JPH08233819A - 感作標識担体、抗原又は抗体の検出方法及び検出用検査セット - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】 抗原又は抗体と標識物質とを担体を介して一
体化してなることを特徴とする感作標識担体。 【効果】 本発明によれば、測定対象の抗原或いは特異
抗体の検出感度を著しく高めることが可能となり、抗原
抗体反応を利用した診断において正診率が高くなり、診
断の正確さを著しく向上させることができる。また、本
発明の検出方法によれば、測定対象が超微量である場合
でも確実に検出することができる。更に、本発明の検出
用検査セットによれば、上記本発明の検出方法にしたが
って検体中の抗原又は抗体等の検査を確実かつ簡便に実
施することができ、本発明の検出用検査セットを自動分
析装置に用いると人手を介さずに大量の検体を迅速に処
理することができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、感作標識担体、該担体
を用いて検体中の抗原又は抗体を検出する方法及び検出
用検査セットに関し、更に詳述すると、抗原又は抗体と
標識物質とを担体に結合又は吸着させて一体化した感作
標識担体を用いて抗原抗体反応を行うことにより、測定
対象の抗原又は抗体の存否、多寡を高感度に検出するこ
とができる感作標識担体、該担体を用いた検体中の抗原
又は抗体の検出方法及び検出用検査セットに関する。

【０００２】

【従来の技術】抗原抗体反応の特徴は、その反応が高い
特異性を持つことである。この高い抗原抗体反応の特異
性は、抗体識別能力が大きく、抗原特異性を持つためで
あるが、この抗原抗体反応の高い特異性を利用し、生体
内の微量成分である細胞表面マーカー、腫瘍マーカー、
血液型物質、ホルモン、薬物や病原体等の測定項目を、
高感度かつ迅速に試験する方法が広く臨床検査法として
応用され、感染症の診断と治療、臓器移植や輸血適合
性、妊娠検査等、広く医学全般に大きな貢献を果たして
いる。特に、感染症の場合、以前は病原体の特定に多大
な時間を要していたが、抗原抗体反応を利用した免疫学
的診断法により迅速な診断が可能となり、患者の享受す
る利益の大きさには計り知れないものがある。

【０００３】従来から、抗原抗体反応を利用し、検体中
の抗原或いは抗体を検出するためのマーカーとしては、
赤血球、菌体、ラテックス等が凝集反応を指標とする測
定方法のために用いられていた。更に、放射性元素、発
色物質、発光物質等を利用した測定方法も近年盛んに開
発され、利用されている。

【０００４】このうち、放射性元素、発色物質、発光物
質を標識物質として利用する方法では、一般に、抗原に
対する特異抗体或いは抗原に直接標識物質を結合させる
方法と、発色或いは発光作用を有する化合物を生成する
酵素を特異抗体或いは抗原に結合させる方法とが公知で
ある。これらの方法は、以前から行われている凝集反
応、沈降反応等の方法よりも高い感度で抗原抗体反応を
検出できるという長所があり、このうち、標識物質とし
て酵素を用いる方法は酵素免疫測定法（Ｅｎｚｙｍｅ
ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ；ＥＩＡ）として、標識物質と
して放射性同位元素用いる方法はラジオイムノアッセイ
（Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ；ＲＩＡ）として
広く知られている。特に、酵素免疫測定法は放射性物質
を使用せず、更に特別の機器も必要としないので、安全
かつ簡便な検出方法として臨床検査分野で広く利用され
ている。

【０００５】この酵素免疫測定法は、例えば特表昭６３
−５００５９３号公報に開示されているように、抗体に
標識となる酵素を直接結合させた標識抗体を用いて抗原
を検出する、或いは逆に、抗原に標識となる酵素を直接
結合させた標識抗原を用いて特異抗体を検出する技術で
ある。具体的な検出方法は、上記標識抗体又は標識抗原
を用いて抗原抗体反応を行い、反応した抗原又は抗体の
標識物である酵素が基質を分解することにより生じる発
色或いは発光を検出することにより、目的とする抗原又
は抗体を定性的、或いは定量的に検出するものである。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】しかしながら、これら
各技術の開発により抗原抗体反応の検出感度は飛躍的に
向上したが、さらなる超微量成分を迅速かつ高感度に検
出できる優れた検出方法及び簡便な操作で確実に目的物
を検出できる検出用検査セットの開発が望まれている。
特に、病原体による感染症の診断分野においては、少し
でも迅速かつ高感度な検出方法を確立することにより、
現在以上の早期診断が可能になることが待望されてい
る。

