CN102924576A - 幽门螺杆菌免疫显性表位肽及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种幽门螺杆菌免疫显性表位肽及其制备方法和应用，所述显性表位肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:97、100、108和115所示。本发明还提供了所述显性表位肽的制备方法，并进一步提供了所述显性表位肽用于预防或治疗幽门螺杆菌感染的制剂中的应用。

Description

幽门螺杆菌免疫显性表位肽及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于医药生物技术领域，涉及一种幽门螺杆菌免疫显性表位肽及其制备方法和应用。
背景技术
幽门螺杆菌（Helicobacter pylori,Hp）1982年由澳大利亚学者Warren和Marshall发现，其定植于人胃粘膜局部，致使全球50%以上人群感染，成为慢性胃炎，胃十二指肠溃疡及胃粘膜相关淋巴组织淋巴瘤等胃肠疾病发生的主要致病因素。同时世界卫生组织已将Hp列为与胃癌发生密切相关的一类致癌因子。目前临床上针对Hp感染问题，主要采用抗生素加质子泵抑制剂的多联疗法，但存在高耐药性、易复发和再次感染等不足，严重制约了抗生素多联疗法的临床疗效和使用范围，而疫苗的免疫接种有可能成为彻底消除Hp感染和治疗相关胃肠疾病的有效手段。
全球现已广泛开展Hp疫苗研究，包括全菌疫苗、亚单位疫苗和核酸疫苗等，但绝大多数处于实验室研发和临床试验阶段，且免疫保护效果仍不十分理想。上述已有疫苗可激发以抗体为主的体液免疫应答且作为其主要免疫保护机制，而对于胞外感染菌所诱导的CD4+T淋巴细胞应答未能在疫苗设计和研究策略上给予足够的重视。大量研究结果表明：无论是Hp自然感染还是疫苗接种，抗原特异性CD4+T淋巴细胞发挥重要作用，其中以产IFN-γ的CD4+T淋巴细胞的免疫保护作用较为明确。为了有效激发机体产生抗原特异性IFN-γ+CD4+T淋巴细胞应答，需对现有疫苗候选保护性抗原中免疫优势表位进行系统的筛选并从中确定保护性表位。
目前表位的筛选与鉴定方法主要包括质谱法、软件预测、步移合成重叠肽等多种方法。质谱法操作简单、省时、快速，但不能排除自身反应性表位和在自然状态下不能被抗原递呈细胞加工递呈的表位。软件预测法虽简便、快速，但预测结果常与真实情况存在一定的出入，需实验加以验证。步移合成重叠肽是一种系统筛选表位的方法，可有效克服质谱法和预测法的不足，明确表位的免疫优势应答特性，避免漏筛和误筛现象。因此本研究采用步移合成重叠肽法进行优势表位的筛选。
现已研究发现：同一种抗原联合不同佐剂可诱导机体产生不同的免疫保护作用，其保护作用的差异可能是由于诱导产生的优势应答表位不同而导致的，因此，本研究采用幽门螺杆菌疫苗候选抗原结合不同佐剂免疫接种小鼠，分析其免疫保护作用，并通过步移合成重叠肽技术筛选鉴定优势应答表位肽，进而对优势应答表位肽进行免疫保护效果评价。
发明内容
本发明的目的是从幽门螺杆菌抗原中筛选鉴定出优势应答的CD4+T细胞免疫显性表位肽，所述免疫显性表位肽能有效激发CD4+T细胞产生高水平IFN-γ应答，并具有显著的抗幽门螺杆菌感染的免疫保护作用。
本发明提供了一种幽门螺杆菌免疫显性表位肽，其氨基酸序列如SEQ IDNO:97、100、108和115所示。
本发明所提供的幽门螺杆菌尿素酶B亚单位（UreB）抗原的优势应答的免疫显性表位肽可用于幽门螺杆菌预防性或治疗性疫苗。所述疫苗优选为蛋白疫苗或核酸疫苗。
所使用制剂包含医学上可接受的免疫佐剂，优选为弗氏佐剂、CPG ODN1826或AddaVax。
本发明进一步提供了所述免疫显性表位肽的制备方法，包含以下步骤：
1）从蛋白数据库中获取幽门螺杆菌来源的UreB蛋白质序列；
2）从步骤1）获取的UreB蛋白质序列的第1号氨基酸开始，每次步移6个氨基酸，以步移重叠的18个氨基酸为一个多肽段，形成第一多肽库，和/或在获得的第一多肽中；
3）利用抗原特异性CD4+T细胞从步骤2）所述的第一多肽库中筛选18个氨基酸短肽的免疫显性表位肽；
4)利用步骤3）筛选出的18个氨基酸短肽的免疫显性表位肽采用步移法，每次步移2个氨基酸，以步移重叠的至少13个氨基酸为一个多肽段，形成第二多肽库；
5）利用抗原特异性CD4+T细胞从步骤4）所述的第二多肽库中筛选13个氨基酸短肽的免疫显性表位肽；
6）利用MHC分子抗体阻断实验确定步骤5）筛选的免疫显性表位肽的限制性。
结果显示所制备的免疫显性表位肽具有明显免疫保护作用，其保护效果不亚于甚至优于全蛋白抗原。本发明中所提供的免疫显性表位肽均可诱导机体针对相应表位产生强烈的免疫应答反应。因此通过诱导机体针对免疫保护性表位产生应答，或直接用保护性表位免疫机体将对幽门螺杆菌感染起到有效免疫保护作用，可用于进一步的幽门螺杆菌预防性和治疗性表位疫苗的研究。
