JP2004300060A - ストレプトコッカス・ミュータンスに対するポリクローナル抗体の製造方法 - Google Patents
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Abstract
【課題】免疫動物の個体差に影響されることなく、ミュータンスレンサ球菌以外の口腔内レンサ球菌との交差反応性を十分に低く抑えたストレプトコッカス・ミュータンスに特異的なポリクローナル抗体を安定的に製造する方法を提供する。
【解決手段】免疫動物に、ストレプトコッカス・ミュータンスの全菌体、そのプロテアーゼ処理菌体、及びこれらの菌体の抗原抽出物から選ばれる少なくとも１種の免疫原を免疫して抗体混合物を得、その後、上記各免疫原から選ばれる少なくとも１種を抗原として用いたアフィニティー精製法によって当該抗体混合物を精製するポリクローナル抗体の製造方法において、前記免疫動物への免疫原及びアフィニティー精製に用いる抗原の少なくとも一方として、前記プロテアーゼ処理菌体、または当該菌体の抗原抽出物を使用し、且つアフィニティー精製における担体からの溶出の際に、カオトロピックイオンを使用する。
【選択図】 なし
【解決手段】免疫動物に、ストレプトコッカス・ミュータンスの全菌体、そのプロテアーゼ処理菌体、及びこれらの菌体の抗原抽出物から選ばれる少なくとも１種の免疫原を免疫して抗体混合物を得、その後、上記各免疫原から選ばれる少なくとも１種を抗原として用いたアフィニティー精製法によって当該抗体混合物を精製するポリクローナル抗体の製造方法において、前記免疫動物への免疫原及びアフィニティー精製に用いる抗原の少なくとも一方として、前記プロテアーゼ処理菌体、または当該菌体の抗原抽出物を使用し、且つアフィニティー精製における担体からの溶出の際に、カオトロピックイオンを使用する。
【選択図】 なし
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ストレプトコッカス・ミュータンスに特異的なポリクローナル抗体の製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
一般に、ミュータンスレンサ球菌と呼ばれる一群の乳酸発酵性細菌が、齲蝕発症に深く関わっていることが知られている。
【０００３】
これらミュータンスレンサ球菌群は、ストレプトコッカス・クリセタス（Ｓ．ｃｒｉｃｅｔｕｓ、血清型ａ）、ストレプトコッカス・ラッタス（Ｓ．ｒａｔｔｕｓ、血清型ｂ）、ストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ、血清型ｃ、ｅ、ｆ）、ストレプトコッカス・フェルス（Ｓ．ｆｅｒｕｓ、血清型ｃ）、ストレプトコッカス・マカカ（Ｓ．ｍａｃａｃａｅ、血清型ｃ）、ストレプトコッカス・ソブリヌス（Ｓ．ｓｏｂｒｉｎｕｓ、血清型ｄ、ｇ）、ストレプトコッカス・ドウネイ（Ｓ．ｄｏｗｎｅｙ、血清型ｈ）として、血清学的、遺伝学的に異なる７種の型に分類されている。
【０００４】
従来、これらミュータンスレンサ球菌の唾液中の濃度が１０５〜１０６個／ｍｌの場合には、齲蝕の危険あり、１０６個／ｍｌ以上の場合は特に危険であると言われており、人の口腔内におけるミュータンスレンサ球菌の存在量を知ることで、その人の齲蝕危険度の判定を行なうことが可能である。一般に、これらミュータンスレンサ球菌の濃度は、バシトラシンを入れた培地を用いて唾液中のミュータンスレンサ球菌を選択的に培養してコロニー数を調べることにより測定されている（そのための測定キットも市販されている）。そして、唾液中の各ミュータンスレンサ球菌の濃度についても、同様に培養を行なって得られたコロニーの中から各菌のコロニーを同定し、その数を調べることにより一応知ることができる。なお、同定の方法としては、糖発酵試験等の生化学的方法、ＤＮＡプローブを用いる遺伝学的方法、血清型特異的抗体を用いる免疫学的方法等が知られている。
【０００５】
近年、ミュータンスレンサ球菌の中でヒトの口腔に存在するのは主にストレプトコッカス・ミュータンスとストレプトコッカス・ソブリヌスの２菌種であることが明らかとなった。特に、ストレプトコッカス・ミュータンスはヒト口腔から高頻度に分離され（９割以上の人から分離される）、齲蝕の発生に深く関連することが判明した。
【０００６】
現在、口腔内のミュータンスレンサ球菌の測定法としては培養法が広く実施されている。しかし、培養法は、培養操作が不可欠であること、更に分離したコロニーの形態からの菌種の同定には熟練した手技が必要であることから、検査時間および操作の煩雑さの点で問題がある。
【０００７】
歯垢や唾液等の臨床検体からストレプトコッカス・ミュータンスを直接検出する方法としては、各種モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体を用いた免疫学的測定方法が報告されている。これらの方法は菌を培養する必要が無く、検出に要する時間が大幅に短縮できるという利点がある。
【０００８】
口腔内には様々なストレプトコッカス属に分類されるレンサ球菌が常在していることが知られている。口腔内の各部位により細菌叢中の存在比率は異なるが、齲蝕危険度の判定に使用する歯垢や唾液では、ストレプトコッカス属のレンサ球菌が細菌叢の約５０％近くを占めることが知られており（例えば、非特許文献１）、また、唾液１ｍｌ中の総菌数は１０８個／ｍｌ以上であると言われている。ミュータンスレンサ球菌数は一般的に１０７個以下であるので、口腔内のレンサ球菌は大部分がミュータンスレンサ球菌以外のレンサ球菌であるといえる。
【０００９】
従って、齲蝕危険度の判定のためには、１０８個／ｍｌオーダーのミュータンスレンサ球菌以外の口腔内レンサ球菌中に混在する１０５個／ｍｌオーダーのストレプトコッカス・ミュータンスを測定する、即ち、ミュータンスレンサ球菌以外の口腔内レンサ球菌がストレプトコッカス・ミュータンスの１０００倍量程度存在していてもストレプトコッカス・ミュータンスを正確に測定する必要がある。このような測定のためには、１０５個／ｍｌのストレプトコッカス・ミュータンスとの反応性に比べて、１０８個／ｍｌのミュータンスレンサ球菌以外の口腔内レンサ球菌との交差反応性は著しく低いという、高力価で且つ特異性の非常に高い抗体が必要になる。
【００１０】
モノクローナル抗体を用いた方法としては、酵素標識したストレプトコッカス・ミュータンスに対するモノクローナル抗体と検体を混合し、孔径０．４５μｍのメンブランフィルターで濾過することでストレプトコッカス・ミュータンスと結合した酵素標識抗体のみをフィルター上に保持し、酵素基質添加後の発色により検出する方法が提案されているが（非特許文献２、特許文献１）、該方法で使用されているモノクローナル抗体は１０５個レベルのストレプトコッカス・ミュータンスの反応性と１０７個レベルのストレプトコッカス・サリバリウスとの交差反応性は同程度である。口腔内では、１０７〜１０８個レベルのストレプトコッカス・サリバリウスが存在する場合があり、この場合にはストレプトコッカス・ミュータンスが正確に測定できないという問題がある。
【００１１】
ミュータンスレンサ球菌以外の口腔内レンサ球菌との反応性に着目し、ストレプトコッカス・ミティス、ストレプトコッカス・サリバリウス、ストレプトコッカス・サンギスと反応しないストレプトコッカス・ミュータンスに対するモノクローナル抗体を用いた測定法が提案されている（特許文献２）。該モノクローナル抗体の特異性は、一定量（１０８個）の上記３菌種とストレプトコッカス・ミュータンスの培養菌に対する抗体の反応性を該抗体の２倍希釈系列により調べて、評価されており、抗原抗体反応の容量−作用曲線がプラトーとなるような抗体過剰域においても、ストレプトコッカス・ミティス、ストレプトコッカス・サリバリウス、ストレプトコッカス・サンギスに対する交差反応性は検出されないという性質が開示されている。しかし、１０５個のストレプトコッカス・ミュータンスに対する反応性については調べられておらず、ミュータンスレンサ球菌以外の口腔内レンサ球菌がストレプトコッカス・ミュータンスの１０００倍量程度存在していている場合にストレプトコッカス・ミュータンスを正確に測定できるかどうか不明である。また、その他の口腔内レンサ球菌のストレプトコッカス・ゴルドニイ、ストレプトコッカス・オラリスとの反応性は全く検討していないという問題がある。
【００１２】
また、ストレプトコッカス・ミティス、ストレプトコッカス・サリバリウス、ストレプトコッカス・サンギスおよびポルフィロモナス・ジンジバリスと反応せず、ストレプトコッカス・ミュータンスおよびストレプトコッカス・ソブリヌスと対するモノクローナル抗体を用いた測定法が提案されている（特許文献３）。該モノクローナル抗体に関して、一定量の培養菌（乾燥重量５μｇ）に対する反応性を調べた場合、ストレプトコッカス・サンギス、ストレプトコッカス・サリバリウス、ストレプトコッカス・ミティス、ストレプトコッカス・ラッタス、ストレプトコッカス・フェルス、ストレプトコッカス・アンギノーサス、ラクトバチラス・カゼイ、ポルフィロモナス・ジンジバリスに対する交差反応性は検出されないこと、また、１０５個／ｍｌのストレプトコッカス・ミュータンスは測定可能であるが、１０６個／ｍｌのストレプトコッカス・サリバリウスに対する交差反応性は検出されないという性質が開示されている。しかし、この場合も、ミュータンスレンサ球菌以外の口腔内レンサ球菌がストレプトコッカス・ミュータンスの１０００倍量程度存在していている場合にストレプトコッカス・ミュータンスを正確に測定できるかどうか不明であり、また、その他の口腔内レンサ球菌のストレプトコッカス・ゴルドニイ、ストレプトコッカス・オラリスとの反応性は全く検討していないという問題がある。
【００１３】
一方、ストレプトコッカス・ミュータンスに対するポリクローナル抗体を利用した方法として、ガラススライド上でのラテックス凝集法を用いた方法が報告されている（非特許文献３、４、特許文献４）。一般的に、ストレプトコッカス・ミュータンスは抗原性があまり高くなく、アフィニティー精製により交差反応の原因となる抗体を除去しても特異性の高いポリクローナル抗体を得ることは困難であることが知られているが（例えば、非特許文献５）、該方法においてはストレプトコッカス・ミュータンス菌体をウサギに免疫し作製したポリクローナル抗体をアフィニティー精製無しに使用している。従って、ここで使用しているポリクローナル抗体の特異性は低いことが考えられ、このため、該方法該方法に於いては、１×１０６個／ｍｌ以上の濃度の菌体試料溶液に於いてしか陽性反応が得られておらず、十分な感度が達成されていない。
【００１４】
このように唾液又は歯垢から直接調製した臨床検体中のストレプトコッカス・ミュータンスの測定に関しては、齲蝕危険度の判定のためには検出限界が１０５個／ｍｌの簡便な測定法が望まれているが、この要求を満たすストレプトコッカス・ミュータンス測定方法は従来知られていなかった。
【００１５】
本発明者等は、検出感度があがらない原因の一つに被検体液中に存在するミュータンスレンサ球菌以外の口腔内レンサ球菌の影響があると考え、鋭意検討した結果、口腔内に存在するミュータンスレンサ球菌以外の口腔内レンサ球菌に対する交差反応性を十分に低く抑え、ストレプトコッカス・ミュータンスを特異的に検出・定量することが可能であるポリクローナル抗体と該抗体の製造方法を先に提案した（特願２００１−３８４５９５号）。この製造方法は、免疫動物に、菌体または菌体からの抗原抽出物を免疫原として免疫することにより抗体混合物を得、次いで該免疫原をアフィニティー担体として使用し、アフィニティー精製することで実施される。この時、免疫動物への免疫原及びアフィニティー精製に用いる抗原の少なくとも一方に、ストレプトコッカス・ミュータンス菌体表面に存在する交差反応の原因となる物質と考えられる菌体表面タンパク質をプロテアーゼ処理により除去した菌体（以下「プロテアーゼ処理菌体」ともいう）、またはその抗原抽出物を使用することにより、唾液または歯垢から直接調製した臨床検体中のストレプトコッカス・ミュータンスを特異的に検出できる抗体を調製することが可能になる。
【００１６】
ここで、アフィニティー精製は、抗体混合物とアフィニティー担体を接触させ、ストレプトコッカス・ミュータンスとのみ反応する抗体（以下「特異的抗体」ともいう）をアフィニティー担体に吸着させ、アフィニティー担体を洗浄することで夾雑物質を除去した後、アフィニティー担体より特異的抗体を溶出することにより実施される。一般的に、抗原−抗体複合体の結合力は強いので、上記アフィニティー担体からの抗体の溶出には、酸性条件、アルカリ性条件、変性剤の使用等厳しい条件が適用され、中でも酸性条件による溶出がよく行われている（例えば、非特許文献６）。
