CN102746381B - 一种幽门螺杆菌抗原hla限制性免疫显性表位肽及其制备方法和应用 - Google Patents

一种幽门螺杆菌抗原hla限制性免疫显性表位肽及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种幽门螺杆菌抗原HLA限制性免疫显性表位肽及其制备方法和应用，所述显性表位肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:63、74、95和105所示。本发明还提供了所述表位肽的制备方法，并进一步提供了所述表位肽用于预防或治疗幽门螺杆菌感染的制剂中的应用。

Description

一种幽门螺杆菌抗原HLA限制性免疫显性表位肽及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于医药生物技术领域，涉及一种幽门螺杆菌抗原HLA限制性免疫显性表位肽及其制备方法和应用。
背景技术
1982年,澳大利亚学者Warren和Marshall发现一种定植在人胃和十二指肠的微需氧、革兰氏阴性、螺旋弯曲菌—幽门螺杆菌（Helicobacter pylori,Hp）。幽门螺杆菌是上消化道的主要致病菌，与胃炎、消化性溃疡、胃粘膜相关淋巴组织淋巴瘤(MALT)和胃癌等疾病的发生密切相关。近几年的研究显示，幽门螺杆菌感染还与缺血性心脏病、动脉粥样硬化、缺铁性贫血等胃外疾病相关。1994年，世界卫生组织已将其列为人群第一类致癌因子。全球50%以上人群存在幽门螺杆菌感染，特别是某些发展中国家的感染率甚至高达80%。因此，有效的治疗幽门螺杆菌感染对人类的健康是非常重要的。
目前，临床上主要是通过“三联”或“四联”疗法来对幽门螺杆菌感染的患者进行根除治疗，但因药物的副作用大，患者的依从性差，耐药菌株的逐渐增加，使其应用受到了较大的限制。且根除治疗并不能预防幽门螺杆菌的感染与根除后再感染。幽门螺杆菌疫苗能诱发机体的特异性免疫应答清除感染,又可激发机体的免疫记忆来预防再次感染，且副作用少。面对幽门螺杆菌高感染率和严重的致病性，国内外已广泛开展幽门螺杆菌疫苗研究。免疫接种是预防和控制感染性疾病最经济而有效的方法，鉴于幽门螺杆菌感染的高发病率及其与慢性胃炎、消化性溃疡、胃粘膜相关淋巴组织淋巴瘤和胃癌等消化系统疾病的密切关系，如何通过免疫接种达到防治这些疾病的目的，一直是各国科研人员研究的重点问题。疫苗接种能有效地调动机体的免疫系统，克服细菌对宿主的免疫逃避来达到预防感染和消除已感染的细菌的目的，经济而简便，可在人群中大规模运用，并且对耐药细菌仍然有效，因此研究幽门螺杆菌疫苗具有重要的意义。
动物实验研究表明，疫苗接种能显著的降低幽门螺杆菌的定植量，并减轻胃黏膜的炎症反应，并且能产生抗原特异性CD4+T细胞的应答以及IgG和sIgA抗体的产生，起到预防和治疗幽门螺杆菌感染的作用。现有疫苗主要有以下几种形式：全菌灭活疫苗、重组亚单位疫苗及核酸疫苗等，其引发的免疫应答与幽门螺杆菌感染的免疫应答相似。幽门螺杆菌感染使机体内产生强烈的细胞与体液免疫应答，但是感染仍慢性持续化甚至是终身感染，说明机体已经对幽门螺杆菌的存在免疫耐受，自然感染时产生的免疫应答不能起到保护作用，因而通过疫苗接种的方式清除幽门螺杆菌就必须在抗原选择以及在表位水平对抗原进行改造，激发更有效和更高效的免疫应答。随着对抗原分子识别理论的发展和深入认识，抗原刺激机体所产生的特异性免疫应答的本质就是表位特异性应答的集合。然而，机体的免疫应答不是针对整个外源物质（抗原）,而仅仅只是抗原的一小段区域，即抗原表位。表位疫苗，就是使用抗原表位制备而成的疫苗。表位疫苗具有易于生产、特异性高、免疫原性强、安全性较好等特点。表位疫苗，是近年来疫苗设计的新思路，在感染性疾病，恶性肿瘤以及自身免疫性疾病等疫苗设计的新方向，具较好的应用前景。
表位的筛选和鉴定，是研制表位疫苗的第一步。研究显示，幽门螺杆菌的免疫保护机制趋向于依赖CD4+T细胞，而并非CD8+T细胞的免疫反应。因此，在幽门螺杆菌表位疫苗的设计中加入CD4+T细胞表位（及辅助T细胞表位）尤为重要。此外，使用全长蛋白作为疫苗研究的抗原，存在抗原表位组成成分复杂、特异性不高、免疫应答不强等局限性。只有免疫显性表位才能激发机体较强的免疫应答，亚显性表位引起的免疫应答远远弱于显性表位，因此，免疫显性CD4+T细胞表位才是幽门螺杆菌表位疫苗所需要的。
目前，已报道的幽门螺杆菌抗原CD4+T细胞表位均为小鼠H-2限制性Th表位，由于小鼠和人MHC分子之间存在着明显的差别，H-2限制性表位可能不适用于人类疫苗设计，因此需要筛选鉴定HLA限制性表位。此外，现有报道的幽门螺杆菌表位多采用生物信息学软件预测而来，准确率不高，虽能通过实验加以验证，但是仍不能避免表位漏筛现象。此外，软件预测方法筛选表位难以解决表位的免疫显性问题，而免疫显性表位才是幽门螺杆菌表位疫苗最佳的候选表位。本发明利用抗原特异性T细胞及步移重叠合成肽，筛选鉴定得到了两个幽门螺杆菌抗原HLA限制性免疫显性辅助T细胞（Th细胞）表位SEQ ID NO:63和74。
发明内容
本发明的目的是提供一种幽门螺杆菌抗原HLA限制性免疫显性表位肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO:63、74、95和、105所示。所述表位肽具有HLA-DR亚型限制性，所述SEQ ID NO:63和95所示的表位肽的HLA-DR亚型为HLA-DRB1*1404，SEQ ID NO:74和105所示的表位肽的HLA-DR亚型为HLA-DRB1*0803。
本发明进一步提供了所述表位肽的制备方法，包含以下步骤：
1）从蛋白数据库中获取幽门螺杆菌来源的UreB蛋白质序列；
2）从步骤1）获取的UreB蛋白质序列的第1号氨基酸开始，每次步移6个氨基酸，以步移重叠的18个氨基酸为一个多肽段，形成第一多肽库，和/或在获得的第一多肽中每次步移2个氨基酸，以步移重叠的至少13个氨基酸为一个多肽段，形成第二多肽库；和/或通过分别在核心序列FFGVKPNMI和NMIIKGGFI的基础上进行逐个氨基酸的增加而合成多肽，形成第三多肽库；
