KR20100132964A

KR20100132964A - 폐렴구군 검출방법

Info

Publication number: KR20100132964A
Application number: KR1020107021865A
Authority: KR
Inventors: 스구루 아카마쓰; 요코 사이조
Original assignee: 오츠카 세이야쿠 가부시키가이샤
Priority date: 2008-03-31
Filing date: 2009-03-31
Publication date: 2010-12-20
Also published as: JP5509067B2; CN101981452A; US8241857B2; CA2720039A1; ES2556354T3; EP2261666A4; KR101678428B1; CN101981452B; EP2261666A1; EP2261666B1; WO2009122714A1; US20110020848A1; JPWO2009122714A1

Abstract

간편하고도 신속하며 고감도로 생체 유래 검체로부터의 폐렴구균 항원의 검출 또는 정량을 가능하게 하고, 면역학적 검출방법 및 그를 위한 항체를 제공한다. 본 발명은 폐렴구균 F-antigen을 특이적으로 인식하는 항체를 제공한다. 또한, 본 발명은 상기 항체를 사용한 면역학적 측정법에 의해 생체 유래 검체 중의 폐렴구균 F-antigen을 검출 또는 정량하는 것을 특징으로 하는 폐렴구균 항원의 첨출 또는 정량방법을 제공한다. 본 발명은 또한 상기 항체를 함유하는 폐렴구균 항원 검출키트를 제공한다.

Description

폐렴구군 검출방법{METHOD FOR DETECTION OF PNEUMOCOCCUS}

본 발명은 생체 중의 폐렴구균 항원을 검출 또는 정량하기 위한 면역학적 측정방법에 관한 것이다.

폐렴구균(Streptococcus pneumoniae)은 시중폐렴(community acquired pneumonia)이나 하기도 감염증(lower respiratory tract infection)의 원인균으로서 가장 검출빈도가 높은 균이며, 일본뿐만이 아니라 전세계적으로도 이환율(morbidity), 사망률이 높은 원인균 중 하나이다. 폐렴구균 감염증은 빈도가 높을 뿐만 아니라 쉽게 중증화하기 때문에, 치료 개시시의 적절한 항균약 선택이 중요하다. 또, 감염증 치료의 원칙에서 보아도 원인균을 가능한 한 조기에 확정하는 것은 적확한 치료법을 조기에 선택할 수가 있으므로, 예후의 개선, 의료비용의 삭감, 내성균 발현 방지로 이어지기 때문에 중요하다. 이와 같은 배경으로부터 폐렴구균 유래 항원을 감염 조기단계에서 신속하게 검출하는 진단약이 요구되고 있다.

폐렴구균의 구조에 대해서는 Sorensen 등에 의해 상세히 보고되어 있다(비특허문헌 1). 균의 가장 외측에는 협막(capsular)이 위치하고, 협막에는 협막다당이라고 하는 다당항원이 결찰(Ligate)된다. 이 협막다당의 구조의 차이에 근거하여 수십 종류 이상의 혈청형이 보고되어 있다. 한편, 협막의 안쪽에는 세포벽(Cell wall) 및 세포막(Plasma membrane)이 순차적으로 위치하고 있고, 세포벽에는 C-polysaccharide(C-ps)가, 또 세포막에는 F-antigen이라고 하는 테이코산 또는 리포테이코산이 각각 결찰하고 있다. C-ps는 모든 폐렴구균에서 보존되어 있는 공통 항원으로 알려져 있고, 또 F-antigen의 다당 부분은 C-ps와 동일한 당의 서열을 갖는다는 것이 보고되어 있다.

면역측정법을 사용한 폐렴구균의 항원검출방법으로는 종래부터 항C-ps항체를 사용한 ELISA에 의해 객담(sputum sample) 중의 C-ps항원을 검출하는 방법(비특허문헌 2, 비특허문헌 3)이나, 협막다당을 대상으로 한 면역 전기 영동법에 의해 혈청 중, 뇨 중의 항원을 검출하는 방법(비특허문헌 4, 비특허문헌 5)이 보고되어 있다.

또, 기존의 폐렴구균 검출키트로는 이전부터 라텍스 응집법에 의해 뇌척수액, 혈청, 뇨 중의 폐렴구균 항원을 검출하는 키트가 사용되고 있었다. 이 방법은 협막다당 등의 다당 부분을 검출한다는 것으로 생각된다(비특허문헌 6, 비특허문헌 7). 그러나, 라텍스 응집법을 사용한 키트는 조작의 번잡함이나 감도의 문제로 현재는 거의 사용되고 있지 않다.

현재는 보다 간편한 검출법이 사용되고 있다. Binax Inc.의 뇨중 항원 신속 검출키트(Binax NOW(등록상표) Streptococcus pneumoniae Urinary antigen Test)는 이뮤노크로마토그래피법에 의해 뇨 중의 C-ps를 검출한다(특허문헌 1). 이 방법은 뇨 중 항원을 검출하기 때문에 비침습적(noninvasive)이고, 측정시간도 15분 정도로 신속하다(비특허문헌 8). 그러나, 뇨 중 항원 측정의 경우, 폐렴구균이 치료 후에도 장기간에 걸쳐 뇨 중에 계속 배출됨으로써 위양성(false positive result)이 발생한다는 문제가 있다(비특허문헌 9). 또, 영유아의 경우, 채뇨의 어려움 및 상재성(indigenous)의 폐렴구균의 영향에 의한 위양성이 발생한다는 문제도 있다(비특허문헌 10). 또한, 이 키트에 대해서는 감도가 약간 낮다는 지적도 되고 있다(비특허문헌 11).

보다 최근에 개발된 폐렴구균 항원 검출키트(비특허문헌 12)는 항C-ps 폴리클로날 항체(토끼)를 사용한 이뮤노크로마토그래피에 의해, 객담 또는 비강이나 상인두(epipharynx)의 스왑(swab), 또는 중이저류액(middle ear fluid sample)이나 이루(otorrhea fluid) 중의 폐렴구균 항원(C-ps)을 신속하게 검출하는 것이다. 이 키트는 상술한 뇨 중 항원 진단 키트과 비교하여 고감도이고, 스왑 등의 임상검체를 농축조작 없이 사용할 수가 있고, 또한 종래 어려웠던 중이저류액으로부터의 측정을 가능하게 할 수 있다. 또, 뇨 검체와 달리, 영유아로부터의 검체 채취가 용이하다. 그러나, 중이나 부비강 유래의 검체 등의 일부 검체에 대해서는 이 키트에 의해서도 역시 감도가 충분하다고는 할 수 없고, 더 고감도의 검출방법의 개발이 요구된다.