【００１７】
【非特許文献１】武笠英彦監修，「う蝕細菌の分子生物学−研究の成果と展望−」，第１版，クインテッセンス出版，１９９７年，ｐ２９―３７
【非特許文献２】安富豊ら著，「小児歯科学雑誌」，第３０巻，１９９２年，ｐ１８６−１９３
【特許文献１】特許第３０９３８８３３号
【特許文献２】特開平１０−３６４００号公報
【特許文献３】特開２００１−１７２２９９号公報
【非特許文献３】武井勉著，「阪大医学雑誌」，第３５巻，１９９０年，ｐ９３−１０９
【非特許文献４】Ｔａｋｅｉ著，「Ｔ．Ａｒｃｈｓ．ｏｒａｌ．Ｂｉｏｌ．」，第３７巻，１９９０年，ｐ９９−１０４
【特許文献４】特開平１−２５００６７号公報
【非特許文献５】浜田茂幸編集，「う蝕と歯周病」，日本歯科詳論社，第１巻，１９８２年，ｐ１７―２３
【非特許文献６】「アフィニティークロマトグラフィーハンドブック」，アマシャムファルマシアバイオテク，１９９９年
【００１８】
【発明が解決しようとする課題】
ところが、上記ストレプトコッカス・ミュータンスに特異的なポリクローナル抗体の製造方法において、アフィニティー担体からの抗体の溶出を、溶出液を酸性条件にすることにより実施した場合、免疫動物の個体差に起因して、製造されるポリクローナル抗体のミュータンスレンサ球菌以外の口腔内レンサ球菌との交差反応性のバラツキが大きくなり、この交差反応を十分に低く抑えられない抗体が製造されるケースが生じることが判明した。これは、上記方法により、多数の免疫動物から抗体混合物を得、大量に前記特異的抗体を製造する場合において、目的とする抗体の生産性を低下させるものであり、該方法を工業的に実施する上での大きな障害になっていた。
【００１９】
そこで、本発明は、免疫動物の個体差に影響されることなく安定的に、ミュータンスレンサ球菌以外の口腔内レンサ球菌との交差反応性を十分に低く抑えたストレプトコッカス・ミュータンスに特異的なポリクローナル抗体を製造する方法を提供することを目的とする。
【００２０】
【課題を解決するための手段】
上述した問題に鑑み、本発明者等が鋭意検討した結果、免疫動物の個体差に影響されず安定的に、ストレプトコッカス・ミュータンスに特異的なポリクローナル抗体を製造できる方法を見出し、本発明を完成するに至った。
【００２１】
即ち、本発明は、免疫動物に、ストレプトコッカス・ミュータンスの全菌体、そのプロテアーゼ処理菌体、及びこれらの菌体の抗原抽出物から選ばれる少なくとも１種の免疫原を免疫して抗体混合物を得、その後、上記各免疫原から選ばれる少なくとも１種を抗原として用いたアフィニティー精製法によって当該抗体混合物を精製するポリクローナル抗体の製造方法であって、前記免疫動物への免疫原及びアフィニティー精製に用いる抗原の少なくとも一方として、前記プロテアーゼ処理菌体、または当該菌体の抗原抽出物を使用し、且つアフィニティー精製における担体からの溶出の際に、カオトロピックイオンを使用することを特徴とするストレプトコッカス・ミュータンスに対するポリクローナル抗体の製造方法である。
【００２２】
本発明の製造方法を適応することで、例えば、特願２００１−３８４５９５号記載のストレプトコッカス・ミュータンスに対する反応性が、ストレプトコッカス・ゴルドニイ、ストレプトコッカス・サリバリウス、ストレプトコッカス・オラリス、ストレプトコッカス・ミティス、およびストレプトコッカス・サンギスに対する反応性と比較してそれぞれ１０００倍以上であることを特徴とするポリクローナル抗体を、容易かつ安定的に製造することが可能になる。これは、本発明者等によって上記のストレプトコッカス・ミュータンスに対する特異的な抗体を製造するための免疫方法、アフィニティー担体からの抗体の溶出条件等が注意深く検討され、これらの条件の最適の組み合わせが見出されたことによりなされたものである。
【００２３】
【発明の実施の形態】
本発明に係るポリクローナル抗体の製造方法は、要するに
（１）免疫動物に、ストレプトコッカス・ミュータンスの全菌体、そのプロテアーゼ処理菌体、及びこれらの菌体の抗原抽出物から選ばれる少なくとも１種の免疫原を免疫して抗体混合物を得、その後、上記プロテアーゼ処理菌体またはその抗原抽出物を抗原として用いたアフィニティー精製法により特異的抗体を回収するか、または、
（２）免疫動物に、ストレプトコッカス・ミュータンスのプロテアーゼ処理菌体、またはその抗原抽出物を免疫して抗体混合物を得、その後、ストレプトコッカス・ミュータンス全菌体、またはその抗原抽出物を抗原として用いたアフィニティー精製法によって特異的抗体を回収する
方法において適用される。
【００２４】
これらの製造方法では、免疫動物への免疫原、及びアフィニティー精製に用いる抗原の少なくとも一方に、ストレプトコッカス・ミュータンスのプロテアーゼ処理菌体、またはその抗原抽出物を使用している。ストレプトコッカス・ミュータンスのプロテアーゼ処理菌体は、プロテアーゼの作用により、菌体表面に存在する交差反応の原因となる物質と考えられる菌体表面タンパク質が除去されている。
【００２５】
したがって、斯様なプロテアーゼ処理菌体、またはその抗原抽出物を、免疫動物への免疫原として用いれば、交差反応を引き起こす抗体の産生を大きく抑えることができ、特異性の高いポリクローナル抗体を製造することが可能になる。他方、該プロテアーゼ処理菌体、またはその抗原抽出物を、アフィニティー精製に用いれば、これら抗原は前記の如くに菌体表面に存在する交差反応の原因となる菌体表面タンパク質が除去されているため、抗体混合物中に含まれる、これに対応する交差反応を引き起こす抗体は、アフィニティー担体には吸着せず、その結果、やはり特異性の高いポリクローナル抗体を製造することが可能になる。
【００２６】
本発明において、ストレプトコッカス・ミュータンスとは、ミュータンスレンサ球菌群の内で血清型がｃ、ｅ、およびｆ型に分類される菌体を意味する。血清型がｃ型の標準菌株としてＩｎｇｂｒｉｔｔ、ＭＴ６Ｒ等の菌株が、血清型がｅ型の標準菌株としてＬＭ７、Ｐ４等の菌株が、血清型がｆ型の標準菌株としてＳＥ１１、ＯＭＺ１７５等の菌株がそれぞれ例示される。
【００２７】
また、ポリクローナル抗体（以下、単に「抗体」ともいう）とは、抗血清中に含まれる抗体画分のことであり、抗体のグロブリンクラスは限定されず、現在知られているどのようなグロブリンクラスのものも含まれる。また、通常の抗体分子のみならず、該抗体の部分分解物（Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’２等）、および該抗体の活性フラグメント（抗体の抗原認識部位）が存在する部分構造等も含む意味である。
【００２８】
本発明の製造方法において、免疫動物への免疫原としては、前記したストレプトコッカス・ミュータンスの血清型ｃ、ｅ、ｆの全菌体、またはそれら３種類のストレプトコッカス・ミュータンスのプロテアーゼ処理菌体が使用できる。これらの全菌体、若しくはプロテーゼ処理菌体からの抗原抽出物も使用できる。ストレプトコッカス・ミュータンスの各血清型由来の各免疫原（全菌体、プロテアーゼ処理菌体、またはこれらの菌体の抗原抽出物）単独で免疫動物に免疫できるが、それらを混合して免疫しても良い。
【００２９】
ストレプトコッカス・ミュータンスの全菌体としては、生菌の他、ホルマリン処理、或いは加熱処理等の前処理を施された死菌、凍結保存された菌体等も使用可能である。
【００３０】
プロテアーゼ処理菌体は、全菌体をプロテアーゼ処理することにより調製できる。プロテアーゼとしては、公知の各種プロテアーゼ、または、それらの混合物が制限無く使用でき、例示すると、プロナーゼ、プロテイナーゼＫ、ペプシン、トリプシン、キモトリプシン等が挙げられる。
【００３１】
プロテアーゼ処理法は、例えば、使用するプロテアーゼの反応至適ｐＨ付近になるよう調製した緩衝液等に全菌体を懸濁し、プロテアーゼを加え、良く混合しながら１５〜５０℃にて１０分〜１２０分保温することで実施できる。反応終了後、例えば、反応液を遠心分離、または濾過することで、プロテアーゼを除去しプロテアーゼ処理菌体を回収する。プロテアーゼの混入を避けるために、上記の遠心または濾過等で回収した菌体をリン酸生理食塩緩衝液（ｐＨ７．４）（以下「ＰＢＳ」と略すこともある）等の緩衝液に懸濁し、同様の操作により菌体を回収することで洗浄操作を３〜５回実施することが好適である。
【００３２】
全菌体またはプロテアーゼ処理菌体からの抗原の抽出は、特に制限されるものではないが、菌体表面に存在するタンパク質、タイコ酸等は他の口腔内レンサ球菌との相同性が高いものが多いので、菌体表面 に存在する多糖抗原を抽出するのが好ましい。多糖抗原の抽出は、菌体懸濁液を加熱処理する方法（Ｒａｎｔｓ，Ｌ．Ａ．，Ｓｔａｎｆｏｒｄ．Ｍｅｄ．Ｂｕｌｌ．１３：２９０−２９１，１９５５．）、亜硝酸により抽出する方法（武井勉．阪大医学雑誌．３５：９３−１０９，１９９０．）等の従来公知の方法により行なうことができる。抽出された多糖抗原は、そのままで免疫原として使用することも可能であるし、更に精製して使用することもできる。
【００３３】
これらの免疫原は、そのまま免疫に使用することも可能であるし、免疫用担体と結合させて使用することも可能である。担体としては、スカシガイのヘモシアニン（ＫＬＨ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、ニワトリ血清アルブミン、ポリ−Ｌ−リジン、ポリアラニルリジン、ジパルミチルリジン、破傷風トキソイド又は多糖類等の従来公知の担体が好適に使用可能である。
【００３４】
本発明の抗体を作製するための免疫原としては、作製の容易さと、得られる抗体の力価が高いということから、ストレプトコッカス・ミュータンスの全菌体またはプロテアーゼ処理菌体を直接免疫するのが特に好適である。更に、ストレプトコッカス・ミュータンスの全菌体を直接免疫する方法は、全菌体の抗原性がプロテアーゼ処理菌体より高いため、高力価の抗体を安定して得ることができるという利点がある。
【００３５】
上記のような免疫原を免疫する動物としては、抗体取得のために一般的に使用される動物が使用可能であるが、マウス、ヤギ、ウサギ、モルモット等の哺乳動物を用いるのが好適である。
【００３６】
これら動物に免疫原を免疫する方法としては、従来公知の方法が制限なく採用でき、例えば、免疫原を皮下、または静脈内に注射することで実施できる。免疫原は、例えば、菌体または菌体抽出物を直接注射してもよいし、菌体または菌体抽出物にアジュバントを添加混合して注射してもよい。例えば、菌体を直接免疫する場合には、ストレプトコッカス・ミュータンスをブレインハートインフージョン（以下ＢＨＩと略す）液体培地等で培養後に得られる菌体の懸濁液をそのまま使用することも可能である。また、アジュバントとしては、フロイントの完全アジュバント、フロイントの不完全アジュバント、水酸化アルミニウムアジュバント又は百日咳菌アジュバント等の従来公知のアジュバントが好適に使用可能である。
【００３７】
これら動物に免疫原を免疫後、採血し血清を調製することで、ストレプトコッカス・ミュータンスに対するポリクローナル抗体を含む多種の抗体の混合液、即ち、抗体混合物が得られる。
【００３８】
この抗体混合物の中には、ミュータンスレンサ球菌以外の口腔内レンサ球菌にも反応する抗体が同時に存在するので、該抗体混合物から特異的抗体を選択的に回収する。
【００３９】
本発明では、抗体混合物から特異的抗体を精製する方法として、アフィニティー精製法を採用する。このアフィニティー精製法において用いる抗原（抗原保持物）としては、前記した免疫動物への免疫原と同様に、ストレプトコッカス・ミュータンスの全菌体、そのプロテアーゼ処理菌体、及びこれらの菌体の抗原抽出物から選ばれる少なくとも１種が使用される。ただし、免疫動物への免疫原が、ストレプトコッカス・ミュータンスの全菌体、またはその抗原抽出物であった場合には、かかるアフィニティー精製法に用いる抗原としては、プロテアーゼ処理菌体、またはその抗原抽出物に特定して使用される。
【００４０】
