CN116068170B - 一种检测幽门螺旋杆菌的试纸和试剂盒 - Google Patents

一种检测幽门螺旋杆菌的试纸和试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明涉及微生物检测技术领域，尤其涉及一种检测幽门螺旋杆菌的试纸和试剂盒。所述试纸包括检测线，所述检测线由用于检测幽门螺旋杆菌的单克隆抗体制备而成，所述单克隆抗体由如SEQ ID NO.1所示的抗原作为免疫原制备而成，由该抗原制备得到的单克隆抗体均具有较高的特异性。本发明进一步提供包括该抗原制备得到的单克隆抗体单抗的试纸和相应地试剂盒，其可以快速、准确地实现幽门螺旋杆菌的检测。

Description

一种检测幽门螺旋杆菌的试纸和试剂盒
技术领域
本发明涉及微生物检测技术领域，尤其涉及一种检测幽门螺旋杆菌的试纸和试剂盒。
背景技术
幽门螺杆菌是一种螺旋形、微厌氧、对生长条件要求十分苛刻的细菌，可能引起胃炎，消化道溃疡，淋巴增生性胃淋巴瘤甚至是胃癌等疾病。
现在检测胃幽门螺旋杆菌(HP)的方法主要有以下几种：第一种是细菌培养法，该方法特异性高，可同时做药敏及耐药试验但同时检验耗时长(2-4天)，工作量大，条件和技术较高，无法检测死菌和活性成分。
第二种是快速尿素酶试验，标本为黏膜活检组织，检测快速，可用于初筛，大约需1小时；但是有创伤性，侵入取样容易增加病人痛苦，需有经验的技术人员。
第三种呼气试验是目前广泛采用的方法。方法简单快速，约需30分钟，并且患者无痛，准确性较高。但是仍然存在设备昂贵，收费高，有放射性，不适合孕妇、婴幼儿、高血压、心脏病人群。
第四种PCR方法虽然灵敏度高，对死菌活菌无要求；但是标本易被污染，假阳性高，操作要求高，需非常有经验的技术人员，侵入取样增加病人痛苦。
第五种酶联免疫吸附试验不能鉴别既往感染及现疫病人，主要适用于流行病学调查。
发明内容
为了解决现有技术存在的问题，本发明的目的是提供一种检测幽门螺旋杆菌的试纸和试剂盒。
本发明选择了特异性较好的免疫原，幽门螺杆菌含有大量高活性的胞外尿素酶，尿素酶约占全菌蛋白的10％，检测尿素酶可以作为检测幽门螺杆菌的方法。本发明进一步针对尿素酶的29KDa片段上第70～84和128～140的位置的氨基酸位置的抗原表位设计免疫原进行后续单克隆抗体的制备，发现针对该靶点设计的免疫原，制备的单克隆抗体具有较优的特异性。
第一方面，本发明提供一种幽门螺旋杆菌免疫原，包括如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。
本发明进一步提供一种制备用于检测幽门螺旋杆菌的单克隆抗体的方法，采用所述的幽门螺旋杆菌免疫原作为免疫原进行制备。
第二方面，本发明提供一种检测幽门螺旋杆菌的试纸，所述试纸条包括检测线，所述检测线包被有所述的单克隆抗体。
进一步地，所述单克隆抗体的浓度为2mg/mL。
进一步地，所述试纸还包括免疫硝酸纤维素膜，所述免疫硝酸纤维素膜上设有所述检测线和质控线，所述质控线包被有羊抗鼠IgG。
所述试纸还包括免疫胶体金垫，所述免疫胶体金垫由如下方法制备得到：
制备胶体金；制备胶体金-单克隆抗体复合物，之后包被至载体膜上。
进一步地，所述制备胶体金可采用柠檬酸三钠还原法进行制备，例如包括如下流程：
将0.005～0.015％的HAuCl4水溶液加热至沸腾，之后加入0.5～1.5％柠檬三钠水溶液；再次加热至沸腾后持续10～15分钟。
进一步地，所述柠檬三钠水溶液的用量为所述HAuCl4水溶液的0.65～1％(体积比)。
进一步地，所述制备胶体金-单克隆抗体复合物包括：
将胶体金颗粒与单克隆抗体在pH为7.8的条件下反应10～15分钟；所述单克隆抗体为可以和幽门螺旋杆菌多肽抗原特异性结合的单克隆抗体。
