JPH08319297A - 免疫学的手法によるメガスフェラ属微生物の検出法 - Google Patents
免疫学的手法によるメガスフェラ属微生物の検出法Info
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- JPH08319297A JPH08319297A JP14973395A JP14973395A JPH08319297A JP H08319297 A JPH08319297 A JP H08319297A JP 14973395 A JP14973395 A JP 14973395A JP 14973395 A JP14973395 A JP 14973395A JP H08319297 A JPH08319297 A JP H08319297A
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Abstract
(57)【要約】
【構成】 メガスフェラ・セレビシエ（Megasphaera ce
revisiae) を哺乳類に免疫して得られるメガスフェラ属
微生物に特異的な抗体並びに該抗体を用いることを特徴
とする免疫学的手法によるメガスフェラ属微生物の検出
法。 【効果】 本発明により、メガスフェラ属微生物を特異
的に認識する抗体が提供され、これを用いる免疫学的手
法によりビール中の有害メガスフェラ属微生物を迅速、
高感度かつ特異的に検出することができる。
revisiae) を哺乳類に免疫して得られるメガスフェラ属
微生物に特異的な抗体並びに該抗体を用いることを特徴
とする免疫学的手法によるメガスフェラ属微生物の検出
法。 【効果】 本発明により、メガスフェラ属微生物を特異
的に認識する抗体が提供され、これを用いる免疫学的手
法によりビール中の有害メガスフェラ属微生物を迅速、
高感度かつ特異的に検出することができる。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、メガスフェラ属微生物
に特異的な抗体および該抗体を用いるメガスフェラ属微
生物の検出法に関し、詳しくはビール製造に有害なグラ
ム陰性菌であるメガスフェラ・セレビシエ（Megasphaer
a cerevisiae) を哺乳類に免疫して得られるメガスフェ
ラ属微生物に特異的な抗体と該抗体を用いる免疫学的手
法によるメガスフェラ属微生物の検出法に関する。
に特異的な抗体および該抗体を用いるメガスフェラ属微
生物の検出法に関し、詳しくはビール製造に有害なグラ
ム陰性菌であるメガスフェラ・セレビシエ（Megasphaer
a cerevisiae) を哺乳類に免疫して得られるメガスフェ
ラ属微生物に特異的な抗体と該抗体を用いる免疫学的手
法によるメガスフェラ属微生物の検出法に関する。
【０００２】
【従来の技術】ビール製造における有害菌には、ラクト
バシラス（Lactobacillus)属、ペディオコッカス (Pedi
ococcus)属などの乳酸菌、野性酵母あるいはグラム陰性
菌であるペクチネータス（Pectinatus) 属やメガスフェ
ラ（Megasphaera)属に属する微生物が代表的なものとし
て挙げられる。これらの有害菌がビールに混入すると、
濁りや酸敗を生じ、著しく商品価値を損なう。
バシラス（Lactobacillus)属、ペディオコッカス (Pedi
ococcus)属などの乳酸菌、野性酵母あるいはグラム陰性
菌であるペクチネータス（Pectinatus) 属やメガスフェ
ラ（Megasphaera)属に属する微生物が代表的なものとし
て挙げられる。これらの有害菌がビールに混入すると、
濁りや酸敗を生じ、著しく商品価値を損なう。
【０００３】そのため、これら有害菌を迅速、かつ正確
に検出、識別することが重要であるが、ビール工場で
は、これらの有害菌の検出に一般的に培養法を用いてい
る。例えば、乳酸菌に関しては、改変ＮＢＢ培地（W. B
ack, Brauwelt, 120, 1562(1980))やＫＯＴ培地（H. Ta
guchi, J.Am.Soc.Brew.Chem., 48, 72 (1990)) が検出
用培地として考案されている。しかし、この方法はコロ
ニーとして観察できるようになるまでに２〜４日を要
し、迅速性に欠けるという難点がある。
に検出、識別することが重要であるが、ビール工場で
は、これらの有害菌の検出に一般的に培養法を用いてい
る。例えば、乳酸菌に関しては、改変ＮＢＢ培地（W. B
ack, Brauwelt, 120, 1562(1980))やＫＯＴ培地（H. Ta