アフィニティー精製の操作は、上記抗原が固定化された不溶性担体（「抗原固定化担体」ともいう）と、抗体混合物とを接触させ、抗体混合物中の特異的抗体を吸着させて該抗原固定化担体を回収した後に、緩衝液等による洗浄で夾雑物を除去し、次いで、該抗原固定化担体から上記特異的抗体を溶出させることにより行うことができる。また、ストレプトコッカス・ミュータンスの全菌体またはプロテアーゼ処理菌体を、不溶性担体を使用せずにそのまま使用して抗体混合物と接触させることにより、これら菌体に特異的抗体を吸着させて分離し、次いで、これら菌体より特異的抗体を溶出させることにより実施しても良い。後者の方法は、操作が簡便である他、ストレプトコッカス・ミュータンスの菌体表面に存在する複数種の抗原と反応する複数種の抗体を同時に回収することが可能であるということから、より好適である。
【００４１】
本発明は、こうしたアフィニティー精製法において、抗原固定化担体から特異的抗体を溶出させる際に、カオトロピックイオンを用いる点に、大きな特徴を有している。それにより、溶出して得られるポリクローナル抗体の特異性はさらに向上し、その優れた性状は、免疫動物の個体差にほとんど影響されなくなる。したがって、特異性の高いポリクローナル抗体を、安定した品質で製造することが可能になる。
【００４２】
ここで、カオトロピックイオンとは、水溶液中の水分子のカゴ型構造を壊す作用のあるイオンの総称で、このイオンの添加により表面張力の減少、イオン近接領域の水和エントロピーの増加等が観察される。カオトロピックイオンは、疎水性分子の水溶性を増加させ疎水結合を弱めることで抗原抗体反応に影響を及ぼす。こうしたカオトロピックイオンとしては、公知のものが特に制限なく使用できる。カオトロピックイオンの具体例として、チオシアン酸イオン、ヨウ素イオン、過塩素酸イオン、トリクロロ酢酸イオン、臭素イオン、亜硝酸イオン等が挙げられる。これらの中でも、チオシアン酸イオン、ヨウ素イオン、過塩素酸イオンは抗体に与える影響が少なく、安定して抗体を精製できるという特徴があるので特に好適である。
【００４３】
これらカオトロピックイオンは、例えば、０．５〜４Ｍの範囲の溶出液として好適に使用され、１種類のカオトロピックイオンを単独で用いても良いし、複数のカオトロピックイオンを組み合わせて使用しても良い。
【００４４】
カオトロピックイオンを含む溶出液は、カオトロピックイオンの塩を水に溶解して調製しても良いし、または、例えば、リン酸緩衝液、トリス塩酸緩衝液等の緩衝液に溶解し所望のｐＨの溶出液を調製することもができる。カオトロピックイオンの塩としては、例えば、各カオトロピックイオンのナトリウム塩、カリウム塩、アンモニウム塩等が好適に利用できる。
【００４５】
抗原固定化担体を用いてアフィニティー精製する方法において、不溶性担体としては、アガロース、デキストラン、セルロース、ポリアクリルアミド、ポリスチレン、塩化ビニル、ガラス、シリコーンラバー、又は多孔性シリカビーズ等の従来公知の担体が何ら制限無く使用可能である。
【００４６】
また、これらの不溶性担体に前記抗原を固定化する方法としては、臭化シアン活性化法等の化学的結合法や、物理化学的吸着性を利用した方法が何ら制限無く使用可能である。
【００４７】
アフィニティー精製法における抗原固定化担体と抗体混合物の接触および分離法としては、バッチ法およびクロマトグラフィー法の何れの方法も適用可能である。また、両方法を組み合わせて実施することも可能である。
【００４８】
クロマトグラフィー法では、抗原固定化担体をカラムに充填後、抗体混合物をカラムに添加し、次いで緩衝液等をカラムに添加してカラムに吸着されず溶出する画分を廃棄した後に、溶出液をカラムに添加し、吸着した抗体を回収すれば良い。また、バッチ法においては、抗原固定化担体を懸濁した液と抗体混合物を混合し、抗原抗体反応を十分行わせた後に、例えば遠心処理により沈殿を回収し、この沈殿を緩衝液等に懸濁し遠心処理により沈殿を回収するという操作を複数回繰り返すことにより洗浄し、最後に沈殿を溶出液に懸濁することで抗体を溶出すれば良い。
【００４９】
ストレプトコッカス・ミュータンス全菌体或いはプロテアーゼ処理菌体をそのまま使用する場合の抗体混合物との接触および分離法は、上記バッチ法と同様であり、すなわち、菌体懸濁液と抗体混合物を混合し、抗原抗体反応を十分行わせた後に、例えば遠心処理により沈殿を回収することで実施できる。
【００５０】
以上説明した本発明の抗体の製造法によれば、免疫動物の個体差に関係なく、ストレプトコッカス・ミュータンスに対し、高い特異性と反応性を持つポリクローナル抗体が安定的に製造できる。このポリクローナル抗体は、通常、ストレプトコッカス・ミュータンスに対する反応性が、ストレプトコッカス・ゴルドニイ、ストレプトコッカス・サリバリウス、ストレプトコッカス・オラリス、ストレプトコッカス・ミティス、およびストレプトコッカス・サンギスに対する反応性と比較してそれぞれ１０００倍以上である。このようにストレプトコッカス・ミュータンスに対する特異性の高いポリクローナル抗体を免疫学的測定法に応用すれば、被検体液中に他のレンサ球菌が存在していても、１０５個／ｍｌ程度の濃度のストレプトコッカス・ミュータンスを検出することができる。
【００５１】
この免疫学的測定に使用する被検体液としては、ストレプトコッカス・ミュータンスを含むものであれば特に限定されないが、例えば、唾液、歯垢、菌体培養液、培養菌体懸濁液等が使用できる。特に、齲蝕リスクを検査するための検体として、唾液、歯垢を含む体液が好適に使用される。なお、唾液および歯垢は、被検体液中にそれぞれ単独で含まれていてもよいし、混合物として含まれていてもよい。また、被検体液に含まれる不溶物を分散させる目的で超音波処理を施す、ガラスビーズ等の破砕剤と混合し攪拌する等の従来公知の方法によって被検体液を処理し、分析に供することもできる。また、上記の被検体液に抽出処理を施して調製した抽出液を被検体液として測定することもできる。抗原の抽出法としては、例えば、加熱処理する方法（Ｒａｎｔｓ，Ｌ．Ａ．，Ｓｔａｎｆｏｒｄ．Ｍｅｄ．Ｂｕｌｌ．１３：２９０−２９１，１９５５．）、亜硝酸、アルカリ、塩、キレート剤、カオトロピックイオン、界面活性剤を使用して抽出する方法（武井勉．阪大医学雑誌．３５：９３−１０９，１９９０．）、菌体細胞の膜構造を破壊する酵素により処理する方法（特開平９−１７８７５２公報）等公知の方法が制限無く利用できる。
【００５２】
免疫学的測定方法は特に限定されず、抗原抗体反応により抗原を測定する方法として知られている免疫凝集法、光学免疫測定法、標識免疫測定法、およびこれらの組合わせ等の従来公知の免疫学的測定方法が制限無く使用できる。これらの免疫学的測定法を実施するための測定試薬は、本発明により得られるポリクローナル抗体を含む免疫学的測定試薬であればその形態は特に限定されず、本発明の抗体を含む溶液；本発明の抗体を粒子、メンブレン等の不溶性担体に固定化したもの、或いはその懸濁液；本発明の抗体に放射性物質、酵素、各種色素類、コロイド類、各種着色粒子等の標識物質を結合させたもの、或いはそれらの溶液や懸濁液；又はこの様な標識された本発明の抗体を粒子やメンブレン等の不溶性担体に固定化したもの或いはそれらの懸濁液；およびこれらを組み合わせたもの等、様々な形態をとり得る。
【００５３】
各種の免疫学的測定方法のなかでも、ラテックス定量法や酵素免疫測定法は、自動分析装置を用いて多数の被検体液を処理することが可能であるので、集団検診等の検査法として好適である。また、フロースルー免疫測定法、免疫クロマトグラフィー法、およびラテックス凝集法は簡便性に加えて特別な知識や装置を必要とすることなく迅速な測定が可能であり、歯科医院や家庭においても実施可能であるため、汎用的な検査方法として好適である。
【００５４】
より好適な測定法は免疫クロマトグラフィー法であり、特に、特願２００１−３８４５９５号に記載されるような被検体液を一時的に吸収・保持するためのサンプルパッドと、標識抗体を一時的に保持するためのコンジュゲートパッドと、検出用抗体が固定化され、前記サンプルパッドに一時的に吸収・保持された被検体液および該被検体液に同伴されて前記コンジュゲートパッドより流出した標識抗体が展開される展開メンブレンとがこの順番で接合された免疫クロマトグラフィーテストストリップを用いる方法が最適である。該免疫クロマトグラフィーテストストリップにおいて、本発明で製造されるポリクローナル抗体は、標識抗体及び検出用抗体の一方または両方として使用される。これら各種の免疫学的測定方法を実施するための詳細は、上記特願２００１−３８４５９５号に記載される他、特開２００１−３０２６９７号公報等により公知であり、これらの方法に準じて適宜に実施すればよい。
【００５５】
【実施例】
以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明は以下の実施例により限定されるものではない。
【００５６】
実施例１
［チオシアン酸溶出法によるポリクローナル抗体の製造と評価］
（Ａ）〔ストレプトコッカス・ミュータンスに対する抗体混合物の製造］
ＢＨＩ（ＤＩＦＣＯ社）３．７ｇを１００ｍｌの超純水に溶解後、オートクレーブ処理し、ＢＨＩ液体培地を調製した。ＢＨＩ液体培地１００ｍｌ中でＩｎｇｂｒｉｔｔを３７℃、５時間、嫌気条件下（Ｎ２：Ｈ２：ＣＯ２＝８０：１０：１０）で培養した。培養液を４０００ｇ、５分遠心処理し、上清の培地成分を除去し菌体沈殿を回収した。次いで、沈殿物を１００ｍｌのＰＢＳに懸濁させて、同様の遠心分離をする操作を３回行い、沈殿物を洗浄した。菌体沈殿をＰＢＳに懸濁しＡ６００＝１．０に調整し、Ｉｎｇｂｒｉｔｔの菌体懸濁液を調製した。
【００５７】
また、上記とは別に、ＢＨＩ培地にて培養して得たＩｎｇｂｒｉｔｔ菌体沈殿を洗浄した後、０．１Ｍ トリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に懸濁しＡ６００＝１５に調整した。ここにプロナーゼ（和光純薬社）を５ｍｇ／ｍｌとなるように添加し、３７℃で１時間保温した。反応終了後、遠心分離し菌体沈殿を回収した。次いで、沈殿物を１０ｍｌのＰＢＳに懸濁して、同様の遠心分離をする操作を３回行い、沈殿物を洗浄した。菌体沈殿をＰＢＳに懸濁しＡ６００＝１．０に調整し、Ｉｎｇｂｒｉｔｔのプロテアーゼ処理菌体懸濁液を調製した。
【００５８】
免疫は以下のように実施した。
【００５９】
０．５ｍｌの菌体懸濁液またはプロテアーゼ処理菌体懸濁液と０．５ｍｌのフロイントの完全アジュバントを良く混合し、ウサギの皮下に注射した。２週間後、１ｍｌの菌体懸濁液またはプロテアーゼ処理菌体懸濁液と１ｍｌのフロイント不完全アジュバントを良く混合し、ウサギ皮下に追加免疫した。同様の追加免疫を４週目、６週目に行い、力価の上昇をスライドグラスを利用した菌体の凝集反応の程度により確認後、最終免疫より２〜３週間後に、定法に従い採血しストレプトコッカス・ミュータンスに対する抗体混合物（菌体懸濁液を免疫して得られた抗体混合物）を得た。
【００６０】
これとは別に、０．５ｍｌのプロテアーゼ処理菌体懸濁液を用いても、同様の免疫処理を行い、ストレプトコッカス・ミュータンスに対する抗体混合物（プロテアーゼ処理菌体懸濁液を免疫して得られた抗体混合物）を得た。
（Ｂ）〔ストレプトコッカス・ミュータンスに対するポリクローナル抗体の精製］
（Ａ）の方法に従い、１ＬのＢＨＩ液体培地で培養したＩｎｇｂｒｉｔｔまたはプロテアーゼ処理ＩｎｇｂｒｉｔｔをＰＢＳで３回洗浄し、次いで２Ｍ チオシアン酸ナトリウムで３回洗浄し、更にＰＢＳで３回洗浄し、菌体懸濁液、及びプロテアーゼ処理菌体懸濁液（Ａ６００＝１２．５）を調製した。
【００６１】
次いで、
ａ）このプロテアーゼ処理菌体懸濁液と、（Ａ）で調製したプロテアーゼ処理菌体懸濁液を免疫して得られた抗体混合物０．５ｍｌとを混合する、
ｂ）上記菌体懸濁液と、（Ａ）で調製したプロテアーゼ処理菌体懸濁液を免疫して得られた抗体混合物０．５ｍｌとを混合する、及び
ｃ）上記プロテアーゼ処理菌体懸濁液と、（Ａ）で調製した菌体懸濁液を免疫して得られた抗体混合物０．５ｍｌとを混合する
という操作をそれぞれ実施し、各混合液を４℃、６０分反応させた。各混合液を４０００ｇ、５分遠心分離し、各菌体を回収した。この各菌体を１０ｍｌのＰＢＳに懸濁し、同様の遠心分離をする操作を３回行い洗浄した。
【００６２】
次いで、０．５ｍｌの２Ｍ チオシアン酸ナトリウム溶液に各菌体を懸濁し、吸着した抗体を溶出し、遠心分離により上清をそれぞれ回収した。同様の溶出操作を再度行い、各画分のタンパク質量を２８０ｎｍの吸光度により測定した。
【００６３】