3）利用抗原特异性CD4+T细胞从步骤2）所述的第一多肽库和/或第二多肽库和/或第三多肽库中筛选免疫显性表位肽；
4）利用HLA-Ⅱ类分子抗体阻断实验初步确定步骤3）筛选的免疫显性表位肽的HLA限制性；
5）利用不同HLA-Ⅱ类分子亚型的B淋巴母细胞系对表位的递呈实验确定步骤3）筛选的免疫显性表位肽的HLA限制性的具体亚型；
6）通过抗原递呈实验验证所筛选的免疫显性表位肽。
本发明还提供了所述表位肽用于预防或治疗幽门螺杆菌感染的制剂中的应用。由于本发明所提供的免疫显性表位肽具有高免疫原性，可引发强烈的免疫反应。另外所述免疫显性表位肽不含有不必要甚至有害的部分，从而降低由其所制备的疫苗的使用风险。本免疫显性表位肽可以与其他疫苗成分进行优势组合，从而扩大免疫应答的宽度。由本免疫显性多肽制备的疫苗对幽门螺杆菌感染不仅有预防作用，还可以作为治疗性疫苗使用。
为让本发明的上述和其它目的、特征和优点能更明显易懂，下文特举较佳实施例，并配合附图，作详细说明如下。
附图说明
图1A表示（样本编号为：4529）经ICS方法检测到的幽门螺杆菌感染阳性者外周血单个核细胞中抗原特异性CD4+T细胞频率，可见DMSO对照组和肽库刺激组之间有显著差别；
图1B表示（样本编号：4493）经ICS方法检测到的幽门螺杆菌感染阳性者外周血单个核细胞中抗原特异性CD4+T细胞频率，可见DMSO对照组和肽库刺激组之间有显著差别；
图2A表示（样本编号为：4529）利用抗原特异性CD4+T细胞和步移重叠合成肽对18氨基酸（18-mer）免疫显性表位进行筛选，其中：第63条肽段（P63，U373-390）为免疫显性肽段，第68（P68,U403-420）和第93（P93,U553-569）条肽段免疫亚显性肽段；
图2B表示（样本编号：4493）利用抗原特异性CD4+T细胞和步移重叠合成肽对18氨基酸（18-mer）免疫显性表位进行筛选，其中：第74条肽段（P74，U439-456）为免疫显性肽段，第44（P44,U259-276）和第81（P81,U481-498）条肽段免疫亚显性肽段；
图3A表示（样本编号为：4529）利用抗原特异性CD4+T细胞和步移重叠合成肽对13-mer免疫显性表位进行筛选，其中：63-2（U373-385）为免疫显性肽段；
图3B1表示（样本编号：4493）利用抗原特异性CD4+T细胞和步移重叠合成肽对13-mer免疫显性表位进行筛选，结果发现合成的13-mer肽太短；
图3B2表示（样本编号：4493）利用DD30抗原特异性CD4+T细胞和合成相关氨基酸短肽对其免疫显性表位进行筛选，其中：74-3（U438-452）为免疫显性肽段；
图4A表示（样本编号为：4529）利用HLA-Ⅱ类分子抗体阻断实验初步确定免疫显性肽P63-2(U373-385)是HLA-DR限制性的；
图4B表示（样本编号为：4493）利用HLA-Ⅱ类分子抗体阻断实验初步确定免疫显性肽P74-3（U438-452）是HLA-DR限制性的；
图5A1表示（样本编号为：4529）利用B淋巴细胞系(BLCL)递呈实验确定免疫显性肽P63-2（U373-385）的HLA限制性是HLA-DRB1*1404；
图5A2表示（样本编号为：4529）HLA-DRB1*1454与HLA-DRB1*1404的基因序列比对图；
图5B表示（样本编号为：4493）利用B淋巴细胞系递呈实验确定免疫显性肽P74-3（U438-452）的HLA限制性是HLA-DRB1*0803；
图6表示（样本编号为：4529）利用自然递呈实验确定所筛选到的18-mer短肽P63，能够被自然递呈，为真正的免疫显性表位。
具体实施方式
为了使本发明目的、技术方案及优点更加清楚明白，下面结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
材料与方法
（一）蛋白和肽段
重组幽门螺杆菌尿素酶B亚单位（rUreB）蛋白为本单位重组构建（吴超幽门螺杆菌尿素酶B亚单位基因克隆表达及临床应用中华检验医学杂志2001年5期）；多肽肽段通过化学方法合成（由上海吉尔生化公司合成），用二甲亚砜（DMSO）溶解至10mM的浓度，在-70℃保存，临用时用RPMI-1640完全培养基稀释到1mM的浓度。
（二）主要溶液及试剂配制
1.RPMI-1640不完全培养基：
分别称取10.4g RPMI-1640粉末，2.4g Hepes和2g NaHCO3，加入去离子水至100mL，搅匀过滤除菌，分装冻存。
2.RPMI-1640完全培养基：
分别量取950mL RPMI-1640不完全培养基和50mL人AB血清，加入20万单位/mL的青霉素和链霉素双抗各0.5mL（终浓度为100U/mL）。
3.冻存液：
将胎牛血清与DMSO按照9︰1的比例混合，然后分装冻存。
（三）所使用的主要试剂及其来源
  试剂名称   来源
  人淋巴细胞分离液   北京TBD公司
  幽门螺杆菌血清抗体检测试剂盒   北京贝尔公司
  重组人IL-2   美国PeproTech公司
  人IFN-γELISPOT检测试剂盒   北京达科为公司
  胎牛血清   美国GIBCO公司
  APC标记抗CD4单抗   美国BD公司
  PE标记抗CD3单抗   美国BD公司
  FITC标记抗IFN-γ单抗   美国BD公司
  细胞内因子染色试剂盒   美国BD公司
  磁珠标记抗CD14单抗   美国MiltenyiBiotec公司
  RPMI-1640不完全培养基   美国GIBCO公司
实施例1：步移重叠18个氨基酸短肽的合成及混合肽库的制备