为让本发明的上述及其它目的、特征和优点能更明显易懂，下文特举较佳实施例，并配合附图，作详细说明如下。
附图说明
图1表示UreB抗原联合不同佐剂免疫攻毒后检测胃组织幽门螺杆菌定植量，可见不同佐剂组免疫保护作用存在差异。
图2A和图2B表示ELISA方法检测不同佐剂组血清IgG（图2A）/胃局部sIgA（图2B）抗体水平，可见IgG抗体应答与免疫保护作用之间并不十分吻合。sIgA抗体应答与免疫保护作用之间存在一定相关性。
图3A表示经流式细胞术方法检测脾淋巴细胞中抗原特异性CD4+T细胞，可见免疫组存在抗原特异性CD4+T细胞。
图3B表示各组脾淋巴细胞中抗原特异性CD4+T细胞的频率，可见免疫组较PBS对照组存在明显区别。
图4表示利用抗原特异性CD4+T细胞和步移合成重叠肽对所有18个氨基酸组成的短肽进行筛选，其中P53、P63、P68、P69、P81、P82为免疫显性肽段。
图5A-图5F表示利用抗原特异性CD4+T细胞和步移重叠合成肽对13个氨基酸组成的短肽进行筛选，其中P53-4，P63-2，P68-5，P81-4为更短的免疫显性肽段。
图6表示利用MHC分子抗体阻断实验确定免疫显性表位MHC限制性，发现均为MHC-Ⅱ（I-A）亚型限制性。
图7表示用免疫显性表位肽免疫小鼠后攻毒，检测胃局部幽门螺杆菌定植量，可见不同表位免疫组保护作用存在差异，P53、P63表位具有更显著的免疫保护作用。
图8A和图8B表示ELISA法检测不同表位免疫组血清抗UreB和相应表位IgG抗体水平，可见表位免疫不能有效诱导血清抗体产生。
图9A和图9B表示ELISA法检测不同表位免疫组胃局部抗UreB和相应表位sIgA抗体水平，可见表位免疫不能有效诱导粘膜抗体产生。
图10表示ICS法检测各表位免疫组脾淋巴细胞中表位特异性CD4+T细胞的比例，可见各免疫组均可诱导表位特异性CD4+T细胞产生。
具体实施方式
为了使本发明目的、技术方案及优点更加清楚明白，下面结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
材料与方法
（一）蛋白和肽段
重组幽门螺杆菌尿素酶B亚单位（rUreB）蛋白由本单位重组构建（吴超“幽门螺杆菌尿素酶B亚单位基因克隆表达及临床应用”《中华检验医学杂志》2001年5期）；
多肽肽段通过化学方法合成（由上海吉尔生化公司合成），二甲亚砜（DMSO）溶解至10mM的浓度，-70℃保存，临用时经RPMI-1640完全培养基稀释到1mM浓度。
（二）主要溶液及试剂配制
1.RPMI-1640不完全培养基：
分别称取10.4g RPMI-1640粉末，2.4g Hepes和2g NaHCO3，加入去离子水至1000mL，搅匀过滤除菌，分装冻存。
2.RPMI-1640完全培养基：
分别量取900ml RPMI-1640不完全培养基和100ml胎牛血清，加入20万单位/mL青霉素和链霉素双抗各0.5mL（终浓度为100U/mL），混匀分装。
3.冻存液：
胎牛血清与DMSO按照9︰1的比例混合，分装冻存。
（三）所使用的主要试剂及其来源
试剂名称 来源
小鼠淋巴细胞分离液 北京TBD公司
重组小鼠IL-2 美国PeproTech公司
胎牛血清 美国GIBCO公司
FITC标记抗CD3单抗 美国BD公司
APC标记抗CD4单抗 美国BD公司
PE标记抗IFN-γ单抗 美国BD公司
小鼠MHC-Ⅰ分子抗体 美国BD公司
小鼠MHC-Ⅱ（I-A）分子抗体 美国BD公司
小鼠MHC-Ⅱ（I-E）分子抗体 美国BD公司
细胞内因子染色试剂盒 美国BD公司
细菌基因组DNA提取试剂盒 北京天根生化科技有限公司
可溶型单组分TMB底物溶液 北京天根生化科技有限公司
Premix Ex TaqTM 大连宝生物工程有限公司
Hp 16S rDNA Sense 英潍捷基上海贸易有限公司
Hp 16S rDNAAnti-Sense 英潍捷基上海贸易有限公司
Hp 16S probe 英潍捷基上海贸易有限公司
辣根酶标记山羊抗小鼠IgG 北京中杉金桥生物技术有限公司
辣根酶标记山羊抗小鼠IgA 美国SouthernBiotech公司
佐剂CPG ODN 1826 美国Invivogen公司
佐剂AddaVax 美国Invivogen公司
RPMI-1640不完全培养基 美国GIBCO公司
实施例1：18个氨基酸短肽的步移重叠合成及混合肽库的制备