guchi, J.Am.Soc.Brew.Chem., 48, 72 (1990)) が検出
用培地として考案されている。しかし、この方法はコロ
ニーとして観察できるようになるまでに２〜４日を要
し、迅速性に欠けるという難点がある。
【０００４】そこで、この欠点を克服するものとして、
乳酸菌の特異的抗体を用いた免疫学的手法の導入により
迅速性を高める試みがなされており、例えばラクトバシ
ラス・ブレビス（Lactobacillus brevis) に対するポリ
クローナル抗体（特開平４−７２５７０号公報）、モノ
クローナル抗体（特開平６−４６８８１号公報）、ラク
トバシラス・カゼイ（Lactobacillus casei)に対するモ
ノクローナル抗体（特開平６−３１１８９４号公報）、
ラクトバシラス・プランタラム（Lactobacillus planta
rum)に対するモノクローナル抗体（特開平６−１０５６
９８号公報）、ペディオコッカス・ダムノサス (Pedioc
occus damnosus) に対するモノクローナル抗体（特開平
６−３１１８９５号公報）等が作製されている。
乳酸菌の特異的抗体を用いた免疫学的手法の導入により
迅速性を高める試みがなされており、例えばラクトバシ
ラス・ブレビス（Lactobacillus brevis) に対するポリ
クローナル抗体（特開平４−７２５７０号公報）、モノ
クローナル抗体（特開平６−４６８８１号公報）、ラク
トバシラス・カゼイ（Lactobacillus casei)に対するモ
ノクローナル抗体（特開平６−３１１８９４号公報）、
ラクトバシラス・プランタラム（Lactobacillus planta
rum)に対するモノクローナル抗体（特開平６−１０５６
９８号公報）、ペディオコッカス・ダムノサス (Pedioc
occus damnosus) に対するモノクローナル抗体（特開平
６−３１１８９５号公報）等が作製されている。
【０００５】一方、グラム陰性菌であるペクチネータス
（Pectinatus) 属やメガスフェラ（Megasphaera)属微生
物に関しては、ＳＭＭＰ培地（S. Y. Lee, J.Am.Soc.Br
ew.Chem., 52, 115 (1994)) が検出用培地として考案さ
れている。また、ペクチネータス属微生物の場合は、ペ
クチネータス・セレビシフィラス（Pectinatus cerevis
iiphilus) に対するモノクローナル抗体（S. L. Gares,
J.Am.Soc.Brew.Chem., 51, 158 (1993)) が作製されて
いる。しかし、メガスフェラ属微生物に関しては、検出
方法としては上記のＳＭＭＰ培地を用いる方法しかな
く、迅速で特異性のある検出方法の開発が要望されてい
た。
（Pectinatus) 属やメガスフェラ（Megasphaera)属微生
物に関しては、ＳＭＭＰ培地（S. Y. Lee, J.Am.Soc.Br
ew.Chem., 52, 115 (1994)) が検出用培地として考案さ
れている。また、ペクチネータス属微生物の場合は、ペ
クチネータス・セレビシフィラス（Pectinatus cerevis
iiphilus) に対するモノクローナル抗体（S. L. Gares,
J.Am.Soc.Brew.Chem., 51, 158 (1993)) が作製されて
いる。しかし、メガスフェラ属微生物に関しては、検出
方法としては上記のＳＭＭＰ培地を用いる方法しかな
く、迅速で特異性のある検出方法の開発が要望されてい
た。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、上記した実
情に鑑みなされたものであり、メガスフェラ属微生物を
迅速、かつ特異的に識別する抗体を提供すると共に、公
知の免疫学的手法、例えば蛍光抗体法を用いて、該菌の
検出法および識別法を提供しようとするものである。
情に鑑みなされたものであり、メガスフェラ属微生物を
迅速、かつ特異的に識別する抗体を提供すると共に、公
知の免疫学的手法、例えば蛍光抗体法を用いて、該菌の
検出法および識別法を提供しようとするものである。
【０００７】
【課題を解決するための手段】すなわち、本発明はメガ
スフェラ・セレビシエを哺乳類に免疫して得られるメガ
スフェラ属微生物に特異的な抗体並びに該抗体を用いる
ことを特徴とする免疫学的手法によるメガスフェラ属微
生物の検出法に関する。
スフェラ・セレビシエを哺乳類に免疫して得られるメガ
スフェラ属微生物に特異的な抗体並びに該抗体を用いる