【０００７】本発明は上記事情に鑑みなされたものであ
り、抗原或いは抗体の検出感度を大幅に上げ、正確な診
断をより早く下すことが可能となる感作標識担体、該担
体を用いて検体中の抗原又は抗体を検出する方法及び検
出用検査セットを提供することを目的とする。

【０００８】

【課題を解決するための手段及び作用】本発明者は、上
記目的を達成するために抗原や抗体の標識方法を改良し
抗原抗体反応の検出限界を改善すべく鋭意検討を行った
結果、検体中の抗原又は抗体を検出する際に、抗原又は
抗体と標識物質とを担体に結合又は吸着させて一体化し
た感作標識担体を作製し、該担体を用いて抗原抗体反応
を行うと、検出限界が大幅に向上し、測定対象を高感度
に検出できることを見い出した。

【０００９】即ち、従来の酵素免疫測定法（ＥＩＡ）で
は、酵素のような高分子化合物を抗体や抗原の特定の化
学構造を利用して結合させるため、結合量の限界による
検出の限界が生ずる。一般に標識技術そのものの限界と
して、抗体を標識する場合はその抗原結合性に、抗原を
標識する場合はそのエピトープ（抗原決定基）に影響を
与えないような標識が必要である。この点が大きな制約
となって、従来の検出限界の改善は、主として比吸光係
数の大きい色素、発光強度の大きい発光物質、発光増強
効果を有するエンハンサーの開発等に向けられていた。
これに対し、本発明者は、上記検出限界の改善方法とし
て抗原或いは抗体と標識物質とを担体を介して一体化す
る標識方法を知見した。つまり、抗原又は抗体と標識物
質とを担体に結合又は吸着させて一体化した感作標識担
体を用いて抗原抗体反応を行うことにより、単位抗原分
子或いは単位抗体分子当りの標識物質の数を大幅に増や
すことが可能となった。これにより、抗原や抗体の構造
による標識物質の数、位置等の制限に拘束されることな
く、抗体や抗原を標識することができ、従来の酵素免疫
測定法と比較し、反応温度や反応時間を同一とした測定
条件下において、測定対象の抗原或いは特異抗体を高感
度に検出でき、検出限界の向上に大きく寄与することで
き、特に、非競合法による免疫学的測定法において本発
明を応用すると、測定対象の抗原或いは特異抗体が極微
量しか存在しないような状況においても、定量性及び検
出感度の点において優れた成績が得られることを見い出
し、本発明をなすに至ったものである。

【００１０】従って、本発明は、抗原又は抗体と標識物
質とを担体を介して一体化してなることを特徴とする感
作標識担体を提供する。この場合、標識物質として酵素
を用いることが好ましい。また、本発明は、検体中の抗
体又は抗原を本発明の感作標識担体と抗原抗体反応させ
た後、反応した担体の標識物質が基質と作用することに
より生じる発色、蛍光・発光又は放射能を検出すること
により、上記検体中の抗原又は抗体を検出することを特
徴とする抗原又は抗体の検出方法、及び、本発明の感作
標識担体と、該担体を用いて抗原抗体反応を行うための
試薬と、標識物質の活性を検出するための試薬とを具備
してなる検体中の抗原又は抗体を検出するための検出用
検査セットを提供する。

【００１１】以下、本発明につき更に詳しく説明する
と、本発明において、抗原とは（ａ）動物に抗体と感作
リンパ球をつくらせるきっかけを与える物質であって、
（ｂ）つくられた抗体や感作リンパ球と特異的に反応す
る物質をいう。この場合、抗原には上記（ａ）と（ｂ）
の２つの働きを共に持っている完全抗原（例えばタンパ
ク質、微生物等）と、（ａ）は欠くが（ｂ）の働きを有
する不完全抗原（ハプテン）とがある。なお、抗原分子
の一部の化学構造中、抗原の特異性を決定している部分
をエピトープ（抗原決定基）という。

【００１２】抗体とは、免疫グロブリンとも呼ばれ、抗
原刺激により産生され、また免疫学的特異性をもって抗
原と結合する蛋白をいい、抗体の大部分はγ−グロブリ
ン分画に含まれる。

