CN116284268A - 新型冠状病毒特异性cd4+和cd8+t细胞表位肽及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于基因工程和蛋白质工程技术领域，具体涉及新型冠状病毒特异性CD4+和CD8+T细胞表位肽及其应用。本发明围绕新型冠状病毒的结构蛋白特异性CD4+和CD8+T细胞展开研究，通过离体刺激法筛选出四个结构蛋白中的免疫优势应答抗原为核衣壳蛋白，同时按照三维矩阵模型构建子肽库，进一步筛选出CD4+T细胞表位肽N391‑408和CD8+T细胞表位肽N19‑36，并鉴定了优势应答肽段特异性T细胞的免疫表型，验证了优势表位特异性T细胞的保护功能。本发明的新型冠状病毒特异性CD4+和CD8+T细胞表位肽可用于疫苗效果评估以及抗原感染诊断试剂开发，且具有较大的疫苗应用价值及制备表位疫苗的潜力。
Description
技术领域
本发明属于基因工程和蛋白质工程技术领域，具体涉及新型冠状病毒特异性CD4+和CD8+ T细胞表位肽及其应用。
背景技术
严重急性呼吸系统综合症冠状病毒2(Sever Acute Respiratory SyndromeCoronavirus 2,SARS-CoV-2)是继严重急性呼吸综合症冠状病毒(Sever AcuteRespiratory Syndrome Coronavirus 1,SARS-CoV-1)和中东呼吸综合症冠状病毒(MiddleEast respiratory syndrome coronavirus,MERS-CoV)外第三种能具有致命性的呼吸相关疾病，第七种能感染人的新型β冠状病毒。
疫苗是防控病原微生物感染的有效手段，通过疫苗接种实现SARS-CoV-2病毒群体免疫是全球公共卫生安全的迫切需求。据WHO报道，目前基于11个疫苗平台有超过150种新型冠状病毒疫苗处于临床研发阶段，其中有46种已在III期临床试验中进行了评估。其中灭活病毒疫苗因其制造方法简单且技术成熟，同时不含有病毒活性成分而具有较高安全性的优势，成为大多数人类疫苗研发的选择之一。目前全球被批准使用的新型冠状病毒灭活疫苗共计11种，包括国药北京生物新型冠状疫苗Sinopharm(Beijing)Covilo(BBIBP-CorV)，科兴新型冠状疫苗Sinovac CoronaVac，印度巴拉特生物技术公司疫苗Bharat BiotechCovaxin(BBV152)等。其中BBIBP-CorV因其良好的保护效率(78.1％)、易于储藏，且未发现严重的安全问题，于2021年5月7日被WHO批准紧急使用(Emergency use authorization,EUA)，是首个中国获得紧急使用认证的新型冠状病毒疫苗。截止目前，BBIBP-CorV已在10个国家被批准上市，在全球91个国家批准使用，是接种最广泛的新型冠状病毒灭活疫苗。
SARS-COV-2病毒基因组共编码29个蛋白，包括4种结构蛋白，16种非结构蛋白以及9种辅助蛋白。其中包膜蛋白(envelope protein,E)、膜蛋白(membrane protein,M)、核衣壳蛋白(nucleocapsid protein,N)和刺突蛋白(Spike protein,S)作为病毒的结构蛋白是病毒复制和传播过程中不可或缺的成分。病毒感染后，机体产生有效的体液免疫和细胞免疫是控制感染的关键。相较于体液免疫产生的中和抗体(Neutralizing antibody,NAb)特异性靶向于S蛋白的受体结合区(Receptor binding domain,RBD)，机体细胞免疫应答产生的特异性CD4+和CD8+T细胞能够针对病毒所有蛋白组分而发挥效应。其中CD4+辅助性T细胞能够协调适应性免疫并帮助B细胞产生抗体，而CD8+细胞毒性T细胞能杀伤靶细胞以消除病毒。几乎所有COVID-19患者体内都证实存在T细胞的激活，并且在缺乏B细胞的X-连锁且无丙种球蛋白血症(XLA)患者中，仍然有报道感染SARS-CoV-2病毒后恢复的病例，这些都提示T细胞应答在COVID-19患者免疫反应中发挥了重要的保护作用。参考其他感染人的β冠状病毒所激发的机体适应性免疫规律，能为了解SARS-CoV-2感染后机体的免疫应答特征发挥提示作用。据文献报道，在SARS-CoV-1患者中，B细胞应答平均维持2年而T细胞反应能持续17年。相似的，在MERS病毒感染的中东呼吸综合症患者中T细胞应答也较抗体应答更加持久。同时，有研究发现第二剂新型冠状病毒疫苗BNT162b2和ChAdox1免疫后机体内针对S蛋白的抗体在10周内下降了50％以上，而特异性细胞免疫可能持续10年。因此，T细胞免疫应答是长期控制SARS-CoV-2病毒感染的关键，而建立有效的保护型特异性T细胞应答将为COVID-19的防治提供新的方向。