전술한 바와 같이, 폐렴구균의 항원 검출키트로는 협막항원 및 C-ps를 검출하는 것이 보고되어 있다. 이 중 다양성이 높은 협막항원은 그 다양한 형태에 따른 항체의 준비가 필요하기 때문에, 간이측정의 대상으로는 적당하지 않다. C-ps에 대해서도 전술한 기존 검출키트의 결과를 보는 한은 고감도화가 더 필요하다.

한편, F-antigen는 지금까지 일상의 임상검사에는 이용되고 있지 않다. 항F-antigen 항체를 사용한 면역학적 검출법에 의해 폐렴구균 항원을 포함하는 균을 검출했다는 보고가 있으나(비특허문헌 13~15), 이와 같은 방법은 균종 간에서의 교차반응이 발생되거나 위음성(false negative result)의 위험이 있는 등, 정밀도의 면에서 문제가 있었다.

선행 기술 문헌

특허문헌 1 : 미국특허 제 6,824,997호

비특허문헌 1 : Sorensen, Danish Medical Bulletin 42:47-53(1995)

비특허문헌 2 : Holmberg 등, J.Clin.Microbiol. 22:111-115(1985)

비특허문헌 3 : Sjogren 등, Diagn.Microbiol.Infect.Dis. 6:239-248(1987)

비특허문헌 4 : Coonrod 등, J.Lab.Clin.Med. 81:778-786(1973)

비특허문헌 5 : Feigin 등, The Journal of Pediatrics 89:773-775(1976)

비특허문헌 6 : Ajello 등, J.Clin.Microbiol. 25:1388-1391(1987)

비특허문헌 7 : Ballard 등, Pediatr.Infect.Dis.J. 6:630-634(1987)

비특허문헌 8 : 고바야시 다카오 등, 감염증학 잡지 제76권 제12호:995-1002(2002)

비특허문헌 9 : 다테다 카즈히로, 모던 미디어 제51권 제6호:129-132(2005)

비특허문헌 10 : 나리아이 아키요시 등, 감염증학 잡지 제78권 제1호:18-21(2004)

비특허문헌 11 : Tzeng 등, J.Microbiol.Immunol.Infect. 39:39-44(2006)

비특허문헌 12 : 히가시카와 코지 등, 소아과 임상 58(1):139-143(2005)

비특허문헌 13 : Kolberg 등, Microbial Pathogenesis 22:321-329(1997)

비특허문헌 14 : Stuertz 등, J.Clin.Microbiol. 36:2346-2348(1998)

비특허문헌 15 : Mattie 등, J.Antimicrob.Chemother. 56:154-159(2005)

본 발명의 과제는 간편하고도 신속하며 고감도로 생체 유래 검체로부터의 폐렴구균 항원의 검출 또는 정량을 가능하게 하는 면역학적 검출방법 및 이를 위한 항체를 제공하는 것에 있다.

본 발명자들은 보다 고감도로 폐렴구균 항원의 검출 또는 정량을 가능하게 하는 방법에 대해 검토하였다. 그 결과, 폐렴구균의 다당항원 중 종래 폐렴구균 항원의 검출에 실제로 사용되지 않았던 폐렴구균 F-antigen에 주목하여, 이를 특이적으로 인식하는 항체를 제작하고, 이 항체를 사용한 면역학적 측정방법을 이용함으로써 생체 유래 검체 중의 폐렴구균 항원을 종래의 방법보다 고감도로, 간편하고도 신속하게 측정할 수 있다는 것을 발견하여 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

즉, 본 발명은 폐렴구균 F-antigen을 특이적으로 인식하는 항체를 제공한다. 또, 본 발명은 상기 항체를 사용한 면역학적 측정법에 의해 생체 유래 검체 중의 폐렴구균 F-antigen을 검출 또는 정량하는 것을 특징으로 하는 폐렴구균 항원의 검출 또는 정량방법을 제공한다. 또한 본 발명은 상기 항체를 함유하는 폐렴구균 항원 검출키트를 제공한다.

본 발명에 의하면, 폐렴구균 F-antigen을 특이적으로 인식하는 신규 항체가 제공된다. 또, 상기 항체를 사용한 면역학적 측정방법을 이용한, 생체 유래 검체 중의 폐렴구균 항원을 간편하고도 신속하게 검출 또는 정량하는 방법이 제공된다. 본 발명의 방법에 의하면, 폐렴구균 항원을 종래보다 고감도로 검출 또는 정량하는 것이 가능해지기 때문에, 뇨, 객담이나 비강 또는 상인두 스왑(swab)뿐만 아니라, 종래보다 높은 검출감도를 요구하는 중이나 부비강 유래의 검체 등에 있어서도 검체의 농축조작을 필요로 하지 않고 신뢰성이 있는 측정결과를 얻을 수가 있다. 또한, 폐렴구균은 수막염, 중이염, 패혈증 등의 기염균(causal bacterium)이 된다는 점에서 본 발명의 방법은 이들 질환의 기염균 동정의 정밀도 및 소요시간을 향상시킬 수 있다는 임상적 유용성을 가진다.