【００１３】抗原抗体反応とは、抗原と抗体との間に生
ずる分子間の結合反応であり、高い特異性を持ってい
る。

【００１４】本発明の標識物質としては、一般に放射性
物質又は非放射性物質から選ばれる１種又は２種以上の
物質を用いることができるが、特に、酵素を用いること
が好適である。酵素は特定の基質とのみ反応し（基質特
異性）、酵素と基質を組み合わせることにより生ずる発
色等により簡易かつ特異的に測定対象を検出できるから
である。なお、酵素以外の標識物質としては、放射性物
質や非放射性物質を用いることができるが、好ましくは
非放射性物質が用いられる。ここで、放射性物質として
は¹²⁵Ｉ、¹³¹Ｉ、³Ｈ、¹⁴Ｃ等が挙げられる。また、非
放射性の標識物質としては直接標識可能なものとして発
光物質、例えばフルオレッセイン誘導体（フルオレセイ
ン・イソチオシアネート（ＦＩＴＣ）等）、ローダミン
及びその誘導体（テトラメチルローダミンイソチオシア
ネート（ＴＲＩＴＣ）等）、化学発光物質（例えばアク
リジン等）や遅延蛍光を発する物質等が挙げられる。

【００１５】本発明において酵素とは、化学反応を触媒
する蛋白質性高分子であり、生体に由来するネイティブ
な酵素に限らず、遺伝子改変した酵素、酵素活性を有す
る酵素断片も含まれる。具体的には、通常の酵素免疫測
定法（ＥＩＡ）で使用される酵素が利用可能であり、ア
ルカリ性ホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、β−Ｄ−
ガラクトシダーゼ、ウレアーゼ、グルコース−６−リン
酸脱水素酵素、アルコール脱水素酵素等が利用できる
が、これらに制限されるものではない。

【００１６】酵素によって発色或いは蛍光・発光する基
質としては、使用する条件下に応じて水溶性、水不溶性
基質を適宜選択することができる。例えば酵素がペルオ
キシダーゼの場合、基質として４−クロロ−１−ナフト
ール、３，３’−ジアミノベンジン、１，２−フェニレ
ンジアミン等のほか、市販キットの２，２’−アジノ−
ビス（３−エチルベンツチアゾリン−６−スルホン酸
（ＡＢＴＳ）、ＴＭＢＺ、ＯＰＤ等、酵素がアルカリ性
ホスファターゼの場合、基質としてｐ−ニトロフェニル
リン酸ナトリウムやそのナトリウム塩、フェノールフタ
レインリン酸ナトリウム塩、４−メチルウンベリフェリ
ルフォスフェート、グリセロール−３−ホスフェートや
ＮＡＤＰ⁺をルシゲニンと共に、酵素がβ−Ｄ−ガラク
トシダーゼの場合、基質としてｐ−ニトロフェニル−β
−Ｄ−ガラクトピラノシド、４−メチルウンベリフェリ
ル−β−Ｄ−ガラクトシド等、酵素がグルコース−６−
リン酸脱水素酵素の場合、基質としてグルコース、ＮＡ
Ｄ等、また酵素がアルコール脱水素酵素である場合、基
質としてエタノール、ＮＡＤ等を用いることができる。

【００１７】本発明において担体とは、それ自身は酵素
免疫測定法（ＥＩＡ）における標識とならずに、抗体と
酵素、或いは抗原と酵素との間に介在するスペーサーと
して存在し、単位抗原分子或いは単位抗体分子当りの標
識物質の数を大幅に増やし抗原抗体反応の検出感度を大
幅に上昇させる役割を果たすものである。ここで、素材
としては、細胞、オルガネラ、タンパク質、アミノ酸ポ
リマー、プラスチック、多糖、脂質、リポゾーム等が広
く使用できる。具体的にはラテックス粒子、ポリ（グル
タミン酸−リジン）、ウサギ赤血球等が用いられる。

【００１８】この場合、担体が大きいほど抗原抗体反応
検出時のシグナルの増幅効果が大きくなるが、大きすぎ
ると高比重の担体ではそれ自身の重さで抗原抗体複合物
が洗浄等により解離しやすくなったり、他の抗原抗体反
応を立体障害的に妨害することもある。従って、担体の
至適な大きさについては担体の比重によっても異なる
が、その上限は長径１０００μｍ以下、好ましくは長径
１００μｍ以下の担体が好適である。