幽门螺杆菌鞭毛尿素酶蛋白B亚单位(UreB)，在各菌株之间序列是保守的，全长569个氨基酸，重组构建的重组幽门螺杆菌尿素酶B亚单位为1-569多肽，来源于11637国际标准菌株。于是在UniProt蛋白数据库中检索幽门螺杆菌11637来源的幽门螺杆菌鞭毛尿素酶蛋白B亚单位蛋白序列（编号P69996），从第1号氨基酸开始合成步移重叠18个氨基酸短肽（由上海吉尔生化公司协助合成），共93条（最后一条为17个氨基酸短肽）。纯度均大于70%。合成肽信息见表1。将合成的肽段用DMSO溶解至10mM的储存浓度，另取93条短肽各10μL混合在一起组成肽库。分装后-70℃保存。
UniProt蛋白数据库检索网址：
http://www.uniprot.org/uniprot/P69996
幽门螺杆菌鞭毛尿素酶蛋白B亚单位(UreB)1-569的氨基酸序列如SEQ IDNO:1所示。
表1步移重叠合成UreB的18个氨基酸短肽基本信息
（依次对应序列表中的SEQ ID No：1-93）
  序号   编号   序列信息   分子量(g/mol)   纯度
  P1   U1-18   MKKISRKEYVSMYGPTTG   2076.48   0.7
  P2   U7-24   KEYVSMYGPTTGDKVRLG   2001.31   0.7
  P3   U13-30   YGPTTGDKVRLGDTDLIA   1892.11   0.7
  P4   U19-36   DKVRLGDTDLIAEVEHDY   2088.28   0.7
  P5   U25-42   DTDLIAEVEHDYTIYGEE   2112.21   0.7
  P6   U31-48   EVEHDYTIYGEELKFGGG   2043.19   0.7
  P7   U37-54   TIYGEELKFGGGKTLREG   1955.22   0.7
  P8   U43-60   LKFGGGKTLREGMSQSNN   1924.18   0.7
  P9   U49-66   KTLREGMSQSNNPSKEEL   2048.28   0.7
  P10   U55-72   MSQSNNPSKEELDLIITN   2033.26   0.7
  P11   U61-78   PSKEELDLIITNALIVDY   2046.36   0.7
  P12   U67-84   DLIITNALIVDYTGIYKA   1996.35   0.7
  P13   U73-90   ALIVDYTGIYKADIGIKD   1968.30   0.7
  P14   U79-96   TGIYKADIGIKDGKIAGI   1833.17   0.7
  P15   U85-102   DIGIKDGKIAGIGKGGNK   1741.04   0.7
  P16   U91-108   GKIAGIGKGGNKDMQDGV   1745.00   0.7
  P17   U97-114   GKGGNKDMQDGVKNNLSV   1861.08   0.7
  P18   U103-120   DMQDGVKNNLSVGPATEA   1846.02   0.7
  P19   U109-126   KNNLSVGPATEALAGEGL   1740.95   0.7
  P20   U115-132   GPATEALAGEGLIVTAGG   1583.77   0.7
  P21   U121-138   LAGEGLIVTAGGIDTHIH   1774.02   0.7
  P22   U127-144   IVTAGGIDTHIHFISPQQ   1934.20   0.7
  P23   U133-150   IDTHIHFISPQQIPTAFA   2036.34   0.7
  P24   U139-156   FISPQQIPTAFASGVTTM   1896.21   0.7
  P25   U145-162   IPTAFASGVTTMIGGGTG   1637.89   0.7
  P26   U151-168   SGVTTMIGGGTGPADGTN   1592.71   0.7
  P27   U157-174   IGGGTGPADGTNATTITP   1600.72   0.7
  P28   U163-180   PADGTNATTITPGRRNLK   1883.11   0.7
  P29   U169-186   ATTITPGRRNLKWMLRAA   2056.48   0.7
  P30   U175-192   GRRNLKWMLRAAEEYSMN   2225.60   0.7
  P31   U181-198   WMLRAAEEYSMNLGFLAK   2130.53   0.7
  P32   U187-204   EEYSMNLGFLAKGNASND   1960.12   0.7
  P33   U193-210   LGFLAKGNASNDASLADQ   1791.95   0.7
  P34   U199-216   GNASNDASLADQIEAGAI   1716.79   0.7
  P35   U205-222   ASLADQIEAGAIGFKIHE   1870.11   0.7
  P36   U211-228   IEAGAIGFKIHEDWGTTP   1942.18   0.7
  P37   U217-234   GFKIHEDWGTTPSAINHA   1981.17   0.7
  P38   U223-240   DWGTTPSAINHALDVADK   1911.07   0.7
  P39   U229-246   SAINHALDVADKYDVQVA   1929.13   0.7
  P40   U235-252   LDVADKYDVQVAIHTDTL   2016.25   0.7
  P41   U241-258   YDVQVAIHTDTLNEAGCV   1948.15   0.7