进一步地，所述胶体金颗粒和所述单克隆抗体的用量比为1000mL：(20～40mg)。
进一步地，所述载体膜为玻璃纤维素膜、聚酯纤维膜或硝酸纤维素膜中的一种或多种。
进一步地，所述试纸还包括吸水纸和样品垫。
进一步地，可以将所述试纸以如下任意一种方式制备成相应的产品：
(1)将所述试纸分切成试剂条，装进塑料卡内，并和干燥剂一起装入铝箔袋，密封、包装即得单人份HP多肽抗原检测试纸(卡型)。
(2)将手柄纸、MAX胶等粘贴到所述试纸上，分切成试剂条，并和干燥剂一起装入铝箔袋，密封、包装既得单人份HP多肽抗原检测试纸(条型)。
第三方面，本发明提供一种试剂盒，所述试剂盒包括所述试纸。
进一步地，所述试剂盒还包括缓冲液和说明书。
进一步地，还可以将上述单人份HP多肽抗原检测试纸(卡型)或单人份HP多肽抗原检测试纸(条型)若干份和缓冲液和说明书包装在一起即为试剂盒成品。
本发明具备如下有益效果：
1、本发明提供的单克隆抗体针对29KDa多肽上特殊的位点，所得到的的单克隆抗体具备较高的免疫原性，在用于幽门螺旋杆菌的检测时具有较高的特异性和灵敏度。
2、本发明针对HP多肽抗原进行检测，多肽是蛋白质水解的中间产物，即使经过消化道降解，保留的多肽片段也可以被检测出来。并且检测样本为粪便，不需要侵入取样，同时可诊断现症感染。此外，由于检测对象是HP抗原多肽，因此可检测死菌体和分泌活性成分。
3、本发明提供的试纸检测HP多肽抗原特异性强，不受粪便中其他细菌、病毒、H2受体拮抗体及取材部位的干扰，特别适合于不宜做创伤性检查HP感染的诊断(尤其适合于幼儿、孕妇、老年人及不宜做胃镜检查的患者)，并可作为明确胃内目前是否有HP感染、观察抗HP药物的疗效以及抗HP治疗后复发或再感染情况的首选检测方法之一，还可作为远期根治疗效的评价指标。
4、本发明提供的试剂盒检测简单快速、标本留取方便、价格相对便宜、可多次重复的无创伤诊断方法。抗原的检出直接反映了病原生物现症感染的信息，也可以诊断急性HP感染和进行治疗疗效评估。
附图说明
图1为本发明实施例1提供的HP Ag检测试剂盒(卡型)示意图。
图2为本发明实施例1提供的HP Ag检测试剂盒(条型)示意图。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1
本实施例提供一种制备检测幽门螺旋杆菌的试剂盒的流程，具体如下：
1、免疫抗原
采用HP多肽抗原，氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2、制备单克隆抗体
HP纯化抗原加福氏完全佐剂，充分乳化后，于BALB/c小鼠背部皮内进行多点注射，间隔2周后，用HP纯化抗原加福氏不完全佐剂作第二次免疫，融合前3d尾静脉加强一针。
将小鼠骨髓瘤细胞(SP2/O-Ag14)与免疫小鼠脾细胞在PEG助融下进行融合，用纯化HP抗原作间接ELISA筛选高滴度抗体的杂交瘤细胞的目标物，将筛选出来的细胞经有限稀释法进行多次克隆，并进行扩种，保存。将扩大培养的杂交瘤细胞腹腔注射BALB/c小鼠，10～14d后收集腹水，离心，上清即为HP-McAb。
如上方法得到多种杂交瘤细胞，本发明针对这些杂交瘤细胞中的几种分泌得到的单克隆抗体进行后续实验。
3、HP单克隆抗体的鉴定与选择
表1 HP单克隆抗体鉴定结果
抗体编号 克隆号 亚型鉴定 结合位点
HP单克隆抗体1 A13001 IgG1 29KDa多肽
HP单克隆抗体2 A13003 IgG1 29KDa多肽
HP单克隆抗体3 A13008 IgG1 29KDa多肽
HP单克隆抗体4 A13015 IgG1 29KDa多肽
将4种抗体以1:3000为包被4孔包被在聚苯乙烯96孔板上，37℃孵育过夜。次日弃去包被液，PBS洗板后，加入经裂解液处理的1×106CFU/ml的胃幽门螺旋杆菌反应1小时后，洗板加入1:3000的4种抗体反应1小时，洗板加入兔抗小鼠-HRP抗体反应30min后，加入50μl终止液(2mol/L H2SO4)终止反应。使用酶标仪读取450nm的OD值，以确定反应情况。
