法和应用。本发明提供的结核分枝杆菌重组融合蛋白EECC为EAST6‑EAST6‑CFP10‑CFP10，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示。重组融合蛋白EECC具有优异的抗原性，在进行结核病诊断时，在保证较高特异性的同时具有更高的灵敏度，可有效降低使用剂量，降低检测成本，有效区分诊断结核菌活菌感染、死菌致敏、BCG接种，可用于结核病诊断、结核病疫苗制备、抗原特异的细胞因子的检测，具有较好的推广应用价值。

Description

结核分枝杆菌重组融合蛋白EECC及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种利用基因工程技术制备的结核分枝杆菌重组融合蛋白EECC、编码该蛋白的核酸、包含该核酸的载体和宿主细胞，以及该融合蛋白的制备方法和应用。

背景技术

针对病原菌的结核病诊断方法包括抗酸染色镜检、菌种培养、基于PCR扩增的分子生物学诊断方法等；然而，针对病原菌的诊断方法不适用于菌阴结核病患者的诊断，而尽管我国结核病患者在缓慢降低，但菌阴结核病患者在升高(已到达80％)，这部分患者迫切需要建立免疫学诊断方法，以鉴别结核菌感染还是非结核分枝菌感染。针对结核感染人群需要进行管理，包括研制新疫苗预防和治疗，需要建立结核潜伏感染的诊断方法。免疫学诊断方法是基于免疫学原理诊断机体的免疫状态，分为免疫血清学诊断和免疫细胞学诊断。结核病血清学诊断价值受到质疑，WHO不推荐血清学诊断。免疫细胞学诊断方法有传统结核菌素试验(TST)和新建立的干扰素释放试验(IGRA)。TST试验是结核分枝杆菌纯蛋白衍生物进行皮内注射(孟都法)，72小时测量注射皮肤红肿或硬结反应横纵直径。IGRA是通过外周血或其分离的单核淋巴细胞在体外经结核分枝杆菌RD1区蛋白多肽刺激，检测分泌的IFN-γ。WHO在2018年结核病年报首次推荐TST或IGRA作为结核潜伏感染的诊断方法(WHO，TBreport，2018)。

IGRA分为ELISA-IGRA和ELISPOT-IGRA两种，所用体外刺激表位多肽是通过仪器合成，相对来说成本较高；ELISA-IGRA是外周血体外经RD1区抗原表位肽体外刺激培养，ELISA检测培养上清的IFN-γ含量；ELISPOT-IGRA是提取外周血的单核淋巴细胞体外经RD1区抗原表位肽体外刺激培养，酶联斑点法检测分泌IFN-γ的细胞数。ELISPOT-IGRA操作较复杂，成本高，需要生物安全柜、离心机、细胞计数仪、CO₂培养箱、斑点计数仪等仪器设备，还需要淋巴细胞分离液、细胞培养液、血清、离心管等试剂和耗材，实验操作需要6小时；ELISA-IGRA需要生物安全柜、离心机、培养箱、酶标仪，需要购买ELISA-IFN-γ试剂盒。ELISPOT-IGRA灵敏度高但不适合大规模筛查，ELISA-IGRA适合大规模筛查但部分数据在灰区，很难鉴定阳性还是阴性。由于IGRA的检测成本高、对设备和实验操作者要求较高，该方法不适合发展中国家进行基层推广。而皮肤试验只需注射和测量，从业人员经过培训均能很快掌握，适合随时和大规模筛查。

结核病的皮肤试验(皮试实验)，最早采用旧结核菌素(OT)皮试，OT皮试易产生副反应和非特异性反应。第二代皮试试剂为结核菌素纯蛋白衍生物(TB-PPD或BCG-PPD)，TB-PPD或BCG-PPD皮试与OT相比减少了副反应；TB-PPD或BCG-PPD是由结核菌或BCG培养8-10周，培养物经121℃灭菌30min，过滤的滤液经三氯醋酸、饱和硫酸铵沉淀，沉淀复溶后透析得到；除蛋白衍生物外，还包含结核菌或BCG代谢产物，如菌体多糖、核酸、脂类及培养基的一些成份。PPD抗原与几乎所有分枝杆菌具有共同抗原，因此，PPD皮试试验仍存在特异性低的问题，对于BCG免疫接种国家，PPD作为结核病流行病学调查时，无法区分结核菌感染还是BCG接种、或暴露的分枝杆菌感染引起。第三代皮试试剂为重组蛋白，BCG表达量低于结核菌的蛋白38KD用于结核病诊断，可以提高诊断的特异度(He XY,et al.,Scand J InfectDis,2008；用于结核病诊断的结核分枝杆菌蛋白，专利号：ZL200410044568.X)，但与BCG接种存在一定交叉。

