CN105131125A

CN105131125A - 一种用于诱导外周血单个核细胞产生结核相关细胞因子的融合蛋白

Info

Publication number: CN105131125A
Application number: CN201510577891.1A
Authority: CN
Inventors: 黄曦; 杨宜英; 李妍; 胡鹏男; 曹炜伟
Original assignee: Guangzhou Diao Medical Technology Co Ltd
Current assignee: Guangzhou Deaou Biotechnology Co ltd; Guangzhou Deaou Medical Diagnosis Co ltd
Priority date: 2015-09-11
Filing date: 2015-09-11
Publication date: 2015-12-09
Anticipated expiration: 2035-09-11
Also published as: CN105131125B

Abstract

本发明公开了一种用于诱导外周血单个核细胞产生结核相关细胞因子的融合蛋白，本发明的融合蛋白为通过连接肽将CFP-10、ESAT-6以及Rv1985c以任意顺序连接后获得的融合蛋白，其中所用的连接肽为可以显著提高融合蛋白活性的短肽。本发明提供的融合蛋白与现有的刺激物相比，其作用更高效、敏感性更强、特异性更高、刺激效果好。在本发明融合蛋白的作用下，PBMC可高效产生结核杆菌抗原特异性的IFN-γ、IL-2、IL-6、TNF-α等结核相关因子，并且这一刺激诱导反应不受BCG（卡介苗）的干扰。本发明提供的融合蛋白对结核病致病及免疫预防机制的研究有重要意义，从而对结核病的控制具有积极的意义。

Description

一种用于诱导外周血单个核细胞产生结核相关细胞因子的融合蛋白

技术领域

本发明涉及蛋白领域，特别提供了一种可特异性诱导已感染结核分枝杆菌的人群的外周血单个核细胞分泌相关细胞因子的蛋白。本发明还涉及该特异性蛋白的制备及使用。

背景技术

结核病是一种由结核分枝杆菌引起的慢性传染病，可侵及许多脏器，以肺部结核感染最为常见。全世界约有1/3的人口感染结核杆菌，每年新发结核病人约900万，每年约有300万人死于结核病，结核病已成为全世界成人因传染病而死亡的主要疾病之一。根据世卫组织2014年10月22日出版的《2014年全球结核病报告》显示，2013年有900万人染上结核病，150万人死亡，约95%的结核病死亡发生在低收入和中等收入国家。中国是全球22个结核病高负担国家之一，活动性肺结核病人数居世界第二位。结核病的传染主要是发生在病人未被发现并进行治疗之前，1名结核病患者平均可传染15人。因为在未发现患病前，新发病人没有采取任何预防手段，在与家庭成员、同事、同学等密切接触的过程中，接触者就容易被结核菌感染。

结核分枝杆菌是一种典型的胞内感染菌，人体对其免疫机制主要是以T细胞为主的细胞免疫。结核分枝杆菌侵入呼吸道后，原肺泡中未活化的树突状细胞（Dendriticcells,DC）抗菌活性弱，不能防止所吞噬的结核分枝杆菌生长，但可将结核分枝杆菌吞噬并带到他处，提呈抗原，使周围T淋巴细胞致敏，致敏的T淋巴细胞可产生多种细胞因子（INF-γ、IL-2、IL-6与TNF-α等），这些细胞因子共同作用，杀死病灶中的结核分枝杆菌。根据这一免疫机制，通过对已感染结核分枝杆菌的患者及健康人血液中的细胞因子进行分析对比，发现感染结核分枝杆菌的患者其血液中INF-γ、IL-2、IL-6、TNF-α的浓度明显升高。

对于已经感染了结核分支杆菌的患者，当已经过免疫的特异性淋巴细胞在再次接触结核杆菌时，仍然会分泌相应的细胞因子。为研究结核分枝杆菌的致病机制及免疫机制，研究人员使用体外诱导PBMC产生结核相关细胞因子的方式。外周血是人类免疫系统研究的主要对象，其中的PBMC包括淋巴细胞（T淋巴细胞、B淋巴细胞和NK细胞）、单核细胞和树突状细胞。将已经感染了结核分枝杆菌的患者的外周血采出，提取其中的PBMC，并采用结核相关抗原对其进行刺激，PMBC即可对抗原发生免疫反应，产生相应的细胞因子。由于直接使用结核分枝杆菌进行实验具有相当的危险性，不利于进行大量研究，因此研究人员采用提取的结核分枝杆菌抗原蛋白进行研究实验。