도 1은 10,000배 희석한 5마리의 토끼 유래의 항혈청(No.1~11)의 F-antigen 고상 플레이트(F-Ag) 및 BSA 고상 플레이트(BSA)에 대한 반응성을 나타낸다.
도 2는 ELISA 측정계의 평가를 나타낸다. A: 항F-antigen 폴리클로날 항체를 사용한 샌드위치 ELISA 측정계. B: 항C-ps 폴리클로날 항체를 사용한 샌드위치 ELISA 측정계. F-Ag; F-antigen와 같은 항원 함유 샘플, C-ps;C-ps 항원 함유 샘플.
도 3은 폐렴구균 배양주(ATCC49619) 추출액의 측정에 의한 ELISA 측정계 감도 평가를 나타낸다. C-ps ELISA: 항C-ps 폴리클로날 항체를 사용한 샌드위치 ELISA 측정계, F-Ag ELISA: 항F-antigen 폴리클로날 항체를 사용한 샌드위치 ELISA 측정계.
도 4는 본 발명의 항체의 특이성 평가를 나타낸다. 실시예 1에서 얻어진 항혈청 유래의 항F-antigen 폴리클로날 항체(No.1~11) 및 공지의 항F-antigen 항체(HAS)의 반응 특이성을 나타낸다.
도 5는 본 발명의 항체를 사용한 ELISA 측정계의 특이성 평가를 나타낸다. 표 1에 나타내는 균체에 대한 반응성을 나타낸다.
도 6은 이뮤노크로마토스트립의 예시적 구성을 나타낸다. A: 사용 전의 스트립. 니트로셀룰로오스 부분에 라인은 확인되지 않는다. B: 사용 후의 스트립. 음성이면 1개의 라인(상단), 양성이면 2개의 라인(하단)을 확인할 수가 있다. C: 라미네이트 가공된 스트립의 구성. D: 스트립을 넣은 플라스틱 케이스를 나타낸다.
도 7은 F-antigen 검출용 이뮤노크로마토그래피의 감도 평가 및 측정 태양을 나타낸다. A: 검체용액을 사용한 측정 태양. B: 여러 가지 농도의 정제 F-antigen와 같은 항원을 검체로 하는 이뮤노크로마토그래피. C: 여러 가지 균체 농도의 폐렴구균 배양주(ATCC49619) 추출액을 검체로 하는 이뮤노크로마토그래피를 나타낸다.

본 발명자들은 종래의 폐렴구균 항원 검출키트로는 사용되지 않았던 F-antigen에 새롭게 착목하여 항F-antigen 항체의 제작을 실시하였다. 얻어진 본 발명의 항F-antigen 항체는 놀랍게도 종래의 항F-antigen 단일클론 항체와 달리 Haemophilus influenzae에는 실질적으로 교차성을 나타내지 않고(도 4), 또 본 항체에 의해 제작한 ELISA계도 Haemophilus influenzae를 포함하는 다른 다양한 균종에 대해서 거의 교차반응을 나타내지 않았다(도 5). 또한, F-antigen와 C-ps가 공통의 다당구조를 가진다는 지금까지의 보고(예를 들면, Sorensen, Danish Medical Bulletin 42:47-53(1995))에도 불구하고, 본 발명의 항F-antigen 항체는 C-ps와 실질적으로 반응하지 않았다(도 2). 즉, 본 발명의 항F-antigen 항체는 종래의 항F-antigen 항체나 항C-ps항체와는 전혀 다른, 고도로 F-antigen 특이적이고, 다당류 부분을 인식하는 신규 항체이다. 또한, 본 발명의 항F-antigen 항체를 사용한 폐렴구균 항원 측정계의 감도를 측정한 바, C-ps항체를 사용한 측정계와 비교하여 같은 검체에 대해서 현저하게 고감도인 것을 알 수 있었다(도 3).

본 발명의 항F-antigen 항체는 후술하는 참고예에 나타내는 방법으로 얻을 수가 있다. 우선, 공지의 방법(예를 들면, Poxton 등, Biochem.J.175:1033-1042(1978))에 의해 F-antigen을 조제한다. 조제된 F-antigen는 그대로 면역원으로서 사용할 수가 있다. 바람직하게는 조제된 F-antigen을 공지의 방법(예를 들면, 말레이미드법, 피리딜디설피드법 등)에 따라 캐리어 단백질과 커플링한 후, 면역원으로 사용한다. 얻어진 면역원을 사용하여 공지의 방법에 의해 항F-antigen 항체를 얻을 수가 있다. 커플링한 항원을 면역원으로 함으로써 Haemophilus influenzae와의 교차반응성이 없는, 보다 폐렴구균에 대한 특이성이 높은 항F-antigen 항체를 얻을 수가 있다.

커플링에 사용되는 담채 단백질로는 BSA(Bovine Serum Albumin), KLH(Keyhole Limpet Hemocyanin), OVA(Ovalbumin), Ascaris 추출물(회충 조추출물) 등을 예로 들 수 있으나, 이들에 한정되지 않고, 통상 사용되는 것이면 좋다. 담채 단백질과 F-antigen을 커플링하기 위한 가교제로는 단백질 또는 펩티드 사이의 연결에 통상 사용되는 것이면 특별히 한정되지 않는다. 이 중 SH기와 아미노기를 가교하는 헤테로 2가 반응시약이 바람직하고, 구체적인 예로는 m-말레이미드벤조일-N-히드록시석신이미드(MBS), N-(4-말레이미드부티릴옥시)석신이미드(GMBS), N-(6-말레이미드카프로일옥시)석신이미드(EMCS), N-(8-말레이미드카프릴옥시)석신이미드(HMCS), N-(11-말레이미드운데카노일옥시)석신이미드(KMUS), N-((4-(2-말레이미드에톡시)석시닐)옥시)석신이미드(MESS), N-석신이미딜-4-(N-말레이미드메틸)-시클로헥산-1-카르복시레이트(SMCC), m-말레이미드벤조일-N-히드록시설포석신이미드(sulfo-MBS), N-(4-말레이미드부티릴옥시) 설포석신이미드(sulfo-GMBS), N-(6-말레이미드카프로일옥시)설포석신이미드(sulfo-EMCS), N-(8-말레이미드카프릴옥시) 설포석신이미드(sulfo-HMCS), N-(11-말레이미드운데카노일옥시)설포석신이미드(sulfo-KMUS), 설포석신이미딜-4-(N-말레이미드메틸)-시클로헥산-1-카르복시레이트(sulfo-SMCC) 등을 예로 들 수 있다.

본 발명의 항체는 항F-antigen 응답성을 가지는 한, 단일클론 항체라도 폴리클로날 항체라도 좋고, 또한 이들과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 가지는 항체를 포함한다. 또, 본 발명의 항체는 항체의 전체 분자, 그의 재조합체 및 그들의 단편 또는 수식물, 및 2가 항체 및 1가 항체를 포함한다.

단일클론 항체는 상기 면역원을 마우스나 래트의 피하, 복강 또는 근육 내에 그대로 또는 프로인트 등의 아쥬반트(adjuvant)와 함께 면역하고, 면역된 개체의 면역 관련 세포와 미엘로마 세포의 하이브리도마를 제작하고, 그 중에서 목적의 특이적 항체를 생산하는 하이브리도마를 선택함으로써 제작된다. 면역은, 예를 들면, 0.1~100μg/body의 양(量)의 항원, 또는 커플링에 사용한 담채 단백질의 절대량으로 0.1~100μg/body, 바람직하게는 1~10μg/body의 양의 항원을 사용하여 격주로 1회에서 수회 정도 실시된다.