  P42   U247-264   IHTDTLNEAGCVEDTMAA   1891.07   0.7
  P43   U253-270   NEAGCVEDTMAAIAGRTM   1840.09   0.7
  P44   U259-276   EDTMAAIAGRTMHTFHTE   2019.26   0.7
  P45   U265-282   IAGRTMHTFHTEGAGGGH   1837.02   0.7
  P46   U271-288   HTFHTEGAGGGHAPDIIK   1845.02   0.7
  P47   U277-294   GAGGGHAPDIIKVAGEHN   1699.86   0.7
  P48   U283-300   APDIIKVAGEHNILPAST   1846.13   0.7
  P49   U289-306   VAGEHNILPASTNPTIPF   1878.13   0.7
  P50   U295-312   ILPASTNPTIPFTVNTEA   1886.15   0.7
  P51   U301-318   NPTIPFTVNTEAEHMDML   2060.35   0.7
  P52   U307-324   TVNTEAEHMDMLMVCHHL   2111.48   0.7
  P53   U313-330   EHMDMLMVCHHLDKSIKE   2196.63   0.7
  P54   U319-336   MVCHHLDKSIKEDVQFAD   2115.42   0.7
  P55   U324-342   DKSIKEDVQFADSRIRPQ   2132.38   0.7
  P56   U331-348   DVQFADSRIRPQTIAAED   2032.21   0.7
  P57   U337-354   SRIRPQTIAAEDTLHDMG   2011.26   0.7
  P58   U343-360   TIAAEDTLHDMGIFSITS   1922.16   0.7
  P59   U349-366   TLHDMGIFSITSSDSQAM   1941.18   0.7
  P60   U355-372   IFSITSSDSQAMGRVGEV   1884.11   0.7
  P61   U361-387   SDSQAMGRVGEVITRTWQ   2021.26   0.7
  P62   U367-384   GRVGEVITRTWQTADKNK   2059.33   0.7
  P63   U373-390   ITRTWQTADKNKKEFGRL   2192.52   0.7
  P64   U379-396   TADKNKKEFGRLKEEKGD   2093.34   0.7
  P65   U385-402   KEFGRLKEEKGDNDNFRI   2195.44   0.7
  P66   U391-408   KEEKGDNDNFRIKRYLSK   2240.52   0.7
  P67   U397-414   NDNFRIKRYLSKYTINPA   2213.54   0.7
  P68   U403-420   KRYLSKYTINPAIAHGIS   2032.39   0.7
  P69   U409-426   YTINPAIAHGISEYVGSV   1891.13   0.7
  P70   U415-432   IAHGISEYVGSVEVGKVA   1815.07   0.7
  P71   U421-438   EYVGSVEVGKVADLVLWS   1950.24   0.7
  P72   U427-444   EVGKVADLVLWSPAFFGV   1934.28   0.7
  P73   U433-450   DLVLWSPAFFGVKPNMII   2047.51   0.7
  P74   U439-456   PAFFGVKPNMIIKGGFIA   1907.37   0.7
  P75   U445-462   KPNMIIKGGFIALSQMGD   1920.34   0.7
  P76   U451-468   KGGFIALSQMGDANASIP   1777.04   0.7
  P77   U457-474   LSQMGDANASIPTPQPVY   1889.13   0.7
  P78   U463-480   ANASIPTPQPVYYREMFA   2055.36   0.7
  P79   U469-486   TPQPVYYREMFAHHGKAK   2160.50   0.7
  P80   U475-492   YREMFAHHGKAKYDANIT   2152.44   0.7
  P81   U481-498   HHGKAKYDANITFVSQAA   1958.18   0.7
  P82   U487-504   YDANITFVSQAAYDKGIK   2004.24   0.7
  P83   U493-510   FVSQAAYDKGIKEELGLE   1997.25   0.7
  P84   U499-516   YDKGIKEELGLERQVLPV   2086.43   0.7
  P85   U505-522   EELGLERQVLPVKNCRNI   2109.47   0.7
  P86   U511-528   RQVLPVKNCRNITKKDMQ   2170.63   0.7
  P87   U517-534   KNCRNITKKDMQFNDTTA   2128.42   0.7
  P88   U523-540   TKKDMQFNDTTAHIEVNP   2089.33   0.7