结核菌素纯蛋白衍生物（PPD）是从结核分枝杆菌培养滤液中获得的活性物质，其主要成分是蛋白质。PPD可以刺激T细胞产生IFN-γ、IL-2等细胞因子，但对于已经经过卡介苗（BCG）免疫个体的样本，PPD同样能够刺激其提取出来的PBMC产生结核相关细胞因子，因此PPD的特异性较低，还需寻找特异性更好的刺激物。

发明内容

为了解决上述存在的问题，本发明通过大量的筛选实验，发现将抗原靶6ku蛋白(earlysecretaryantigenictarget6kuprotein，ESAT-6)、培养滤液蛋白(culturefiltrateprotein，CFP-10)和Rv1985c蛋白通过特定的连接肽连接成融合蛋白，将该融合蛋白作为抗原可提高刺激的特异性。刺激感染了（/过）结核分枝杆菌的机体中具有免疫活性的PBMC，可显著增强PBMC产生结核相关细胞因子INF-γ、IL-2、IL-6与TNF-α等的能力，说明该融合蛋白作用更高效、敏感性更强、特异性更高、刺激效果好，有利于后续检测这些细胞因子的浓度来对结核病的致病及免疫预防机制进行进一步研究。

本发明的目的在于提供一种用于诱导外周血单个核细胞产生结核相关细胞因子的融合蛋白。

本发明所采取的技术方案是：

一种用于诱导外周血单个核细胞产生结核相关细胞因子的融合蛋白，该融合蛋白为CFP-10、ESAT-6和Rv1985c三个蛋白通过连接多肽按任意顺序连接而成的融合蛋白。

进一步的，该融合蛋白为CFP-10-连接肽-ESAT-6-连接肽-Rv1985c、CFP-10-连接肽-Rv1985c-连接肽-ESAT-6、ESAT6-连接肽-CFP10-连接肽-Rv1985c或者ESAT6-连接肽-Rv1985c-连接肽-CFP10。

进一步的，该融合蛋白为CFP-10-连接肽-ESAT-6-连接肽-Rv1985c。

进一步的，上述连接肽的氨基酸序列如SEQIDNO：3所示。

进一步的，上述融合蛋白CFP-10-连接肽-ESAT-6-连接肽-Rv1985c的氨基酸序列如SEQIDNO：1所示。

进一步的，上述融合蛋白CFP-10-连接肽-ESAT-6-连接肽-Rv1985c的碱基序列如SEQIDNO：2所示。

本发明的有益效果是：

1）本发明提供了一种可以刺激PBMC产生结核相关细胞因子的融合蛋白，与现有的刺激物相比，其作用更高效、敏感性更强、特异性更高、刺激效果好。在本发明融合蛋白的作用下，PBMC可高效产生结核杆菌抗原特异性的IFN-γ、IL-2、IL-6、TNF-α等结核相关因子，并且这一刺激诱导反应不受BCG（卡介苗）的干扰。

2）本发明选用的连接肽链为经过设计、筛选的可以显著提高融合蛋白活性的短肽。目前蛋白领域研究中常用的连接肽主要有（Gly₄Ser）₃，而本发明所采用的连接肽氨基酸序列为GGGGSGGGSGGSGS，使得CFP-10-ESAT-6-Rv1985c融合蛋白中各自蛋白的空间构象及活性得到更好的实现，与混合肽、或其他融合蛋白相比，本发明融合蛋白的特异性及诱导效果具有明显的进步。本发明提供的融合蛋白对结核病致病及免疫预防机制的研究有重要意义，从而对结核病的控制具有积极的意义。

附图说明

图1为ELISA检测各组人PBMC在融合蛋白CFP-10-ESAT-6-Rv1985c作用下分泌细胞因子IL-2的情况；

图2为ELISPOT检测不同处理组中PBMC分泌IFN-γ的水平；

图3为细胞流式检测不同处理组中PBMC分泌TNF-α的水平；

图4为ELISPOT检测不同处理组中PBMC分泌IL-6的水平；

图5为ELISPOT检测各组PBMC分泌IFN-γ的水平；其中本发明融合蛋白的连接肽为GGGGSGGGSGGSGS；(Gly4Ser)3-融合蛋白组的连接肽为(Gly4Ser)3，其他序列均与本发明融合蛋白相同；