SARS-CoV-2病毒通过S蛋白的RBD区与宿主受体细胞的血管紧张素转化酶2(angiotensin-converting enzyme 2,ACE2)结合将病毒遗传物质RNA打入宿主细胞，由此开始了病毒的复制、转录、包装和释放。抗原提呈细胞(Antigen-presenting cell,APC)主要包括树突状细胞DC、单核巨噬细胞、B细胞、被病毒感染的靶细胞等，能够将摄取的抗原分子降解并加工处理成多肽片段，并以抗原肽-MHC分子复合物(MHC即组织相容性复合体)的形式表达于APC细胞的表面，抗原肽-MHC分子复合物在与T细胞接触的过程中被表达相应TCR受体的T细胞识别，从而活化T细胞并发挥效应功能。因此，筛选具有免疫优势的保护性T细胞表位能为疫苗的研发提供潜在靶点。
综上可见，基于新型冠状病毒免疫原性最强的四个结构蛋白，筛选出免疫优势抗原并进一步筛选优势应答表位，将为优化SARS-CoV-2疫苗的研发提供坚实的理论基础，并有利于在人群中预防COVID-19、对疫苗免疫效果进行评估以及感染后抗原的检测。
发明内容
为了克服上述现有技术的不足，本发明的首要目的是提供一种新型冠状病毒特异性CD4+和CD8+ T细胞表位肽。本发明围绕SARS-CoV-2病毒的结构蛋白特异性CD4+和CD8+T细胞展开研究，用体外检测的方法筛选出四种结构蛋白中的优势抗原，并利用三维矩阵模型构建优势抗原子肽库，进而筛选得到两种免疫优势应答的肽段：CD4+T细胞表位肽N391-408和性CD8+T细胞表位肽N19-36。
本发明的第二个目的是提供上述新型冠状病毒特异性CD4+和CD8+ T细胞表位肽的应用。本发明的新型冠状病毒特异性CD4+和CD8+ T细胞表位肽可用于疫苗效果评估的补充以及抗原感染诊断试剂的开发，且具有较大的疫苗应用价值以及制备表位疫苗的潜力。
本发明的上述第一个目的是通过以下技术方案来实现的：
本发明一方面提供了一种新型冠状病毒特异性CD4+T细胞表位肽，所述CD4+T细胞表位肽具有如SEQ ID NO.66所示的氨基酸序列。
具体地，所述免疫优势CD4+T细胞表位肽序列为TVTLLPAADLDDFSKQLQ。
本发明另一方面提供了一种新型冠状病毒特异性CD8+T细胞表位肽，所述CD8+T细胞表位肽具有如SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列。
具体地，所述免疫优势CD8+T细胞表位肽序列为GPSDSTGSNQNGERSGAR。
本发明首先通过结构蛋白肽库的离体检测，分别比较CD4+和CD8+特异性T细胞应答水平在E、M、N、S四个结构蛋白抗原上的强度与分布，发现N和S抗原特异性T细胞的比例要显著性高于E和M抗原特异性T细胞的占比，但N和S抗原两者应答强度的差异不具有统计学意义。分析抗原特异性T细胞分泌IFN-γ、IL-2、TNF-α的细胞因子表达谱，其中能分泌2或3种细胞因子的特异性CD4+和CD8+T细胞的占比在N和S抗原刺激后要高于E和M抗原的刺激，说明N和S肽库特异性T细胞的多功能性高于E和M肽库特异性T细胞。比较四个结构蛋白抗原的优势应答频次，发现无论是CD4+还是CD8+T细胞应答水平，N、S蛋白肽库的优势应答频次均高于E、M蛋白，且在CD4+T细胞应答水平N蛋白的优势频次相较于S蛋白更高。
接着聚焦于N蛋白抗原，根据三维矩阵模型构建N抗原子肽库Pool 1-13，通过子肽库分别对PBMC的离体刺激，比对出在矩阵中三个维度上分别应答最强的子肽库，推导出该个体的T细胞优势应答肽段，并综合40个标本的结果统计出人群最优势应答的CD4+和CD8+T细胞应答肽段。其中，CD8+T细胞优势肽段为N19-36(GPSDSTGSNQNGERSGAR)，CD4+T细胞优势肽段为N391-408(TVTLLPAADLDDFSKQLQ)。
本发明还提供了上述的新型冠状病毒特异性CD4+T细胞表位肽或上述的新型冠状病毒特异性CD8+T细胞表位肽的编码基因。
本发明还提供了含有上述编码基因(CD4+T细胞表位肽编码基因和/或CD8+T细胞表位肽编码基因)的生物材料，所述生物材料包括重组表达载体、表达盒、重组菌或宿主细胞。