结核分枝杆菌RD1区蛋白EAST6、CFP10和MPT64的编码基因在BCG菌株和大部分NTM的基因组中缺失，因此该区蛋白用于皮肤试验诊断可以排除BCG接种和分枝杆菌感染的影响。皮肤试验诊断有两种方式，一种是patch test，另一种孟都氏法。Patch test实际应用较少，主要是采用MPT64蛋白，关于采用MPB64的patch test法现有技术的两篇报道的结果差异较大，其中一篇中MPB64采用patch test法诊断敏感性98.1％、特异度100％(NakamuraRM,et al.,Int J Tubercul Lung Dis,1998)；而另一篇报道MPT64蛋白采用patch test法诊断敏感性27％、特异度74％(Pope V,et al.,Int J Tubercul Lung Dis,2018)。Patchtest方法制备工艺要求高，多种因素影响个体对抗原的吸收，因此，结果重复性差。孟都氏法采用皮内注射，方便简单，个体给药可以控制。因此，RD1区蛋白用于皮肤诊断一般采用皮内注射。ESAT6抗原(11KD)皮试诊断特异度高(专利ZL200410008653.0)，但存在敏感度需要提高的问题。CFP-10蛋白与ESAT6蛋白体外刺激外周血单核淋巴细胞分泌IFN-γ存在一定的互补性，两个多肽可联合用于结核病干扰素释放试验诊断结核病。因此，采用ESAT6与CFP10融合蛋白制备皮试诊断试剂是提高皮试诊断敏感度的有效途径。中国专利申请CN201510617780.9利用融合蛋白ESAT6-CFP10(简称EC)进行皮试试验，临床试验敏感性高。然而，目前在进行临床诊断时，皮肤试验诊断结核病使用的抗原试剂的用量较高，导致诊断成本增加。因此，抗原皮试诊断的灵敏度仍有待提高，开发具有较高免疫原性的抗原组分用于结核病的皮肤试验诊断，对于降低皮内注射抗原成分的剂量具有重要意义。

发明内容

为了解决现有技术中存在的技术问题，本发明的目的是提供一种结核分枝杆菌重组融合蛋白EECC，该蛋白具有较高的抗原免疫原性，采用低剂量的该融合蛋白即能够实现有效的结核病诊断和结核潜伏感染筛查的免疫学诊断(包括皮肤试验、细胞因子释放、血清学诊断)，并可用于研制结核病疫苗。

首先，本发明提供一种结核分枝杆菌重组融合蛋白EECC，其包括顺次连接的2个EAST6蛋白和2个CFP10蛋白，所述顺次连接的顺序如下：EAST6-EAST6-CFP10-CFP10。

作为优选，本发明提供的结核分枝杆菌重组融合蛋白EECC的氨基酸序列如SEQ IDNO.1或SEQ ID NO.2所示，或者为如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列经取代、缺失、或插入一个或多个氨基酸后所得的具有结核杆菌抗原免疫原活性的融合蛋白的氨基酸序列。

EAST6和CFP10形成的融合蛋白具有更好的抗原性，本发明发现，适当提高EAST6和CFP10融合蛋白中EAST6蛋白和CFP10蛋白的重复次数，能够更有效促进EAST6蛋白和CFP10蛋白在抗原性方面相互补充，增加抗原表位数量，进而显著提高融合蛋白的抗原性，有效降低融合蛋白作为免疫学诊断的检测抗原和疫苗研制的抗原的使用剂量。然而，本发明意外发现，与本领域技术人员预期不同的是，对于EAST6和CFP10融合蛋白中单体的重复次数并不是越高越好，单体重复次数的提高可能对融合蛋白的检测特异性产生不利影响；而且融合蛋白单体的连接顺序对于其抗原性影响较大，不合适的单体重复次数和连接方式无法同时保证较高的灵敏度和特异性。本发明通过对融合蛋白中EAST6和CFP10的重复次数和连接顺序进行大量的分子结构分析和抗原性、检测灵敏度的筛选，确定EAST6和CFP10各2个单体以EAST6-EAST6-CFP10-CFP10的连接顺序为最佳的融合蛋白组成结构。上述结构尤其以如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示的连接方式和序列能够表现更优的抗原性、能够同时保证较高的检测灵敏度和特异性。

本发明进一步提供编码所述结核分枝杆菌重组融合蛋白EECC的核酸。

根据上述结核分枝杆菌重组融合蛋白EECC的氨基酸序列，本领域技术人员可以根据表达宿主的密码子偏好性设计能够编码上述结核分枝杆菌重组融合蛋白EECC的不同的核苷酸序列，所有能够编码本发明提供的结核分枝杆菌重组融合蛋白EECC的核酸均在本发明的保护范围内。

作为优选，所述编码所述结核分枝杆菌重组融合蛋白EECC的核酸的核苷酸序列为如下任一种：

(1)如SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列或其互补序列；

(2)如SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列经一个或多个核苷酸的替换、缺失或插入得到的编码相同功能蛋白的核苷酸序列；

(3)与如SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4所示的核苷酸具有至少80％同源性的核苷酸序列；优选地，所述同源性为至少90％，更优选为95％。