幽门螺杆菌尿素酶蛋白B亚单位(UreB)，全长569个氨基酸，在各菌株之间序列保守，重组构建幽门螺杆菌尿素酶B亚单位为1-569多肽，源于11637国际标准菌株。UniProt蛋白数据库中检索幽门螺杆菌11637源尿素酶蛋白B亚单位氨基酸序列（编号P69996），从第1号氨基酸开始步移重叠合成18个氨基酸短肽（由上海吉尔生化公司协助合成），共93条（最后一条为17个氨基酸短肽）。纯度均大于70%。合成肽信息见表1。将合成的肽段用DMSO溶解至10mM储存浓度，另取93条短肽各10μL混合组成肽库。分装后-70℃保存。
UniProt蛋白数据库检索网址：
http://www.uniprot.org/uniprot/P69996
幽门螺杆菌尿素酶蛋白B亚单位(UreB)18个氨基酸表位肽序列如表1所示。
表1步移重叠合成UreB 18个氨基酸短肽基本信息
(依次分别为SEQ ID NO.1-93)
序号 编号 序列信息 分子量 纯度
P1 U1-18 MKKISRKEYVSMYGPTTG 2076.48 0.7
P2 U7-24 KEYVSMYGPTTGDKVRLG 2001.31 0.7
P3 U13-30 YGPTTGDKVRLGDTDLIA 1892.11 0.7
P4 U19-36 DKVRLGDTDLIAEVEHDY 2088.28 0.7
P5 U25-42 DTDLIAEVEHDYTIYGEE 2112.21 0.7
P6 U31-48 EVEHDYTIYGEELKFGGG 2043.19 0.7
P7 U37-54 TIYGEELKFGGGKTLREG 1955.22 0.7
P8 U43-60 LKFGGGKTLREGMSQSNN 1924.18 0.7
P9 U49-66 KTLREGMSQSNNPSKEEL 2048.28 0.7
P10 U55-72 MSQSNNPSKEELDLIITN 2033.26 0.7
P11 U61-78 PSKEELDLIITNALIVDY 2046.36 0.7
P12 U67-84 DLIITNALIVDYTGIYKA 1996.35 0.7
P13 U73-90 ALIVDYTGIYKADIGIKD 1968.30 0.7
P14 U79-96 TGIYKADIGIKDGKIAGI 1833.17 0.7
P15 U85-102 DIGIKDGKIAGIGKGGNK 1741.04 0.7
P16 U91-108 GKIAGIGKGGNKDMQDGV 1745.00 0.7
P17 U97-114 GKGGNKDMQDGVKNNLSV 1861.08 0.7
P18 U103-120 DMQDGVKNNLSVGPATEA 1846.02 0.7
P19 U109-126 KNNLSVGPATEALAGEGL 1740.95 0.7
P20 U115-132 GPATEALAGEGLIVTAGG 1583.77 0.7
P21 U121-138 LAGEGLIVTAGGIDTHIH 1774.02 0.7
P22 U127-144 IVTAGGIDTHIHFISPQQ 1934.20 0.7
P23 U133-150 IDTHIHFISPQQIPTAFA 2036.34 0.7
P24 U139-156 FISPQQIPTAFASGVTTM 1896.21 0.7
P25 U145-162 IPTAFASGVTTMIGGGTG 1637.89 0.7
P26 U151-168 SGVTTMIGGGTGPADGTN 1592.71 0.7
P27 U157-174 IGGGTGPADGTNATTITP 1600.72 0.7
P28 U163-180 PADGTNATTITPGRRNLK 1883.11 0.7
P29 U169-186 ATTITPGRRNLKWMLRAA 2056.48 0.7
P30 U175-192 GRRNLKWMLRAAEEYSMN 2225.60 0.7
P31 U181-198 WMLRAAEEYSMNLGFLAK 2130.53 0.7
P32 U187-204 EEYSMNLGFLAKGNASND 1960.12 0.7
P33 U193-210 LGFLAKGNASNDASLADQ 1791.95 0.7
P34 U199-216 GNASNDASLADQIEAGAI 1716.79 0.7
P35 U205-222 ASLADQIEAGAIGFKIHE 1870.11 0.7
P36 U211-228 IEAGAIGFKIHEDWGTTP 1942.18 0.7
P37 U217-234 GFKIHEDWGTTPSAINHA 1981.17 0.7
P38 U223-240 DWGTTPSAINHALDVADK 1911.07 0.7
P39 U229-246 SAINHALDVADKYDVQVA 1929.13 0.7
P40 U235-252 LDVADKYDVQVAIHTDTL 2016.25 0.7