本发明的上述第二个目的是通过以下技术方案来实现的：
本发明还提供了上述的新型冠状病毒特异性CD4+T细胞表位肽或新型冠状病毒特异性CD8+T细胞表位肽在制备评估新型冠状病毒疫苗效果的相关试剂或试剂盒中的应用。
本发明还提供了上述的新型冠状病毒特异性CD4+T细胞表位肽或新型冠状病毒特异性CD8+T细胞表位肽在制备新型冠状病毒感染诊断试剂或试剂盒中的应用。
本发明还提供了上述的新型冠状病毒特异性CD4+T细胞表位肽或新型冠状病毒特异性CD8+T细胞表位肽在制备防治新型冠状病毒疫苗中的应用。
本发明进一步围绕核衣壳蛋白CD4+ T细胞免疫优势表位N391-408和CD8+ T细胞免疫优势表位N19-36的特异性T细胞的免疫表型开展鉴定工作，包括记忆效应表型、活化表型，并对免疫优势表位SEQ ID NO.4的特异性CD8+ T细胞中分泌杀伤性细胞因子perforin、Granzyme A和Granzyme B的比例进行分析。结果发现，N391-408特异性CD4+T细胞主要为TEM表型，能迁移到指定位置发挥即刻的效应功能，而N19-36特异性CD8+ T细胞主要是TEMRA表型，虽然增殖活力较低，但能分泌细胞因子，并发挥细胞毒效应；通过检测出N19-36特异性CD8+T细胞中分泌杀伤性细胞因子granzyme A、granzyme B和perforin的细胞，其占比分别为62.48±12.60％,59.28±8.75％,47.42±7.43％。上述结果提示筛选到的优势CD4+ T细胞表位N391-408和优势CD8+ T细胞表位N19-36特异性T细胞对新型冠状病毒感染的免疫保护潜能，有望用于新型冠状病毒疫苗效果评价、抗原感染诊断以及防治疫苗的开发。
本发明还提供了一种多肽疫苗，所述多肽疫苗包括上述的新型冠状病毒特异性CD4+T细胞表位肽和/或新型冠状病毒特异性CD8+T细胞表位肽。
优选地，所述多肽疫苗还包括药学上可接受的佐剂。进一步地，所述佐剂包括但不限于壳聚糖、载体蛋白。
本发明还提供了一种用于新型冠状病毒疫苗效果评价或抗原感染诊断的试剂盒，所述试剂盒包括上述的新型冠状病毒特异性CD4+T细胞表位肽和/或新型冠状病毒特异性CD8+T细胞表位肽。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明围绕新型冠状病毒的结构蛋白特异性CD4+和CD8+T细胞展开研究，用离体刺激的检测方法筛选出四个结构蛋白的免疫优势应答抗原为核衣壳蛋白；接着以N抗原为基础，通过三维矩阵模型构建了13个子肽库，在Pool 1-13的离体刺激下比对出在矩阵中三个维度上分别应答最强的子肽库，并推导出该个体免疫优势应答肽段；最后综合多个标本的结果，统计出人群优势应答的CD4+和CD8+T细胞肽段。其中，CD8+T细胞优势肽段为N19-36(GPSDSTGSNQNGERSGAR)，CD4+T细胞优势肽段为N391-408(TVTLLPAADLDDFSKQLQ)。同时，进一步通过鉴定优势应答肽段特异性T细胞的免疫表型，提示了优势表位特异性T细胞的保护功能，并且筛选到的优势应答肽段可用于防治新型冠状病毒疫苗的研发。本发明的新型冠状病毒特异性CD4+和CD8+T细胞表位肽可用于新型冠状病毒疫苗效果评价以及抗原感染诊断试剂的开发，同时表位中不含有不必要的部分，具有较大的疫苗应用价值和制备表位疫苗的潜力，为深入认识新型冠状病毒感染后机体免疫应答的功能与机制奠定了基础，并为解析新型冠状病毒灭活疫苗的分子保护机制提供了新思路。
附图说明
图1为E、M、N、S和T肽库离体刺激PBMC后分泌IFN-γ的特异性CD4+与CD8+T细胞占比的检测结果(a和c图为5个肽库刺激后特异性T细胞应答强度的比较，b和d图为检测的113个标本中5个肽库特异性T细胞应答强度的热图展示，从左到右为标本1-113；**p＜0.01，***p<0.001，****p＜0.0001)；
图2为E、M、N、S和T肽库特异性T细胞分泌IFN-γ、IL-2、TNF-α的细胞因子表达谱(展示了5个肽库刺激下能分泌一种、两种和三种细胞因子的T细胞数量的占比)；
图3为E、M、N和S蛋白抗原的优势应答频次结果(左图为CD4+T细胞应答水平各抗原的优势应答频次，右图为CD8+T细胞应答水平各抗原的优势应答频次)；
图4为N蛋白抗原68条18mer肽段三维矩阵子肽库的构建模型(矩阵的三个维度上分别包含Pool 1-4，Pool 5-8以及Pool 9-13子肽库，其中每条肽段同时出现在三个维度中的不同的子肽库中，且每个子肽库包含的肽段不超过20条)；