本发明进一步提供含有所述编码结核分枝杆菌重组融合蛋白EECC的核酸的生物材料。

所述生物材料包括表达盒、载体、转座子、宿主细胞、工程菌或转基因细胞系。

本发明进一步提供所述结核分枝杆菌重组融合蛋白EECC或所述编码结核分枝杆菌重组融合蛋白EECC的核酸或含有所述核酸的生物材料的如下任一种应用：

(1)在制备结核分枝杆菌融合蛋白中的应用；

(2)在制备用于结核病免疫学诊断、结核病辅助诊断或结核菌潜伏感染筛查的试剂或试剂盒中的应用；

(3)在制备用于预防或治疗结核病的疫苗中的应用。

优选地，所述免疫学诊断包括皮肤试验、细胞因子释放试验和或血清学诊断。

更优选地，所述结细胞因子释放试验中的细胞因子为IFN-γ。

更优选地，所述血清学诊断针对血清中的抗体IgG或IgM。

本发明进一步提供一种用于诊断结核分枝杆菌感染的试剂或试剂盒，其包含所述结核分枝杆菌重组融合蛋白EECC。

为便于诊断，上述试剂或试剂盒还可包含诊断所需的其它试剂，包括但不限于TWEEN80、TWEEN20、苯酚、PBS、RPMI1640、IFN-γ单抗、胎牛血清等。

本发明还提供所述结核分枝杆菌重组融合蛋白EECC的制备方法，包括：将编码所述结核分枝杆菌重组融合蛋白EECC的基因导入宿主细胞中进行表达。

优选地，所述宿主细胞为原核细胞；更优选为大肠杆菌BL21(DE3)。

具体地，所述结核分枝杆菌重组融合蛋白EECC的制备方法包括如下步骤：

(1)构建携带编码所述结核分枝杆菌重组融合蛋白EECC的基因的表达载体；

(2)将所述表达载体导入所述宿主细胞中，经筛选获得携带所述表达载体的阳性宿主细胞；

(3)培养所述阳性宿主细胞，表达所述结核分枝杆菌重组融合蛋白EECC；

(4)结核分枝杆菌重组融合蛋白EECC的提取和纯化。

上述步骤(1)中，所述表达载体可为本领域常用的表达载体，优选为pET28系列载体。

上述步骤(2)中，所述宿主细胞可为本领域常用的蛋白表达宿主细胞。当采用pET28系列载体时，优选宿主细胞为大肠杆菌，更优选大肠杆菌BL21(DE3)。

上述步骤(3)中，表达所述结核分枝杆菌重组融合蛋白EECC可通过常规方式表达，如诱导表达。

上述步骤(4)中，所述提取和纯化可采用常规方法。优选地，所述提取和纯化包括：破碎菌体，分离目标蛋白，经离子层析、分子筛层析纯化。

作为本发明的一种实施方式，所述结核分枝杆菌重组融合蛋白EECC的制备包括如下步骤：

(1)将如SEQ ID NO.4所示的结核分枝杆菌重组融合蛋白EECC编码基因通过NcoI和HindIII酶切位点克隆到大肠杆菌表达质粒pET28a，构建重组质粒pET28a-EECC；

(2)将重组质粒pET28a-EECC转化感受态大肠杆菌BL21(DE3)构建工程菌株pET28a-EECC/BL21(DE3)；

(3)工程菌株在IPTG诱导下表达目的蛋白EECC；

(4)经过破菌、离子层析、分子筛层析获得高纯度的EECC蛋白；

(5)将EECC蛋白溶于PBS缓冲液或Tris-HCl缓冲液，于-80℃保存，或冻干后于-20℃保存。

本发明的有益效果在于：本发明提供的结核分枝杆菌重组融合蛋白EECC(EAST6-EAST6-CFP10-CFP10)具有优异的抗原性，利用重组融合蛋白EECC进行结核病皮试试验诊断时，在保证较高特异性的同时具有显著增强的免疫原性，可有效降低检测下限和用于诊断的使用剂量以及用于制备疫苗的使用剂量，降低成本，且可有效区分结核菌活菌感染、死菌致敏、BCG接种。本发明提供的结核分枝杆菌重组融合蛋白EECC可用于结核病免疫性诊断(包括皮试试验等)、结核病疫苗(包括结核亚单位疫苗等)制备、抗原特异的细胞因子(包括IFN-γ等)的检测，具有较好的推广应用价值。

附图说明

图1为本发明实施例1中重组质粒pET28a-EECC的酶切图谱，其中，泳道1：DL10000marker；泳道2：原代菌种(筛选获得的pET28a-EECC阳性转化子)提取质粒经HindⅢ单酶切，箭头所指代表单酶切获得的目的条带；泳道3：工作代菌种(用于EECC诱导表达的pET28a-EECC/BL21(DE3)工程菌)提取质粒经HindⅢ单酶切；泳道4：原代菌种提取质粒经HindⅢ、NcoⅠ双酶切；泳道5：工作代菌种提取质粒经HindⅢ、NcoⅠ双酶切，箭头所指分别代表双酶切得到的质粒片段和EECC片段；泳道6：DL2000marker。

图2为本发明实施例1中EECC蛋白在大肠杆菌中以可溶形式表达，泳道1：蛋白marker，泳道2和4：破碎上清，泳道3：破碎沉淀。

图3为本发明实施例1中全菌体蛋白免疫印迹，其中，泳道1为未诱导菌体，泳道2为诱导菌体，泳道3为纯化EECC样品。

图4为本发明实施例2中纯化蛋白EECC的SDS-PAGE图谱，其中，泳道1：蛋白marker，泳道2：纯化蛋白EECC。

图5为本发明实施例2中纯化蛋白EECC的HPLC检测结果。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1结核分枝杆菌重组融合蛋白EECC的制备