P41 U241-258 YDVQVAIHTDTLNEAGCV 1948.15 0.7
P42 U247-264 IHTDTLNEAGCVEDTMAA 1891.07 0.7
P43 U253-270 NEAGCVEDTMAAIAGRTM 1840.09 0.7
P44 U259-276 EDTMAAIAGRTMHTFHTE 2019.26 0.7
P45 U265-282 IAGRTMHTFHTEGAGGGH 1837.02 0.7
P46 U271-288 HTFHTEGAGGGHAPDIIK 1845.02 0.7
P47 U277-294 GAGGGHAPDIIKVAGEHN 1699.86 0.7
P48 U283-300 APDIIKVAGEHNILPAST 1846.13 0.7
P49 U289-306 VAGEHNILPASTNPTIPF 1878.13 0.7
P50 U295-312 ILPASTNPTIPFTVNTEA 1886.15 0.7
P51 U301-318 NPTIPFTVNTEAEHMDML 2060.35 0.7
P52 U307-324 TVNTEAEHMDMLMVCHHL 2111.48 0.7
P53 U313-330 EHMDMLMVCHHLDKSIKE 2196.63 0.7
P54 U319-336 MVCHHLDKSIKEDVQFAD 2115.42 0.7
P55 U324-342 DKSIKEDVQFADSRIRPQ 2132.38 0.7
P56 U331-348 DVQFADSRIRPQTIAAED 2032.21 0.7
P57 U337-354 SRIRPQTIAAEDTLHDMG 2011.26 0.7
P58 U343-360 TIAAEDTLHDMGIFSITS 1922.16 0.7
P59 U349-366 TLHDMGIFSITSSDSQAM 1941.18 0.7
P60 U355-372 IFSITSSDSQAMGRVGEV 1884.11 0.7
P61 U361-387 SDSQAMGRVGEVITRTWQ 2021.26 0.7
P62 U367-384 GRVGEVITRTWQTADKNK 2059.33 0.7
P63 U373-390 ITRTWQTADKNKKEFGRL 2192.52 0.7
P64 U379-396 TADKNKKEFGRLKEEKGD 2093.34 0.7
P65 U385-402 KEFGRLKEEKGDNDNFRI 2195.44 0.7
P66 U391-408 KEEKGDNDNFRIKRYLSK 2240.52 0.7
P67 U397-414 NDNFRIKRYLSKYTINPA 2213.54 0.7
P68 U403-420 KRYLSKYTINPAIAHGIS 2032.39 0.7
P69 U409-426 YTINPAIAHGISEYVGSV 1891.13 0.7
P70 U415-432 IAHGISEYVGSVEVGKVA 1815.07 0.7
P71 U421-438 EYVGSVEVGKVADLVLWS 1950.24 0.7
P72 U427-444 EVGKVADLVLWSPAFFGV 1934.28 0.7
P73 U433-450 DLVLWSPAFFGVKPNMII 2047.51 0.7
P74 U439-456 PAFFGVKPNMIIKGGFIA 1907.37 0.7
P75 U445-462 KPNMIIKGGFIALSQMGD 1920.34 0.7
P76 U451-468 KGGFIALSQMGDANASIP 1777.04 0.7
P77 U457-474 LSQMGDANASIPTPQPVY 1889.13 0.7
P78 U463-480 ANASIPTPQPVYYREMFA 2055.36 0.7
P79 U469-486 TPQPVYYREMFAHHGKAK 2160.50 0.7
P80 U475-492 YREMFAHHGKAKYDANIT 2152.44 0.7
P81 U481-498 HHGKAKYDANITFVSQAA 1958.18 0.7
P82 U487-504 YDANITFVSQAAYDKGIK 2004.24 0.7
P83 U493-510 FVSQAAYDKGIKEELGLE 1997.25 0.7
P84 U499-516 YDKGIKEELGLERQVLPV 2086.43 0.7
P85 U505-522 EELGLERQVLPVKNCRNI 2109.47 0.7
P86 U511-528 RQVLPVKNCRNITKKDMQ 2170.63 0.7
P87 U517-534 KNCRNITKKDMQFNDTTA 2128.42 0.7