图5为N抗原子肽库Pool 1-13刺激后代表性标本特异性CD4+ T细胞的流式图。(该个体在矩阵的三个维度上的CD4+T细胞应答最强的子肽库分别为Pool 4、Pool 6和Pool10，推导出该个体的CD4+T细胞优势应答肽段为N-66)；
图6为N抗原子肽库Pool 1-13刺激后代表性标本特异性CD8+T细胞的流式图。(该个体在矩阵的三个维度上CD8+T细胞应答最强的子肽库分别为Pool 1、Pool 8和Pool 9，推导出该个体CD8+T细胞优势应答肽段为N-4)；
图7为优势应答肽段整合40个标本后的分析结果【15％的个体(6个)的CD8+T细胞优势肽段为N19-36(GPSDSTGSNQNGERSGAR)，17.5％的个体(7个)的CD4+T细胞优势肽段为N391-408(TVTLLPAADLDDFSKQLQ)】；
图8为免疫优势肽N19-36和N391-408氨基酸序列的同源性比对分析结果(N19-36和N391-408在另外6种能感染人的β冠状病毒中均具有高度的种间特异性，并在6种受关注的SARS-CoV-2病毒变异株中呈现出高度的保守性)；
图9为N19-36特异性CD8+T细胞和N391-408特异性CD4+T细胞的记忆效应表型与活化表型的分析结果，以及N19-36特异性CD8+T细胞中分泌杀伤性细胞因子perforin、Granzyme A和Granzyme B的占比(a、c、e图为代表性流式图，b、d、f为结果统计柱状图)。
具体实施方式
下面对本发明的具体实施方式作进一步说明。在此需要说明的是，对于这些实施方式的说明用于帮助理解本发明，但并不构成对本发明的限定。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为可通过常规的商业途径购买得到。
下列实施例中涉及的多肽均由上海强耀公司通过重叠肽合成技术合成。
下列实施例中涉及的外周全血样本来自2021年1月以来在中山大学附属第八医院体检并接种3剂BBIBP-CorV灭活疫苗的健康成年人。本实验经中山大学附属第八医院伦理审查委员会批准(2021-005-01)。
实施例1新型冠状病毒特异性CD4+与CD8+ T细胞优势应答抗原的筛选
1、SARS-CoV-2结构蛋白抗原18mer步移重叠肽的合成
基于NCBI公布的Wuhan-Hu-1病毒株序列可知SARS-CoV-2四个结构蛋白E、M、N和S分别含有75、222、419和1273个氨基酸，其中E蛋白的NCBI登录号为YP_009724392.1，M蛋白的NCBI登录号为YP_009724393.1，N蛋白的NCBI登录号为YP_009724397.2，S蛋白的NCBI登录号为YP_009724390.1。
以从第1个氨基酸开始每次步移6个氨基酸，重叠12个氨基酸的方式分别合成覆盖E、M、N和S蛋白序列全长的11条、35条、68条和210条18个氨基酸短肽，共计324条，且纯度均大于90％。将这些冻干肽短暂高速离心后用二甲基亚砜(DMSO)溶解为20mM的储存浓度，分装并冻存于-80℃冰箱。
2、检测SARS-CoV-2结构蛋白抗原特异性CD4+和CD8+T细胞应答筛选优势抗原
(1)人外周血单个核细胞(Peripheral blood mononuclear cell,PBMC)的体外分离
共收集113例未感染SARS-CoV-2病毒且接种了3剂国药北京生物新型冠状病毒疫苗BBIBP-CorV体检者的2mL静脉全血标本。取一支15mL离心管，加入4mL的淋巴细胞分离液(天津灏洋TBD生物制品科技有限公司)，向血液样本中加入等量的生理盐水(2mL)进行稀释，用3mL巴氏吸管动作轻柔的将稀释后的血液样本混匀并缓慢悬滴加入分离液上层，过程中注意不要破坏分离液与血标本分离界面。将加入分离液和全血的15mL离心管放入离心机，将离心机程序调整为离心力为800g，升降速度为0，离心20分钟。离心完毕后离心管内液体从液面到底部分为四层，依次为血浆层、单个核细胞层、分离液层、红细胞和粒细胞层。先用3mL巴士吸管将最上层的血浆层吸弃，后用新的巴士吸管将乳白色的单个核细胞层吸至新的15mL离心管中，用5倍于单个核细胞层体积的生理盐水洗涤，250g离心10分钟。重复两次洗涤后，将得到的细胞沉淀用1640完全培养基进行重悬并计数，以5×105cells/well的密度将100uL细胞悬液铺于96孔U底板中。