根据公布的结核杆菌H37Rv的基因组序列(http://genolist.pasteur.fr/Tubercu List/)，获得ESAT6蛋白(简称E蛋白)的氨基酸(如SEQ ID NO.5所示)和编码基因的碱基序列(如SEQ ID NO.6所示)；以及CFP10蛋白(简称C蛋白)的氨基酸序列(如SEQ IDNO.7所示)和编码基因碱基序列(如SEQ ID NO.8示)。将ESAT6蛋白和CFP10蛋白以ESAT6-ESAT6-CFP10-CFP10的方式串联，获得EECC蛋白的氨基酸序列(如SEQ ID NO.1所示)和编码基因碱基序列(如SEQ ID NO.3所示)。将如SEQ ID NO.3所示的序列委托上海生物工程公司进行密码子优化，并在经密码子优化获得的序列的5’端添加了NcoI酶切位点(CCATGG)、为了防止移码还在酶切位点的3’端添加碱基GC，即在经密码子优化的序列的5’端添加序列CCATGGGC(如SEQ ID NO.9)；在经密码子优化的序列的3’末端添加含终止密码TAA和HindIII酶切位点的序列AAGCTT(SEQ ID NO.10)，经上述修饰后EECC蛋白编码基因优化的碱基序列委托上海捷瑞全基因合成，该序列编码的蛋白在N端额外插入了1个甘氨酸(缩写G)，即得到的EECC融合蛋白的序列如SEQ ID NO.2所示，其编码序列如SEQ ID NO.4所示。将全基因合成的上述序列克隆到表达载体pET28a，筛选酶切和测序验证正确的携带如SEQ IDNO.2所示EECC融合蛋白的重组质粒pET28a-EECC，酶切鉴定结果如图1所示。

将验证正确的重组质粒pET28a-EECC转化感受态宿主菌大肠杆菌BL21(DE3)，铺卡那抗性LB琼脂平板，37℃培养过夜，挑单菌落进行诱导表达，筛选获得表达目的蛋白EECC且重组质粒pET28a-EECC酶切和测序正确的阳性菌株，命名为pET28a-EECC/BL21(DE3)工程菌。pET28a-EECC/BL21(DE3)工程菌在IPTG诱导下表达目的蛋白EECC，目的蛋白EECC以可溶形式表达(图2)，工程菌表达的EECC蛋白与ESAT6单克隆抗体杂交呈阳性反应，且pET28a-EECC/BL21(DE3)工程菌经多次传代(15代)均能保持EECC蛋白的稳定大量表达(图3)。

实施例2 EECC蛋白提取纯化和鉴定

培养pET28a-EECC/BL21(DE3)工程菌并进行EECC蛋白的诱导表达，EECC蛋白的提取和纯化方法如下：

1、菌体破碎

将高压匀浆机逐步加压至700±50bar，待压力达到要求时，将出液管放入空烧杯，即为第一次破碎液。重复操作破碎三次，收取菌体破碎液。

2、稀释过滤

将离心的上清使用菌体破碎缓冲液稀释2-3倍体积，控制料液pH在7.1-7.5之间。使用0.45μm的囊氏滤器进行过滤。收集过滤液。

3、阴离子交换层析(Capto Q)

洗脱样品以300mL/min流速上样，以洗脱液，流速300mL/min洗脱。在280nm紫外吸收大于100mAU开始收集洗脱峰，再洗脱峰低于100mAU时停止收集。

4、盐析

按照公式计算向离心上清中补加饱和硫酸铵溶液的体积，溶解即成35％硫酸铵饱和度。2-8℃放置1小时，离心收取沉淀。记录沉淀质量。

按照10：1(v/w)比例加入菌体破碎液重悬沉淀，充分吹打溶解。溶解液再次离心，收集上清。离心条件：12000rpm，1小时，4℃。记录离心上清体积。

5、脱盐换液

用阳离子交换层析平衡液不少于10CV平衡G-25，将G-25洗脱样品以300mL/min流速上样，上样后以流速300mL/min洗脱。收集洗脱峰。

6、阳离子交换层析

将G-25洗脱样品以100mL/min流速上样，上样后以阳离子交换层析洗脱液洗脱，流速100mL/min。在280nm紫外吸收大于200mAU开始收集洗脱峰，在洗脱峰低于200mAU时停止收集。

7、分子筛层析

分子筛层析液平衡分子筛不少于2CV，以10mL/min流速上样阳离子交换洗脱样品。上样后以流速15mL/min洗脱不少于1.5CV。收集目的蛋白洗脱峰。

纯化蛋白的鉴定：分子筛层析纯化蛋白的SDS-PAGE电泳结果如图4所示，阳离子交换层析纯化蛋白经HPLC检测表明纯度满足要求(如图5所示)，证明通过上述纯化工艺获得了高纯度的EECC蛋白。