最后确定HP单克隆抗体1和HP单克隆抗体2、HP单克隆抗体4可完成夹心配对检测靶标物。HP单克隆抗体3和HP单克隆抗体2、HP单克隆抗体4可形成夹心配对检测靶标物。HP单克隆抗体2和HP单克隆抗体4，HP单克隆抗体1和HP单克隆抗体3不可形成有效配对检测靶标物。
将HP单克隆抗体1、2、3、4用PBS稀释到1mg/ml后，分别包被到硝酸纤维素膜上，胶体金标记HP单克隆抗体1、2、3、4后分别放在玻璃纤维素膜上干燥，经分别按照1-2，1-4，3-2，3-4八种组合进行测试。
表2样本处理液测试结果
根据试验结果单克隆4不适合用作包被抗体，其余3种可以用作包被，4种抗体均可用于标记。
表3标准菌液测试结果
根据试验结果多种抗体配对均可成功检出裂解液处理的菌液，但当包被抗体为HP单克隆1和标记抗体为HP单克隆2时可在胃幽门螺旋杆菌为5×103CFU/ml时检测出线。
4、胶体金的制备
分别配制0.01％的HAuCl4水溶液和1.0％的柠檬酸三钠水溶液，将0.01％的HAuCl4水溶液1000ml置烧杯或三角瓶中加热至沸腾，搅拌下加入1.0％柠檬酸三钠水溶液6.5ml，边加边搅拌。沸腾后，继续加热煮沸10～15分钟至溶液呈透明的紫红色。制备40～70nm大小的胶体金颗粒，将溶液冷却至室温，加水恢复至原体积。用分光光度法扫描，在520～545nm处有最大吸收峰。
5、确定HP单克隆抗体-1与胶体金结合的最适pH值
取8个1.5ml试管，分别加入100μl步骤4中制得的胶体金，用0.1mL K2CO3和0.1mol/L HCl将pH值分别调节为6.6、6.8、7.0、7.2、7.4、7.6、7.8、8.0；每试管分别加入3μL浓度为1mg/mL的HP单克隆抗体-1，混合，室温下放置10分钟～15分钟,HP单克隆抗体-1与胶体金结合的最适pH值为7.8。
胶体金-HP单克隆抗体1复合物的制备：取1000ml胶体金，加入pH7.8，0.01M磷酸盐缓冲液100ml，混匀；在搅拌下，将10ml HP单克隆抗体1溶液加入到准备好的胶体金溶液中，混匀、室温反应10分钟；反应结束后，加入5％的BSA(作为保护剂)，使溶液中BSA的终浓度为0.01％，混匀、室温反应10分钟；反应复合物10000rpm离心纯化；加pH7.8，0.01M磷酸盐缓冲液至原体积，离心，取沉淀，加pH7.8，0.01M磷酸盐缓冲液至终体积90ml得到免疫胶体金溶液。每1000ml胶体金的最佳HP单克隆抗体1标记量为20mg。
5、制备免疫胶体金垫
取纯化的免疫胶体金溶液用缓冲液进行10倍稀释，将一张待铺玻璃纤维膜平整放置于模板中，取一定量胶体金稀释溶液缓慢均匀倒在膜板内，使其浸泡均匀，取出干燥即得。每张玻璃纤维膜(规格为300mm×220mm)需耗用30ml免疫胶体金稀释溶液。
6、免疫硝酸纤维素膜的制备：
将硝酸纤维素膜贴在PVC板上，检测线(T线)所固定的HP单克隆抗体2最佳包被浓度为2.0mg/ml，C线羊抗鼠IgG最佳包被浓度为2.0mg/ml。喷好的膜进行干燥。
7、将吸水纸、胶体金-HP单克隆抗体1、样本垫依次贴在已经制备好的免疫硝酸纤维素膜上，贴好后切条装入卡槽即可得到HP检测试剂卡。
成品示意图如图1和图2所示，图1中1为塑料盒，2为结果观察窗，3为质控线(C线)，4为检测线(T线)，5为检测试纸，6为加样孔。
图2中1为手柄纸，2为质控线(C线)，3为检测线(T线)，4为检测试纸，5为MAX线，6为MAX胶。
试验例1
本发明搜集来自安徽、广东、山东3地的15例幽门螺旋杆菌阳性粪便样本，分别使用本发明制备的幽门螺旋杆菌试剂盒与C13呼气检测结果进行对比，结果如下表所示：