次いで、あらかじめＰＢＳで平衡化した１ｍｌのプロテインＡ−セファロース（アマシャムファルマシアバイオテク社）を充填したカラムに上記各溶出液にＰＢＳを添加しチオシアン酸ナトリウム濃度が０．２Ｍとなるように調製した溶液を添加し、５ｍｌのＰＢＳでカラムを洗浄後、５ｍｌの０．１Ｍグリシン−塩酸緩衝液（ｐＨ３．０）にて溶出し、直ちに１Ｍトリス−塩酸（ｐＨ９．０）を添加しｐＨ７．４に各調整した。ＩｇＧの溶出画分は、Ａ２８０を測定することでそれぞれ確認した。
【００６４】
以上により、ａ）プロテアーゼ処理菌体懸濁液を抗原として得た抗体混合物をプロテアーゼ処理菌体により精製したポリクローナル抗体「Ｍ−１」を得た。また、ｂ）プロテアーゼ処理菌体懸濁液を抗原として得た抗体混合物を菌体により精製したポリクローナル抗体「Ｍ−２」を得た。さらに、ｃ）菌体懸濁液を抗原として得た抗体混合物をプロテアーゼ処理菌体により精製したポリクローナル抗体「Ｍ−３」を得た。
（Ｃ）〔ポリクローナル抗体の特異性評価］
Ｉ．〔ストレプトコッカス・ミュータンス測定用免疫クロマト法ストリップの作製］
（１）〔金コロイド標識されたストレプトコッカス・ミュータンスに対するポリクローナル抗体の調製］
コロイド粒径が４０ｎｍの市販金コロイド溶液（Ｂｒｉｔｉｓｈ ＢｉｏＣｅｌｌ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）１０ｍｌに１００ｍＭＫ２ＣＯ３を８８μｌ添加し、ｐＨを９．０に調製後、０．２２μｍフィルター処理した。金コロイド溶液の５２０ｎｍの吸光度を測定したところ、Ａ５２０＝１．０であった。
【００６５】
次いで、１ｍｇ／ｍｌに調整したＭ−１、Ｍ−２、Ｍ−３の各ポリクローナル抗体の２ｍＭホウ酸緩衝溶液（ｐＨ９．０）６４μｌを、上記金コロイド溶液に撹拌しながら添加し、室温下５分放置した。次いで、１０％スキムミルク−２ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ９．０）を１．１ｍｌ撹拌しながら添加し（スキムミルク終濃度１％）、室温下３０分放置した。次いで、反応溶液を１０℃、１００００ｇ、３０分遠心処理し、上清を除去後、２ｍｌの２ｍＭＰＢＳ（ｐＨ７．４）を添加し、下層の金コロイド画分を再懸濁した。該再懸濁した画分の５２０ｎｍの吸光度を測定したところ、Ａ５２０＝４．９であった。
【００６６】
得られた各抗体の金コロイド画分（以下、「金コロイド標識Ｍ−１」「金コロイド標識Ｍ−２」「金コロイド標識Ｍ−３」と表記することもある）は、４℃にて保存した。
【００６７】
（２）〔免疫クロマト法ストリップの作製］
以下の方法により、図１及び図２に示すような免疫クロマト法ストリップを組み立てた。
【００６８】
ニトロセルロースメンブレン（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社、Ｈｉ−Ｆｌｏｗ Ｐｌｕｓ Ｍｅｍｂｒａｎｅ、ＨＦ１８０、２５ｍｍ×６ｍｍ）からなる展開メンブレン４上の検出ライン６上に、１ｍｇ／ｍｌのＭ−１、Ｍ−２、またはＭ−３をスポットした。さらに判定ライン７上に抗ウサギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）ポリクローナル抗体１μｌをスポットし、インキュベーター内で３７℃、６０分乾燥し抗体を固定化した。該抗体固定化メンブレンを１％スキムミルク−０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ１００水溶液中で室温下、５分振とうした。次いで、該メンブレンを１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）中で室温下、１０分振とう後取り出し、真空ポンプで吸引しながら６０分間デシケーター中で乾燥した。
【００６９】
また、コンジュゲートパッド３（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社、７．５ｍｍ×６ｍｍ）を０．５％ＰＶＡ−０．５％ショ糖水溶液中で１分間振とう後取り出し、真空ポンプで吸引しながら６０分間デシケーター中で乾燥した。該コンジュゲートパッドにＡ５２０＝１．０に調整した金コロイド標識Ｍ−１、金コロイド標識Ｍ−２または金コロイド標識Ｍ−３を２５μｌ添加し、真空ポンプで吸引しながら６０分間デシケーター中で乾燥した。更に、サンプルパッド２（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社、１７ｍｍ×６ｍｍ）を１％Ｔｗｅｅｎ２０−ＰＢＳ水溶液中で１分間振とう後取り出し、真空ポンプで吸引しながら６０分間デシケーター中で乾燥した。尚、吸収パッド５（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社、２０ｍｍ×６ｍｍ）は未処理のまま用いた。
【００７０】
このように調製した、図１に示すような免疫クロマト法ストリップの各構成部分をプラスチックの支持台上に配置し、図２に示すような免疫クロマト法ストリップを組み立てた。Ｍ−１を固定化したニトロセルロースメンブレンには金コロイド標識Ｍ−１を、Ｍ−２を固定化したニトロセルロースメンブレンには金コロイド標識Ｍ−２を、Ｍ−３を固定化したニトロセルロースメンブレンには金コロイド標識Ｍ−３を組み合わせて、免疫クロマト法ストリップＭ−１、免疫クロマト法ストリップＭ−２、免疫クロマト法ストリップＭ−３を組み立てた。
【００７１】
ＩＩ．〔特異性評価試験］
（１）〔唾液の採取］
被験者にパラフィンペレットを約１分間噛ませ、分泌された唾液を採取した。
【００７２】
（２）〔培養法による唾液中のストレプトコッカス・ミュータンスの定量］
上記（１）の方法に従い得られた唾液を適宜希釈して、１００μｌをミチス・サリバリウス・バシトラシン（以下、「ＭＳＢ」と表記することもある。）固体培地上およびＢＨＩ固体培地上に添加し、３７℃、嫌気条件下、２４〜４８時間培養した。ＭＳＢおよびＢＨＩ固体培地上に生じるコロニー数を計数し、希釈率から、ミュータンスレンサ球菌濃度を個／ｍｌとして算出した。
【００７３】
ＭＳＢおよびＢＨＩ培地上のストレプトコッカス・ミュータンスの識別は、コロニーの形態学的分類、および形態学的に識別不可能なコロニーに関しては、該コロニーを純粋培養後、ミュータンスレンサ球菌の血清型特異的な抗体を利用した免疫学的測定方法および、糖発酵試験等の生化学的方法によりストレプトコッカス・ミュータンスの同定を行った。
【００７４】
（３）［検体の前処理］
上記（１）で採取した唾液１００μｌを遠心分離し上清を除去した。沈殿を５００μｌの０．１ＭＮａＯＨに懸濁し、遠心分離により上清を除去した。次いで沈殿を５００μｌのＰＢＳに懸濁し、遠心分離にて上清を除去した。ＰＢＳによる同様の操作を再度実施した後、沈殿に１０μｌの４Ｍ酢酸と５μｌの２Ｍ亜硝酸ナトリウムを添加し、良く混合後室温で１０分間放置した。４５μｌの０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含む１Ｍトリス（ｐＨ未調製）と４０μｌの０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含む０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）を添加し、被検体液を調製した。
【００７５】
（４）〔免疫クロマト法ストリップによるストレプトコッカス・ミュータンスの測定］
前記Ｉ．−（２）で製造した免疫クロマトグラフ法ストリップＭ−１〜Ｍ−３を用いて、上記（３）で調製した被検体液中のストレプトコッカス・ミュータンスの測定を実施した。免疫クロマト法ストリップに於ける１０分後のスポット発色強度を、４段階（＋＋＋：強い陽性、＋＋：陽性、＋：弱い陽性、−：陰性）に識別した結果と、（２）の培養法により得られたストレプトコッカス・ミュータンス菌数とを比較した。結果を表１に示す。
【００７６】
【表１】
【００７７】
表１から明らかなように、チオシアン酸ナトリウム溶出により調製したポリクローナル抗体により、１０５／ｍｌのストレプトコッカス・ミュータンスが検出でき、更に、培養法により得られたストレプトコッカス・ミュータンスの濃度と相関するスポット発色強度が得られた。これらのことから、ここで調製した抗体は、ミュータンスレンサ球菌以外の口腔内レンサ球菌との交差反応性が十分に低く抑えられていることが分かる。
【００７８】
実施例２
［複数のウサギを用いて免疫し、各種カオトロピックイオンを用いて精製して得たポリクローナル抗体の特異性評価］
（１）［ポリクローナル抗体の製造］
実施例１の方法に従って、１０羽のウサギを用いて、菌体懸濁液を免疫することで抗体混合物を調製した。実施例１（Ｂ）ｃ）におけるプロテアーゼ処理菌体でのアフィニティー精製の際に、２Ｍ チオシアン酸ナトリウム、または２Ｍ ヨウ化ナトリウム、または２Ｍ 過塩素酸ナトリウムで溶出し、次いで、プロテインＡ−セファロースで精製した。このようにして各溶出法につき１０種類のポリクローナル抗体を調製した。
【００７９】
（２）［免疫クロマト法ストリップの製造］
実施例１（Ｃ）−Ｉ．記載の方法に従って、上記（１）で調製した３０種類のポリクローナル抗体を使用した免疫クロマト法ストリップを製造した。
【００８０】
（３）［特異性評価試験］
実施例１（Ｃ）−ＩＩ．と同様の方法により唾液より被検体液を調製し、上記（２）で作製した免疫クロマト法ストリップにより分析した。チオシアン酸ナトリウムにより溶出した抗体の結果を表２に、
【００８１】
【表２】
【００８２】
【表３】
【００８３】
ヨウ化ナトリウムにより溶出した抗体の結果を表３に、
【００８４】
【表４】
【００８５】
【表５】
【００８６】
過塩素酸ナトリウムにより溶出した抗体の結果を表４に示す。
【００８７】
【表６】
【００８８】
【表７】
【００８９】
表２〜４に示したように、チオシアン酸ナトリウム、ヨウ化ナトリウム、過塩素酸ナトリウムで溶出した場合、１０種類のすべての抗体で、１０５／ｍｌのストレプトコッカス・ミュータンスが検出でき、更に、培養法により得られたストレプトコッカス・ミュータンスの濃度と相関するスポット発色強度が得られた。ウサギ個体に関係なく、ミュータンスレンサ球菌以外の口腔内レンサ球菌との交差反応性が十分に低く抑えられた抗体が安定に得られた。
【００９０】
比較例１
［複数のウサギを用い、酸溶出法により精製して得たポリクローナル抗体の特異性評価］
（１）［ポリクローナル抗体の製造］
実施例２（１）で得られた各抗体混合物を用いて、酸溶出法によるアフィニティー精製を行った。
【００９１】
実施例１（Ａ）の方法に従ってプロテアーゼ処理菌体を調製した。該プロテアーゼ処理菌体をＰＢＳで３回洗浄し、次いで０．１Ｍ グリシン塩酸緩衝液（ｐＨ２．０）で３回洗浄し、更にＰＢＳで３回洗浄し、プロテアーゼ処理菌体懸濁液（Ａ６００＝１２．５）を調製した。
【００９２】
次いで、実施例１（Ｂ）ｃ）と同様の方法により抗体混合物とプロテアーゼ処理菌体懸濁液とを混合し、ＰＢＳで３回洗浄した後、０．５ｍｌの０．１Ｍ グリシン塩酸緩衝液（ｐＨ２．０）に菌体を懸濁して、吸着していた抗体を溶出し、遠心分離により上清を回収し、１Ｍトリス−塩酸（ｐＨ９．０）を添加しｐＨ７．４に調整した。同様の溶出操作を４回行い、各画分のタンパク質量を２８０ｎｍの吸光度により測定した。
【００９３】
次いで、あらかじめＰＢＳで平衡化した１ｍｌのプロテインＡ−セファロース（アマシャムファルマシアバイオテク社）を充填したカラムに上記溶出液を添加し、実施例１（Ｂ）と同様の方法により抗体を溶出し、１０種類のポリクローナル抗体を調製した。
【００９４】
（２）［免疫クロマト法ストリップの製造］
実施例１（Ｃ）−Ｉ．記載の方法に従って、上記（１）で調製したポリクローナル抗体を使用した免疫クロマト法ストリップを製造した。
【００９５】
（３）［特異性評価試験］
実施例３（３）で調製した抗原抽出液を、上記（２）で作製した免疫クロマト法ストリップにより分析した。結果を表５に示す。
【００９６】
【表８】
【００９７】
【表９】
【００９８】
表５に示したように、酸溶出法によるアフィニティー精製でポリクローナル抗体を製造すると、ウサギによっては非特異的反応が検出される場合があることが明らかとなった。
【００９９】
【発明の効果】
本発明によれば、ミュータンスレンサ球菌以外の口腔内レンサ球菌との交差反応性を十分に低く抑えたストレプトコッカス・ミュータンスに特異的なポリクローナル抗体を、免疫動物個体差に影響されることなく安定して製造することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本図は、本発明の免疫クロマト法で使用するストリップの各部材の概略図である。