图6为ELISPOT检测各组PBMC分泌IFN-γ的水平；实验组孔中含有本发明融合蛋白，阳性对照组中含有植物凝集素PHA；

图7为ELISPOT检测不同处理组中PBMC分泌IFN-γ的水平。

具体实施方式

实施例1：CFP-10-ESAT-6-Rv1985c融合蛋白目的基因合成及原核表达载体的构建

1）分别用CFP10、ESAT-6和Rv1985c的上下游引物，用PCR分别扩增CFP-10、ESAT-6和Rv1985c的目的片段，使用TaqDNA聚合酶进行PCR扩增并回收上述片段。

2）采用人工合成方式合成两种带有连接肽核苷酸序列的核苷酸链，其中一种核苷酸链（下文简称连接肽链1）两端分别包含CFP-10和ESAT-6部分序列，中间为连接肽的碱基序列（SEQIDNO：4），另一种核苷酸链（下文简称连接肽链2）两端分别包含ESAT-6和Rv1985c部分序列，中间也为连接肽的碱基序列（SEQIDNO：4）。

3）取CFP10DNA模板、连接肽链1DNA模板各1μl，用CFP10的上游引物和连接肽链1的下游引物进行重叠PCR，获取CFP-10-连接肽融合基因；切胶回收融合片段作为模板，同时加入ESAT-6DNA模板，再用CFP10的上游引物和ESAT-6的下游引物进行重叠PCR，获取CFP10-连接肽-ESAT-6融合基因；同理，用CFP10的上游引物和连接肽链2的下游引物进行重叠PCR，获取CFP-10-连接肽-ESAT-6-连接肽融合基因，切胶回收融合片段；最后用CFP10的上游引物和Rv1985c的下游引物进行重叠PCR，获取CFP10-连接肽-ESAT-6-连接肽Rv1985c融合基因（其核酸序列如SEQIDNO：2所示），切胶回收融合片段。

4）将CFP10-连接肽-ESAT-6-连接肽Rv1985c融合基因片段连接到pMD19-T载体上。挑取单克隆，菌液PCR筛选阳性克隆，最后酶切鉴定。将表达载体pET-28a和上述阳性克隆的质粒进行双酶切（BamHⅠ和HindⅢ），目的基因乙醇沉淀回收，载体过柱回收。然后用T4DNALigase对酶切的载体和目的片段进行连接，再转化到表达宿主大肠杆菌BL21感受态细胞中。挑取单克隆，菌液PCR鉴定与双酶切鉴定后获得的阳性菌落进行测序鉴定。选取鉴定正确的重组菌进行保种，备用。

实施例2：融合蛋白CFP-10-连接肽-ESAT-6-连接肽-Rv1985c的诱导表达和纯化

取上述实施例1鉴定正确的含有CFP-10-连接肽-ESAT-6-连接肽-Rv1985c目的基因片段（碱基序列如SEQIDNO：2所示）的重组表达菌接入20ml含卡那抗性的LB培养基中，37℃，250rpm，振荡培养6h。高压灭菌2L的LB培养基，每个1L的锥形瓶中放500ml，共分为4个瓶子。每个瓶子中加入2.5ml活化后的菌液，37℃，250rpm，振荡培养约3h，使菌液OD₆₀₀为0.5。把锥形瓶放入冷水中，并对摇床降温，冷却后再诱导。每瓶中加入IPTG，使其终浓度为0.5mM，放入20℃摇床，200rpm，诱导20小时。离心：4℃，5000rpm，45min。离心后，弃上清，加入悬菌缓冲液重悬，随后将液体转移至50ml离心管中，每管内液体量30ml，放在-20℃冻存。反复冻融3个循环，冰浴超声破碎菌体后离心：4℃，7000rpm，45min。吸取离心所得上清、过滤，把滤液收集到新的50ml离心管中，分别收集上清、沉淀。SDS-PAGE蛋白电泳，考马斯亮蓝染色后观察结果，确定该重组菌可以正确表达目的蛋白。对所得的重组菌进行扩大诱导培养，对诱导表达的目的蛋白进行收集和纯化，即可获得纯化后的融合蛋白CFP-10-连接肽-ESAT-6-连接肽-Rv1985c（其氨基酸序列如SEQIDNO：1所示），以下简称CFP-10-ESAT-6-Rv1985c。