表4 15例幽门螺旋杆菌阳性粪便样本的检出结果
如上结果显示本发明制备的幽门螺旋杆菌试剂盒与C13呼气检测结果进行对比，均可有效检出，说明本次免疫原免疫后所取得的抗体针对不同样本可以有效识别。
试验例2
本试验例进一步对本发明提供的检测试纸的灵敏度进行实验，阳性标准品按照如下浓度进行配置：幽门螺杆菌(ATCC 700392)，将胃幽门螺旋杆菌进行培养计数灭活后，调整至系列浓度：1×107CFU/ml、5×106CFU/ml、1×106CFU/ml、1×105CFU/ml、1×104CFU/ml、5×103CFU/ml进行检测。结果如下表所示，抗原试剂可以在幽门螺杆菌浓度为1×104CFU/ml时可有效检出。
表5不同浓度的幽门螺旋杆菌的检测结果
试验例3
本发明依次将多种可能产生假阳性结果或者对结果产品干扰的细菌，大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌、绿脓假单胞菌、肠炎沙门氏菌和白色念珠菌等细菌进行计数、灭活后，分别调整浓度值至1×106个/ml。其中腺病毒和轮状病毒样本的调整至1*105PFU/mL后，用抗原试剂进行检测。检测结果如下表所示，结果显示无交叉反应，说明本发明提供的检测幽门螺旋杆菌的试剂盒具有较高的特异性。
表6其他菌株的检测结果
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (10)

1.一种幽门螺旋杆菌免疫原，其特征在于，氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；SEQ IDNO.1所示的氨基酸序列如下：
GGIDTHIHFISPQQIPTAFASGVTTMIGGGTGPADGTNATTITPGRRNIFSITSSDSQAMGRVGEVITRTWQTADKNKKEFGRLKEEKGDNDNFRIKRYLSKYTINPAIAHGISEYVGSVEVGKVADLVLWSPAFFGVKPNMIIKGGFIALSQMGDANASIPTPQPVYYREMFAHHGKAKYDANITFVSQAAYDKGIKEELGLERQVLPVKNCRNITKKDMQFNDTT AHIEVNPETYHVFVDGKEVTSKPANKVSLAQLFSIF。
2.一种制备用于检测幽门螺旋杆菌的单克隆抗体的方法，其特征在于，采用权利要求1所述的幽门螺旋杆菌免疫原作为免疫原进行制备。
3.权利要求2所述的方法制备得到的单克隆抗体。
4.一种检测幽门螺旋杆菌的试纸，其特征在于，所述试纸条包括检测线，所述检测线包被有如权利要求3所述的单克隆抗体。
5.根据权利要求4所述的试纸，其特征在于，所述试纸还包括免疫硝酸纤维素膜，所述免疫硝酸纤维素膜上设有所述检测线和质控线，所述质控线包被有羊抗鼠IgG。
6.根据权利要求5所述的试纸，其特征在于，所述试纸还包括免疫胶体金垫，所述免疫胶体金垫由如下方法制备得到：
制备胶体金；制备胶体金-单克隆抗体复合物，之后包被至载体膜上。
7.根据权利要求6所述的试纸，其特征在于，所述制备胶体金-单克隆抗体复合物包括：
将胶体金颗粒与单克隆抗体在pH为7.8的条件下反应10～15分钟；所述单克隆抗体为可以和幽门螺旋杆菌多肽抗原特异性结合的单克隆抗体。
8.根据权利要求6所述的试纸，其特征在于，所述载体膜为玻璃纤维素膜、聚酯纤维膜或硝酸纤维素膜中的一种或多种。
9.根据权利要求4～8中任一项所述的试纸，其特征在于，所述试纸还包括吸水纸和样品垫。
10.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求4-9任一项所述的试纸。
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