实施例3结核菌活菌致敏豚鼠的皮试试验

健康未做过任何试验的SPF级白色豚鼠，体重300g-500g。取出冻存的结核分枝杆菌1支，室温自然溶解，用生理盐水稀释10倍；每只豚鼠后腿腹股沟皮下注射0.5ml稀释菌液，豚鼠致敏5-6周后皮试。将豚鼠脊柱双侧去毛，于皮内注射0.2ml EECC各稀释浓度样品以及TB-PPD和EC标准品。双盲法于24和48小时分别测量注射部位红肿和/或硬结的纵径与横径(mm)，纵径与横径均值作为作为该点注射样品的皮试反应直径。

结果：结核菌活菌致敏豚鼠皮试反应结果见表1。统计分析，24小时，EECC(10μg/ml)皮试反应平均直径大于TB-PPD(P＝0.017)，其他两两比较无统计学差异(P>0.05)。EECC皮试反应平均直径与TB-PPD、EC比值见表2，EECC(10μg/ml)皮试反应平均直径与TB-PPD皮试反应直径>1.2；EECC(10μg/ml)和EECC(5μg/ml)皮试反应平均直径与EC皮试反应平均直径的比值及EECC(5μg/ml)皮试反应平均直径与TB-PPD皮试反应平均直径的比值均为1.0±0.2；因此，EECC(5μg/ml)效价符合TB-PPD、10μg/ml EC效价要求(中国药典三部，2015)。

表1结核杆菌活菌感染豚鼠皮试结果

表2 EECC皮试反应与对照TB-PPD、EC皮试反应比值

实施例4结核菌死菌致敏的豚鼠皮试试验

健康未做过任何试验的SPF级白色豚鼠，体重300g-500g。将浓度为200mg/ml的结核分枝杆灭活菌液与等体积的佛氏不完全佐剂经医用三通管乳化而成，豚鼠两只后腿腹股沟皮下各注射0.1ml。豚鼠致敏5-6周后皮试，将豚鼠脊柱双侧去毛，于皮内注射0.2ml EEC各稀释浓度样品以及TB-PPD、EC标准品；双盲法于皮试后24和48小时测量注射部位红肿和/或硬结的纵径与横径(mm)，纵径与横径均值作为该点注射样品的皮试反应直径。

结果：TB-PPD于结核分枝杆菌死菌致敏豚鼠皮试反应呈阳性，EECC和EC于结核分枝杆菌死菌致敏豚鼠皮试反应呈阴性(表3)。

表3结核杆菌死菌致敏豚鼠效价实验反应结果

注：/表示阴性反应

实施例5BCG致敏豚鼠的皮试试验

健康未做过任何试验的白色SPF级豚鼠，体重300g-500g。用灭菌生理盐水将BCG培养菌从培养基洗下后6000r/min离心30min，称重，用生理盐水稀释成50mg/mL的菌液。选取TB-PPD标准品(每只豚鼠注射10IU/0.2ml)皮试阴性的豚鼠，分别于豚鼠腹股沟皮下注射0.2ml 50mg/ml BCG菌液。豚鼠致敏5-6周后皮试，将豚鼠脊柱双侧去毛，于皮内注射0.2mlEECC各稀释浓度样品以及TB-PPD、EC标准品；双盲法于皮试后24和48小时测量注射部位红肿和/或硬结的纵径与横径(mm)，纵径与横径均值作为该点注射样品的皮试反应直径。

结果：TB-PPD于BCG致敏豚鼠皮试反应呈阳性，EECC和EC于BCG致敏豚鼠皮试反应呈阴性(表4)。

表4 BCG致敏豚鼠皮试反应结果

注：/表示阴性反应

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 扩增生物科技(北京)有限公司

<120> 结核分枝杆菌重组融合蛋白EECC及其制备方法和应用

<130> KHP191112048.7

<160> 10

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 390

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Met Thr Glu Gln Gln Trp Asn Phe Ala Gly Ile Glu Ala Ala Ala Ser