폴리클로날 항체는 상기 면역원을 토끼나 염소의 피하에 프로인트 등의 아쥬반트와 함께 면역하는 것으로 제작된다. 면역은, 예를 들면, 10~500μg/body의 양의 항원, 또는 커플링에 사용한 담채 단백질의 절대량으로 0.1~1000μg/body, 바람직하게는 10~500μg/body의 양의 항원을 사용하여 격주로 1회에서 수회 정도 실시된다. 면역된 개체로부터 혈액을 채취하고 Protein A 등을 사용한 어피니티 정제나 이온 교환 수지 등의 공지의 방법을 사용함으로써 IgG 분획이 얻어진다. 필요에 따라 겔 여과정제 등의 다른 정제조작을 조합하여 실시하여도 좋다.

「실질적으로 동일한 아미노산 서열을 가지는 항체」란, 항F-antigen 응답성을 가지는 한, 원래 항체의 아미노산 서열로부터 1 또는 복수개(예를 들면, 1~30개, 바람직하게는 1~20개, 보다 바람직하게는 1~10개, 더 바람직하게는 1~5개)의 아미노산이 결실, 치환, 삽입 또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지는 항체를 말한다. 특정 아미노산 서열에 있어서 1 또는 복수개의 아미노산 서열을 치환, 결실, 삽입 또는 부가하는 기술은 공지이며, 예를 들면, 부위 특이적 돌연변이 유발 등과 같은 각종 방법을 이용할 수가 있다.

또, 「실질적으로 동일한 아미노산 서열을 가지는 항체」란, 항F-antigen 응답성을 가지는 한, 원래 항체의 아미노산 서열과 80% 이상의 서열 동일성, 바람직하게는 85% 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 90% 이상의 서열 동일성, 보다 더 바람직하게는 95% 이상의 서열 동일성을 가지는 항체를 예로 들 수 있다. 아미노 서열의 동일성은, 예를 들면, 리프만-퍼슨법(Lipman-Pearson법; Science,227,1435(1985))에 의해 계산된다. 구체적으로는 유전 정보 처리 소프트웨어 Genetyx-Win(Ver.5.1.1; 소프트웨어 개발)의 호몰로지 해석(Search Homology) 프로그램을 사용하여 Unit size to compare(ktup)를 2로 하여 해석함으로써 산출된다.

항체의 단편으로는 Fab, F(ab')₂, Fv, Fab/c, 또는 단쇄 Fv(scFv)를 예로 들 수 있다. 이들 항체 단편은 항체를 파파인이나 펩신 등의 효소로 처리하거나, 또는 이들 단편을 암호화하는 유전자를 구축하고, 그것을 임의의 숙주세포 중에서 발현시킴으로써 얻을 수가 있다(예를 들면, Co, M.S.et al., J.Immunol. (1994)152, 2968-2976, Better, M. & Horwitz, A.H.Methods in Enzymology(1989)178, 476-496, Academic Press, Inc., Plueckthun, A. & Skerra, A.Methods in Enzymology(1989)178, 476-496, Academic Press, Inc., Lamoyi, E., Methods in Enzymology(1989)121, 652-663, Rousseaux, J.et al., Methods in Enzymology(1989)121, 663-669, Bird, R.E.et al., TIBTECH(1991)9, 132-137참조).

scFv는 항체의 H쇄 V영역과 L쇄 V영역을 연결함으로써 얻어진다. 이 scFv에 있어서 H쇄 V영역과 L쇄 V영역은 링커, 바람직하게는 펩티드 링커를 통하여 연결된다(Huston, J.S.et al., Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(1988)85, 5879-5883). 또는, 이와 같은 연결 펩티드를 암호화하는 유전자를 구축하고, 임의의 숙주세포 중에서 발현시켜도 좋다. 항체 수식물은 항체에 화학적인 수식을 실시함으로써 얻을 수가 있다. 항체의 재조합체는 임의의 돌연변이를 발생시킨 항체 유전자를 숙주세포 중에서 발현시킴으로써 제작할 수가 있다. 항체 재조합체 및 항체 수식물을 얻는 방법은 상기 분야에서 주지이다.

또, 본 발명은 본 발명의 항F-antigen 항체를 사용한 면역학적 측정법에 의해 생체 유래 검체 중의 폐렴구균 F-antigen을 검출 또는 정량하는 것을 특징으로 하는 폐렴구균 항원의 검출 또는 정량방법을 제공한다. 본 발명의 검출방법은 간편하고도 신속하며 고감도로 폐렴구균 항원을 검출할 수가 있으므로, 신속하고 적확한 진단을 가능하게 한다. 또, 본 발명의 정량방법을 사용함으로써 폐렴구균에 기인하는 질환에 대한 약제의 효과 등을 간편하고도 신속하며 고정밀도로 판정할 수가 있다. 따라서, 이와 같은 방법은 모두 적절한 치료법의 조기 선택에 공헌한다.

본 발명의 측정방법으로 사용되는 생체 유래 검체로는 특별히 한정되는 것은 아니나, 생체 유래의 조직, 기관(organ) 또는 체액(예를 들면, 객담, 비강 또는 상인두 스왑, 중이저류액, 이루, 부비강저류액, 뇌척수액, 뇨, 혈액, 림프액 등)에 유래하는 검체 및 이들 배양물 유래의 검체를 예로 들 수 있다. 바람직하게는, 검체는 객담, 비강 또는 상인두 스왑, 중이저류액, 이루, 부비강저류액, 뇌척수액, 뇨, 혈액, 림프액에 유래한다. 검체는 필요에 따라서 계면활성제나 산, 알칼리 처리, 가열 등에 의한 추출, 농축, 희석 등의 통상의 전처리를 실시할 수 있다.

본 발명의 방법은 종래법보다 고감도이기 때문에, 중이저류액, 이루, 부비강저류액, 뇌척수액, 혈액 유래의 검체 등의, 종래법으로는 충분한 측정 감도가 얻어지지 않았던 검체를 사용하는 것도 또한 본 발명의 방법의 바람직한 태양이다. 예를 들면, 폐렴구균은 수막염, 중이염, 패혈증 등의 기염균이 되므로, 중이저류액, 이루, 부비강저류액, 뇌척수액, 혈액 유래의 검체를 본 발명의 방법으로 측정하면, 이들 질환의 기염균을 보다 고감도로 동정할 수가 있다.