P88 U523-540 TKKDMQFNDTTAHIEVNP 2089.33 0.7
P89 U519-546 FNDTTAHIEVNPETYHVF 2134.31 0.7
P90 U535-552 HIEVNPETYHVFVDGKEV 2112.34 0.7
P91 U541-558 ETYHVFVDGKEVTSKPAN 2021.23 0.7
P92 U547-564 VDGKEVTSKPANKVSLAQ 1871.14 0.7
P93 U553-569 TSKPANKVSLAQLFSIF 1851.19 0.7
实施例2：不同佐剂组免疫效果评价及抗体应答分析
1.动物免疫及攻毒实验方案
rUreB抗原与不同佐剂联合免疫小鼠。具体免疫方案如下：
实验动物：BALB/c小鼠雌性6-8周龄。
免疫方式：滴鼻、皮下。
免疫体积：滴鼻，8ul/只；皮下，200ul/只。
实验分组：
①rUreB（100ug/只）+弗氏佐剂（体积1:1）。皮下免疫3次（第0,2,4周）。
②rUreB（50ug/只）+CpG（20ug/只）。滴鼻免疫4次（第1,2,3,4周）。
③rUreB（100ug/只）+CpG（20ug/只）。皮下免疫3次（第0,2,4周）。
④rUreB（100ug/只）+AddaVax（体积1:1）。皮下免疫3次（第0，2,4周）。
⑤rUreB（100ug/只）+PBS（体积1:1）。皮下免疫3次（第0,2,4周）。
⑥PBS。皮下免疫3次（第0,2,4周）。
末次免疫后一周，1.0×108CFU幽门螺杆菌灌胃，每天一次，连续4天。攻毒后第4周处死小鼠，检测小鼠胃组织中幽门螺杆菌定值量，分析其免疫保护效果。
2.胃组织中幽门螺杆菌定植量检测
取步骤1处死小鼠1/2胃组织，匀浆后采用细菌基因组提取试剂盒提取DNA。以此为模板采用实时定量PCR检测16S rDNA水平。包括：合成幽门螺杆菌16S rDNA特异性上游引物(SEQ ID NO.:120)：5’-TTTGTTAGAGAAGATAATGACGGTATCTAAC-3’；下游引物(SEQ ID NO.:121)：5’-CATAGGATTTCACACCTGACTGACTATC-3’；Taqman探针：5’-FAM-CGTGCCAGCAGCCGCGGT-TAMRA-3’。绘制标准曲线，依16S rDNA计算出胃局部幽门螺杆菌的定植量（Roussel Y，Wilks M,Harris A,Mein C,Tabaqchali S.Evaluation of DNAextraction methods from mouse stomachs for the quantification of H.pylori byreal-time PCR.J Microbiol Methods 2005;62(1):71-81）。测定结果如图1所示，可见CpG滴鼻组和弗氏佐剂皮下注射组胃局部幽门螺杆菌定植量明显降低，其它各组与PBS对照组相比无明显区别。
3.血清抗UreB IgG抗体检测
UreB抗原（终浓度5ug/ml）包被ELISA板，将上述步骤获得的免疫血清按1:1000稀释作为一抗，辣根酶标记山羊抗小鼠IgG抗体作为二抗，分别测定450nm处的OD值。结果如图2A所示，可见免疫组血清IgG抗体水平较PBS组明显增高，佐剂免疫组中CpG皮下组、AddaVax皮下组、弗氏佐剂皮下注射组血清抗体水平较CpG滴鼻组明显要高。
4.胃局部抗UreB sIgA抗体检测
取步骤1处死小鼠1/2胃组织，加500ul生理盐水，匀浆，8000rpm，5min离心，取上清得胃局部sIgA溶液。
UreB抗原（终浓度5ug/ml）包被ELISA板，上述sIgA溶液作为一抗，辣根酶标记山羊抗小鼠IgA抗体作为二抗，分别测定450nm处的OD值。结果如图2B所示，可见CpG滴鼻组可诱导胃粘膜局部产生明显的sIgA抗体，其它各组与对照组无区别。
实施例3：小鼠脾脏中淋巴细胞的收集和保存
无菌条件下分离小鼠脾脏，研磨，制成单细胞悬液，经小鼠淋巴细胞分离液密度梯度离心后收集白膜层淋巴细胞。分离得到的脾淋巴细胞除体外培养使用之外，多余细胞用冻存液调整细胞浓度为1×107/mL，以1mL/管的量加入冻存管，放入冻存盒-70℃过夜，转入液氮冻存。
实施例4：脾组织中抗原特异性CD4+T淋巴细胞的体外扩增
1.体外扩增抗原特异性T细胞
免疫后小鼠脾脏按上述实施例3中所述处理，得脾淋巴细胞，完全1640培养基调整细胞浓度为2.5×106/ml，铺于12孔板，4ml/孔。添加mIL-2至终浓度5U/ml，同时以0.5μM终浓度rUreB刺激培养，5天后再次进行淋巴细胞分离，在20U/ml mIL-2条件下继续培养，直至检测。
2.UreB抗原特异性CD4+T淋巴细胞频率的检测分析