  P89   U519-546   FNDTTAHIEVNPETYHVF   2134.31   0.7
  P90   U535-552   HIEVNPETYHVFVDGKEV   2112.34   0.7
  P91   U541-558   ETYHVFVDGKEVTSKPAN   2021.23   0.7
  P92   U547-564   VDGKEVTSKPANKVSLAQ   1871.14   0.7
  P93   U553-569   TSKPANKVSLAQLFSIF   1851.19   0.7
实施例2：幽门螺杆菌感染阳性者外周血单个核细胞的收集和保存
幽门螺杆菌感染阳性者外周血单个核细胞的采集保存
幽门螺杆菌感染阳性者外周血来自中国人民解放军重庆血站，在采血前用C13尿素酶呼气实验筛查幽门螺杆菌感染阳性者，采血后取白膜层细胞，再用聚蔗糖-泛影葡胺淋巴细胞分离液（天津TBD公司）分离外周血单个核细胞，按照实际说明书进行。分离得到的外周血单个核细胞用冻存液重悬至细胞密度1×107/mL，以1mL/管的量加入冻存管，放入冻存盒中-70℃冰箱过夜，然后转入液氮冻存。
实施例3：幽门螺杆菌感染者外周血中抗原特异性CD4+T细胞的体外有效扩增
1.体外扩增抗原特异性T细胞方法
复苏一管幽门螺杆菌感染阳性者外周血单个核细胞，调整幽门螺杆菌感染阳性患者外周血单个核细胞细胞浓度至2.5×106/ml，接种于48孔细胞培养板（1ml/孔），加入适量UreB抗原，混匀后在37℃、5%CO2条件下培养。在第五天时加入低剂量的重组人IL-2（rhIL-2）（终浓度为25U/ml）。在第8天的时候培养基开始变黄，进行半量换液（换入的培养液含有25U/ml的rhIL-2，适时进行细胞分孔传代。
2.ICS方法检测幽门螺杆菌感染阳性者外周血单个核细胞中UreB特异性CD4+T细胞频率
复苏一管幽门螺杆菌感染阳性者外周血单个核细胞，用RPMI-1640完全培养基重悬细胞至5×106/ml，96孔平底板每孔铺细胞悬液0.2ml。加入1μl肽库和0.15μl蛋白分泌阻断剂GolgiStop（BD公司），37℃、5%CO2细胞培养孵箱培养5小时后收集细胞。用PE标记的抗人CD3单抗、APC标记的抗人CD4单抗以及FITC标记的抗人IFN-γ单抗进行染色（BD公司）。流式细胞仪检测分泌IFN-γ的CD4+T细胞比例。
3.体外抗原特异性T细胞的检测
经过在体外水平对抗原特异性CD4+T细胞的有效扩增，其频率已经达到了ICS的检测范围，采用ICS的方法对抗原特异性CD4+T细胞频率进行检测。收集培养的细胞，离心去除含有rhIL-2的培养基（rIL-2会刺激细胞非特异性应答），加入新鲜的不含rhIL-2的RPMI-1640完全培养基重悬细胞至1×106/ml，在96孔U型板中加入100微升RPMI-1640完全培养基，然后加入刺激肽段1μl（终浓度10μM）及Golgistop0.15μl，再加入细胞悬液100μl，37℃、5%CO2细胞培养孵箱培养5个小时后离心收集细胞，按照实施例3的第2点所述方法进行ICS及流式检测。
结果：在进行特异性CD4+T细胞体外扩增培养之后，（样本编号4529、4493）其频率可分别达到2.34%、1.64%（图1A、1B）。
实施例4：利用抗原特异性CD4+T细胞和步移重叠合成肽对免疫显性表位进行筛选
1.免疫显性18个氨基酸短肽的筛选
按照实施例3中描述的抗原特异性CD4+T细胞的体外培养方法，刺激培养UreB特异性T淋巴细胞，（样本编号4529、4493）肽库刺激检测其特异性细胞应答频率可分别达到2.34%、1.64%。利用实施例1中合成的93条18个氨基酸短肽分别刺激这些细胞，再按照实施例3中描述的ICS方法检测各条短肽刺激所能产生的特异性T细胞频率。
2.针对免疫显性18个氨基酸短肽步移重叠合成13个氨基酸短肽
针对实施例3筛选得到的免疫显性18个氨基酸短肽，再采用步移法每次步移两个氨基酸重叠合成13个氨基酸的短肽以及合成相关氨基酸短肽（由上海吉尔生化公司合成），短肽纯度平均大于90%。合成肽信息见表2。将合成的肽段用二甲亚砜（DMSO）溶解成10mM的储存浓度，分装后-70℃保存。临用时用DMSO稀释成1mM，使用工作浓度为5μM。
表2A步移重叠合成免疫显性18-mer肽的13-mer肽基本信息(样本编号：4529)
（依次对应序列表中的SEQ ID No：94-98）
  序号   编号   序列信息   分子量   纯度
  P63-1   U371-383   EVITRTWQTADKN   1561.73   0.8751
  P63-2   U373-385   ITRTWQTADKNKK   1589.93   0.9244
  P63-3   U375-387   RTWQTADKNKKEF   1651.86   0.8821
  P63-4   U377-389   WQTADKNKKEFGR   1607.80   0.9596
  P63-5   U379-391   TADKNKKEFGRLK   1534.79   0.9691
表2B步移重叠合成免疫显性18-mer肽的13-mer肽基本信息(样本编号：4493)
（依次对应序列表中的SEQ ID No：99-103）
  序号   编号   序列信息   分子量   纯度
  P74-A   U437-449   WSPAFFGVKPNMI   1493.80   0.8693
  P74-B   U439-451   PAFFGVKPNMIIK   1461.85   0.9496
  P74-C   U441-453   FFGVKPNMIIKGG   1407.75   0.8862
  P74-D   U443-455   GVKPNMIIKGGFI   1373.74   0.9435