본 발명의 방법에서 사용되는 면역학적 측정법으로는 상기 분야에서 공지된 임의의 면역측정방법을 사용할 수가 있다. 예시적으로는 라디오이뮤노어세이(RIA), ELISA 등의 엔자임이뮤노어세이(EIA), 라텍스 응집법(LTIA) 및 이뮤노크로마토그래피를 예로 들 수 있다. 검출감도의 향상이라는 점에서 샌드위치법의 사용이 바람직하다. 또, 간편성 및 신속성의 관점에서는 이뮤노크로마토그래피가 바람직하다. 이뮤노크로마토그래피법을 사용하는 경우, 병상이나 외래 환자의 진단이 단시간에 가능하게 된다.

상기 면역학적 측정에서 사용되는 표지로는 상기 분야에서 사용되는 임의의 표지를 예로 들 수 있다. 예시적으로는 서양고추냉이 페록시다아제(horseradish peroxidase, HRP)나 알칼리포스파타제, β갈락토시다아제 등의 효소, ¹²⁵I, ³²P, ¹⁴C, ³⁵S 또는 ³H 등의 라디오이소토프(RI), FITC, 테트라메틸로다민이소시아네이트 등의 형광물질, 케미루미네센스 등의 발광물질, 및 금 콜로이드, 착색 라텍스 입자 등의 가시화 물질을 예로 들 수 있다. 또한, 비오틴으로 일차 표지한 후, 상기 표지에 의해 표지된 아비딘을 사용하는 증감계나 디곡시제닌 등의 저분자 물질로 일차 표지한 후, 상기 표지에 의해 표지된 항체 등의 상기 저분자 물질에 친화성을 가지는 물질을 사용하는 검출법도 예로 들 수 있다.

상기 본 발명의 검출 또는 정량방법을 이용한, 폐렴구균 항원을 검출하는 키트도 또한 제공된다. 본 발명의 키트는 폐렴구균 F-antigen을 특이적으로 인식하는 항체를 포함할 수가 있다. 또 본 발명의 키트는 면역측정에 사용하는 다른 시약이나 재료를 포함할 수가 있다. 예를 들면, 본 발명의 키트는 본 발명의 항체와 함께 이뮤노크로마토, ELISA 또는 라텍스 응집법을 위한 고상(예를 들면, 스트립, 플레이트, 비즈 등), 및 표지물질 등의 시약 등을 포함할 수가 있다.

실시예

이하에 본 발명의 실시예를 기재한다. 그러나, 본 발명은 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

(참고예1: 항F-antigen 항체 제작용의 면역원의 조제)

1) F-antigen과 같은 항원의 조제

Poxton 등의 방법(Biochem.J.175:1033-1042(1978))을 참고로 하여 F-antigen을 조제하였다. 우선, 양혈액 한천배지나 브레인 하트 인퓨전(brain heart infusion) 액체배지를 사용하여 폐렴구균을 배양하고, 조취법(scraping)이나 원심법에 의해 폐렴구균의 펠렛(pellet)을 회수하였다. 회수한 펠렛을 적당량의 정제수에 현탁한 후, 초음파 파쇄하였다. 가온처리한 후, 원심조작에 의해 펠렛을 회수하였다. 정제수에 대한 현탁, 초음파 파쇄, 원심을 수회 반복하여 수용성 성분을 충분히 제거하였다. 얻어진 수불용성 펠렛을 Boiled SDS에 첨가하고, 종농도 2.5% SDS로 조정한 후, 실온에서 수시간 동안 교반하였다. 원심한 후, 펠렛을 물로 세정하였다. 원심·물세정을 수회 반복하여 불용성 성분을 회수하였다. 불용성 성분은 종농도 10% TCA 용액으로서 냉장하에서 수시간 이상 교반하였다. 원심한 후 상청을 회수하고, 디에틸에테르 등으로 TCA를 제거한 후, 정제수에 대해서 투석하였다. 본 용액을 동결건조한 후, 백색의 분말이 얻어졌다. 이 백색 분말은 F-antigen과 핵산의 혼합물로 생각되나, 핵산은 면역원성을 가지지 않기 때문에, 본 분말을 항F-antigen 항체 제작용의 항원(F-antigen과 같은 항원)으로서 차후의 공정에서 사용하였다.

2) F-antigen과 같은 항원의 순도 평가

본 백색 분말의 1 mg를 채취하여 초순수 1mL에 용해한 후, 시판의 단백질 정량 키트(Bicinchoninic acid법: BCA 측정 키트, Pierce사)를 사용하여 단백질의 혼재를 평가하였다. 검출감도 31.25μg/mL 이하이며, 단백질의 혼재는 매우 낮다는 것이 나타났다.

3) 면역원의 조제

Szu 등의 보고(Infection and Immunity 54:448-455(1986))를 참고로 하여 얻어진 F-antigen과 같은 항원을 담채 단백질(KLH(투구게헤모시아닌(limulus polyphemus hemocyanin)) 또는 시판의 Ascaris 추출물(제조원 엘에스엘(LSL), 발매원 코스모바이오주식회사(Cosmo Bio)))에 커플링하였다. 담채 단백질과 커플링한 항원 및 커플링 하지 않은 항원(F-antigen 단독)을 각각 면역원으로서 사용하였다. 환언하면, 이하의 순서로 실시하였다.

1: 인산 완충액에 현탁한 담채 단백질을 디티오트레이톨이나 2-메르캅토에탄올 등의 SH기 환원제로 처리하였다. 처리한 후, 겔 여과나 투석 등의 수법을 사용하여 인산 완충액으로 치환하였다.

2: 상기 조작과 병행하여 적당량의 F-antigen과 같은 항원을 인산 완충액에 용해하였다. 이어서 유리(crosslink free) SH와 아미노기를 가교하는 2가반응시약(sulfo-SMCC 또는 sulfo-KMUS)을 F-antigen과 같은 항원 1mg에 대해 0.1~2mg(바람직하게는 0.2~1mg)의 비율로 용해액에 첨가하였다.