(2)蛋白肽库的构建以及PBMC的离体刺激
分别构建SARS-CoV-2四个结构蛋白E、M、N、S的抗原肽库以及这四个结构蛋白的合并肽库T，其中E肽库包括：E1-E11共计11条肽段，M肽库包括M1-M35共计35条肽段，N肽库包括N1-N68共计68条肽段，S肽库包括S1-S210共计210条肽段，而T肽库中含有E、M、N、S四个结构蛋白的所有肽段共计324条。在1640完全培养基中分别加入肽段浓度为1.5μM的E、M、N、S和T肽库，并按0.15uL/well加入高尔基体阻断剂GolgiStop(BD，美国)来抑制分泌蛋白通过高尔基体转运至细胞外。将100uL含有肽库和GolgiStop的1640培养基加入铺好PBMC的96孔U底板中，同时，以DMSO刺激孔和PMA+ionomycin(达科为生物技术有限公司)刺激孔分别作为本实验的阴性和阳性对照。最后将该刺激体系置于37℃、5％CO2孵箱中培养5小时
(3)细胞内因子染色(Intracellular cytokine staining，ICS)实验
①死细胞的染色：PBMC体外刺激5小时之后，1800rpm离心5分钟，弃去上清，用PBS缓冲液将Zombie UV Fixable Viability母液(Biolegend，美国)以1:1000的比例稀释为工作液，按每孔100uL加入96孔U底板并重悬PBMC沉淀，室温避光染色20分钟。
②细胞表面标志物的染色：每孔加入150uL的PBS缓冲液，1800rpm离心5分钟，弃去上清，除掉多余的Zombie死细胞染料。用PBS缓冲液将APC-Cy7抗人CD3抗体，AF700抗人CD4抗体，FITC抗人CD8抗体(Biolegend，美国)按1:200比例进行稀释，按每孔50uL加入含有上述抗体的PBS缓冲液并重悬PBMC沉淀，4℃避光染色30分钟。
③细胞的固定：每孔加入200uL的PBS缓冲液，1800rpm离心5分钟，弃去上清，除去游离的细胞表面标志物抗体，再以每孔100uL加入4％的多聚甲醛(Biolegend，美国)并重悬PBMC沉淀，4℃避光染色20分钟。
④细胞破膜处理：每孔加入0.2％皂苷工作液(Biolegend，美国)200uL，1800rpm离心5分钟，弃去上清，除去多聚甲醛固定液，并重复一遍此步骤。
⑤细胞内因子染色：用0.2％的皂苷工作液将APC抗人IFN-γ抗体，PE-Dazzle594抗人TNF-α抗体，BV650抗人IL-2抗体(Biolegend，美国)按1:100的比例稀释后，每孔加入50uL并重悬PBMC沉淀，4℃避光染色30分钟。
⑥每孔加入200uL的0.2％皂苷工作液，1800rpm离心5分钟,弃去上清，除去游离的细胞内因子抗体，每孔加入200uL的PBS缓冲液重悬PBMC沉淀。通过LSRFortessa流式细胞仪(BD，美国)上机检测，利用FACSDiva软件(BD，美国)进行信号的收集，并使用FlowJo X软件对所得的FCS文件进一步分析。
⑦分别比较在SARS-CoV-2病毒E、M、N、S蛋白肽库以及这四个结构蛋白总肽库T的刺激下，PBMC中分泌IFN-γ的抗原特异性CD4+和CD8+T细胞占比，对灭活疫苗免疫后SARS-CoV-2结构蛋白中的优势抗原进行筛选。
如图1所示，分泌IFN-γ的T肽库特异性CD4+和CD8+T细胞占比最高，N、S抗原特异性CD4+和CD8+T比例高于E、M抗原特异性T细胞的占比，但无论是CD4+还是CD8+T细胞应答水平，N、S抗原间的特异性T细胞比率没有统计学差异。同时，分析抗原特异性T细胞分泌IFN-γ、IL-2、TNF-α的细胞因子表达谱，比较这三种细胞因子中能分泌其中的1、2和3种因子的特异性T细胞分别在E、M、N、S和T这5个肽库刺激后的PBMC中所占比例。如图2所示，发现T肽库刺激后能分泌2种和3种细胞因子的特异性CD4+和CD8+T细胞占比最高，说明T肽库刺激下产生的多功能T细胞最多，而N和S抗原特异性T细胞的多功能性高于E和M抗原特异性T细胞。此外，还分析了四个结构蛋白抗原的优势应答频次，如图3所示，发现无论是CD4+还是CD8+应答水平，N、S蛋白肽库的优势频次均高于E、M，且N蛋白优势频次在CD4+T细胞水平是最强的。
实施例2筛选CD4+与CD8+ T细胞优势应答18mer肽段