ことを特徴とする免疫学的手法によるメガスフェラ属微
生物の検出法に関する。
【０００８】以下に本発明を詳細に説明する。 （１）抗体の作製 メガスフェラ・セレビシエを適当な培地で培養し、培養
物から集菌して得た菌体を生理食塩水に懸濁し、これを
抗原として哺乳類に免疫（静脈内注射法など）する。適
当な間隔で数回、通常は４日間隔で３回追加免疫を行
い、血中の抗体価が上昇したならば採血し、抗体を得
る。ここで、哺乳動物としては、例えばウサギ，マウス
などが好適に用いられる。また、検出用抗体の典型的な
形態は、抗血清であるが、必要に応じて、周知の方法
（例えばプロテインＡやプロテインＧカラムなどのアフ
ィニティークロマトグラフィーを用いた分画方法）によ
り目的の抗体画分を分離したもの、あるいは周知の方法
（例えばハイブリドーマによる方法）によりモノクロー
ナル抗体として得たものを用いることも可能である。
物から集菌して得た菌体を生理食塩水に懸濁し、これを
抗原として哺乳類に免疫（静脈内注射法など）する。適
当な間隔で数回、通常は４日間隔で３回追加免疫を行
い、血中の抗体価が上昇したならば採血し、抗体を得
る。ここで、哺乳動物としては、例えばウサギ，マウス
などが好適に用いられる。また、検出用抗体の典型的な
形態は、抗血清であるが、必要に応じて、周知の方法
（例えばプロテインＡやプロテインＧカラムなどのアフ
ィニティークロマトグラフィーを用いた分画方法）によ
り目的の抗体画分を分離したもの、あるいは周知の方法
（例えばハイブリドーマによる方法）によりモノクロー
ナル抗体として得たものを用いることも可能である。
【０００９】（２）メガスフェラ属微生物の検出法 上記のようにして得られた抗体は、メガスフェラ属微生
物を特異的に認識することができる。例えばビール中の
当該有害菌を検出するには、ビールをメンブランフィル
ター等により濾過し、集菌したものをサンプルとし、こ
れに周知の免疫学的手法である抗原抗体反応、例えば凝
集反応法、蛍光抗体法、酵素抗体法，ラジオイムノアッ
セイ法等のうち適当な方法を適用して当該有害菌を検出
することができる。
物を特異的に認識することができる。例えばビール中の
当該有害菌を検出するには、ビールをメンブランフィル
ター等により濾過し、集菌したものをサンプルとし、こ
れに周知の免疫学的手法である抗原抗体反応、例えば凝
集反応法、蛍光抗体法、酵素抗体法，ラジオイムノアッ
セイ法等のうち適当な方法を適用して当該有害菌を検出
することができる。
【００１０】
【実施例】次に、本発明を実施例により詳しく説明する
が、本発明はこれらによって何ら限定されるものではな
い。 実施例１ （１）抗原の調製と免疫 メガスフェラ・セレビシエＪＣＭ６１３０を改変ＮＢＢ
液体培地に接種し、３０℃で７日間培養し、培養物から
集菌した菌体を２回蒸留水で洗浄した後、生理食塩水に
ＯＤ625 が２．４〜２．８になるように懸濁し、これを
抗原とした。日本白色種のウサギ（雄，１０週令，体重
１．９〜２．１Ｋｇ）の耳静脈に上記の抗原を１ｍｌ／
１羽接種して免疫した。４日の間隔で追加免疫を３回行
った。その抗原量はそれぞれ２ｍｌ，４ｍｌ，４ｍｌと
した。なお、メガスフェラ・セレビシエＪＣＭ６１２９
も同様に抗原として用いることができる。
が、本発明はこれらによって何ら限定されるものではな
い。 実施例１ （１）抗原の調製と免疫 メガスフェラ・セレビシエＪＣＭ６１３０を改変ＮＢＢ
液体培地に接種し、３０℃で７日間培養し、培養物から
集菌した菌体を２回蒸留水で洗浄した後、生理食塩水に
ＯＤ625 が２．４〜２．８になるように懸濁し、これを
抗原とした。日本白色種のウサギ（雄，１０週令，体重
１．９〜２．１Ｋｇ）の耳静脈に上記の抗原を１ｍｌ／
１羽接種して免疫した。４日の間隔で追加免疫を３回行
った。その抗原量はそれぞれ２ｍｌ，４ｍｌ，４ｍｌと
した。なお、メガスフェラ・セレビシエＪＣＭ６１２９
も同様に抗原として用いることができる。
【００１１】（２）抗血清の採取 最終免疫の３日後、ウサギを半日絶食させ、全採血を行
った。得られた血液を室温に１〜２時間放置後、２００
０ｒｐｍ，１０分間の遠心分離を行い、血餅を除いて抗
血清を得た。ウサギ１羽から、約４０〜６０ｍｌの抗血
清が得られた。
った。得られた血液を室温に１〜２時間放置後、２００
０ｒｐｍ，１０分間の遠心分離を行い、血餅を除いて抗
血清を得た。ウサギ１羽から、約４０〜６０ｍｌの抗血
清が得られた。
【００１２】（３）イムノグロブリンＧ（ＩｇＧと略記
する。）画分の分離 抗血清１ｍｌに飽和硫酸アンモニウム溶液（最終５０％