实施例3：密度梯度离心法分离人外周血单个核细胞（PBMC）

使用新鲜肝素锂或肝素钠的采血管或真空采血管无菌抽取待检人员外周静脉血4ml，颠倒使抗凝剂和血液混匀待用。准备2个15ml离心管，分别加入与采血量等体积的注射用生理盐水和淋巴细胞分离液。将新鲜肝素抗凝血与生理盐水混匀后，匀速缓慢加入分离液中，于22℃，1800g离心20min，离心后，可见PBMCs细胞存在于云雾状层中。吸取PBMCs细胞层至新的15ml离心管内，用RPMI-1640培养液补齐至12ml，于22℃，600g离心10min。倒掉上清，用RPMI-1640培养液补齐至5ml，轻轻吹打沉淀重悬后，于22℃，350g离心10min。弃上清，加入0.5ml-1ml无血清培养基重悬细胞。采用台盼蓝染色手工计数法或使用合适的设备自动计数。根据计数结果，用无血清培养基将其稀释为所需浓度的PBMC细胞悬液。

实施例4：ELISA检测本发明融合蛋白诱导PPD阳性患者的PBMC分泌IL-2的作用

1）分别选取PPD（结核菌素试验）阳性结核患者、未感染结核分枝杆菌的人的肝素钠抗凝外周静脉血样本，按实施例3中的密度分层法分离PBMC，经过细胞计数后使用无血清培养基将PBMC稀释到2.5×10⁶个/ml的浓度，将细胞接种至96孔板中，每孔加入2.5×10⁵个细胞，将实施例2制备的融合蛋白CFP-10-连接肽-ESAT-6-连接肽-Rv1985c用无血清培养基稀释为浓度5μg/ml的工作液，向实验孔中加入已配制好的融合蛋白工作液，37℃、5%CO₂条件下孵育18小时，取细胞培养液进行相关细胞因子的检测。

2）采用预先包被了抗人IL-2单克隆抗体的ELISA板，加入上步所提细胞培养上清液，室温孵育2小时，用Washbuffer清洗ELISA板3-5次，往检测孔中加入抗IL-2抗体，室温孵育1小时，然后去除抗体，用Washbuffer清洗ELISA板3-5次，再加入HRP标记的二抗，37℃孵育1小时，然后去除二抗，用Washbuffer清洗ELISA板3-5次，加入配制好的TMB显色底物，室温下避光显色20分钟，最后加入终止液终止显色，30分钟内用酶标仪进行结果分析。

检测结果如图1所示，从中可以看出与健康人相比，PPD阳性患者的PBMC在经过融合蛋白CFP-10-ESAT-6-Rv1985c刺激后其IL-2的分泌量有明显提高。

实施例5：酶联免疫斑点法（ELISPOT）检测本发明融合蛋白诱导PPD阳性的PBMC分泌IFN-γ水平

1）选取PPD（结核菌素试验）阳性结核患者的肝素钠抗凝外周静脉血样本，按实施例3中的密度分层法分离PBMC，经过细胞计数后使用无血清培养基将其稀释到2.5×10⁶个/ml的浓度备用。

2）选择PVDF膜检测板（预先使用抗人IFN-γ单克隆抗体包被过夜，4℃条件保存）作为反应板，每孔加入2.5×10⁵个上步制备的PBMC，每个样本设置3个检测孔，分别是空白对照（加入无血清培养基）、实验孔（加入实施例2制得的融合蛋白进行刺激，浓度为5μg/ml）和阳性对照孔（加入植物凝集素PHA进行刺激，浓度为5μg/ml），37℃、5%CO₂培养箱中孵育16-20小时。

3）取出检测板，弃培养上清液，用PBS冲洗检测板3-4遍，再用PBS洗板1-2次，每次来回轻轻晃动5下，最后一次洗板后拍干。在每个孔中加入1标记抗体工作液，置37℃孵育1小时。弃液体，用PBS洗板3-5次，每次来回轻轻晃动5下，最后一次洗板后拍干，每孔加入酶结合物工作液，置37℃孵育1小时。弃液体，用PBS洗板5次，每次来回轻轻晃动5下，最后一次洗板后拍干，每孔加入100μl的显色液，置37℃避光显色5-10分钟至斑点大小肉眼清晰可见，弃液体，用去离子水或自来水洗涤检测板正反面及底座3-5遍，扣干孔里的水，终止显色，将板放入37℃烘箱干燥4小时或者室温干燥过夜。显色结果用CTLImmunoSpotS6ELISpot分析仪进行自动分析。