在筛选出N、S抗原为SARS-CoV-2病毒四个结构蛋白中优势应答抗原的基础上，鉴于CD4+T细胞具备辅助抗体产生的功能，且N抗原的免疫原性在之前的研究中似乎被严重低估而未彻底阐述。因此，针对N蛋白抗原，按照三维矩阵模型构建N蛋白子肽库，通过检测肽库特异性CD4+和CD8+T细胞筛选免疫优势应答18mer肽段，具体步骤如下：
(1)根据三维矩阵构建N蛋白抗原子肽库
N蛋白抗原共有68条步移6个氨基酸，重叠12个氨基酸的18mer肽段，肽段信息如表1所示。
按照图4所示的三维矩阵模型将这68条肽段进行子肽库Pool 1-13的配制。13个子肽库信息如表2所示。其中每一条肽段都同时出现于三个不同维度的三个子肽库中，且每一个子肽库所包含的肽段数量不超过20条。
表1 SARS-CoV-2核衣壳蛋白重叠短肽(18mer)的序列信息表
同时，按照图4所示的三维矩阵模型将这68条肽段进行子肽库Pool 1-13的配制。其中每一条肽段都同时出现于三个不同维度的三个子肽库中，且每一个子肽库所包含的肽段数量不超过20条。其中Pool 1包含肽段：NO.1-20；Pool 2包含肽段：NO.21-40；Pool 3包含肽段：NO.41-60；Pool 4包含肽段：NO.61-68；Pool 5包含肽段：NO.1，5，9，13，17，21，25，29，33，37，41，45，49，53，57，61，65；Pool 6包含肽段：NO.2，6，10，14，18，22，26，30，34，38，42，46，50，54，58，62，66；Pool 7包含肽段：NO.3，7，11，15，19，23，27，31，35，39，43，47，51，55，59，63，67；Pool 8包含肽段：NO.4，8，12，16，20，24，28，32，36，40，44，48，52，56，60，64，68；Pool 9包含肽段：NO.1-4，NO.21-24，NO.41-44，NO.61-64；Pool 10包含肽段：NO.5-8，NO.25-28，NO.45-48，NO.65-68；Pool 11包含肽段：NO.9-12，NO.29-32，NO.49-52；Pool 12包含肽段：NO.13-16，NO.33-36，NO.53-56；Pool 13包含肽段：NO.17-20，NO.37-40，NO.57-60。
(2)N抗原子肽库Pool 1-13对PBMC的离体刺激
①外周血单个核细胞的分离：收集三针BBIBP-CorV灭活疫苗免疫后健康体检者的全血标本40例，进行PBMC的分离，具体操作步骤详见实施例1的优势应答抗原筛选过程。
②PBMC的离体刺激实验：用1640完全培养基重悬PBMC，以每孔2×105cells将100uL细胞悬液铺于96孔U底板中，分别加入含有肽段处理浓度为1.5μM的Pool 1-13以及0.15uL含GolgiStop的1640完全培养基100uL，并设立DMSO处理孔及PMA+ionomycin刺激孔分别作为阴性对照和阳性对照。将刺激体系置于37℃、5％CO2孵箱中培养5h。
③刺激结束后，1800rpm离心5min，弃去上清，收集细胞。
(3)Pool 1-13子肽库特异性CD4+和CD8+ T细胞内因子染色
将刺激培养结束后收集到的细胞，分别染色细胞表面抗体(APC-Cy7抗人CD3抗体，AF700抗人CD4抗体，FITC抗人CD8抗体)及细胞内因子(APC抗人IFN-γ抗体)，具体操作步骤详见实施例1的优势应答抗原筛选过程。染色结束后，通过流式细胞仪上机获取数据，并利用Flowjo软件分析特异性CD4+和CD8+ T细胞的应答情况。分析Pool 1-13刺激下分泌IFN-γ的特异性T细胞占比，分别比对三个维度中信号最强的子肽库，按照N抗原三维矩阵推导出优势应答肽段。
如图4所示，根据三维矩阵模型，将N蛋白抗原68条18mer肽段分为Pool 1-13共13个子肽库。该矩阵的三个维度上分别包含Pool 1-4，Pool 5-8以及Pool 9-13子肽库，其中每条肽段同时出现在三个维度中的不同的子肽库中，且每个子肽库包含的肽段不超过20条。如图5所示，分别为代表性标本分别在Pool 1-13刺激后特异性CD4+和CD8+ T细胞的流式图。在图5中，该个体CD4+T细胞在矩阵里三个维度上应答最强的子肽库分别为Pool 4、Pool6和Pool 10，推导出该个体的CD4+T细胞优势应答肽段为N-66。在图6中，该个体CD8+T细胞在矩阵里三个维度上应答最强的子肽库分别为Pool 1、Pool 8和Pool 9，推导出该个体CD8+T细胞优势应答肽段为N-4。如图7所示，不同个体的优势应答肽段呈现出多样性。然而，整合40个标本的T细胞优势肽段结果，发现15％的个体(6个)的CD8+T细胞优势肽段为N19-36(GPSDSTGSNQNGERSGAR)，17.5％的个体(7个)的CD4+T细胞优势肽段为N391-408(TVTLLPAADLDDFSKQLQ)，因此N19-36和N391-408分别被筛选为N抗原中的CD8+和CD4+T细胞的最优势应答肽段。