【００１９】抗原又は抗体と標識物質とを担体と一体化
する方法は、物理的吸着法及び化学的結合法の中から、
担体や酵素の構造的特徴に合わせて適宜選択できる。こ
の場合、物理的吸着法としては、抗原又は抗体、酵素、
担体の性状に合わせて、疎水性結合やイオン結合を形成
しやすい吸着方法を選択する。化学的結合法としては、
抗原又は抗体、酵素、担体の各々が有する官能基の種類
に応じて、混合酸無水化物法、カルボジイミド法、コハ
ク酸イミドエステル法、過ヨウ素酸塩−水素化ホウ素
法、グルタルアルデヒド法、ジマレイミド法、イソチオ
シアネート法、ｐ−ベンゾキノン法、ピリジルジスルフ
ィド法、タンニン酸法等の公知の結合方法の中から適当
なものを選択する。更に、ビオチン−アビジン、糖−レ
クチンのような特異的結合を介した方法も利用可能であ
る。

【００２０】物理的吸着法で標識を導入する場合は、標
識後の担体をブロッキング処理をする必要がある。ブロ
ッキング処理の方法は、通常のラテックスの感作や酵素
抗体法で行われているブロッキング処理と同じ方法が可
能であり、アルブミン、ウシ血清アルブミン（ＢＳ
Ａ）、ゼラチン、スキムミルク系ブロッキング剤等のタ
ンパク質やポリリジンのようなアミノ酸ポリマー系物質
を常法の通りに使用すればよい。化学的結合法により標
識を導入する場合ではブロッキング処理は必ずしも必要
ではないが、官能基間の相互作用が抗原抗体反応を妨害
する可能性がある場合は、残存している官能基を無効に
する操作を追加する必要がある。

【００２１】担体に標識物質を導入する操作と、抗原或
いは抗体で担体を感作する操作の順序については、１）
感作をしてから標識化する、２）標識化してから感作を
する、３）標識化と感作を同時に行う、の３種類のプロ
セスから適宜選択できる。標識物質、担体、抗原或いは
抗体の構造的特徴をよく勘案し、標識化と感作の双方が
効率的に進行できる手順を選択することが好ましい。

【００２２】本発明で使用する特異抗体としては、ポリ
クローン抗体又はモノクローン抗体のいずれも好適に使
用することができる。ここで、ポリクローン抗体とは、
動物に免疫して得られるもので、多種類の抗体産生細胞
集団により産生された抗体であり、抗原分子上の種々の
エピトープをそれぞれ特異的に認識する抗体が混在して
いる。これに対して、モノクローン抗体は１個のエピト
ープにだけ特異的に結合する１個のＢ細胞から細胞分裂
によって生じた均一な細胞集団により産生された抗体で
あり、特異性のみならず免疫グロブリンの型、親和力も
均一な抗体である。モノクローン抗体は、その反応特異
性がよく特定できるという点では優れた試薬であるが、
多数の異なるエピトープを介して抗原分子全体を認識す
るポリクローン抗体に比べ、分子に対する特異性という
点では必ずしも特異性が高いわけではない。従って、測
定対象の構造的特徴等を考慮して適宜選択することが好
ましい。

【００２３】特異抗体の純度は抗血清程度のものでも使
用できるが、抗体の純度が高いほど精度の高い測定が可
能となるので、ヒトＩｇＧのほとんどのサブクラスに特
異的に結合するプロテインＡやプロテインＧを結合した
アフィニティーカラム、更には抗原を結合させたアフィ
ニティーカラムなど当分野で繁用される方法で有効かつ
特異的に抗体を精製する方法を用いるとさらに良い。ま
た、抗体分子をペプシンで分解して得られるＦ（ａｂ
´）₂断片や同じくパパインで分解して得られるＦａｂ
断片のように、抗原結合能を有する特異抗体由来のフラ
グメントも特異抗体と同様に使用できる。

【００２４】また、測定の対象によっては、二種類以上
の特異抗体又は抗原を組み合わせて一回の測定の中で併
用することにより、特異性の高い高感度の測定を行うこ
とができる。