【図２】本図は、本発明の免疫クロマト法で使用するストリップの側面図である。
【符号の説明】
１・・・ストリップ
２・・・サンプルパッド
３・・・コンジュゲートパッド
４・・・展開メンブレン
５・・・吸収パッド
６・・・検出ライン
７・・・コントロール判定ライン
【発明の属する技術分野】
本発明は、ストレプトコッカス・ミュータンスに特異的なポリクローナル抗体の製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
一般に、ミュータンスレンサ球菌と呼ばれる一群の乳酸発酵性細菌が、齲蝕発症に深く関わっていることが知られている。
【０００３】
これらミュータンスレンサ球菌群は、ストレプトコッカス・クリセタス（Ｓ．ｃｒｉｃｅｔｕｓ、血清型ａ）、ストレプトコッカス・ラッタス（Ｓ．ｒａｔｔｕｓ、血清型ｂ）、ストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ、血清型ｃ、ｅ、ｆ）、ストレプトコッカス・フェルス（Ｓ．ｆｅｒｕｓ、血清型ｃ）、ストレプトコッカス・マカカ（Ｓ．ｍａｃａｃａｅ、血清型ｃ）、ストレプトコッカス・ソブリヌス（Ｓ．ｓｏｂｒｉｎｕｓ、血清型ｄ、ｇ）、ストレプトコッカス・ドウネイ（Ｓ．ｄｏｗｎｅｙ、血清型ｈ）として、血清学的、遺伝学的に異なる７種の型に分類されている。
【０００４】
従来、これらミュータンスレンサ球菌の唾液中の濃度が１０５〜１０６個／ｍｌの場合には、齲蝕の危険あり、１０６個／ｍｌ以上の場合は特に危険であると言われており、人の口腔内におけるミュータンスレンサ球菌の存在量を知ることで、その人の齲蝕危険度の判定を行なうことが可能である。一般に、これらミュータンスレンサ球菌の濃度は、バシトラシンを入れた培地を用いて唾液中のミュータンスレンサ球菌を選択的に培養してコロニー数を調べることにより測定されている（そのための測定キットも市販されている）。そして、唾液中の各ミュータンスレンサ球菌の濃度についても、同様に培養を行なって得られたコロニーの中から各菌のコロニーを同定し、その数を調べることにより一応知ることができる。なお、同定の方法としては、糖発酵試験等の生化学的方法、ＤＮＡプローブを用いる遺伝学的方法、血清型特異的抗体を用いる免疫学的方法等が知られている。
【０００５】
近年、ミュータンスレンサ球菌の中でヒトの口腔に存在するのは主にストレプトコッカス・ミュータンスとストレプトコッカス・ソブリヌスの２菌種であることが明らかとなった。特に、ストレプトコッカス・ミュータンスはヒト口腔から高頻度に分離され（９割以上の人から分離される）、齲蝕の発生に深く関連することが判明した。
【０００６】
現在、口腔内のミュータンスレンサ球菌の測定法としては培養法が広く実施されている。しかし、培養法は、培養操作が不可欠であること、更に分離したコロニーの形態からの菌種の同定には熟練した手技が必要であることから、検査時間および操作の煩雑さの点で問題がある。
【０００７】
歯垢や唾液等の臨床検体からストレプトコッカス・ミュータンスを直接検出する方法としては、各種モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体を用いた免疫学的測定方法が報告されている。これらの方法は菌を培養する必要が無く、検出に要する時間が大幅に短縮できるという利点がある。
【０００８】
口腔内には様々なストレプトコッカス属に分類されるレンサ球菌が常在していることが知られている。口腔内の各部位により細菌叢中の存在比率は異なるが、齲蝕危険度の判定に使用する歯垢や唾液では、ストレプトコッカス属のレンサ球菌が細菌叢の約５０％近くを占めることが知られており（例えば、非特許文献１）、また、唾液１ｍｌ中の総菌数は１０８個／ｍｌ以上であると言われている。ミュータンスレンサ球菌数は一般的に１０７個以下であるので、口腔内のレンサ球菌は大部分がミュータンスレンサ球菌以外のレンサ球菌であるといえる。
【０００９】
従って、齲蝕危険度の判定のためには、１０８個／ｍｌオーダーのミュータンスレンサ球菌以外の口腔内レンサ球菌中に混在する１０５個／ｍｌオーダーのストレプトコッカス・ミュータンスを測定する、即ち、ミュータンスレンサ球菌以外の口腔内レンサ球菌がストレプトコッカス・ミュータンスの１０００倍量程度存在していてもストレプトコッカス・ミュータンスを正確に測定する必要がある。このような測定のためには、１０５個／ｍｌのストレプトコッカス・ミュータンスとの反応性に比べて、１０８個／ｍｌのミュータンスレンサ球菌以外の口腔内レンサ球菌との交差反応性は著しく低いという、高力価で且つ特異性の非常に高い抗体が必要になる。
【００１０】
モノクローナル抗体を用いた方法としては、酵素標識したストレプトコッカス・ミュータンスに対するモノクローナル抗体と検体を混合し、孔径０．４５μｍのメンブランフィルターで濾過することでストレプトコッカス・ミュータンスと結合した酵素標識抗体のみをフィルター上に保持し、酵素基質添加後の発色により検出する方法が提案されているが（非特許文献２、特許文献１）、該方法で使用されているモノクローナル抗体は１０５個レベルのストレプトコッカス・ミュータンスの反応性と１０７個レベルのストレプトコッカス・サリバリウスとの交差反応性は同程度である。口腔内では、１０７〜１０８個レベルのストレプトコッカス・サリバリウスが存在する場合があり、この場合にはストレプトコッカス・ミュータンスが正確に測定できないという問題がある。
【００１１】
ミュータンスレンサ球菌以外の口腔内レンサ球菌との反応性に着目し、ストレプトコッカス・ミティス、ストレプトコッカス・サリバリウス、ストレプトコッカス・サンギスと反応しないストレプトコッカス・ミュータンスに対するモノクローナル抗体を用いた測定法が提案されている（特許文献２）。該モノクローナル抗体の特異性は、一定量（１０８個）の上記３菌種とストレプトコッカス・ミュータンスの培養菌に対する抗体の反応性を該抗体の２倍希釈系列により調べて、評価されており、抗原抗体反応の容量−作用曲線がプラトーとなるような抗体過剰域においても、ストレプトコッカス・ミティス、ストレプトコッカス・サリバリウス、ストレプトコッカス・サンギスに対する交差反応性は検出されないという性質が開示されている。しかし、１０５個のストレプトコッカス・ミュータンスに対する反応性については調べられておらず、ミュータンスレンサ球菌以外の口腔内レンサ球菌がストレプトコッカス・ミュータンスの１０００倍量程度存在していている場合にストレプトコッカス・ミュータンスを正確に測定できるかどうか不明である。また、その他の口腔内レンサ球菌のストレプトコッカス・ゴルドニイ、ストレプトコッカス・オラリスとの反応性は全く検討していないという問題がある。
【００１２】
また、ストレプトコッカス・ミティス、ストレプトコッカス・サリバリウス、ストレプトコッカス・サンギスおよびポルフィロモナス・ジンジバリスと反応せず、ストレプトコッカス・ミュータンスおよびストレプトコッカス・ソブリヌスと対するモノクローナル抗体を用いた測定法が提案されている（特許文献３）。該モノクローナル抗体に関して、一定量の培養菌（乾燥重量５μｇ）に対する反応性を調べた場合、ストレプトコッカス・サンギス、ストレプトコッカス・サリバリウス、ストレプトコッカス・ミティス、ストレプトコッカス・ラッタス、ストレプトコッカス・フェルス、ストレプトコッカス・アンギノーサス、ラクトバチラス・カゼイ、ポルフィロモナス・ジンジバリスに対する交差反応性は検出されないこと、また、１０５個／ｍｌのストレプトコッカス・ミュータンスは測定可能であるが、１０６個／ｍｌのストレプトコッカス・サリバリウスに対する交差反応性は検出されないという性質が開示されている。しかし、この場合も、ミュータンスレンサ球菌以外の口腔内レンサ球菌がストレプトコッカス・ミュータンスの１０００倍量程度存在していている場合にストレプトコッカス・ミュータンスを正確に測定できるかどうか不明であり、また、その他の口腔内レンサ球菌のストレプトコッカス・ゴルドニイ、ストレプトコッカス・オラリスとの反応性は全く検討していないという問題がある。
【００１３】
一方、ストレプトコッカス・ミュータンスに対するポリクローナル抗体を利用した方法として、ガラススライド上でのラテックス凝集法を用いた方法が報告されている（非特許文献３、４、特許文献４）。一般的に、ストレプトコッカス・ミュータンスは抗原性があまり高くなく、アフィニティー精製により交差反応の原因となる抗体を除去しても特異性の高いポリクローナル抗体を得ることは困難であることが知られているが（例えば、非特許文献５）、該方法においてはストレプトコッカス・ミュータンス菌体をウサギに免疫し作製したポリクローナル抗体をアフィニティー精製無しに使用している。従って、ここで使用しているポリクローナル抗体の特異性は低いことが考えられ、このため、該方法該方法に於いては、１×１０６個／ｍｌ以上の濃度の菌体試料溶液に於いてしか陽性反応が得られておらず、十分な感度が達成されていない。
【００１４】
このように唾液又は歯垢から直接調製した臨床検体中のストレプトコッカス・ミュータンスの測定に関しては、齲蝕危険度の判定のためには検出限界が１０５個／ｍｌの簡便な測定法が望まれているが、この要求を満たすストレプトコッカス・ミュータンス測定方法は従来知られていなかった。
【００１５】
本発明者等は、検出感度があがらない原因の一つに被検体液中に存在するミュータンスレンサ球菌以外の口腔内レンサ球菌の影響があると考え、鋭意検討した結果、口腔内に存在するミュータンスレンサ球菌以外の口腔内レンサ球菌に対する交差反応性を十分に低く抑え、ストレプトコッカス・ミュータンスを特異的に検出・定量することが可能であるポリクローナル抗体と該抗体の製造方法を先に提案した（特願２００１−３８４５９５号）。この製造方法は、免疫動物に、菌体または菌体からの抗原抽出物を免疫原として免疫することにより抗体混合物を得、次いで該免疫原をアフィニティー担体として使用し、アフィニティー精製することで実施される。この時、免疫動物への免疫原及びアフィニティー精製に用いる抗原の少なくとも一方に、ストレプトコッカス・ミュータンス菌体表面に存在する交差反応の原因となる物質と考えられる菌体表面タンパク質をプロテアーゼ処理により除去した菌体（以下「プロテアーゼ処理菌体」ともいう）、またはその抗原抽出物を使用することにより、唾液または歯垢から直接調製した臨床検体中のストレプトコッカス・ミュータンスを特異的に検出できる抗体を調製することが可能になる。
【００１６】
ここで、アフィニティー精製は、抗体混合物とアフィニティー担体を接触させ、ストレプトコッカス・ミュータンスとのみ反応する抗体（以下「特異的抗体」ともいう）をアフィニティー担体に吸着させ、アフィニティー担体を洗浄することで夾雑物質を除去した後、アフィニティー担体より特異的抗体を溶出することにより実施される。一般的に、抗原−抗体複合体の結合力は強いので、上記アフィニティー担体からの抗体の溶出には、酸性条件、アルカリ性条件、変性剤の使用等厳しい条件が適用され、中でも酸性条件による溶出がよく行われている（例えば、非特許文献６）。
【００１７】
【非特許文献１】武笠英彦監修，「う蝕細菌の分子生物学−研究の成果と展望−」，第１版，クインテッセンス出版，１９９７年，ｐ２９―３７
【非特許文献２】安富豊ら著，「小児歯科学雑誌」，第３０巻，１９９２年，ｐ１８６−１９３
【特許文献１】特許第３０９３８８３３号
【特許文献２】特開平１０−３６４００号公報
【特許文献３】特開２００１−１７２２９９号公報
【非特許文献３】武井勉著，「阪大医学雑誌」，第３５巻，１９９０年，ｐ９３−１０９
【非特許文献４】Ｔａｋｅｉ著，「Ｔ．Ａｒｃｈｓ．ｏｒａｌ．Ｂｉｏｌ．」，第３７巻，１９９０年，ｐ９９−１０４
【特許文献４】特開平１−２５００６７号公報
【非特許文献５】浜田茂幸編集，「う蝕と歯周病」，日本歯科詳論社，第１巻，１９８２年，ｐ１７―２３
【非特許文献６】「アフィニティークロマトグラフィーハンドブック」，アマシャムファルマシアバイオテク，１９９９年
【００１８】
【発明が解決しようとする課題】