实验分析结如图2所示，从中可以看出PPD阳性的PBMC在经过本发明融合蛋白刺激后其IFN-γ的分泌量有明显提高。

实施例6：细胞流式方法检测本发明融合蛋白诱导PPD阳性的PBMC分泌TNF-α的情况

1）选取PPD阳性结核患者肝素钠抗凝外周静脉血样本，密度分层法分离PBMC，经过细胞计数后使用无血清培养基将其稀释；

2）将上步制得的PBMC以1×10⁶个细胞/ml的浓度接种到96-u型板中，设置3组实验，分别为阴性对照（加入无血清培养基）、实验孔（加入实施例2制得的融合蛋白进行刺激，浓度为5μg/ml）和阳性对照孔（加入植物凝集素PHA进行刺激，浓度为5μg/ml），37℃、5%CO₂条件孵育6-8小时。

3）孵育完成后收集细胞，加入PBS清洗细胞，1500r/min低温离心10分钟，弃上清；加入CD4抗体（CD4细胞会分泌TNF-α，本实验需要筛选CD4和TNF-α双阳性的细胞，后续实验步骤中再加入TNF-α抗体），4℃避光孵育30分钟，然后再加入PBS洗液，轻轻振荡洗涤，1500r/min低温离心5分钟，后弃上清；滴加100μl固定剂，用加样枪轻吹匀，室温固定20分钟，加入破膜剂，2000r/min低温离心5分钟后弃上清，再加入破膜剂，用枪轻吹匀，4℃孵育30分钟后2000r/min，低温离心5分钟，弃上清，加入TNF-α抗体4℃孵育45分钟，加入破膜剂轻轻振荡，2000r/min低温离心5分钟，弃上清，振荡滴加1%多聚甲醛，最后300μLPBS，用枪轻混匀后上流式细胞仪进行检测。

检测结果如图3所示，从中可以看出PPD阳性的PBMC在经本发明融合蛋白刺激后其TNF-α的分泌量（0.82%）有明显提高，阴性对照组为0.46%。

实施例7：ELISPOT方法检测本发明融合蛋白诱导PPD阳性的PBMC分泌IL-6水平

1）选取PPD阳性结核患者的肝素钠抗凝外周静脉血样本，密度分层法分离PBMC，经过细胞计数后使用无血清培养基将其稀释到2.5×10⁶个/ml的浓度备用。

2）采用ELISPOT检测的方法，选择PVDF膜检测板（预先使用抗人IL-6单克隆抗体包被过夜，4℃条件保存）作为反应板，每孔加入2.5×10⁵个PBMC，每个样本设置3个检测孔，分别是空白对照、实验孔（加入实施例2制得的融合蛋白）和阳性对照孔（加入植物凝集素PHA），37℃、5%CO₂培养箱中孵育16-20小时。第二天依次加入生物素标记抗人IL-6单克隆抗体、酶结合物工作液，显色液。显色结果用CTLImmunoSpotS6ELISpot分析仪进行自动分析。

上述实验分析结果如图4所示，从中可以出PPD阳性的PBMC在经过本发明融合性蛋白刺激后其IL-6的分泌量有明显提高。

实施例8：本发明融合蛋白对外周血单个核细胞产生结核相关细胞因子具有显著的诱导作用

实验方法：

本实验设置5组，各组的实验设置如下所述：

阴性对照组：将PPD阳性结核患者的PBMC加入到PVDF膜检测板（预先使用抗人IFN-γ单克隆抗体包被过夜，4℃条件保存）中，每孔加入2.5×10⁵个PBMC，再加入50μl无血清培养基进行培养；

阳性对照组：与阴性对照组相同，将相同数量的PBMC加入到相同的PVDF膜检测板中，再加入等体积含植物凝集素PHA的无血清培养基进行培养；

本发明融合蛋白组：与阴性对照组相同，将相同数量的PBMC加入到PVDF膜检测板中，再加入等体积含实施例2制备的融合蛋白的无血清培养基进行培养，融合蛋白的工作液浓度为5μg/μl；