3: 실온에서 반응한 후, 투석이나 겔 여과 등의 수법에 의해 과잉량의 2가반응시약을 제거하였다.

4: 1의 조작에 의해 얻은 SH환원 담채 단백질 1mg당, 2의 조작으로 얻은 2가반응시약 처리 F-antigen 항원을 0.1~10mg(바람직하게는 0.5~5mg)의 범위에서 첨가하였다.

5: 냉장 하에서 충분한 시간 동안 반응한 후, 다시 투석처리를 하였다. 본 용액을 F-antigen 항체 제작용의 면역원으로서 사용하였다.

(실시예 1: 항F-antigen 항체의 제작)

1) 항F-antigen 폴리클로날 항체의 제작

참고예 1에서 얻어진 면역원을 토끼(n=11)의 피하에 프로인트 등의 아쥬반트와 함께 면역하였다. 면역량은 F-antigen 단독으로 면역한 경우 10~500μg/body를, 담채 단백질과 커플링한 경우에는 커플링에 사용한 담채 단백질의 절대량으로 0.1~1000μg/body, 바람직하게는 10~500μg/body를 사용하고, 격주로 1회에서 수회 정도 실시하였다. 항혈청을 부분 채취하여 면역에 사용한 항원에 대한 반응성을 확인한 후, 대량채혈 또는 전(全)채혈을 실시하였다. 대량채혈의 경우에는 면역을 계속하면서 개체에 부담이 되지 않는 범위에서 수회의 대량채혈을 실시하였다. 얻어진 전혈(全血)을 원심분리한 후, 항혈청으로서 동결보관하였다. 항혈청을 적당량 해동하고, Protein A 등을 사용한 어피니티 정제나 이온 교환 수지등에 의해 정제하여 IgG 분획을 얻었다. 또, 필요에 따라서 겔 여과정제를 조합하였다.

2) 항F-antigen 단일클론 항체의 제작

참고예 1에서 얻어진 면역원을 마우스 또는 래트(rat)의 피하, 복강 또는 근육 내에 그대로 또는 프로인트 등의 아쥬반트와 함께 면역한다. 면역량은 F-antigen 단독으로 면역하였을 경우는 0.1~100μg/body를, 담채 단백질과 커플링하였을 경우는 커플링에 사용한 담채 단백질의 절대량으로 0.1~100μg/body, 바람직하게는 1~10μg/body를 사용하여 격주로 1회에서 수회 정도의 면역을 실시한다. 항혈청을 부분채취하여 면역에 사용한 항원에 대한 반응성을 확인한 후, 비장, 흉선(thymus)이나 림프절을 적출하고, 그곳에서 얻어진 면역 관련 세포와 P3U1 등의 마우스 미엘로마 세포주를 폴리에틸렌글리콜법 등 공지의 방법으로 융합하여 하이브리도마를 제작한다. 제작된 하이브리도마 중에서 한계희석법에 의해 목적으로 하는 항원에 반응하는 하이브리도마를 선택한다. 선택된 하이브리도마의 배양 상청액이나 복수(ascite)로부터 Protein A 등을 사용한 어피니티 정제나 이온 교환 수지 등에 의해 단일클론 항체를 정제한다. 또, 필요에 따라서 겔 여과정제를 조합하여 실시한다.

(실시예 2: 항F-antigen 항체의 역가(titer))

실시예 1에서 제작한 11개체의 토끼로부터 얻어진 항혈청(No.1~No.5:KLH를 캐리어 단백질로 하여 sulfo-SMCC로 가교한 항원을 면역한 5마리, No.6~No.9:Ascaris 추출물을 캐리어 단백질로 하여 sulfo-KMUS로 가교한 항원을 면역한 4마리, No.10,11:F-antigen 단독으로 면역한 2마리)을 적절히 희석(No.1~5:50,000배, No.6~9:50,000배, No.10,11:1,000배)한 후, F-antigen과 같은 항원 고상화 플레이트에 반응시켜서 항혈청의 역가를 평가하였다. 결과를 도 1에 나타낸다. 11개체 모든 항혈청이 F-antigen과 같은 항원 고상화 플레이트에 강력히 반응하는 것이 확인되었다. 또, 본 항혈청은 콘트롤 역할을 하는 소혈청알부민(BSA) 고상화 플레이트에는 전혀 반응하지 않는다 것도 확인되었다. 이들 결과로부터 상기 방법에서 제작된 모든 항혈청은 강력한 항F-antigen 응답성을 나타낸다는 것이 밝혀졌다.

(실시예 3: 항F-antigen 항체를 사용한 샌드위치 ELISA의 항원 반응성)

실시예 1의 항혈청 중 No.1 및 No.5로부터 Protein A 정제 및 겔 여과정제에 의해 IgG 분획을 얻은 후, 이들 폴리클로날 항체를 사용한 샌드위치 ELISA에 의한 측정계를 구축하여 그 성능을 평가하였다. 환언하면, No.5 혈청 유래의 정제 항체를 고정한 고상 플레이트에 F-antigen과 같은 항원 또는 C-ps를 포함하는 샘플(0.041~10ng/mL)을 각각 첨가하여 항체와 반응시켰다. 항F-antigen 항체를 사용한 측정계에서는 플레이트를 세정한 후, 비오틴 표지한 No.1 혈청 유래의 정제 항체를 첨가하여 샘플과 반응시켰다. 플레이트를 다시 세정하고, 서양고추냉이페록시다아제(HRP) 표지한 스트렙트 아비딘을 첨가하여 비오틴과 반응시켰다. 이어서, HRP의 발색을 흡광도계에 의해 측정하였다. 동일한 수법에 의해 시판 C-ps를 사용하여 제작한 항C-ps 폴리클로날 항체에 의한 샌드위치 측정계를 구축하여 HRP의 발색을 측정하였다.

측정된 흡광도에 기초하여, 두 측정계의 성능을 평가하였다. 지금까지의 보고에서 C-ps와 F-antigen은 공통의 다당구조를 가진다는 것이 알려져 있었으므로(Sorensen, Danish Medical Bulletin 42:47-53(1995)), 두 측정계 모두 C-ps와 F-antigen에 교차반응할 것이 예상되었다. 그러나, 도 2에 도시한 바와 같이, 본 발명의 항F-antigen 폴리클로날 항체를 사용한 샌드위치 ELISA 측정계는 F-antigen과 같은 항원은 검출하나, C-ps는 전혀 검출하지 않았다(도 2A). 마찬가지로 C-ps를 사용한 샌드위치 ELISA 측정계는 C-ps는 검출하나, F-antigen과 같은 항원은 전혀 검출하지 않았다(도 2B).