P74-E U445-457 KPNMIIKGGFIAL 1401.79   0.8615
表2C30-mer长肽(简称：DD30，对应序列表中的SEQ ID No：116)基本信息(样本编号：4493)
  序号   编号   序列信息   分子量   纯度
  DD30   U433-462   DLVLWSPAFFGVKPNMIIKGGFIALSQMGD   3252.92   0.9045
表2D免疫显性18-mer肽的相关短肽基本信息(样本编号：4493)
（依次对应序列表中的SEQ ID No：104-115）
  序号   编号   序列信息   分子量   纯度
  P74-1   U438-451   SPAFFGVKPNMIIK   1548.93   0.9195
  P74-2   U439-452   PAFFGVKPNMIIKG   1518.90   0.9189
  P74-3   U438-452   SPAFFGVKPNMIIKG   1605.98   0.9471
  P74-4   U437-451   WSPAFFGVKPNMIIK   1735.14   0.9464
  P74-5   U439-453   PAFFGVKPNMIIKGG   1575.95   0.9403
  P74-6   U437-452   WSPAFFGVKPNMIIKG   1792.19   0.9768
  P74-7   U438-453   SPAFFGVKPNMIIKGG   1663.03   0.9141
  P74-8   U445-458   KPNMIIKGGFIALS   1488.87   0.9613
  P74-9   U445-459   KPNMIIKGGFIALSQ   1617.00   0.9698
  P74-10   U444-457   VKPNMIIKGGFIAL   1500.92   0.9459
  P74-11   U444-458   VKPNMIIKGGFIALS   1588.00   0.9527
  P74-12   U445-460   KPNMIIKGGFIALSQM   1748.20   0.9237
3.免疫显性18个氨基酸短肽特异性T淋巴细胞的体外扩增
调整幽门螺杆菌感染阳性者外周血单个核细胞细胞浓度至5×106/ml，48孔板中加入0.5mlRPMI-1640完全培养基，再加入5mM免疫显性18个氨基酸短肽1μl（终浓度5μM），与0.5ml细胞悬液混匀，按照实施例3的第1点所述方法进行培养。
4.免疫显性13个氨基酸短肽的筛选
免疫显性18个氨基酸短肽特异性T淋巴细胞体外扩增培养到第13天，用4.2中步移重叠合成的13个氨基酸短肽，按照实施例3的第2点所述的ICS方法检测各条短肽刺激所能产生的特异性T细胞频率。
结果：（样本编号4529）通过免疫显性18个氨基酸短肽的筛选得到一个免疫显性肽段以及两个亚显性肽段，如图2A，第63条肽段（P63，U373-390）能够刺激出和肽库相当的信号，是一段免疫显性肽；而第93（P93,U403-420）和68（P68,U553-569）条肽段虽然不能刺激出于肽库相当的信号，但其信号明显高出其他肽段，为两段亚显性肽段。针对显性第63条肽段（P63，U373-390）合成的5条13个氨基酸短肽经过筛选，只有P63-2(U373-385)能够刺激出与63（P63，U373-390）相当的信号（图3A）。故UreB的免疫显性表位即为P63-2(U373-385)。
同理（样本编号4493）UreB的免疫显性表位即为P74（U439-456），其中：第44（P44,U259-276）和第81（P81,U481-498）条肽段免疫亚显性肽段(图2B)；由于实验过程中发现，针对免疫显性第74条肽段合成的13-mer氨基酸短肽肽太短(图3B1)。因此，根据对第74条肽段的截短和延长合成了12条氨基酸短肽，具体过程为，通过IEDB表位预测网站（http://tools.immuneepitope.org/analyze/html/mhc_II_binding.html）预测蛋白肽段73至76所覆盖的氨基酸序列：DLVLWSPAFFGVKPNMIIKGGFIALSQMGDANASIP中包含的表位核心序列。预测方法为：consensus，预测的HLA限制性分子分别为：HLA-DRB1*08:03和HLA-DRB1*15:01，根据预测的结果进行分析得到限制性表位的核心序列共有两条，一条为FFGVKPNMI，另一条为：NMIIKGGFI。围绕该两条核心序列进行逐个氨基酸的增加而合成了74-1至74-12相关短肽（合成信息见表2D）。并合成一条覆盖所有12条氨基酸短肽的30个氨基酸长肽，简称：DD30，（合成信息见表2C），建立DD30抗原特异细胞，经过筛选，只有P74-3(U438-452)能够刺激出与DD30(U433-462)相当的信号（图3B2）。
实施例5：利用HLA-Ⅱ类分子抗体阻断实验初步确定表位HLA限制性
1.免疫显性13个氨基酸短肽P63-2(U373-385)/P74-3(U438-452)特异性T淋巴细胞的体外扩增
调整幽门螺杆菌感染阳性者外周血单个核细胞浓度至5×106/mL，48孔板中加入0.5mL RPMI-1640完全培养基，再加入1μL免疫显性13个氨基酸短肽P63-2(U373-385)/P74-3(U438-452)（终浓度5μM），与0.5mL细胞悬液混匀，按照前述方法进行培养。
2.利用HLA-Ⅱ类分子抗体阻断实验初步确定免疫显性表位P63-2(U373-385)/P74-3(U438-452)的HLA限制性