ところが、上記ストレプトコッカス・ミュータンスに特異的なポリクローナル抗体の製造方法において、アフィニティー担体からの抗体の溶出を、溶出液を酸性条件にすることにより実施した場合、免疫動物の個体差に起因して、製造されるポリクローナル抗体のミュータンスレンサ球菌以外の口腔内レンサ球菌との交差反応性のバラツキが大きくなり、この交差反応を十分に低く抑えられない抗体が製造されるケースが生じることが判明した。これは、上記方法により、多数の免疫動物から抗体混合物を得、大量に前記特異的抗体を製造する場合において、目的とする抗体の生産性を低下させるものであり、該方法を工業的に実施する上での大きな障害になっていた。
【００１９】
そこで、本発明は、免疫動物の個体差に影響されることなく安定的に、ミュータンスレンサ球菌以外の口腔内レンサ球菌との交差反応性を十分に低く抑えたストレプトコッカス・ミュータンスに特異的なポリクローナル抗体を製造する方法を提供することを目的とする。
【００２０】
【課題を解決するための手段】
上述した問題に鑑み、本発明者等が鋭意検討した結果、免疫動物の個体差に影響されず安定的に、ストレプトコッカス・ミュータンスに特異的なポリクローナル抗体を製造できる方法を見出し、本発明を完成するに至った。
【００２１】
即ち、本発明は、免疫動物に、ストレプトコッカス・ミュータンスの全菌体、そのプロテアーゼ処理菌体、及びこれらの菌体の抗原抽出物から選ばれる少なくとも１種の免疫原を免疫して抗体混合物を得、その後、上記各免疫原から選ばれる少なくとも１種を抗原として用いたアフィニティー精製法によって当該抗体混合物を精製するポリクローナル抗体の製造方法であって、前記免疫動物への免疫原及びアフィニティー精製に用いる抗原の少なくとも一方として、前記プロテアーゼ処理菌体、または当該菌体の抗原抽出物を使用し、且つアフィニティー精製における担体からの溶出の際に、カオトロピックイオンを使用することを特徴とするストレプトコッカス・ミュータンスに対するポリクローナル抗体の製造方法である。
【００２２】
本発明の製造方法を適応することで、例えば、特願２００１−３８４５９５号記載のストレプトコッカス・ミュータンスに対する反応性が、ストレプトコッカス・ゴルドニイ、ストレプトコッカス・サリバリウス、ストレプトコッカス・オラリス、ストレプトコッカス・ミティス、およびストレプトコッカス・サンギスに対する反応性と比較してそれぞれ１０００倍以上であることを特徴とするポリクローナル抗体を、容易かつ安定的に製造することが可能になる。これは、本発明者等によって上記のストレプトコッカス・ミュータンスに対する特異的な抗体を製造するための免疫方法、アフィニティー担体からの抗体の溶出条件等が注意深く検討され、これらの条件の最適の組み合わせが見出されたことによりなされたものである。
【００２３】
【発明の実施の形態】
本発明に係るポリクローナル抗体の製造方法は、要するに
（１）免疫動物に、ストレプトコッカス・ミュータンスの全菌体、そのプロテアーゼ処理菌体、及びこれらの菌体の抗原抽出物から選ばれる少なくとも１種の免疫原を免疫して抗体混合物を得、その後、上記プロテアーゼ処理菌体またはその抗原抽出物を抗原として用いたアフィニティー精製法により特異的抗体を回収するか、または、
（２）免疫動物に、ストレプトコッカス・ミュータンスのプロテアーゼ処理菌体、またはその抗原抽出物を免疫して抗体混合物を得、その後、ストレプトコッカス・ミュータンス全菌体、またはその抗原抽出物を抗原として用いたアフィニティー精製法によって特異的抗体を回収する
方法において適用される。
【００２４】
これらの製造方法では、免疫動物への免疫原、及びアフィニティー精製に用いる抗原の少なくとも一方に、ストレプトコッカス・ミュータンスのプロテアーゼ処理菌体、またはその抗原抽出物を使用している。ストレプトコッカス・ミュータンスのプロテアーゼ処理菌体は、プロテアーゼの作用により、菌体表面に存在する交差反応の原因となる物質と考えられる菌体表面タンパク質が除去されている。
【００２５】
したがって、斯様なプロテアーゼ処理菌体、またはその抗原抽出物を、免疫動物への免疫原として用いれば、交差反応を引き起こす抗体の産生を大きく抑えることができ、特異性の高いポリクローナル抗体を製造することが可能になる。他方、該プロテアーゼ処理菌体、またはその抗原抽出物を、アフィニティー精製に用いれば、これら抗原は前記の如くに菌体表面に存在する交差反応の原因となる菌体表面タンパク質が除去されているため、抗体混合物中に含まれる、これに対応する交差反応を引き起こす抗体は、アフィニティー担体には吸着せず、その結果、やはり特異性の高いポリクローナル抗体を製造することが可能になる。
【００２６】
本発明において、ストレプトコッカス・ミュータンスとは、ミュータンスレンサ球菌群の内で血清型がｃ、ｅ、およびｆ型に分類される菌体を意味する。血清型がｃ型の標準菌株としてＩｎｇｂｒｉｔｔ、ＭＴ６Ｒ等の菌株が、血清型がｅ型の標準菌株としてＬＭ７、Ｐ４等の菌株が、血清型がｆ型の標準菌株としてＳＥ１１、ＯＭＺ１７５等の菌株がそれぞれ例示される。
【００２７】
また、ポリクローナル抗体（以下、単に「抗体」ともいう）とは、抗血清中に含まれる抗体画分のことであり、抗体のグロブリンクラスは限定されず、現在知られているどのようなグロブリンクラスのものも含まれる。また、通常の抗体分子のみならず、該抗体の部分分解物（Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’２等）、および該抗体の活性フラグメント（抗体の抗原認識部位）が存在する部分構造等も含む意味である。
【００２８】
本発明の製造方法において、免疫動物への免疫原としては、前記したストレプトコッカス・ミュータンスの血清型ｃ、ｅ、ｆの全菌体、またはそれら３種類のストレプトコッカス・ミュータンスのプロテアーゼ処理菌体が使用できる。これらの全菌体、若しくはプロテーゼ処理菌体からの抗原抽出物も使用できる。ストレプトコッカス・ミュータンスの各血清型由来の各免疫原（全菌体、プロテアーゼ処理菌体、またはこれらの菌体の抗原抽出物）単独で免疫動物に免疫できるが、それらを混合して免疫しても良い。
【００２９】
ストレプトコッカス・ミュータンスの全菌体としては、生菌の他、ホルマリン処理、或いは加熱処理等の前処理を施された死菌、凍結保存された菌体等も使用可能である。
【００３０】
プロテアーゼ処理菌体は、全菌体をプロテアーゼ処理することにより調製できる。プロテアーゼとしては、公知の各種プロテアーゼ、または、それらの混合物が制限無く使用でき、例示すると、プロナーゼ、プロテイナーゼＫ、ペプシン、トリプシン、キモトリプシン等が挙げられる。
【００３１】
プロテアーゼ処理法は、例えば、使用するプロテアーゼの反応至適ｐＨ付近になるよう調製した緩衝液等に全菌体を懸濁し、プロテアーゼを加え、良く混合しながら１５〜５０℃にて１０分〜１２０分保温することで実施できる。反応終了後、例えば、反応液を遠心分離、または濾過することで、プロテアーゼを除去しプロテアーゼ処理菌体を回収する。プロテアーゼの混入を避けるために、上記の遠心または濾過等で回収した菌体をリン酸生理食塩緩衝液（ｐＨ７．４）（以下「ＰＢＳ」と略すこともある）等の緩衝液に懸濁し、同様の操作により菌体を回収することで洗浄操作を３〜５回実施することが好適である。
【００３２】
全菌体またはプロテアーゼ処理菌体からの抗原の抽出は、特に制限されるものではないが、菌体表面に存在するタンパク質、タイコ酸等は他の口腔内レンサ球菌との相同性が高いものが多いので、菌体表面 に存在する多糖抗原を抽出するのが好ましい。多糖抗原の抽出は、菌体懸濁液を加熱処理する方法（Ｒａｎｔｓ，Ｌ．Ａ．，Ｓｔａｎｆｏｒｄ．Ｍｅｄ．Ｂｕｌｌ．１３：２９０−２９１，１９５５．）、亜硝酸により抽出する方法（武井勉．阪大医学雑誌．３５：９３−１０９，１９９０．）等の従来公知の方法により行なうことができる。抽出された多糖抗原は、そのままで免疫原として使用することも可能であるし、更に精製して使用することもできる。
【００３３】
これらの免疫原は、そのまま免疫に使用することも可能であるし、免疫用担体と結合させて使用することも可能である。担体としては、スカシガイのヘモシアニン（ＫＬＨ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、ニワトリ血清アルブミン、ポリ−Ｌ−リジン、ポリアラニルリジン、ジパルミチルリジン、破傷風トキソイド又は多糖類等の従来公知の担体が好適に使用可能である。
【００３４】
本発明の抗体を作製するための免疫原としては、作製の容易さと、得られる抗体の力価が高いということから、ストレプトコッカス・ミュータンスの全菌体またはプロテアーゼ処理菌体を直接免疫するのが特に好適である。更に、ストレプトコッカス・ミュータンスの全菌体を直接免疫する方法は、全菌体の抗原性がプロテアーゼ処理菌体より高いため、高力価の抗体を安定して得ることができるという利点がある。
【００３５】
上記のような免疫原を免疫する動物としては、抗体取得のために一般的に使用される動物が使用可能であるが、マウス、ヤギ、ウサギ、モルモット等の哺乳動物を用いるのが好適である。
【００３６】
これら動物に免疫原を免疫する方法としては、従来公知の方法が制限なく採用でき、例えば、免疫原を皮下、または静脈内に注射することで実施できる。免疫原は、例えば、菌体または菌体抽出物を直接注射してもよいし、菌体または菌体抽出物にアジュバントを添加混合して注射してもよい。例えば、菌体を直接免疫する場合には、ストレプトコッカス・ミュータンスをブレインハートインフージョン（以下ＢＨＩと略す）液体培地等で培養後に得られる菌体の懸濁液をそのまま使用することも可能である。また、アジュバントとしては、フロイントの完全アジュバント、フロイントの不完全アジュバント、水酸化アルミニウムアジュバント又は百日咳菌アジュバント等の従来公知のアジュバントが好適に使用可能である。
【００３７】
これら動物に免疫原を免疫後、採血し血清を調製することで、ストレプトコッカス・ミュータンスに対するポリクローナル抗体を含む多種の抗体の混合液、即ち、抗体混合物が得られる。
【００３８】
この抗体混合物の中には、ミュータンスレンサ球菌以外の口腔内レンサ球菌にも反応する抗体が同時に存在するので、該抗体混合物から特異的抗体を選択的に回収する。
【００３９】
本発明では、抗体混合物から特異的抗体を精製する方法として、アフィニティー精製法を採用する。このアフィニティー精製法において用いる抗原（抗原保持物）としては、前記した免疫動物への免疫原と同様に、ストレプトコッカス・ミュータンスの全菌体、そのプロテアーゼ処理菌体、及びこれらの菌体の抗原抽出物から選ばれる少なくとも１種が使用される。ただし、免疫動物への免疫原が、ストレプトコッカス・ミュータンスの全菌体、またはその抗原抽出物であった場合には、かかるアフィニティー精製法に用いる抗原としては、プロテアーゼ処理菌体、またはその抗原抽出物に特定して使用される。
【００４０】
アフィニティー精製の操作は、上記抗原が固定化された不溶性担体（「抗原固定化担体」ともいう）と、抗体混合物とを接触させ、抗体混合物中の特異的抗体を吸着させて該抗原固定化担体を回収した後に、緩衝液等による洗浄で夾雑物を除去し、次いで、該抗原固定化担体から上記特異的抗体を溶出させることにより行うことができる。また、ストレプトコッカス・ミュータンスの全菌体またはプロテアーゼ処理菌体を、不溶性担体を使用せずにそのまま使用して抗体混合物と接触させることにより、これら菌体に特異的抗体を吸着させて分離し、次いで、これら菌体より特異的抗体を溶出させることにより実施しても良い。後者の方法は、操作が簡便である他、ストレプトコッカス・ミュータンスの菌体表面に存在する複数種の抗原と反応する複数種の抗体を同時に回収することが可能であるということから、より好適である。
【００４１】
本発明は、こうしたアフィニティー精製法において、抗原固定化担体から特異的抗体を溶出させる際に、カオトロピックイオンを用いる点に、大きな特徴を有している。それにより、溶出して得られるポリクローナル抗体の特異性はさらに向上し、その優れた性状は、免疫動物の個体差にほとんど影響されなくなる。したがって、特異性の高いポリクローナル抗体を、安定した品質で製造することが可能になる。
【００４２】
ここで、カオトロピックイオンとは、水溶液中の水分子のカゴ型構造を壊す作用のあるイオンの総称で、このイオンの添加により表面張力の減少、イオン近接領域の水和エントロピーの増加等が観察される。カオトロピックイオンは、疎水性分子の水溶性を増加させ疎水結合を弱めることで抗原抗体反応に影響を及ぼす。こうしたカオトロピックイオンとしては、公知のものが特に制限なく使用できる。カオトロピックイオンの具体例として、チオシアン酸イオン、ヨウ素イオン、過塩素酸イオン、トリクロロ酢酸イオン、臭素イオン、亜硝酸イオン等が挙げられる。これらの中でも、チオシアン酸イオン、ヨウ素イオン、過塩素酸イオンは抗体に与える影響が少なく、安定して抗体を精製できるという特徴があるので特に好適である。