이들 결과로부터 본 발명의 항F-antigen 항체가 F-antigen만을 특이적으로 인식한다는 것이 나타났다. 또, 본 발명의 항F-antigen 항체는 C-ps와의 교차반응을 전혀 나타내지 않으므로(도 2), 종래부터 사용되어 온 항C-ps항체와는 전혀 다른 신규인 것임이 시사되었다.

(실시예 4: 항F-antigen 항체를 사용한 샌드위치 ELISA의 균체 반응성)

실시예 3에서 제작한 2종류의 샌드위치 ELISA 측정계의 폐렴구균균체 추출액에 대한 반응성을 조사하였다. 균체 추출액에는 배양에 의해 얻은 폐렴구균(ATCC49619)을 계면활성제 또는 초음파 등을 사용하여 파쇄한 용액을 사용하였다. 도 3에 도시한 바와 같이, 본 발명의 항F-antigen 항체를 사용한 측정계는 항C-ps항체를 사용한 측정계보다 100배 고감도로 폐렴구균균체 추출액으로부터 폐렴구균 항원을 검출하였다. 이로부터 본 발명의 항F-antigen 항체를 사용한 ELISA 측정계에 의해 종래부터 사용되고 있는 C-ps측정계보다 현저하게 고감도로 생체 유래 검체 중의 폐렴구균을 검출할 수 있다는 것이 확인되었다. 또한 도 2에 도시한 바와 같이, 정제 항원을 측정한 경우의 감도는 두 측정계에서 거의 동등(0.1ng/mL정도)하므로, 생체 유래 검체에서의 감도차가 폐렴구균에서의 양 항원의 발현량의 차에 기인할 가능성이 시사된다.

(실시예 5: 항F-antigen 항체를 사용한 샌드위치 ELISA의 균체 특이성)

공지의 항F-antigen 항체나 F-antigen 검출계(Kolberg 등, Microbial Pathogenesis 22:321-329(1997) 또는 Stuertz 등, J.Clin.Microbiol.36:2346-2348(1998))에서는 포스포릴콜린 부분을 에피토프로서 이용한다. 따라서, 이들 항체나 검출계에는 F-antigen 이외에도 C-ps 및 Haemophilus influenzae 등에 강한 교차반응성을 가진다는 결점이 있음이 시사된다.

따라서, 실시예 1에서 얻어진 항혈청(No.1~11) 유래의 본 발명의 항F-Antigen 폴리클로날 항체를 사용한 샌드위치 ELISA 측정계의 균종간에서의 교차반응성을 조사하였다. 비교를 위하여 포스포릴콜린을 에피토프로 하는 마우스 단일클론 항체 HAS(Statens serum institut, Denmark, 참고 문헌:Infection and immunity 1984;43:876-878, Microbial Pathogenesis 1993;14:299-305)를 사용하여 동일하게 실험하였다.

1) Haemophilus influenzae와의 사이의 교차반응성의 비교

폐렴구균(ATCC49619) 및 Haemophilus influenzae(Type B, ATCC31441)의 배양균체를 초음파 파쇄한 후, 시판의 단백질 정량 키트(Bicinchoninic acid법:BCA 측정 키트, Pierce사)에 의해 단백질 정량을 실시하고, D-PBS 희석한 후 1.0μg/mL의 농도로 ELISA용 플레이트에 하룻밤 동안 고상화하였다. 일반적 수법에 의해 블로킹한 후, 적절히 희석한 실시예 1에서 제작한 각 항혈청(No.1~5:50,000배, No. 6~9:50,000배, No.10,11:1,000배) 또는 상기 HAS 항체의 희석액(125배)을 반응시켰다. 이어서 HRP 표지한 항토끼 IgG 항체 또는 HRP 표지한 항마우스 IgM 항체에 의해 발색시키고, HRP의 발색을 흡광도계에 의해 측정하였다. 또한, 콘트롤 플레이트로서 BSA 고상 플레이트를 사용하였다. 결과를 도 4에 도시한다.

F-antigen 단독 항원을 면역하여 얻어진 No.10,11의 두 항혈청, 및 포스포콜린을 에피토프로 하는 HAS 항체는 폐렴구균 파쇄항원에도 Haemophilus influenzae파쇄항원에도 반응하였다. 한편, 커플링 항원을 면역하여 얻어진 항혈청 No.1~No. 9에서는 No.8에만 약한 교차가 있었으나, Haemophilus influenzae에는 반응성을 나타내지 않고, 고도로 폐렴구균 특이적이었다. 따라서, F-antigen을 캐리어 단백질에 가교함으로써 제작되는 항원을 면역원으로 사용하여 얻어진 항체는 HAS 항체와 같은 Haemophilus influenzae와의 교차반응을 발생시키지 않으므로, 포스포콜린을 인식하지 않는 항F-antigen 항체인 것이 시사된다. 한편, 담채 단백질과 커플링되어 있지 않은 F-antigen 항원을 면역원으로 얻어진 항혈청은 HAS 항체와 동일한 포스포릴콜린을 에피토프로 하는 항체를 함유한다는 것이 밝혀졌다.

2) 다균종간에서의 교차반응성의 비교

또한, 다균종간에서의 교차반응성을 조사하였다. 표 1의 균을 사용하는 것 이외에, 본 실시예의 1)과 동일한 방법을 사용하여 본 발명의 항체의 반응성을 측정하였다. 결과를 도 5에 도시한다. 본 발명의 항체는 Stuertz 등(Stuertz 등, J.Clin.Microbiol.36:2346-2348(1998))의 항체와 마찬가지로 S. mitis와의 교차반응성을 가지나, 다른 균종과의 사이에는 전혀 교차반응을 나타내지 않았다.