实施例3优势应答肽段N19-36和N391-408的序列比对分析
分别将N19-36和N391-408的氨基酸序列与其他能感染人的β冠状病毒N蛋白的氨基酸序列以及SARS-CoV-2变异株的N蛋白序列进行同源性比对，分析筛选得到的N蛋白CD8+和CD4+T细胞优势肽段的种间特异性以及在不同变异株中的保守性。具体步骤如下：
(1)在NCBI数据库(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)中对N19-36和N391-408进行序列比对分析，并从数据库中下载7种能感染人的β冠状病毒N蛋白的氨基酸序列：SARS-CoV-2(登录号：YP_009724397.2)，SARS-CoV-1(登录号：YP_009825-061.1)，MERS-CoV(登录号：YP_009047211.1)，HKU1(登录号：YP_173242.1)，OC43(登录号：YP_00955524-5.1))，NL63(登录号：YP_003771.1)以及229E(登录号：NP_073556.1)。
(2)从2019新型冠状病毒信息库(2019nCoVR，https://bigd.big.ac.cn/ncov)中下载6种受关注的SARS-CoV-2病毒变异株(Alpha，Beta，Gamma，Delta，Epsilon，Omicron)的N蛋白氨基酸序列
(3)利用序列分析软件Jalview(2.11.1.4)，通过Mafft算法对筛选得到的N蛋白抗原CD8+和CD4+ T细胞表位N19-36和N391-408分别与另外六种能感染人的β冠状病毒的N蛋白序列进行特异性分析，将N19-36和N391-408序列与受关注的6种SARS-CoV-2病毒变异株的N蛋白序列进行保守性分析，并通过NCBI数据库计算N19-36和N391-408在6种变异株中的同源性。
NCBI数据库比对结果显示，在所有物种的所有蛋白中N19-36序列有且仅能100％匹配到SARS-CoV-2病毒的核衣壳蛋白，N391-408序列除能匹配到穿山甲冠状病毒(Pangolincoronavirus GZ5-2)的核衣壳蛋白外，仅能100％匹配到SARS-CoV-2病毒的核衣壳蛋白，明确了N19-36N391-408具有高度特异性。如图8所示，比对出免疫优势肽N19-36和N391-408均表现为在不同β冠状病毒中具有高度的种间特异性，并在不同的SARS-CoV-2病毒变异株中呈现出高度的保守性。
实施例4 N391-408特异性CD4+ T细胞和N19-36特异性CD8+ T细胞免疫表型的鉴定
直接通过体外刺激检测N391-408特异性CD4+ T细胞和N19-36特异性CD8+ T细胞的记忆效应表型和活化表型，并检测N19-36特异性CD8+ T细胞中分别能分泌杀伤性细胞因子granzyme A、granzyme B和perforin的占比。具体步骤如下：
(1)外周血单个核细胞的分离以及免疫优势肽段的离体刺激
收集三针BBIBP-CorV免疫后的全血标本，进行PBMC的分离，将细胞铺于96孔U底板中，分别用N391-408和N19-36肽段按1.5μM的处理浓度离体刺激PBMC，37℃、5％CO2孵箱中刺激培养5小时。PBMC分离和离体刺激的具体操作步骤详见实施例1的优势抗原筛选过程。
(2)优势肽段特异性T细胞记忆效应表型和活化表型的鉴定
根据CD62L、CD45RO和CD95表面标记物，将特异性T细胞分为幼稚T细胞