收集上述培养13天的P63-2(U373-385)/P74-3(U438-452)特异性T淋巴细胞，离心去除含有rhIL-2的培养基，以新鲜的不含rhIL-2的RPMI-1640完全培养基重悬细胞至1×106/mL，在96孔U型板中加入细胞悬液100μL，分成4孔，其中三孔再分别加入HLA-DR、HLA-DP和HLA-DQ的三种单克隆抗体（抗-DR(L243),抗-DP(B7/21),抗-DQ(SPV-L3)）各10μL；另外一孔加入不含rhIL-2的RPMI-1640完全培养基10μL，混匀后37℃、5%CO2细胞培养孵箱培养30分钟后，每孔再加入100μL含有1μL肽段P63-2(U373-385)/P74-3(U438-452)（终浓度10μM）和0.15μL GolgiStop的RPMI-1640完全培养基，混匀后37℃、5%CO2细胞培养孵箱培养5个小时，随后收集细胞进行ICS和流式检测。
结果：免疫显性表位刺激表位特异性T细胞的应答能够被HLA-DR的单克隆抗体完全阻断，而不能被HLA-DP和HLA-DQ的单克隆抗体所阻断（图4A、4B），证明该两个免疫显性表位都是HLA-DR限制性的。但其HLA-DR的亚型仍需进一步鉴定。
实施例6：利用不同HLA-Ⅱ类分子亚型的B淋巴母细胞系对表位的递呈实验确定表位HLA限制性的具体亚型
1.EB病毒转化的B淋巴细胞系的制备
以接种密度106/mL（50mL培养瓶装5mL）培养含有EBV的B95-8细胞，培养2-3天后，离心弃上清，用新鲜培养基将细胞以1：4的比例传代，培养5-7天后收获细胞，用50mL离心管离心，吸取15mL所得上清至另一无菌离心管，用剩下的5mL上清重悬细胞沉淀，在-70℃和37℃反复冻融3次以破碎细胞和释放EB病毒，使之与原来的15mL上清混合，以2000rpm的速度离心20分钟后，取上清，用0.22μm滤器过滤，分装至1mL/冻存管，-70℃保存。该上清中含有EB病毒，即得EB病毒病毒液。复苏一管幽门螺杆菌感染阳性者外周血单个核细胞，调整细胞浓度至（1-2）×106/mL，24孔板中加入1mL细胞悬液，再加入上述EB病毒病毒液，同时加入环孢素A至终浓度1μg/mL。37℃、5%CO2细胞培养孵箱培养细胞，注意适时换液和分孔。2个月后，BLCL建立完毕，用液氮冻存该BLCL细胞。
2.PCR-SBT技术分析患者HLA-Ⅱ类分子亚型
取建立好的BLCL，将样本送往深圳华大基因公司，该公司用PCR扩增测序分型（PCR-SBT）技术对样本的HLA-Ⅱ类分子亚型进行分析。本发明中所使用的相关BLCL样本的HLA-Ⅱ类分子基因亚型为见表3A-3B。
表3A患者HLA-Ⅱ类分子分型信息
  样本号   4529   4528   4530   8901   3546
  HLA-DRB1   14:04,16:02   11:01,16:02   14:54,08:02   14:05,15:01   01:01,09:01
表3B患者HLA-Ⅱ类分子分型信息
  样本号   4493   4531   5248   8901
  HLA-DRB1   08:03,15:01   08:03,10:01   09:01,16:02   14:05,15:01
3.BLCL递呈实验确定免疫显性表位P63-2(U373-385)/P74-3(U438-452)的HLA限制性
由实施例5可知，免疫显性表位P63-2(U373-385)是HLA-DR限制性的，而该个体的的HLA-DR是杂合子：HLA-DRB1*1404和HLA-DRB1*1602，因此并不清楚关于该表位的具体限制性亚型。现选择与该个体HLA-DR的亚型相同和不同的BLCL，4528(DR14-/DR16+)、4530(DR14+/DR16-)、8901(DR04+/DR16-)和3546(DR14-/DR16-)作为抗原递呈细胞（APC）进行亚型鉴定。用免疫显性表位P63-2(U373-385)（浓度1mM分别负载上述BLCL1h，用RPMI-1640不完全培养基洗涤细胞3遍以完全去除未结合到HLA上的游离肽段。其后，在GolgiStop存在的体系中，用这些负载了P63-2(U373-385)肽段的APC与P63-2(U373-385)特异性T淋巴细胞进行混合淋巴细胞反应。其后用ICS的方法检测P63-2(U373-385)特异性T淋巴细胞的应答频率。
结果：如图5A1，只有用含有HLA-DRB1*1454等位基因的BLCL负载肽段P63-2(U373-385)后才能刺激P63-2(U373-385)特异性T淋巴细胞产生应答。不负载任何肽段不能刺激P63-2(U373-385)特异性T淋巴细胞产生应答。经过基因序列比对发现HLA-DRB1*1454与HLA-DRB1*1404的基因相似度很高，如图5A2。且HLA-DRB1*1602基因型的BLCL（4528）在负载了肽段P63-2(U373-385)后也不能刺激P63-2(U373-385)特异性T淋巴细胞产生应答。这证明免疫显性肽P63-2(U373-385)的HLA限制性是HLA-DRB1*1404。同理：证明免疫显性肽P74-3(U438-452)的HLA限制性是HLA-DRB1*0803，如图5B。
实施例7：验证该免疫显性表位能够被抗原递呈细胞自然加工和递呈
1.树突状细胞的制备
复苏一管4529患者外周血单个核细胞，用免疫磁珠阳性选择的方法（Miltenyi Biotec公司的试剂盒）分离外周血单个核细胞中CD14+单核细胞，操作按照试剂盒说明书进行。分离后的CD14+单核细胞用APC标记的抗人CD14单抗染色，流式细胞计数鉴定纯度大于95%。用RPMI-1640完全培养基重悬细胞至密度5×105/mL，加入重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）和重组人白介素4（IL-4），使其终浓度均为20ng/mL。24孔板中加入2mL细胞悬液，37℃、5%CO2细胞培养孵箱培养。培养到第6天收集细胞，负载抗原。
2.幽门螺杆菌全蛋白超声上清的制备