(Gly4Ser)3-融合蛋白组：与阴性对照组相同，将相同数量的PBMC加入到PVDF膜检测板中，再加入等体积含(Gly4Ser)3-融合蛋白的无血清培养基进行培养；(Gly4Ser)3-融合蛋白浓度为5μg/μl；所述(Gly4Ser)3-融合蛋白为CFP10-连接肽(Gly4Ser)3-ESAT-6-连接肽(Gly4Ser)3-Rv1985c，其中连接肽(Gly4Ser)3的氨基酸序列为GGGGSGGGGSGGGGS（SEQIDNO：5）；

蛋白混合物组：与阴性对照组相同，将相同数量的PBMC加入到PVDF膜检测板中，再加入等体积含蛋白CFP10、ESAT-6-和Rv1985c的无血清培养基进行培养，CFP10、ESAT-6-和Rv1985c浓度均为5μg/μl；；

将上述5组细胞均在37℃、5%CO₂培养箱中孵育16-20小时；分别取出检测板，弃培养上清液，用PBS冲洗检测板3-4遍，再用PBS洗板1-2次，每次来回轻轻晃动5下，最后一次洗板后拍干。在每个孔中加入生物素标记抗人IFN-γ单克隆抗体工作液，置37℃孵育1小时。弃液体，用PBS洗板3-5次，每次来回轻轻晃动5下，最后一次洗板后拍干，每孔加入酶结合物工作液，置37℃孵育1小时。弃液体，用PBS洗板5次，每次来回轻轻晃动5下，最后一次洗板后拍干，每孔加入100μl的显色液，置37℃避光显色5-10分钟至斑点大小肉眼清晰可见，弃液体，用去离子水或自来水洗涤检测板正反面及底座3-5遍，扣干孔里的水，终止显色，将板放入37℃烘箱干燥4小时或者室温干燥过夜。显色结果用CTLImmunoSpotS6ELISpot分析仪进行自动分析。

实验结果：

实验分析结果如图5所示，从中可以看出用在相同面积内，本发明融合蛋白刺激PBMC所得的斑点数（231）明显多于(Gly4Ser)3-融合蛋白组（148）和蛋白混合物组（81），说明本发明将蛋白CFP10、ESAT-6-和Rv1985c进行融合表达后，可显著提高PBMC产生结核相关细胞因子的能力，并且本发明中对连接肽的改进也带来了不可预料的效果，现常用的连接肽(Gly4Ser)3用于连接CFP10、ESAT-6-和Rv1985c融合表达后效果不及本发明改进后的连接肽GGGGSGGGSGGSGS。说明使用本发明连接肽GGGGSGGGSGGSGS能够提高本发明融合蛋白的活性，诱导PBMC分泌细胞因子的效果更好。

实施例9：特异性融合蛋白分别诱导健康人、经BCG免疫的健康人及PPD阳性患者的PBMC分泌IFN-γ对比

1）分别选取健康人、经BCG(卡介苗)免疫的健康人和PPD阳性患者的肝素钠抗凝外周静脉血样本，密度分层法分离PBMC，经过细胞计数后使用无血清培养基将其稀释到2.5×10⁶个/ml的浓度备用。

2）采用ELISPOT检测INF-γ分泌的方法，选择PVDF膜检测板（预先使用抗人IFN-γ单克隆抗体包被过夜，4℃条件保存）作为反应板，每孔加入2.5×10⁵个PBMC，每个样本设置3个检测孔，分别是阴性对照（加入无血清培养基）、实验组（加入本发明融合蛋白）和阳性对照组（加入植物凝集素PHA），37℃、5%CO₂培养箱中孵育16-20小时。

3）第二天依次加入生物素标记抗人IFN-γ单克隆抗体、酶结合物工作液，显色液。显色结果用CTLImmunoSpotS6ELISpot分析仪进行自动分析。

实验检测结果如图6所示，从结果中可以看出，未感染结核病的健康人和经BCG免疫的健康人的PBMC细胞不会被本发明融合蛋白（实施例2制备的融合蛋白）诱导分泌IFN-γ，即没有出现斑点，只有PPD阳性样本的实验孔中有斑点，说明本发明融合蛋白的刺激作用不受BCG的影响，对感染结核病的外周血单个核细胞（PBMC）具有很好的特异性。