(CD62L+CD45RO-CD95-)亚群，中枢记忆T细胞TSCM(CD62L+CD45RO-CD95+)亚群，中央记忆T细胞TCM(CD62L+CD45RO+)亚群，效应记忆T细胞TEM(CD62L-CD45RO+)亚群，以及表达CD45RA的终末分化效应T细胞TEMRA(CD62L-CD45RO-)亚群。根据CD69、CD25、CD38三种细胞活化指标，检测特异性T细胞的早、中、晚期活化水平。将N391-408和N19-36肽段刺激结束后的PBMC，1800rpm离心5分钟，弃去上清，分别染色细胞表面抗体(APC-Cy7抗人CD3抗体，AF700抗人CD4抗体，BV510抗人CD8抗体，PC5.5抗人CD45RO抗体，FITC抗人CD62L抗体，PE-Dazzle594抗人CD95抗体，BV650抗人CD69抗体，BV421抗人CD25抗体，PE抗人CD38抗体，PE-Cy7抗人HLA-DR抗体)及细胞内因子(APC抗人IFN-γ抗体)。染色结束后，通过流式细胞仪上机收集数据，并利用FlowJo软件分析各类型细胞的占比。
(3)检测N19-36特异性CD8+ T细胞中分泌杀伤性细胞因子的占比
通过细胞内因子染色检测N19-36特异性CD8+ T细胞的杀伤性细胞因子穿孔素(perforin)、颗粒酶A(Granzyme A)和颗粒酶B(Granzyme B)的分泌。将N19-36肽段刺激结束后的PBMC，1800rpm离心5分钟，弃去上清，分别染色特异性T细胞表面抗体(APC-Cy7抗人CD3抗体，AF700抗人CD4抗体，BV510抗人CD8抗体)及细胞内因子(APC抗人IFN-γ抗体，APC-Cy7抗人perforin抗体，PE-Cy7抗人Granzyme A抗体，BV421抗人Granzyme B抗体)。
如图9所示，N391-408特异性CD4+ T细胞主要表现为TEM表型(54.33±21.81％)(迁移到指定位置发挥即刻的效应功能)，早期和中期活化细胞占比26.62±10.68％，晚期活化细胞占比31.53±12.07％。而N19-36特异性CD8+ T细胞主要是TEMRA表型((53.78±18.81％)(增殖活力较低，但能分泌细胞因子，并发挥细胞毒效应)，早期和中期活化细胞占比30.11±12.49％，晚期活化细胞占比36.02±13.93％。而N19-36特异性CD8+T细胞中分泌杀伤性细胞因子granzyme A、granzyme B和perforin的细胞占比分别为62.48±12.60％,59.28±8.75％,47.42±7.43％。上述结果提示出筛选到的优势CD4+ T细胞表位N391-408和优势CD8+T细胞表位N19-36特异性T细胞具有对新型冠状病毒感染的免疫保护潜能。
以上对本发明的实施方式作了详细说明，但本发明不限于所描述的实施方式。对于本领域的技术人员而言，在不脱离本发明原理和精神的情况下，对这些实施方式进行多种变化、修改、替换和变型，仍落入本发明的保护范围内。
Claims (10)
1.一种新型冠状病毒特异性CD4+T细胞表位肽，其特征在于，所述CD4+T细胞表位肽具有如SEQ ID NO.66所示的氨基酸序列。
2.一种新型冠状病毒特异性CD8+T细胞表位肽，其特征在于，所述CD8+T细胞表位肽具有如SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列。
3.权利要求1所述的新型冠状病毒特异性CD4+T细胞表位肽或权利要求2所述的新型冠状病毒特异性CD8+T细胞表位肽的编码基因。
4.含有权利要求3或权利要求4所述的编码基因的生物材料，其特征在于，所述生物材料包括重组表达载体、表达盒、重组菌或宿主细胞。
5.权利要求1所述的新型冠状病毒特异性CD4+T细胞表位肽或权利要求2所述的新型冠状病毒特异性CD8+T细胞表位肽在制备评估新型冠状病毒疫苗效果的相关试剂或试剂盒中的应用。
6.权利要求1所述的新型冠状病毒特异性CD4+T细胞表位肽或权利要求2所述的新型冠状病毒特异性CD8+T细胞表位肽在制备新型冠状病毒感染诊断试剂或试剂盒中的应用。
7.权利要求1所述的新型冠状病毒特异性CD4+T细胞表位肽或权利要求2所述的新型冠状病毒特异性CD8+T细胞表位肽在制备防治新型冠状病毒疫苗中的应用。
8.一种多肽疫苗，其特征在于，包括权利要求1所述的新型冠状病毒特异性CD4+T细胞表位肽和/或权利要求2所述的新型冠状病毒特异性CD8+T细胞表位肽。
9.根据权利要求8所述的一种多肽疫苗，其特征在于，还包括药学上可接受的佐剂。
10.一种用于新型冠状病毒疫苗效果评价或抗原感染诊断的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的新型冠状病毒特异性CD4+T细胞表位肽和/或权利要求2所述的新型冠状病毒特异性CD8+T细胞表位肽。
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