1 5 10 15

Ala Ile Gln Gly Asn Val Thr Ser Ile His Ser Leu Leu Asp Glu Gly

20 25 30

Lys Gln Ser Leu Thr Lys Leu Ala Ala Ala Trp Gly Gly Ser Gly Ser

35 40 45

Glu Ala Tyr Gln Gly Val Gln Gln Lys Trp Asp Ala Thr Ala Thr Glu

50 55 60

Leu Asn Asn Ala Leu Gln Asn Leu Ala Arg Thr Ile Ser Glu Ala Gly

65 70 75 80

Gln Ala Met Ala Ser Thr Glu Gly Asn Val Thr Gly Met Phe Ala Met

85 90 95

Thr Glu Gln Gln Trp Asn Phe Ala Gly Ile Glu Ala Ala Ala Ser Ala

100 105 110

Ile Gln Gly Asn Val Thr Ser Ile His Ser Leu Leu Asp Glu Gly Lys

115 120 125

Gln Ser Leu Thr Lys Leu Ala Ala Ala Trp Gly Gly Ser Gly Ser Glu

130 135 140

Ala Tyr Gln Gly Val Gln Gln Lys Trp Asp Ala Thr Ala Thr Glu Leu

145 150 155 160

Asn Asn Ala Leu Gln Asn Leu Ala Arg Thr Ile Ser Glu Ala Gly Gln

165 170 175

Ala Met Ala Ser Thr Glu Gly Asn Val Thr Gly Met Phe Ala Met Ala

180 185 190

Glu Met Lys Thr Asp Ala Ala Thr Leu Ala Gln Glu Ala Gly Asn Phe

195 200 205

Glu Arg Ile Ser Gly Asp Leu Lys Thr Gln Ile Asp Gln Val Glu Ser

210 215 220

Thr Ala Gly Ser Leu Gln Gly Gln Trp Arg Gly Ala Ala Gly Thr Ala

225 230 235 240

Ala Gln Ala Ala Val Val Arg Phe Gln Glu Ala Ala Asn Lys Gln Lys

245 250 255

Gln Glu Leu Asp Glu Ile Ser Thr Asn Ile Arg Gln Ala Gly Val Gln

260 265 270

Tyr Ser Arg Ala Asp Glu Glu Gln Gln Gln Ala Leu Ser Ser Gln Met

275 280 285

Gly Phe Met Ala Glu Met Lys Thr Asp Ala Ala Thr Leu Ala Gln Glu

290 295 300

Ala Gly Asn Phe Glu Arg Ile Ser Gly Asp Leu Lys Thr Gln Ile Asp

305 310 315 320

Gln Val Glu Ser Thr Ala Gly Ser Leu Gln Gly Gln Trp Arg Gly Ala

325 330 335

Ala Gly Thr Ala Ala Gln Ala Ala Val Val Arg Phe Gln Glu Ala Ala

340 345 350

Asn Lys Gln Lys Gln Glu Leu Asp Glu Ile Ser Thr Asn Ile Arg Gln

355 360 365

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370 375 380

Ser Ser Gln Met Gly Phe

385 390

<210> 2

<211> 391

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Met Gly Thr Glu Gln Gln Trp Asn Phe Ala Gly Ile Glu Ala Ala Ala

1 5 10 15

Ser Ala Ile Gln Gly Asn Val Thr Ser Ile His Ser Leu Leu Asp Glu

20 25 30

Gly Lys Gln Ser Leu Thr Lys Leu Ala Ala Ala Trp Gly Gly Ser Gly

35 40 45

Ser Glu Ala Tyr Gln Gly Val Gln Gln Lys Trp Asp Ala Thr Ala Thr

50 55 60

Glu Leu Asn Asn Ala Leu Gln Asn Leu Ala Arg Thr Ile Ser Glu Ala

65 70 75 80

Gly Gln Ala Met Ala Ser Thr Glu Gly Asn Val Thr Gly Met Phe Ala

85 90 95

Met Thr Glu Gln Gln Trp Asn Phe Ala Gly Ile Glu Ala Ala Ala Ser

100 105 110

Ala Ile Gln Gly Asn Val Thr Ser Ile His Ser Leu Leu Asp Glu Gly

115 120 125

Lys Gln Ser Leu Thr Lys Leu Ala Ala Ala Trp Gly Gly Ser Gly Ser

130 135 140

Glu Ala Tyr Gln Gly Val Gln Gln Lys Trp Asp Ala Thr Ala Thr Glu

145 150 155 160

Leu Asn Asn Ala Leu Gln Asn Leu Ala Arg Thr Ile Ser Glu Ala Gly

165 170 175

Gln Ala Met Ala Ser Thr Glu Gly Asn Val Thr Gly Met Phe Ala Met

180 185 190

Ala Glu Met Lys Thr Asp Ala Ala Thr Leu Ala Gln Glu Ala Gly Asn

195 200 205

Phe Glu Arg Ile Ser Gly Asp Leu Lys Thr Gln Ile Asp Gln Val Glu

210 215 220

Ser Thr Ala Gly Ser Leu Gln Gly Gln Trp Arg Gly Ala Ala Gly Thr

225 230 235 240

Ala Ala Gln Ala Ala Val Val Arg Phe Gln Glu Ala Ala Asn Lys Gln

245 250 255

Lys Gln Glu Leu Asp Glu Ile Ser Thr Asn Ile Arg Gln Ala Gly Val

260 265 270

Gln Tyr Ser Arg Ala Asp Glu Glu Gln Gln Gln Ala Leu Ser Ser Gln

275 280 285

Met Gly Phe Met Ala Glu Met Lys Thr Asp Ala Ala Thr Leu Ala Gln

290 295 300

Glu Ala Gly Asn Phe Glu Arg Ile Ser Gly Asp Leu Lys Thr Gln Ile

305 310 315 320

Asp Gln Val Glu Ser Thr Ala Gly Ser Leu Gln Gly Gln Trp Arg Gly

325 330 335

Ala Ala Gly Thr Ala Ala Gln Ala Ala Val Val Arg Phe Gln Glu Ala

340 345 350

Ala Asn Lys Gln Lys Gln Glu Leu Asp Glu Ile Ser Thr Asn Ile Arg

355 360 365

Gln Ala Gly Val Gln Tyr Ser Arg Ala Asp Glu Glu Gln Gln Gln Ala

370 375 380

Leu Ser Ser Gln Met Gly Phe

385 390

<210> 3

<211> 1170

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atgacagagc agcagtggaa tttcgcgggt atcgaggccg cggcaagcgc aatccaggga 60