收集步骤1中培养的细胞，离心去除含有mIL-2的培养基（mIL-2会刺激细胞非特异性应答）。加入新鲜不含mIL-2的RPMI-1640完全培养基重悬细胞至1×106/ml。96孔U型板中加入100微升RPMI-1640完全培养基，然后加入刺激肽段1μl（终浓度10μM）及Golgistop 0.15μl，再加入细胞悬液100μl，37℃、5%CO2细胞孵箱培养5个小时后离心收集细胞，用FITC标记的抗小鼠CD3单抗、APC标记的抗小鼠CD4单抗以及PE标记的抗小鼠IFN-γ单抗进行染色，流式细胞仪检测分泌IFN-γ的CD4+T细胞的比例。结果可见免疫组抗原特异性CD4+T细胞的比例明显高于PBS对照组（图3A-3B）。
实施例5：利用抗原特异性CD4+T细胞和步移合成的重叠肽进行免疫显性表位肽的筛选
1.免疫显性的18个氨基酸短肽的筛选
按照实施例4方法，体外培养各佐剂免疫组抗原特异性CD4+T细胞。利用实施例1中合成的93条18个氨基酸短肽分别刺激细胞5h，按实施例4中描述的流式细胞术方法检测各短肽刺激所产生的特异性T细胞频率。
2.针对所筛选的免疫显性18个氨基酸表位肽，进行13个氨基酸短肽的步移重叠合成
针对步骤1中所筛选到的免疫显性18个氨基酸短肽，采用步移法合成13个氨基酸短肽，每次步移两个氨基酸（上海吉尔生化公司合成），合成肽纯度均大于90%。合成肽信息表见表2。合成肽用二甲亚砜（DMSO）溶解成10mM，分装，-70℃冻存。使用时用DMSO稀释成1mM，工作浓度为5μM。
表2步移合成免疫显性18mer肽的13me短肽基本信息
(依次分别为SEQ ID NO..94-119)
序号 编号 序列信息 分子量 纯度
P53-1 U311-323 EAEHMDMLMVCHH 1582.87 0.9167
P53-2 U313-325 EHMDMLMVCHHLD 1610.92 0.9815
P53-3 U315-327 MDMLMVCHHLDKS 1559.92 0.9918
P53-4 U317-329 MLMVCHHLDKSIK 1554.96 0.9759
P53-5 U319-331 MVCHHLDKSIKED 1554.81 0.9378
P63-1 U371-383 EVITRTWQTADKN 1561.73 0.8751
P63-2 U373-385 ITRTWQTADKNKK 1589.93 0.9244
P63-3 U375-387 RTWQTADKNKKEF 1651.86 0.8821
P63-4 U377-389 WQTADKNKKEFGR 1607.80 0.9596
P63-5 U379-391 TADKNKKEFGRLK 1534.79 0.9691
P68-1 U401-413 RIKRYLSKYTINP 1651.99 0.9360
P68-2 U403-415 KRYLSKYTINPAI 1566.88 0.9423
P68-3 U405-417 YLSKYTINPAIAH 1490.74 0.9359
P68-4 U407-419 SKYTINPAIAHGI 1384.61 0.9441
P68-5 U409-421 YTINPAIAHGISE 1385.55 0.9189
P68-6 U411-423 INPAIAHGISEYV 1383.58 0.9307
P68-7 U413-425 PAIAHGISEYVGS 1300.45 0.9056
P68-8 U415-427 IAHGISEYVGSVE 1360.50 0.9640
P81-1 U479-491 FAHHGKAKYDANI 1471.65 0.9737
P81-2 U481-493 HHGKAKYDANITF 1501.68 0.9322
P81-3 U483-495 GKAKYDANITFVS 1413.61 0.9025
P81-4 U485-497 AKYDANITFVSQA 1427.59 0.9668
P81-5 U487-499 YDANITFVSQAAY 1462.59 0.9033
P81-6 U489-501 ANITFVSQAAYDK 1427.59 0.9491
P81-7 U491-503 ITFVSQAAYDKGI 1412.62 0.9145
P81-8 U493-505 FVSQAAYDKGIKE 1455.64 0.9293
3.18个氨基酸显性短肽的特异性T淋巴细胞的体外扩增
调整各组脾淋巴浓度为5×106/ml，12孔板中加入2ml RPMI-1640完全培养基，再加入免疫显性18个氨基酸短肽（终浓度5μM），与2ml细胞混匀。按照实施例4第1步所述方法进行培养。
4.免疫显性13个氨基酸短肽的筛选