【００４３】
これらカオトロピックイオンは、例えば、０．５〜４Ｍの範囲の溶出液として好適に使用され、１種類のカオトロピックイオンを単独で用いても良いし、複数のカオトロピックイオンを組み合わせて使用しても良い。
【００４４】
カオトロピックイオンを含む溶出液は、カオトロピックイオンの塩を水に溶解して調製しても良いし、または、例えば、リン酸緩衝液、トリス塩酸緩衝液等の緩衝液に溶解し所望のｐＨの溶出液を調製することもができる。カオトロピックイオンの塩としては、例えば、各カオトロピックイオンのナトリウム塩、カリウム塩、アンモニウム塩等が好適に利用できる。
【００４５】
抗原固定化担体を用いてアフィニティー精製する方法において、不溶性担体としては、アガロース、デキストラン、セルロース、ポリアクリルアミド、ポリスチレン、塩化ビニル、ガラス、シリコーンラバー、又は多孔性シリカビーズ等の従来公知の担体が何ら制限無く使用可能である。
【００４６】
また、これらの不溶性担体に前記抗原を固定化する方法としては、臭化シアン活性化法等の化学的結合法や、物理化学的吸着性を利用した方法が何ら制限無く使用可能である。
【００４７】
アフィニティー精製法における抗原固定化担体と抗体混合物の接触および分離法としては、バッチ法およびクロマトグラフィー法の何れの方法も適用可能である。また、両方法を組み合わせて実施することも可能である。
【００４８】
クロマトグラフィー法では、抗原固定化担体をカラムに充填後、抗体混合物をカラムに添加し、次いで緩衝液等をカラムに添加してカラムに吸着されず溶出する画分を廃棄した後に、溶出液をカラムに添加し、吸着した抗体を回収すれば良い。また、バッチ法においては、抗原固定化担体を懸濁した液と抗体混合物を混合し、抗原抗体反応を十分行わせた後に、例えば遠心処理により沈殿を回収し、この沈殿を緩衝液等に懸濁し遠心処理により沈殿を回収するという操作を複数回繰り返すことにより洗浄し、最後に沈殿を溶出液に懸濁することで抗体を溶出すれば良い。
【００４９】
ストレプトコッカス・ミュータンス全菌体或いはプロテアーゼ処理菌体をそのまま使用する場合の抗体混合物との接触および分離法は、上記バッチ法と同様であり、すなわち、菌体懸濁液と抗体混合物を混合し、抗原抗体反応を十分行わせた後に、例えば遠心処理により沈殿を回収することで実施できる。
【００５０】
以上説明した本発明の抗体の製造法によれば、免疫動物の個体差に関係なく、ストレプトコッカス・ミュータンスに対し、高い特異性と反応性を持つポリクローナル抗体が安定的に製造できる。このポリクローナル抗体は、通常、ストレプトコッカス・ミュータンスに対する反応性が、ストレプトコッカス・ゴルドニイ、ストレプトコッカス・サリバリウス、ストレプトコッカス・オラリス、ストレプトコッカス・ミティス、およびストレプトコッカス・サンギスに対する反応性と比較してそれぞれ１０００倍以上である。このようにストレプトコッカス・ミュータンスに対する特異性の高いポリクローナル抗体を免疫学的測定法に応用すれば、被検体液中に他のレンサ球菌が存在していても、１０５個／ｍｌ程度の濃度のストレプトコッカス・ミュータンスを検出することができる。
【００５１】
この免疫学的測定に使用する被検体液としては、ストレプトコッカス・ミュータンスを含むものであれば特に限定されないが、例えば、唾液、歯垢、菌体培養液、培養菌体懸濁液等が使用できる。特に、齲蝕リスクを検査するための検体として、唾液、歯垢を含む体液が好適に使用される。なお、唾液および歯垢は、被検体液中にそれぞれ単独で含まれていてもよいし、混合物として含まれていてもよい。また、被検体液に含まれる不溶物を分散させる目的で超音波処理を施す、ガラスビーズ等の破砕剤と混合し攪拌する等の従来公知の方法によって被検体液を処理し、分析に供することもできる。また、上記の被検体液に抽出処理を施して調製した抽出液を被検体液として測定することもできる。抗原の抽出法としては、例えば、加熱処理する方法（Ｒａｎｔｓ，Ｌ．Ａ．，Ｓｔａｎｆｏｒｄ．Ｍｅｄ．Ｂｕｌｌ．１３：２９０−２９１，１９５５．）、亜硝酸、アルカリ、塩、キレート剤、カオトロピックイオン、界面活性剤を使用して抽出する方法（武井勉．阪大医学雑誌．３５：９３−１０９，１９９０．）、菌体細胞の膜構造を破壊する酵素により処理する方法（特開平９−１７８７５２公報）等公知の方法が制限無く利用できる。
【００５２】
免疫学的測定方法は特に限定されず、抗原抗体反応により抗原を測定する方法として知られている免疫凝集法、光学免疫測定法、標識免疫測定法、およびこれらの組合わせ等の従来公知の免疫学的測定方法が制限無く使用できる。これらの免疫学的測定法を実施するための測定試薬は、本発明により得られるポリクローナル抗体を含む免疫学的測定試薬であればその形態は特に限定されず、本発明の抗体を含む溶液；本発明の抗体を粒子、メンブレン等の不溶性担体に固定化したもの、或いはその懸濁液；本発明の抗体に放射性物質、酵素、各種色素類、コロイド類、各種着色粒子等の標識物質を結合させたもの、或いはそれらの溶液や懸濁液；又はこの様な標識された本発明の抗体を粒子やメンブレン等の不溶性担体に固定化したもの或いはそれらの懸濁液；およびこれらを組み合わせたもの等、様々な形態をとり得る。
【００５３】
各種の免疫学的測定方法のなかでも、ラテックス定量法や酵素免疫測定法は、自動分析装置を用いて多数の被検体液を処理することが可能であるので、集団検診等の検査法として好適である。また、フロースルー免疫測定法、免疫クロマトグラフィー法、およびラテックス凝集法は簡便性に加えて特別な知識や装置を必要とすることなく迅速な測定が可能であり、歯科医院や家庭においても実施可能であるため、汎用的な検査方法として好適である。
【００５４】
より好適な測定法は免疫クロマトグラフィー法であり、特に、特願２００１−３８４５９５号に記載されるような被検体液を一時的に吸収・保持するためのサンプルパッドと、標識抗体を一時的に保持するためのコンジュゲートパッドと、検出用抗体が固定化され、前記サンプルパッドに一時的に吸収・保持された被検体液および該被検体液に同伴されて前記コンジュゲートパッドより流出した標識抗体が展開される展開メンブレンとがこの順番で接合された免疫クロマトグラフィーテストストリップを用いる方法が最適である。該免疫クロマトグラフィーテストストリップにおいて、本発明で製造されるポリクローナル抗体は、標識抗体及び検出用抗体の一方または両方として使用される。これら各種の免疫学的測定方法を実施するための詳細は、上記特願２００１−３８４５９５号に記載される他、特開２００１−３０２６９７号公報等により公知であり、これらの方法に準じて適宜に実施すればよい。
【００５５】
【実施例】
以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明は以下の実施例により限定されるものではない。
【００５６】
実施例１
［チオシアン酸溶出法によるポリクローナル抗体の製造と評価］
（Ａ）〔ストレプトコッカス・ミュータンスに対する抗体混合物の製造］
ＢＨＩ（ＤＩＦＣＯ社）３．７ｇを１００ｍｌの超純水に溶解後、オートクレーブ処理し、ＢＨＩ液体培地を調製した。ＢＨＩ液体培地１００ｍｌ中でＩｎｇｂｒｉｔｔを３７℃、５時間、嫌気条件下（Ｎ２：Ｈ２：ＣＯ２＝８０：１０：１０）で培養した。培養液を４０００ｇ、５分遠心処理し、上清の培地成分を除去し菌体沈殿を回収した。次いで、沈殿物を１００ｍｌのＰＢＳに懸濁させて、同様の遠心分離をする操作を３回行い、沈殿物を洗浄した。菌体沈殿をＰＢＳに懸濁しＡ６００＝１．０に調整し、Ｉｎｇｂｒｉｔｔの菌体懸濁液を調製した。
【００５７】
また、上記とは別に、ＢＨＩ培地にて培養して得たＩｎｇｂｒｉｔｔ菌体沈殿を洗浄した後、０．１Ｍ トリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に懸濁しＡ６００＝１５に調整した。ここにプロナーゼ（和光純薬社）を５ｍｇ／ｍｌとなるように添加し、３７℃で１時間保温した。反応終了後、遠心分離し菌体沈殿を回収した。次いで、沈殿物を１０ｍｌのＰＢＳに懸濁して、同様の遠心分離をする操作を３回行い、沈殿物を洗浄した。菌体沈殿をＰＢＳに懸濁しＡ６００＝１．０に調整し、Ｉｎｇｂｒｉｔｔのプロテアーゼ処理菌体懸濁液を調製した。
【００５８】
免疫は以下のように実施した。
【００５９】
０．５ｍｌの菌体懸濁液またはプロテアーゼ処理菌体懸濁液と０．５ｍｌのフロイントの完全アジュバントを良く混合し、ウサギの皮下に注射した。２週間後、１ｍｌの菌体懸濁液またはプロテアーゼ処理菌体懸濁液と１ｍｌのフロイント不完全アジュバントを良く混合し、ウサギ皮下に追加免疫した。同様の追加免疫を４週目、６週目に行い、力価の上昇をスライドグラスを利用した菌体の凝集反応の程度により確認後、最終免疫より２〜３週間後に、定法に従い採血しストレプトコッカス・ミュータンスに対する抗体混合物（菌体懸濁液を免疫して得られた抗体混合物）を得た。
【００６０】
これとは別に、０．５ｍｌのプロテアーゼ処理菌体懸濁液を用いても、同様の免疫処理を行い、ストレプトコッカス・ミュータンスに対する抗体混合物（プロテアーゼ処理菌体懸濁液を免疫して得られた抗体混合物）を得た。
（Ｂ）〔ストレプトコッカス・ミュータンスに対するポリクローナル抗体の精製］
（Ａ）の方法に従い、１ＬのＢＨＩ液体培地で培養したＩｎｇｂｒｉｔｔまたはプロテアーゼ処理ＩｎｇｂｒｉｔｔをＰＢＳで３回洗浄し、次いで２Ｍ チオシアン酸ナトリウムで３回洗浄し、更にＰＢＳで３回洗浄し、菌体懸濁液、及びプロテアーゼ処理菌体懸濁液（Ａ６００＝１２．５）を調製した。
【００６１】
次いで、
ａ）このプロテアーゼ処理菌体懸濁液と、（Ａ）で調製したプロテアーゼ処理菌体懸濁液を免疫して得られた抗体混合物０．５ｍｌとを混合する、
ｂ）上記菌体懸濁液と、（Ａ）で調製したプロテアーゼ処理菌体懸濁液を免疫して得られた抗体混合物０．５ｍｌとを混合する、及び
ｃ）上記プロテアーゼ処理菌体懸濁液と、（Ａ）で調製した菌体懸濁液を免疫して得られた抗体混合物０．５ｍｌとを混合する
という操作をそれぞれ実施し、各混合液を４℃、６０分反応させた。各混合液を４０００ｇ、５分遠心分離し、各菌体を回収した。この各菌体を１０ｍｌのＰＢＳに懸濁し、同様の遠心分離をする操作を３回行い洗浄した。
【００６２】
次いで、０．５ｍｌの２Ｍ チオシアン酸ナトリウム溶液に各菌体を懸濁し、吸着した抗体を溶出し、遠心分離により上清をそれぞれ回収した。同様の溶出操作を再度行い、各画分のタンパク質量を２８０ｎｍの吸光度により測定した。
【００６３】
次いで、あらかじめＰＢＳで平衡化した１ｍｌのプロテインＡ−セファロース（アマシャムファルマシアバイオテク社）を充填したカラムに上記各溶出液にＰＢＳを添加しチオシアン酸ナトリウム濃度が０．２Ｍとなるように調製した溶液を添加し、５ｍｌのＰＢＳでカラムを洗浄後、５ｍｌの０．１Ｍグリシン−塩酸緩衝液（ｐＨ３．０）にて溶出し、直ちに１Ｍトリス−塩酸（ｐＨ９．０）を添加しｐＨ７．４に各調整した。ＩｇＧの溶出画分は、Ａ２８０を測定することでそれぞれ確認した。
【００６４】
以上により、ａ）プロテアーゼ処理菌体懸濁液を抗原として得た抗体混合物をプロテアーゼ処理菌体により精製したポリクローナル抗体「Ｍ−１」を得た。また、ｂ）プロテアーゼ処理菌体懸濁液を抗原として得た抗体混合物を菌体により精製したポリクローナル抗体「Ｍ−２」を得た。さらに、ｃ）菌体懸濁液を抗原として得た抗体混合物をプロテアーゼ処理菌体により精製したポリクローナル抗体「Ｍ−３」を得た。
（Ｃ）〔ポリクローナル抗体の特異性評価］
Ｉ．〔ストレプトコッカス・ミュータンス測定用免疫クロマト法ストリップの作製］
（１）〔金コロイド標識されたストレプトコッカス・ミュータンスに対するポリクローナル抗体の調製］
コロイド粒径が４０ｎｍの市販金コロイド溶液（Ｂｒｉｔｉｓｈ ＢｉｏＣｅｌｌ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）１０ｍｌに１００ｍＭＫ２ＣＯ３を８８μｌ添加し、ｐＨを９．０に調製後、０．２２μｍフィルター処理した。金コロイド溶液の５２０ｎｍの吸光度を測定したところ、Ａ５２０＝１．０であった。