aatgtcacgt ccattcattc cctccttgac gaggggaagc agtccctgac caagctcgca 120

gcggcctggg gcggtagcgg ttcggaggcg taccagggtg tccagcaaaa atgggacgcc 180

acggctaccg agctgaacaa cgcgctgcag aacctggcgc ggacgatcag cgaagccggt 240

caggcaatgg cttcgaccga aggcaacgtc actgggatgt tcgcaatgac agagcagcag 300

tggaatttcg cgggtatcga ggccgcggca agcgcaatcc agggaaatgt cacgtccatt 360

cattccctcc ttgacgaggg gaagcagtcc ctgaccaagc tcgcagcggc ctggggcggt 420

agcggttcgg aggcgtacca gggtgtccag caaaaatggg acgccacggc taccgagctg 480

aacaacgcgc tgcagaacct ggcgcggacg atcagcgaag ccggtcaggc aatggcttcg 540

accgaaggca acgtcactgg gatgttcgca atggcagaga tgaagaccga tgccgctacc 600

ctcgcgcagg aggcaggtaa tttcgagcgg atctccggcg acctgaaaac ccagatcgac 660

caggtggagt cgacggcagg ttcgttgcag ggccagtggc gcggcgcggc ggggacggcc 720

gcccaggccg cggtggtgcg cttccaagaa gcagccaata agcagaagca ggaactcgac 780

gagatctcga cgaatattcg tcaggccggc gtccaatact cgagggccga cgaggagcag 840

cagcaggcgc tgtcctcgca aatgggcttc atggcagaga tgaagaccga tgccgctacc 900

ctcgcgcagg aggcaggtaa tttcgagcgg atctccggcg acctgaaaac ccagatcgac 960

caggtggagt cgacggcagg ttcgttgcag ggccagtggc gcggcgcggc ggggacggcc 1020

gcccaggccg cggtggtgcg cttccaagaa gcagccaata agcagaagca ggaactcgac 1080

gagatctcga cgaatattcg tcaggccggc gtccaatact cgagggccga cgaggagcag 1140

cagcaggcgc tgtcctcgca aatgggcttc 1170

<210> 4

<211> 1173

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

atgggcaccg aacagcagtg gaattttgcc ggcatcgaag ccgcggcgag cgctatccag 60

ggcaatgtga cgagtattca tagtctgtta gatgaaggta aacagtcact gaccaaatta 120

gctgcggctt ggggtggtag tggtagcgag gcgtatcagg gcgttcagca gaaatgggat 180

gcaacggcta ccgaattaaa taatgcatta cagaatttag ctcgtacgat ctctgaagcc 240

ggtcaggcta tggcctcaac cgaaggtaat gtgaccggta tgtttgctat gacggaacag 300

cagtggaatt ttgctggcat cgaagccgcc gcgagtgcga tccagggcaa tgtgacaagt 360

atccatagtt tattagatga aggcaaacag agtctgacca aattagctgc ggcttggggt 420

ggttctggta gcgaagccta tcagggtgtg cagcagaaat gggatgcgac cgccacggaa 480

ctgaataatg ccttacagaa tctggctcgt acgatttctg aagccggtca ggctatggcc 540

tcaacggaag gtaatgttac gggtatgttt gcaatggccg aaatgaaaac ggatgcggcc 600

accttagcgc aggaagcggg caattttgaa cgcatctctg gtgatttaaa aacccagatc 660

gatcaggttg aatctaccgc gggttcttta cagggtcagt ggcgtggcgc agcgggcacc 720

gctgcccagg ccgctgttgt tcgctttcag gaagctgcta ataaacagaa acaggaactg 780

gatgaaatct caaccaatat ccgtcaggcg ggtgtgcagt atagtcgtgc tgatgaagaa 840

cagcagcagg cactgtctag ccagatgggt tttatggccg aaatgaaaac cgatgctgcg 900

acgttagccc aggaagctgg taattttgaa cgcatctctg gtgatttaaa aacccagatt 960

gatcaggttg aaagtacggc gggctcatta cagggtcagt ggcgtggtgc cgccggtacc 1020

gctgcccagg ctgccgttgt tcgctttcag gaagctgcta ataaacagaa acaggaactg 1080

gatgaaatct ctaccaatat tcgccaggcc ggtgtgcagt attcacgcgc ggatgaagaa 1140

cagcagcagg cgttatcaag tcagatgggc ttt 1173

<210> 5

<211> 95

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

Met Thr Glu Gln Gln Trp Asn Phe Ala Gly Ile Glu Ala Ala Ala Ser

1 5 10 15

Ala Ile Gln Gly Asn Val Thr Ser Ile His Ser Leu Leu Asp Glu Gly

20 25 30