免疫显性18个氨基酸多肽特异性T淋巴细胞体外培养至第6天，用上述第2点中步移合成的相应13个氨基酸短肽刺激，按实施例4第2步所述的ICS方法检测各短肽刺激产生的特异性T细胞的频率。
结果：不同佐剂免疫组筛选得到的免疫显性18mer多肽存在差异，如图4。CpG滴鼻组免疫显性18mer肽为P63，CpG皮下注射组免疫显性18mer肽为P53、P68-69，CFA皮下注射组免疫显性18mer肽为P53、P68-69，AddaVax皮下注射组免疫显性18mer肽为P81-82，rUreB单独皮下注射组免疫显性18mer肽为P81-82。对免疫显性18mer肽相应的13个氨基酸短肽进行筛选发现，P53-4、P63-2、P68-5、P81-4可诱导与对应18mer多肽相当的信号，如图5A-图5F，即此13mer短肽为相应佐剂免疫组的免疫显性表位。
实施例6：利用MHC分子抗体阻断实验确定显性表位肽的MHC限制性
1.免疫显性13mer短肽P53-4、P63-2、P68-5、P81-4特异性T淋巴细胞的体外扩增
调整脾淋巴细胞浓度为5×106/mL，12孔板中加入2ml RPMI-1640完全培养基，分别加入免疫显性13个氨基酸短肽P53-4、P63-2、P68-5、P81-4（终浓度5μM），与2ml细胞悬液混匀，按实施例4第1步所述方法进行培养。
2.利用MHC分子抗体阻断实验确定免疫显性表位P53-4、P63-2、P68-5、P81-4的MHC限制性
收集第1步中培养6d的13mer短肽特异性T淋巴细胞，离心去除含mIL-2的培养基，以新鲜的不含mIL-2的RPMI-1640完全培养基重悬细胞至1×106/mL，分至96孔U型板4孔，100μL/孔，其中三孔分别加入MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ（I-A）、MHC-Ⅱ（I-E）三种抗体各1μL，另外一孔加入不含mIL-2的RPMI-1640完全培养基1μL，混匀，37℃、5%CO2细胞培养孵箱培养30分钟，每孔再加入100μL含13mer显性表位（终浓度10μM）和0.15μL GolgiStop的RPMI-1640完全培养基，混匀后37℃、5%CO2细胞孵箱培养5个小时，收集细胞进行ICS和流式检测。
结果：免疫显性13mer短肽刺激表位特异性T细胞的应答均可被MHC-Ⅱ（I-A）单抗阻断，而不能被MHC-Ⅰ和MHC-Ⅱ（I-E）单克隆抗体所阻断（图6），证明免疫显性13mer表位均为MHC-Ⅱ（I-A）限制性。
实施例7：显性表位肽的免疫保护效果评价
1.显性表位肽免疫及攻毒方案
将筛选到的免疫显性表位肽与佐剂CpG联合，滴鼻免疫小鼠，具体免疫方案如下：
实验动物：BALB/c小鼠雌性6-8周龄。
免疫方式：滴鼻。
免疫体积：8ul/只。
佐剂：CpG OND 1826：20ug/只。
表位肽：50ug/只。
实验分组：
①P53+CpG。滴鼻免疫4次（1、2、3、4周）。
②P63+CpG。滴鼻免疫4次（1、2、3、4周）。
③P68-69+CpG。滴鼻免疫4次（1、2、3、4周）。
④P81-82+CpG。滴鼻免疫4次（1、2、3、4周）。
⑤P7（对照肽）+CpG。滴鼻免疫4次（1、2、3、4周）。
⑥PBS+CpG。滴鼻免疫4次（1、2、3、4周）。
末次免疫后一周，1.0×108CFU幽门螺杆菌灌胃，每天一次，连续4天。攻毒后4周处死小鼠，评价免疫保护效果。
2.胃局部幽门螺杆菌定植量检测
取步骤1处死小鼠1/2胃组织，匀浆后采用细菌基因组提取试剂盒提取DNA。以此为模板采用实时定量PCR检测16S rDNA水平。包括：合成幽门螺杆菌16S rDNA特异性上游引物(SEQ ID NO.:120)：5’-TTTGTTAGAGAAGATAATGACGGTATCTAAC-3’,下游引物(SEQ ID NO.:121)：5’-CATAGGATTTCACACCTGACTGACTATC-3’，Taqman探针：5’-FAM-CGTGCCAGCAGCCGCGGT-TAMRA-3’。绘制标准曲线，依16S rDNA计算出胃局部幽门螺杆菌的定植量。测定结果如图7所示，可见P53、P63表位免疫组胃局部幽门螺杆菌定植量明显降低，其它各组与PBS对照组相比无统计学差异，说明P53、P63为免疫保护性表位。
3.血清IgG抗体检测
UreB抗原（终浓度5ug/ml）和相应显性表位（终浓度5ug/ml）分别包被ELISA板，将上述步骤获得的免疫血清按1:10稀释作为一抗，辣根酶标记山羊抗小鼠IgG抗体作为二抗，分别测定450nm处的OD值。结果如图8A和图8B所示，可见表位免疫组不能有效诱导机体产生抗UreB和抗表位的血清IgG抗体。
4.胃局部sIgA抗体检测
取步骤1处死小鼠1/2胃组织，加500ul生理盐水，匀浆，8000rpm，5min离心，取上清得胃局部sIgA溶液。