【００２５】本発明による測定方法では、抗原を検出す
る場合は、特異抗体及び酵素が一体化した担体を感作標
識担体として、特異抗体を検出する場合は、抗原及び酵
素が一体化した担体を感作標識担体として、それぞれ使
用することができる。

【００２６】抗原抗体反応を発色や発光で定性的に、或
いは半定量的に検出する場合には、基準となる色見本を
陽性対照と共に提供すると試験結果を容易に判定するこ
とができる。これに対して、定量的に検出する場合は、
抗原抗体反応を行い、測定対象と反応した担体に結合又
は吸着した担体の標識物質である酵素が発色・蛍光基質
を分解することにより生じる発色或いは発光を分光光度
計又は蛍光光度計を用いてその強度を測定することによ
り、測定対象を定量的に検出することができる。また、
標識物質が放射性物質であればそのまま活性を測定すれ
ばよく、標識物質が蛍光性物質であれば、そのまま蛍光
光度計を用いて強度を測定すればよい。

【００２７】抗原抗体反応の実施条件は、一般に当分野
で通常行われている実験条件を採用することができる。
例えば、洗浄液としては界面活性剤を含有する塩類緩衝
液等を使用する。標識用化合物の濃度は、その力価に合
わせて適当な緩衝液で至適濃度に希釈する。ブロッキン
グが必要な場合は、界面活性剤やブロッキング剤を含有
する塩類緩衝液を使用できる。また、抗原抗体反応を行
なう時間、温度も当分野で周知の方法を採用できる。こ
れらの実験条件はバックグラウンドの高さに大きく影響
し、結果として診断の正診率にも影響するので、個々の
抗原抗体反応に適した条件を定めることが好ましい。

【００２８】次に、本発明の検出用検査セットは、本発
明の感作標識担体と、該担体を用いて抗原抗体反応を行
なうための試薬として該感作標識化担体を溶解又は懸濁
するための緩衝液、標識物質の活性、例えば酵素活性を
検出するための試薬類、余剰の試薬を除去するための洗
浄液を含む。ここで、酵素活性を検出するための試薬類
としては、標識として用いた酵素の基質、補酵素、基質
や補酵素を溶解するための緩衝液、反応停止剤、反応停
止剤の溶解液等が含まれる。更に、必要に応じてブロッ
キング剤、陽性対照、陰性対照、検体採取用器具、検体
保存用器具、検体保存用溶液、検体前処理剤、抗原抽出
用溶液、抗原抗体反応用の器具や容器、フィルター等の
固液分離用装置等を適宜組み合わせて検査セットとする
ことができる。この検査セットによれば、操作に熟練し
ない場合でも安定した試験成績を修めることが可能とな
る。なお、セット化に当っては、凍結乾燥等のドライ化
で試薬の長期保存が可能となるが、ドライ化が困難な場
合には、試薬の性状に合わせて、保存剤、防腐剤等を適
宜使用することにより保存期間を長くすることができ
る。

【００２９】本発明の検出用検査セットは、特に臨床検
査分野において、感染症の早期診断、ホルモンや薬物等
の微量物質の検出や定量、移植及び輸血適合性の診断等
に広く応用できるものであり、研究用試薬や理科教材等
としても広く利用可能である。

【００３０】また、本発明の検出用検査セットを公知の
酵素免疫測定用の自動分析装置に応用することで、大量
の検体を迅速に、人手を介さずに検出することもでき
る。

【００３１】

【発明の効果】本発明によれば、測定対象の抗原或いは
特異抗体の検出感度を著しく高めることが可能となり、
抗原抗体反応を利用した診断において正診率が高くな
り、診断の正確さを著しく向上させることができる。ま
た、本発明の検出方法によれば、測定対象が超微量であ
る場合でも確実に検出することができる。更に、本発明
の検出用検査セットによれば、上記本発明の検出方法に
したがって検体中の抗原又は抗体等の検査を確実かつ簡
便に実施することができ、本発明の検出用検査セットを
自動分析装置に用いると人手を介さずに大量の検体を迅
速に処理することができる。

【００３２】

【実施例】以下、実施例と比較例を示し、本発明を具体
的に説明するが、本発明は下記の実施例に制限されるも
のではない。なお、蛋白質、ポリペプチドの定量法にお
いて特に記述のない場合は、２８０ｎｍにおける吸光度
測定結果からその濃度を算出した。