飽和）を１ｍｌ加え、１時間低温室にて攪拌を続けた。
その後、１００００ｒｐｍ，２０分間の遠心分離を行
い、沈澱物を得た。得られた沈澱物を飽和硫酸アンモニ
ウム溶液２ｍｌで１回洗浄した後、２ｍｌの０．０２Ｍ
リン酸バッファー（ｐＨ７）に溶解し、同バッファーに
て１晩透析後、１００００ｒｐｍ，１０分間の遠心分離
を行って不溶物を除いた上清を得た。この上清１ｍｌ
を、市販の５ｍｌ容プロテインＡカラム（ファルマシア
社製）に吸着させ、同バッファー２０ｍｌで洗浄し、Ｉ
ｇＧ以外の蛋白質を洗い出した。その後、ＯＤ280 でモ
ニターしながら、０．１Ｍクエン酸バッファー（ｐＨ
３）で溶出し、ＩｇＧ画分を分取した。
する。）画分の分離 抗血清１ｍｌに飽和硫酸アンモニウム溶液（最終５０％
飽和）を１ｍｌ加え、１時間低温室にて攪拌を続けた。
その後、１００００ｒｐｍ，２０分間の遠心分離を行
い、沈澱物を得た。得られた沈澱物を飽和硫酸アンモニ
ウム溶液２ｍｌで１回洗浄した後、２ｍｌの０．０２Ｍ
リン酸バッファー（ｐＨ７）に溶解し、同バッファーに
て１晩透析後、１００００ｒｐｍ，１０分間の遠心分離
を行って不溶物を除いた上清を得た。この上清１ｍｌ
を、市販の５ｍｌ容プロテインＡカラム（ファルマシア
社製）に吸着させ、同バッファー２０ｍｌで洗浄し、Ｉ
ｇＧ以外の蛋白質を洗い出した。その後、ＯＤ280 でモ
ニターしながら、０．１Ｍクエン酸バッファー（ｐＨ
３）で溶出し、ＩｇＧ画分を分取した。
【００１３】実施例２ 実施例１で作製した抗血清の特異性を蛍光抗体法で検討
した。スライドガラス上に５μｌの蒸留水を滴下し、そ
の水滴中に被検体菌の１白金耳量の菌体を懸濁し、風乾
後、火炎固定した。この固定菌体の上に１％アルブミン
溶液を約５０μｌ（１滴）のせて室温で３分間放置し
た。その後、0.０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ（以
下、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎと略記する。）で洗浄後、抗血
清を約５０μｌ（１滴）のせて室温で３分間放置した。
次いで、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで洗浄後、ＦＩＴＣ標識抗
ウサギＩｇＧ（Binding Site社製) を約５０μｌ（１
滴）のせ、室温で３分間放置した。その後、ＰＢＳ−Ｔ
ｗｅｅｎで洗浄したのち、風乾し、蛍光顕微鏡で蛍光像
が得られるか否かを検討した。
した。スライドガラス上に５μｌの蒸留水を滴下し、そ
の水滴中に被検体菌の１白金耳量の菌体を懸濁し、風乾
後、火炎固定した。この固定菌体の上に１％アルブミン
溶液を約５０μｌ（１滴）のせて室温で３分間放置し
た。その後、0.０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ（以
下、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎと略記する。）で洗浄後、抗血
清を約５０μｌ（１滴）のせて室温で３分間放置した。
次いで、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで洗浄後、ＦＩＴＣ標識抗
ウサギＩｇＧ（Binding Site社製) を約５０μｌ（１
滴）のせ、室温で３分間放置した。その後、ＰＢＳ−Ｔ
ｗｅｅｎで洗浄したのち、風乾し、蛍光顕微鏡で蛍光像
が得られるか否かを検討した。
【００１４】このようにして、各種乳酸菌，グラム陽性
菌，グラム陰性菌の標準菌株について、抗血清との反応
性を検討した。その結果、実施例１で作製した抗血清
は、メガスフェラ属微生物、特にメガスフェラ・セレビ
シエと特異的に反応し、その他の乳酸菌，グラム陽性
菌，グラム陰性菌とは反応しないことが判明した。以上
の結果を第１表に示した。この結果は、ビール有害グラ
ム陰性菌であるメガスフェラ属微生物の特異的検出に、
本抗血清が有用であることを示している。
菌，グラム陰性菌の標準菌株について、抗血清との反応
性を検討した。その結果、実施例１で作製した抗血清
は、メガスフェラ属微生物、特にメガスフェラ・セレビ
シエと特異的に反応し、その他の乳酸菌，グラム陽性
菌，グラム陰性菌とは反応しないことが判明した。以上
の結果を第１表に示した。この結果は、ビール有害グラ
ム陰性菌であるメガスフェラ属微生物の特異的検出に、
本抗血清が有用であることを示している。
【００１５】
【表１】