UreB抗原（终浓度5ug/ml）和相应显性表位（终浓度5ug/ml）包被ELISA板，上述sIgA溶液作为一抗，辣根酶标记山羊抗小鼠IgA抗体作为二抗，分别测定450nm处的OD值。结果如图9A和图9B所示，可见表位免疫组不能有效诱导机体产生抗UreB和抗表位的粘膜sIgA抗体。
实施例8：表位肽免疫小鼠的脾组织中表位特异性CD4+T淋巴细胞的应答分析
1.特异性T细胞的培养
分离实施例7中各表位免疫组小鼠的脾，研磨制单细胞悬液，经小鼠淋巴细胞分离液分离，收集白膜层脾淋巴细胞。RPMI-1640完全培养基调整细胞浓度为2.5×106/ml，铺于12孔板，4ml/孔。添加mIL-2至终浓度5U/ml，同时以0.5μM终浓度rUreB刺激培养，5天后再次进行淋巴细胞分离，在20U/ml mIL-2条件下继续培养，直至检测。
2.表位肽免疫小鼠的脾组织中表位肽特异性CD4+T细胞应答频率分析
收集第1步中经rUreB蛋白抗原刺激培养6d的细胞，离心去除含有mIL-2的培养基，加入新鲜的不含mIL-2的RPMI-1640完全培养基重悬细胞至1×106/ml，96孔U型板中加入100μl RPMI-1640完全培养基，然后加入刺激肽段1μl（终浓度10μM）及Golgistop 0.15μl，再加入细胞悬液100μl，37℃、5%CO2细胞孵箱培养5个小时后离心收集细胞，用FITC标记的抗小鼠CD3单抗、APC标记的抗小鼠CD4单抗以及PE标记的抗小鼠IFN-γ单抗进行染色，流式细胞仪检测分泌IFN-γ的CD4+T细胞的比例。结果如图10，可见优势应答表位P53、P63、P68-69、P81-82滴鼻免疫可诱导机体针对相应表位产生特异性CD4+T细胞，非应答表位P7即使免疫机体也不能诱导产生表位特异性CD4+T细胞。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并非用来限定本发明的实施范围；如果不脱离本发明的精神和范围，对本发明进行修改或者等同替换，均应涵盖在本发明权利要求的保护范围当中。
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Claims (9)

1.一种幽门螺杆菌免疫显性表位肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO:97、100、108和115所示。
2.根据权利要求1所述的幽门螺杆菌免疫显性表位肽，其特征在于，所述表位肽具有MHC-Ⅱ（I-A）限制性。
3.权利要求1或2所述的幽门螺杆菌免疫显性表位肽在制备用于预防或治疗幽门螺杆菌感染的制剂中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述制剂为疫苗。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述疫苗为蛋白疫苗或核酸疫苗。
6.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述制剂包含医学上可接受的免疫佐剂。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述免疫佐剂为弗氏佐剂、CPGODN 1826或AddaVax。
8.制备权利要求1所述的幽门螺杆菌免疫显性表位肽的方法，其特征在于，有以下步骤：
1）从蛋白数据库中获取幽门螺杆菌来源的UreB蛋白质序列；
2）从步骤1）获取的UreB蛋白质序列的第1号氨基酸开始，每次步移6个氨基酸，以步移重叠的18个氨基酸为一个多肽段，形成第一多肽库，和/或在获得的第一多肽中
3）利用抗原特异性CD4+T细胞从步骤2）所述的第一多肽库中筛选18个氨基酸短肽的免疫显性表位肽；
4）利用步骤3）筛选出的18个氨基酸短肽的免疫显性表位肽采用步移法，每次步移2个氨基酸，以步移重叠的至少13个氨基酸为一个多肽段，形成第二多肽库；
5）利用抗原特异性CD4+T细胞从步骤4）所述的第二多肽库中筛选13个氨基酸短肽的免疫显性表位肽；
6）利用MHC分子抗体阻断实验确定步骤5）筛选的免疫显性表位肽的限制性。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，步骤2）所述的第一多肽库的多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:1-93所示；第二多肽库的多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:94-119所示。
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