Lys Gln Ser Leu Thr Lys Leu Ala Ala Ala Trp Gly Gly Ser Gly Ser

35 40 45

Glu Ala Tyr Gln Gly Val Gln Gln Lys Trp Asp Ala Thr Ala Thr Glu

50 55 60

Leu Asn Asn Ala Leu Gln Asn Leu Ala Arg Thr Ile Ser Glu Ala Gly

65 70 75 80

Gln Ala Met Ala Ser Thr Glu Gly Asn Val Thr Gly Met Phe Ala

85 90 95

<210> 6

<211> 285

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

atgacagagc agcagtggaa tttcgcgggt atcgaggccg cggcaagcgc aatccaggga 60

aatgtcacgt ccattcattc cctccttgac gaggggaagc agtccctgac caagctcgca 120

gcggcctggg gcggtagcgg ttcggaggcg taccagggtg tccagcaaaa atgggacgcc 180

acggctaccg agctgaacaa cgcgctgcag aacctggcgc ggacgatcag cgaagccggt 240

caggcaatgg cttcgaccga aggcaacgtc actgggatgt tcgca 285

<210> 7

<211> 100

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

Met Ala Glu Met Lys Thr Asp Ala Ala Thr Leu Ala Gln Glu Ala Gly

1 5 10 15

Asn Phe Glu Arg Ile Ser Gly Asp Leu Lys Thr Gln Ile Asp Gln Val

20 25 30

Glu Ser Thr Ala Gly Ser Leu Gln Gly Gln Trp Arg Gly Ala Ala Gly

35 40 45

Thr Ala Ala Gln Ala Ala Val Val Arg Phe Gln Glu Ala Ala Asn Lys

50 55 60

Gln Lys Gln Glu Leu Asp Glu Ile Ser Thr Asn Ile Arg Gln Ala Gly

65 70 75 80

Val Gln Tyr Ser Arg Ala Asp Glu Glu Gln Gln Gln Ala Leu Ser Ser

85 90 95

Gln Met Gly Phe

100

<210> 8

<211> 300

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

atggcagaga tgaagaccga tgccgctacc ctcgcgcagg aggcaggtaa tttcgagcgg 60

atctccggcg acctgaaaac ccagatcgac caggtggagt cgacggcagg ttcgttgcag 120

ggccagtggc gcggcgcggc ggggacggcc gcccaggccg cggtggtgcg cttccaagaa 180

gcagccaata agcagaagca ggaactcgac gagatctcga cgaatattcg tcaggccggc 240

gtccaatact cgagggccga cgaggagcag cagcaggcgc tgtcctcgca aatgggcttc 300

<210> 9

<211> 8

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

ccatgggc 8

<210> 10

<211> 9

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

taaaagctt 9

Claims

1.一种结核分枝杆菌重组融合蛋白EECC，其特征在于，其包括顺次连接的2个EAST6蛋白和2个CFP10蛋白，所述顺次连接的顺序如下：EAST6-EAST6-CFP10-CFP10；

所述融合蛋白EECC的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

2.编码权利要求1所述重组融合蛋白EECC的核酸。

3.根据权利要求2所述的核酸，其特征在于，其核苷酸序列为如下任一种：

（1）如SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列或其互补序列；

（2）如SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列经一个或多个核苷酸的替换得到的编码相同功能蛋白的核苷酸序列；

（3）与如SEQ ID NO.4所示的核苷酸具有至少80%同源性的核苷酸序列。

4.含有权利要求2或3所述核酸的生物材料，其特征在于，所述生物材料包括表达盒、载体、转座子、宿主细胞、工程菌或转基因细胞系。

5.权利要求1所述的结核分枝杆菌重组融合蛋白EECC在制备用于结核病免疫学诊断、结核病辅助诊断或结核菌潜伏感染筛查的试剂或试剂盒中的应用。

6.权利要求2或3所述的核酸或权利要求4所述的生物材料的如下任一种应用：

（1）在制备结核分枝杆菌融合蛋白中的应用；

（2）在制备用于结核病免疫学诊断、结核病辅助诊断或结核菌潜伏感染筛查的试剂或试剂盒中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述免疫学诊断包括皮肤试验、细胞因子释放试验或血清学诊断。

8.一种用于诊断结核分枝杆菌感染的试剂或试剂盒，其特征在于，包含权利要求1所述的结核分枝杆菌重组融合蛋白EECC。

9.权利要求1所述结核分枝杆菌重组融合蛋白EECC的制备方法，其特征在于，包括：将编码所述结核分枝杆菌重组融合蛋白EECC的核酸导入宿主细胞中进行表达。

10.根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于，所述宿主细胞为原核细胞。

11.根据权利要求10所述的制备方法，其特征在于，所述原核细胞为大肠杆菌BL21(DE3)。

12.根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）构建携带编码所述结核分枝杆菌重组融合蛋白EECC的核酸的表达载体；

（2）将所述表达载体导入所述宿主细胞中，经筛选获得携带所述表达载体的阳性宿主细胞；

（3）培养所述阳性宿主细胞，表达所述结核分枝杆菌重组融合蛋白EECC；

（4）结核分枝杆菌重组融合蛋白EECC的提取和纯化。