본 발명의 다당류 부분을 인식하는 항F-antigen 항체는 종래 알려진 포스포릴콜린을 에피토프로 하는 항F-antigen 항체와 비교하여 고도로 폐렴구균 특이적이었다. 또한 본 발명의 항F-antigen 항체는 임상적으로 폐렴구균과의 혼합감염을 발생시키기 쉬운 Haemophilus influenzae와의 반응성을 갖지 않으므로, Haemophilus influenzae에 의한 영향을 받지 않는다는 점에서 임상검사에 유용하다. 또, 상술한 실시예 3에서 나타낸 본 발명 항체를 사용한 ELISA 측정계의 감도(0.041~10ng/mL)는 종래부터 보고되어 있는 ELISA 측정계의 감도(예를 들면, 상술한 Stuertz 등에서의 3.1~50ng/mL)와 비교하여 현저하게 높다(약 75배).

(참고예 2: 이뮤노크로마토그래피의 구성)

이뮤노크로마토그래피는 일반적 수법에 따라 실시할 수가 있다. 예시적으로는 도 6에 도시한 바와 같은 스트립 등의 구성을 사용할 수가 있다. 예를 들면, 상기 구성은 플라스틱 대지(plastic base sheet) 등의 기판상의 편측말단에 샘플어플라이 부분(샘플 패드)을, 또 표지항F-Antigen 항체를 건조유지시킨 부분(콘쥬게이트 패드(conjugate pad)), 니트로셀룰로오스 부분, 및 과잉인 샘플을 흡수하는 부분(흡수 패드)을 구비한다. 표지항F-antigen 항체의 용액을 샘플과 함께 샘플 패드로부터 흡수시키는 경우에는 콘쥬게이트 패드는 필요없다. 샘플 패드, 콘쥬게이트 패드 및 흡수 패드로는 유리 섬유, 셀룰로오스 혹은 코튼 등, 또는 그들의 혼합체로부터 형성되는 다공질 소재(예를 들면, 여과지)가 바람직하고, 니트로셀룰로오스는 포아사이즈(pore size) 1.0~20μm(바람직하게는 5.0~15.0μm)인 것이 바람직하다.

니트로셀룰로오스에는 상기의 정제항F-antigen 폴리클로날 항체를 0.1~10mg/ml(바람직하게는 0.2~5mg/mL)의 농도로 도포하고(테스트 라인), 또한 테스트 라인과 다른 위치에 항토끼 IgG 활성을 가지는 염소나 마우스의 IgG 등을 0.1~10 mg/ml의 농도로 도포한다(콘트롤 라인). 건조한 후, 단백질이나 고분자 등으로 블로킹한다. 블로킹에는 스킴 밀크, BSA, 카세인, 젤라틴 등의 단백질이나, 폴리비닐알코올(PVA), 폴리비닐피롤리돈(PVP), 폴리에틸렌글리콜(PEG) 등의 고분자가 사용가능하다.

항체의 표지로는 20~150nm의 사이즈(바람직하게는 30~100nm)의 금 콜로이드가 바람직하고, 또 착색 Latex 입자나 다른 귀금속 콜로이드도 사용가능하다. 이들 표지는 콜로이드나 Latex 입자에 대한 직접적인 흡착이나 다른 단백질 등을 통한 공유결합, 또한 Latex상의 관능기를 통한 공유결합 등의 적절한 방법에 의해 항체에 결합시킨다. 표지의 블로킹은 니트로셀룰로오스와 동일하게 스킴 밀크, BSA, 카세인, 젤라틴 등의 단백질이나, PVA, PVP, PEG 등의 고분자가 사용가능하다. 상기 방법에 의해 제작한 표지항F-antigen 폴리클로날 항체는 스킴 밀크, BSA, 카세인, 젤라틴 등의 단백질이나, PVA, PVP, PEG 등의 고분자 및 당류 등과 함께 상기에서 언급한 다공질 소재에 함침시킨 후에 건조시켜서 콘쥬게이트 패드로 한다. 이 콘쥬게이트 패드, 샘플 패드, 흡수 패드 및 상기한 바와 같이 제작한 니트로셀룰로오스를 기판에 붙여서 조립한 이뮤노크로마토스트립은 플라스틱 케이스 내에 넣거나, 라미네이트 씰을 붙임으로써 스트립 단체로 사용가능하다(도 6C 및 D).

(실시예 6: 항F-antigen 항체를 사용한 샌드위치이뮤노크로마토그래피의 성능 평가)

금 콜로이드 표지항F-antigen 항체를 건조유지시킨 콘쥬게이트 패드를 구비하는 이뮤노크로마토스트립을 제작하였다. 계면활성제를 함유하는 인산완충액 등으로 중이염, 폐렴 및 수막염 등에 유래하는 침출액, 스왑, 객담, 혈액, 뇌척수액, 뇨 등의 샘플을 희석한 후, 그 희석액(검체 추출액)에 스트립을 삽입하여 샘플을 전개하였다(도 7A). 전개 개시 후 15분에 양성·음성의 판정을 육안으로 실시하였다. 그 결과, F-antigen과 같은 항원이 10~0.6ng/mL의 범위에서 테스트 라인 부위에 적색 라인이 확인되어 양성으로 판단할 수가 있었다. 한편, F-antigen과 같은 항원을 대신하여 완충액을 제공한 경우에는 테스트 라인 부위에는 적색 라인을 확인할 수 있는 음성으로 판단할 수가 있었다(도 7B). 또한, 동일한 수법에 의해, 균량 기지의 균체 추출액을 동(同)이뮤노크로마토스트립으로 측정한 결과, 완충액만을 도포한 0농도에서는 상기한 바와 마찬가지로 테스트 라인은 확인할 수 없었으나, 폐렴구균 추출액에서는 10³CFU/ml까지 테스트 라인을 확인할 수가 있어서 양성으로 판정할 수가 있었다(도 7C).

Claims

폐렴구균 F-antigen을 특이적으로 인식하는 항체.
제 1항에 있어서,
Haemophilus influenzae 항원 및 폐렴구균 C-ps 항원과의 교차반응성을 실질적으로 나타내지 않는 것을 특징으로 하는 항체.
제 1항 또는 제 2항 기재의 항체를 사용한 면역학적 측정법에 의해 생체 유래 검체 중의 폐렴구균 F-antigen을 검출 또는 정량하는 것을 특징으로 하는 폐렴구균 항원의 검출 또는 정량방법.
제 3항에 있어서,
상기 생체 유래 검체가 중이 또는 부비강 유래 검체인 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항 또는 제 2항 기재의 항체를 함유하는 폐렴구균 항원 검출키트.
제 5항에 있어서,
제 3항 기재의 방법을 실시하기 위한 키트.