混配11637菌株接种到脑心浸液血琼脂平板，通过抽气换气建立微需氧环境（10%CO2、5%O2和85%N2）37℃培养2天，从平板上刮取菌苔，混悬于无菌生理盐水，以麦氏标准比浊管第一管为标准配成浓度为3×108个/mL的菌悬液，迅速取2mL接种于200mL无菌幽门螺杆菌培养肉汤，微需氧环境及37℃震荡（120转/分钟）培养，培养24小时后，取出培养液，沉淀细菌，用无菌PBS洗涤3遍后用无菌PBS重悬细菌，超声破菌2个循环(功率200W，破碎时间30s，间歇30s)。4℃，10000g离心20分钟去除未破碎的细菌和大块碎片。所得到的上清中包含幽门螺杆菌的细胞膜和胞质成分蛋白。用BCA法测量蛋白浓度，分装-20℃保存。
3.抗原递呈细胞的抗原负载及表型分析
树突状细胞培养到第六天，收获细胞用含GM-CSF和IL-4（20ng/mL）的新鲜RPMI-1640培养基调整细胞细胞密度至1×105个/mL，96孔U型板中加入100μL上述培养基，再加入合适体积幽门螺杆菌全蛋白超声上清或者重组表达的UreB蛋白，使蛋白终浓度为50μg/mL。再加入细胞悬液100μL。37℃、5%CO2细胞培养孵箱培养过夜。在负载抗原之前和之后取少许细胞进行表型分析：用PE标记的抗人CD86单抗、APC标记的抗人HLA-DR单抗以及FITC标记的抗人CD80单抗进行染色和流式分析。
4.混合淋巴细胞反应
离心抗原递呈细胞去除没有被负载的游离蛋白抗原，用RPMI-1640不完全培养基洗涤2遍，用100μL RPMI-1640完全培养基重悬细胞，以0.15μL/孔加入GolgiStop，再加入P63-2(U373-385)特异性T淋巴细胞100μL，37℃、5%CO2细胞培养孵箱培养5小时后按照实施例3第2点所述的方法染色及流式检测。
结果：如图6，负载了UreB蛋白的DC4529能够刺激P63-2(U373-385)特异性T淋巴细胞产生强烈的免疫应答，负载幽门螺杆菌全蛋白超声上清的DC4529刺激的应答虽不如负载UreB的强烈，但明显强于没负载任何抗原的DC4529刺激的应答。这证明P63-2(U373-385)是能够通过树突状细胞自然加工递呈产生的。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并非用来限定本发明的实施范围；如果不脱离本发明的精神和范围，对本发明进行修改或者等同替换，均应涵盖在本发明权利要求的保护范围当中。
Figure IDA00001933815700011
Figure IDA00001933815700031
Figure IDA00001933815700041
Figure IDA00001933815700051
Figure IDA00001933815700071
Figure IDA00001933815700081
Figure IDA00001933815700091
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Figure IDA00001933815700111
Figure IDA00001933815700121
Figure IDA00001933815700131
Figure IDA00001933815700141
Figure IDA00001933815700161
Figure IDA00001933815700171
Figure IDA00001933815700181

Claims (5)

1. 一种幽门螺杆菌抗原HLA限制性免疫显性表位肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO: 63、74、95和105所示，所述表位肽具有HLA-DR亚型限制性，所述SEQ ID NO:63和95所示的表位肽的HLA-DR亚型为HLA-DRB1*1404，SEQ ID NO:74和105所示的表位肽的HLA-DR亚型为HLA-DRB1*0803。
2. 权利要求1所述的幽门螺杆菌抗原HLA限制性免疫显性表位肽在制备用于预防或治疗幽门螺杆菌感染的制剂中的应用。
3. 如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述制剂为疫苗。
4. 一种制备权利要求1所述的幽门螺杆菌抗原HLA限制性免疫显性表位肽的方法，其特征在于，包含步骤：
1）从蛋白数据库中获取幽门螺杆菌来源的UreB蛋白质序列；
2）从步骤1）获取的UreB蛋白质序列的第1号氨基酸开始，每次步移6个氨基酸，以步移重叠的18个氨基酸为一个多肽段，形成第一多肽库，和/或在获得的第一多肽中每次步移2个氨基酸，以步移重叠的至少13个氨基酸为一个多肽段，形成第二多肽库；和/或通过分别在核心序列FFGVKPNMI和NMIIKGGFI的基础上进行逐个氨基酸的增加而合成多肽，形成第三多肽库；
3）利用抗原特异性CD4+ T细胞从步骤2）所述的第一多肽库和/或第二多肽库和/或第三多肽库中筛选免疫显性表位肽；
4）利用HLA-Ⅱ类分子抗体阻断实验初步确定步骤3）筛选的免疫显性表位肽的HLA限制性；
5）利用不同HLA-Ⅱ类分子亚型的B淋巴母细胞系对表位的递呈实验确定步骤3）筛选的免疫显性表位肽的HLA限制性的具体亚型；
6）通过抗原递呈实验验证所筛选的免疫显性表位肽。
5. 如权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤2）所述的第一多肽库的多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO: 1-93所示；第二多肽库的多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:94-103所示；第三多肽库的多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO: 104-115所示。
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