【００６５】
次いで、１ｍｇ／ｍｌに調整したＭ−１、Ｍ−２、Ｍ−３の各ポリクローナル抗体の２ｍＭホウ酸緩衝溶液（ｐＨ９．０）６４μｌを、上記金コロイド溶液に撹拌しながら添加し、室温下５分放置した。次いで、１０％スキムミルク−２ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ９．０）を１．１ｍｌ撹拌しながら添加し（スキムミルク終濃度１％）、室温下３０分放置した。次いで、反応溶液を１０℃、１００００ｇ、３０分遠心処理し、上清を除去後、２ｍｌの２ｍＭＰＢＳ（ｐＨ７．４）を添加し、下層の金コロイド画分を再懸濁した。該再懸濁した画分の５２０ｎｍの吸光度を測定したところ、Ａ５２０＝４．９であった。
【００６６】
得られた各抗体の金コロイド画分（以下、「金コロイド標識Ｍ−１」「金コロイド標識Ｍ−２」「金コロイド標識Ｍ−３」と表記することもある）は、４℃にて保存した。
【００６７】
（２）〔免疫クロマト法ストリップの作製］
以下の方法により、図１及び図２に示すような免疫クロマト法ストリップを組み立てた。
【００６８】
ニトロセルロースメンブレン（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社、Ｈｉ−Ｆｌｏｗ Ｐｌｕｓ Ｍｅｍｂｒａｎｅ、ＨＦ１８０、２５ｍｍ×６ｍｍ）からなる展開メンブレン４上の検出ライン６上に、１ｍｇ／ｍｌのＭ−１、Ｍ−２、またはＭ−３をスポットした。さらに判定ライン７上に抗ウサギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）ポリクローナル抗体１μｌをスポットし、インキュベーター内で３７℃、６０分乾燥し抗体を固定化した。該抗体固定化メンブレンを１％スキムミルク−０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ１００水溶液中で室温下、５分振とうした。次いで、該メンブレンを１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）中で室温下、１０分振とう後取り出し、真空ポンプで吸引しながら６０分間デシケーター中で乾燥した。
【００６９】
また、コンジュゲートパッド３（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社、７．５ｍｍ×６ｍｍ）を０．５％ＰＶＡ−０．５％ショ糖水溶液中で１分間振とう後取り出し、真空ポンプで吸引しながら６０分間デシケーター中で乾燥した。該コンジュゲートパッドにＡ５２０＝１．０に調整した金コロイド標識Ｍ−１、金コロイド標識Ｍ−２または金コロイド標識Ｍ−３を２５μｌ添加し、真空ポンプで吸引しながら６０分間デシケーター中で乾燥した。更に、サンプルパッド２（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社、１７ｍｍ×６ｍｍ）を１％Ｔｗｅｅｎ２０−ＰＢＳ水溶液中で１分間振とう後取り出し、真空ポンプで吸引しながら６０分間デシケーター中で乾燥した。尚、吸収パッド５（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社、２０ｍｍ×６ｍｍ）は未処理のまま用いた。
【００７０】
このように調製した、図１に示すような免疫クロマト法ストリップの各構成部分をプラスチックの支持台上に配置し、図２に示すような免疫クロマト法ストリップを組み立てた。Ｍ−１を固定化したニトロセルロースメンブレンには金コロイド標識Ｍ−１を、Ｍ−２を固定化したニトロセルロースメンブレンには金コロイド標識Ｍ−２を、Ｍ−３を固定化したニトロセルロースメンブレンには金コロイド標識Ｍ−３を組み合わせて、免疫クロマト法ストリップＭ−１、免疫クロマト法ストリップＭ−２、免疫クロマト法ストリップＭ−３を組み立てた。
【００７１】
ＩＩ．〔特異性評価試験］
（１）〔唾液の採取］
被験者にパラフィンペレットを約１分間噛ませ、分泌された唾液を採取した。
【００７２】
（２）〔培養法による唾液中のストレプトコッカス・ミュータンスの定量］
上記（１）の方法に従い得られた唾液を適宜希釈して、１００μｌをミチス・サリバリウス・バシトラシン（以下、「ＭＳＢ」と表記することもある。）固体培地上およびＢＨＩ固体培地上に添加し、３７℃、嫌気条件下、２４〜４８時間培養した。ＭＳＢおよびＢＨＩ固体培地上に生じるコロニー数を計数し、希釈率から、ミュータンスレンサ球菌濃度を個／ｍｌとして算出した。
【００７３】
ＭＳＢおよびＢＨＩ培地上のストレプトコッカス・ミュータンスの識別は、コロニーの形態学的分類、および形態学的に識別不可能なコロニーに関しては、該コロニーを純粋培養後、ミュータンスレンサ球菌の血清型特異的な抗体を利用した免疫学的測定方法および、糖発酵試験等の生化学的方法によりストレプトコッカス・ミュータンスの同定を行った。
【００７４】
（３）［検体の前処理］
上記（１）で採取した唾液１００μｌを遠心分離し上清を除去した。沈殿を５００μｌの０．１ＭＮａＯＨに懸濁し、遠心分離により上清を除去した。次いで沈殿を５００μｌのＰＢＳに懸濁し、遠心分離にて上清を除去した。ＰＢＳによる同様の操作を再度実施した後、沈殿に１０μｌの４Ｍ酢酸と５μｌの２Ｍ亜硝酸ナトリウムを添加し、良く混合後室温で１０分間放置した。４５μｌの０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含む１Ｍトリス（ｐＨ未調製）と４０μｌの０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含む０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）を添加し、被検体液を調製した。
【００７５】
（４）〔免疫クロマト法ストリップによるストレプトコッカス・ミュータンスの測定］
前記Ｉ．−（２）で製造した免疫クロマトグラフ法ストリップＭ−１〜Ｍ−３を用いて、上記（３）で調製した被検体液中のストレプトコッカス・ミュータンスの測定を実施した。免疫クロマト法ストリップに於ける１０分後のスポット発色強度を、４段階（＋＋＋：強い陽性、＋＋：陽性、＋：弱い陽性、−：陰性）に識別した結果と、（２）の培養法により得られたストレプトコッカス・ミュータンス菌数とを比較した。結果を表１に示す。
【００７６】
【表１】
表１から明らかなように、チオシアン酸ナトリウム溶出により調製したポリクローナル抗体により、１０５／ｍｌのストレプトコッカス・ミュータンスが検出でき、更に、培養法により得られたストレプトコッカス・ミュータンスの濃度と相関するスポット発色強度が得られた。これらのことから、ここで調製した抗体は、ミュータンスレンサ球菌以外の口腔内レンサ球菌との交差反応性が十分に低く抑えられていることが分かる。
【００７８】
実施例２
［複数のウサギを用いて免疫し、各種カオトロピックイオンを用いて精製して得たポリクローナル抗体の特異性評価］
（１）［ポリクローナル抗体の製造］
実施例１の方法に従って、１０羽のウサギを用いて、菌体懸濁液を免疫することで抗体混合物を調製した。実施例１（Ｂ）ｃ）におけるプロテアーゼ処理菌体でのアフィニティー精製の際に、２Ｍ チオシアン酸ナトリウム、または２Ｍ ヨウ化ナトリウム、または２Ｍ 過塩素酸ナトリウムで溶出し、次いで、プロテインＡ−セファロースで精製した。このようにして各溶出法につき１０種類のポリクローナル抗体を調製した。
【００７９】
（２）［免疫クロマト法ストリップの製造］
実施例１（Ｃ）−Ｉ．記載の方法に従って、上記（１）で調製した３０種類のポリクローナル抗体を使用した免疫クロマト法ストリップを製造した。
【００８０】
（３）［特異性評価試験］
実施例１（Ｃ）−ＩＩ．と同様の方法により唾液より被検体液を調製し、上記（２）で作製した免疫クロマト法ストリップにより分析した。チオシアン酸ナトリウムにより溶出した抗体の結果を表２に、
【００８１】
【表２】
【表３】
ヨウ化ナトリウムにより溶出した抗体の結果を表３に、
【００８４】
【表４】
【表５】
過塩素酸ナトリウムにより溶出した抗体の結果を表４に示す。
【００８７】
【表６】
【表７】
表２〜４に示したように、チオシアン酸ナトリウム、ヨウ化ナトリウム、過塩素酸ナトリウムで溶出した場合、１０種類のすべての抗体で、１０５／ｍｌのストレプトコッカス・ミュータンスが検出でき、更に、培養法により得られたストレプトコッカス・ミュータンスの濃度と相関するスポット発色強度が得られた。ウサギ個体に関係なく、ミュータンスレンサ球菌以外の口腔内レンサ球菌との交差反応性が十分に低く抑えられた抗体が安定に得られた。
【００９０】
比較例１
［複数のウサギを用い、酸溶出法により精製して得たポリクローナル抗体の特異性評価］
（１）［ポリクローナル抗体の製造］
実施例２（１）で得られた各抗体混合物を用いて、酸溶出法によるアフィニティー精製を行った。
【００９１】
実施例１（Ａ）の方法に従ってプロテアーゼ処理菌体を調製した。該プロテアーゼ処理菌体をＰＢＳで３回洗浄し、次いで０．１Ｍ グリシン塩酸緩衝液（ｐＨ２．０）で３回洗浄し、更にＰＢＳで３回洗浄し、プロテアーゼ処理菌体懸濁液（Ａ６００＝１２．５）を調製した。
【００９２】
次いで、実施例１（Ｂ）ｃ）と同様の方法により抗体混合物とプロテアーゼ処理菌体懸濁液とを混合し、ＰＢＳで３回洗浄した後、０．５ｍｌの０．１Ｍ グリシン塩酸緩衝液（ｐＨ２．０）に菌体を懸濁して、吸着していた抗体を溶出し、遠心分離により上清を回収し、１Ｍトリス−塩酸（ｐＨ９．０）を添加しｐＨ７．４に調整した。同様の溶出操作を４回行い、各画分のタンパク質量を２８０ｎｍの吸光度により測定した。
【００９３】
次いで、あらかじめＰＢＳで平衡化した１ｍｌのプロテインＡ−セファロース（アマシャムファルマシアバイオテク社）を充填したカラムに上記溶出液を添加し、実施例１（Ｂ）と同様の方法により抗体を溶出し、１０種類のポリクローナル抗体を調製した。
【００９４】
（２）［免疫クロマト法ストリップの製造］
実施例１（Ｃ）−Ｉ．記載の方法に従って、上記（１）で調製したポリクローナル抗体を使用した免疫クロマト法ストリップを製造した。
【００９５】
（３）［特異性評価試験］
実施例３（３）で調製した抗原抽出液を、上記（２）で作製した免疫クロマト法ストリップにより分析した。結果を表５に示す。
【００９６】
【表８】
【表９】
表５に示したように、酸溶出法によるアフィニティー精製でポリクローナル抗体を製造すると、ウサギによっては非特異的反応が検出される場合があることが明らかとなった。
【００９９】
【発明の効果】
本発明によれば、ミュータンスレンサ球菌以外の口腔内レンサ球菌との交差反応性を十分に低く抑えたストレプトコッカス・ミュータンスに特異的なポリクローナル抗体を、免疫動物個体差に影響されることなく安定して製造することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本図は、本発明の免疫クロマト法で使用するストリップの各部材の概略図である。
【図２】本図は、本発明の免疫クロマト法で使用するストリップの側面図である。
【符号の説明】
１・・・ストリップ
２・・・サンプルパッド
３・・・コンジュゲートパッド
４・・・展開メンブレン
５・・・吸収パッド
６・・・検出ライン
７・・・コントロール判定ライン
Claims (2)
- 免疫動物に、ストレプトコッカス・ミュータンスの全菌体、そのプロテアーゼ処理菌体、及びこれらの菌体の抗原抽出物から選ばれる少なくとも１種の免疫原を免疫して抗体混合物を得、その後、上記各免疫原から選ばれる少なくとも１種を抗原として用いたアフィニティー精製法によって当該抗体混合物を精製するポリクローナル抗体の製造方法であって、前記免疫動物への免疫原及びアフィニティー精製に用いる抗原の少なくとも一方として、前記プロテアーゼ処理菌体、または当該菌体の抗原抽出物を使用し、且つアフィニティー精製における担体からの溶出の際に、カオトロピックイオンを使用することを特徴とするストレプトコッカス・ミュータンスに対するポリクローナル抗体の製造方法。
- カオトロピックイオンが、ヨウ素イオン、チオシアン酸イオン、過塩素酸イオンであることを特徴とする請求項１に記載のストレプトコッカス・ミュータンスに対するポリクローナル抗体の製造方法。
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