【００１６】実施例３ 実施例１で得たＩｇＧ画分と各種乳酸菌，グラム陽性
菌，グラム陰性菌の標準菌株との反応性を実施例２と同
様の方法で検討した。その結果、実施例１で作製したＩ
ｇＧ画分も、メガスフェラ属微生物、特にメガスフェラ
・セレビシエと特異的に反応し、その他の乳酸菌，グラ
ム陽性菌，グラム陰性菌とは反応しないことが判明し
た。以上の結果を第２表に示した。
菌，グラム陰性菌の標準菌株との反応性を実施例２と同
様の方法で検討した。その結果、実施例１で作製したＩ
ｇＧ画分も、メガスフェラ属微生物、特にメガスフェラ
・セレビシエと特異的に反応し、その他の乳酸菌，グラ
ム陽性菌，グラム陰性菌とは反応しないことが判明し
た。以上の結果を第２表に示した。
【００１７】
【表２】
【００１８】
【発明の効果】本発明により、メガスフェラ属微生物を
特異的に認識する抗体が提供され、これを用いる免疫学
的手法によりビール中の有害メガスフェラ属微生物を迅
速、高感度かつ特異的に検出することができる。
特異的に認識する抗体が提供され、これを用いる免疫学
的手法によりビール中の有害メガスフェラ属微生物を迅
速、高感度かつ特異的に検出することができる。
Claims (4)
- 【請求項１】 メガスフェラ・セレビシエ（Megasphaer
a cerevisiae) を哺乳類に免疫して得られるメガスフェ
ラ属微生物に特異的な抗体。 - 【請求項２】 抗体が、抗血清である請求項１記載のメ
ガスフェラ属微生物に特異的な抗体。 - 【請求項３】 抗体が、ＩｇＧ画分である請求項１記載
のメガスフェラ属微生物に特異的な抗体。 - 【請求項４】 請求項１記載の抗体を用いることを特徴
とする免疫学的手法によるメガスフェラ属微生物の検出
法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP14973395A JPH08319297A (ja) | 1995-05-25 | 1995-05-25 | 免疫学的手法によるメガスフェラ属微生物の検出法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP14973395A JPH08319297A (ja) | 1995-05-25 | 1995-05-25 | 免疫学的手法によるメガスフェラ属微生物の検出法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH08319297A true JPH08319297A (ja) | 1996-12-03 |
Family
ID=15481631
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP14973395A Withdrawn JPH08319297A (ja) | 1995-05-25 | 1995-05-25 | 免疫学的手法によるメガスフェラ属微生物の検出法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH08319297A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2022154094A1 (ja) * | 2021-01-15 | 2022-07-21 | 旭化成株式会社 | 飲食品検体、環境検体、又は生体検体中の細菌の有無及び／又は存在量を検出するための方法及びキット |
-
1995
- 1995-05-25 JP JP14973395A patent/JPH08319297A/ja not_active Withdrawn
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2022154094A1 (ja) * | 2021-01-15 | 2022-07-21 | 旭化成株式会社 | 飲食品検体、環境検体、又は生体検体中の細菌の有無及び／又は存在量を検出するための方法及びキット |
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| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A300 | Withdrawal of application because of no request for examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A300 Effective date: 20020806 |