实施例10、CFP-10-ESAT-6-Rv1985c融合蛋白与不同融合蛋白的刺激效果对比

采用分子克隆方法分别获得对CFP-10、ESAT-6和Rv1985c蛋白以不同顺序进行连接的融合蛋白，包括CFP-10-Rv1985c-ESAT-6、ESAT6-CFP10-Rv1985c、ESAT6-Rv1985c-CFP10、Rv1985c-CFP-10-ESAT-6和Rv1985c-ESAT-6-CFP-10。

分别选用以下融合蛋白对PPD阳性结核患者的PBMC进行处理，并用ELISPOT法检测各组中PBMC分泌IFN-γ的水平，各组所用到的融合蛋白分别为：

CFP-10-连接肽-ESAT-6-连接肽-Rv1985c（简称CFP-10-ESAT-6-Rv1985c）、

CFP-10-连接肽-Rv1985c-连接肽-ESAT-6（简称CFP-10-Rv1985c-ESAT-6）、

ESAT6-连接肽-CFP10-连接肽-Rv1985c（简称ESAT-6-CFP-10-Rv1985c）、

ESAT6-连接肽-Rv1985c-连接肽-CFP10（简称ESAT-6-Rv1985c-CFP-10）、

Rv1985c-连接肽-CFP-10-连接肽-ESAT-6（简称Rv1985c-CFP-10-ESAT-6）、

Rv1985c-连接肽-ESAT-6-连接肽-CFP-10（简称Rv1985c-ESAT-6-CFP-10）、

CFP-10-连接肽-ESAT-6-连接肽-Rv1978（简称CFP-10-ESAT-6-Rv1978）、

CFP-10-连接肽-ESAT-6-连接肽-Rv3425（简称CFP-10-ESAT-6-Rv3425）；

其中Rv1987和Rv3425分别为RD2区和RD11区相应基因编码的蛋白；

上述连接肽的氨基酸序列均为GGGGSGGGSGGSGS（SEQIDNO：3）；同时设置阴性对照（无血清培养基）和阳性对照（用植物凝集素PHA处理）；具体的处理过程和检测方法同以上实施例所述。

实验检测结果如图7所示，从中可以看出，融合蛋白CFP-10-ESAT-6-Rv1985c处理组中检测的斑点数最多，其次是CFP-10、ESAT-6和Rv1985c按其他顺序连接而成的融合蛋白，而CFP-10、ESAT-6和其他抗原蛋白（Rv1978、Rv3425）连接而成的融合蛋白对PBMC的刺激效果最差。说明本明发将CFP-10、ESAT-6和Rv1985c三种抗原蛋白通过特定连接肽连接而成的融合肽产生了不可预料的效果，可特异性显著诱导外周血单个核细胞产生结核相关细胞因子（INF-γ、IL-2、IL-6与TNF-α等）的能力，尤其是融合肽CFP-10-ESAT-6-Rv1985c产生的诱导效果最为显著。）

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

<110>广州迪澳医疗科技有限公司

<120>一种用于诱导外周血单个核细胞产生结核相关细胞因子的融合蛋白

<130>

<160>5

<170>PatentInversion3.5

<210>1

<211>323

<212>PRT

<213>人工序列

<400>1

MetAlaGluMetLysThrAspAlaAlaThrLeuAlaGlnGluAlaGly

151015

AsnPheGluArgIleSerGlyAspLeuLysThrGlnIleAspGlnVal

202530

GluSerThrAlaGlySerLeuGlnGlyGlnTrpArgGlyAlaAlaGly

354045

ThrAlaAlaGlnAlaAlaValValArgPheGlnGluAlaAlaAsnLys

505560

GlnLysGlnGluLeuAspGluIleSerThrAsnIleArgGlnAlaGly

65707580

ValGlnTyrSerArgAlaAspGluGluGlnGlnGlnAlaLeuSerSer

859095

GlnMetGlyPheGlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlySerGlyGlySer

100105110

GlySerMetThrGluGlnGlnTrpAsnPheAlaGlyIleGluAlaAla

115120125

AlaSerAlaIleGlnGlyAsnValThrSerIleHisSerLeuLeuAsp

130135140

GluGlyLysGlnSerLeuThrLysLeuAlaAlaAlaTrpGlyGlySer

145150155160

GlySerGluAlaTyrGlnGlyValGlnGlnLysTrpAspAlaThrAla

165170175

ThrGluLeuAsnAsnAlaLeuGlnAsnLeuAlaArgThrIleSerGlu

180185190

AlaGlyGlnAlaMetAlaSerThrGluGlyAsnValThrGlyMetPhe

195200205

AlaGlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlySerGlyGlySerGlySerLeu

210215220

AlaAlaLeuAlaAlaValValGluLeuGlySerPheAspAlaAlaAla

225230235240

GluArgLeuHisValThrProSerAlaValSerGlnArgIleLysSer

245250255

LeuGluGlnGlnValGlyGlnValLeuValValArgGluLysProCys

260265270

ArgAlaThrThrAlaGlyIleProLeuLeuArgLeuAlaAlaGlnThr

275280285

AlaLeuLeuGluSerGluAlaLeuAlaGluMetGlyGlyAsnAlaSer

290295300

LeuLysArgThrArgIleThrIleAlaValAsnAlaAspSerMetAla

305310315320

ThrTrpPhe

<210>2

<211>972

<212>DNA

<213>人工序列

<400>2

atggcagagatgaagaccgatgccgctaccctcgcgcaggaggcaggtaatttcgagcgg60

atctccggcgacctgaaaacccagatcgaccaggtggagtcgacggcaggttcgttgcag120

ggccagtggcgcggcgcggcggggacggccgcccaggccgcggtggtgcgcttccaagaa180

gcagccaataagcagaagcaggaactcgacgagatctcgacgaatattcgtcaggccggc240

gtccaatactcgagggccgacgaggagcagcagcaggcgctgtcctcgcaaatgggcttc300

ggcggcggcggcagcggcggcggcagcggcggcagcggcagcatgacagagcagcagtgg360

aatttcgcgggtatcgaggccgcggcaagcgcaatccagggaaatgtcacgtccattcat420

tccctccttgacgaggggaagcagtccctgaccaagctcgcagcggcctggggcggtagc480

ggttcggaggcgtaccagggtgtccagcaaaaatgggacgccacggctaccgagctgaac540

aacgcgctgcagaacctggcgcggacgatcagcgaagccggtcaggcaatggcttcgacc600

gaaggcaacgtcactgggatgttcgcaggcggcggcggcagcggcggcggcagcggcggc660

agcggcagcctggccgcattggctgccgtggtcgaactgggcagcttcgatgcggccgcg720

gagcgcctacatgtcaccccgtcggctgtcagtcagcgcatcaagtcgttggagcagcag780

gtcggccaggtgctggtggtcagggaaaagccatgtcgggcgacgaccgcaggtatcccg840

ctgttgcggttggccgcgcaaacagcgttgctcgagtccgaggcgctcgctgaaatgggt900

ggcaacgcgtcgctgaaacgcacgcggatcaccattgcggtaaacgccgattccatggcg960

acatggttttag972

<210>3

<211>14

<212>PRT

<213>人工序列

<400>3

GlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlySerGlyGlySerGlySer

1510

<210>4

<211>42

<212>DNA

<213>人工序列

<400>4

ggcggcggcggctccggcggcggctccggcggctccggctcc42

<210>5

<211>15

<212>PRT

<213>人工序列

<400>5

GlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySer

151015

Claims

1.一种用于诱导外周血单个核细胞产生结核相关细胞因子的融合蛋白，其特征在于：该融合蛋白为CFP-10、ESAT-6和Rv1985c三个蛋白通过连接多肽按任意顺序连接而成的融合蛋白。

2.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于：该融合蛋白为CFP-10-连接肽-ESAT-6-连接肽-Rv1985c、CFP-10-连接肽-Rv1985c-连接肽-ESAT-6、ESAT6-连接肽-CFP10-连接肽-Rv1985c或者ESAT6-连接肽-Rv1985c-连接肽-CFP10。

3.根据权利要求2所述的融合蛋白，其特征在于：该融合蛋白为CFP-10-连接肽-ESAT-6-连接肽-Rv1985c。

4.根据权利要求1～3任一所述的融合蛋白，其特征在于：所述连接肽的氨基酸序列如SEQIDNO：3所示。

5.根据权利要求3所述的融合蛋白，其特征在于：融合蛋白CFP-10-连接肽-ESAT-6-连接肽-Rv1985c的氨基酸序列如SEQIDNO：1所示。

6.根据权利要求3所述的融合蛋白，其特征在于：编码融合蛋白CFP-10-连接肽-ESAT-6-连接肽-Rv1985c的碱基序列如SEQIDNO：2所示。