【００３３】［実施例１］下記方法により抗原、特異抗
体、感作標識担体の調製及び抗原抗体反応の検出を行っ
た。以下、特に記述のない操作は室温で行った。特異抗体の調製 エドワード ディ サンガーらの方法（Ｅｄｗａｒｄ
Ｄ．Ｚａｎｄｅｒｓｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏ
ｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ（１９８１），１２２，
２１７−２２５）に準じ、ストレプトコッカス・ミュー
タンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ、
以下、Ｓ．ｍｕｔａｎｓと記す。）ＮＣＴＣ１０４４９
株（血清型ｃ、以下、Ｓ．ｍｕｔａｎｓ １０４４９と
記す。）の培養液上清より、硫酸アンモニウム沈殿処理
後、ＤＥＡＥ−セルロースカラム、その後セファロース
（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）−６Ｂカラムの操作により蛋白
質抗原ｃを得た。

【００３４】常法に従いアジュバント（免疫助成剤）と
共に蛋白質抗原ｃをウマに投与し、抗体価の上昇を確認
後に採血して抗血清を分離した。この抗血清に対して３
３％飽和となるよう硫酸アンモニウムを添加し、４℃で
２回塩析し、１０ｍＭリン酸緩衝化生理食塩水（ｐＨ
７．４、以下、ＰＢＳと記す。）に溶解した後、ＰＢＳ
に対して４℃で一晩透析し、ＰＢＳを用いて蛋白質濃度
が１０ｍｇ／ｍｌの特異抗体溶液を調製した。

【００３５】検体溶液（菌懸濁液）の調製 Ｓ．ｍｕｔａｎｓ １０４４９をブレイン・ハート・イ
ンヒュージョン培地（以下、ＢＨＩ培地と記す。）を用
いて３７℃で一晩培養し、ＢＨＩ培地で５５０ｎｍの吸
光度（Ａ₅₅₀）が０．３となるように希釈した。この菌
懸濁液をＢＨＩ培地で段階的に１０倍希釈して検体溶液
とした。対照としてはＢＨＩ培地のみのものを用いた。
なお、ミティス・サリバリウス寒天培地で生菌数をチェ
ックした結果より、Ａ₅₅₀＝０．３の菌懸濁液は約１×
１０⁹ｃｆｕ／ｍｌに相当することがわかった。

【００３６】感作標識担体の調製 １．ラテックス粒子の感作 １）ラテックス懸濁液（日本合成ゴム（株）、ＩＭＭＵ
ＴＥＸ Ｇ２８０１）１０μｌと２μｇ／μｌとなるよ
うに１００ｍＭグリシン緩衝化生理食塩水（ｐＨ８．
２、以下、ＧＢＳと記す。）に溶解した特異抗体溶液１
０μｌとをチューブに加え、ＧＢＳで全容量５００μｌ
とした。この溶液をローテーターで回転させながら、３
７℃で２時間処理した（感作ラテックス）。 ２）遠心分離により未吸着の特異抗体を除き、上記感作
ラテックスをＰＢＳで３回洗浄した後、１ｍＭ塩化マグ
ネシウムと０．１ｍＭ硫酸亜鉛を添加したＧＢＳ（以
下、Ｍｇ−Ｚｎ−ＧＢＳと記す。）１００μｌ中に懸濁
した（感作ラテックス溶液）。 ２．感作ラテックスの標識化、ブロッキング １）上記感作ラテックス溶液１００μｌにアルカリ性ホ
スファターゼ懸濁液（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ
Ｃｏｍｐａｎｙ社、Ｐ５５２１）１０μｌを添加し、ロ
ーテーターでゆっくり回転させながら、４℃で一晩処理
した（感作標識ラテックス）。 ２）遠心分離により感作標識ラテックスを回収した後、
Ｍｇ−Ｚｎ−ＧＢＳによる洗浄を５回行ない、１％ウシ
血清アルブミン（以下、ＢＳＡと記す。）含有Ｍｇ−Ｚ
ｎ−ＧＢＳ５００μｌ中に懸濁し、ローテーターでゆっ
くり回転させながら、４℃で一晩処理した（ブロッキン
グ）。 ３）遠心分離でラテックスを回収した後、０．１％ＢＳ
Ａ添加Ｍｇ−Ｚｎ−ＧＢＳで３回洗浄し、同溶液１００
０μｌ中に懸濁し、使用時まで４℃で保存した。なお、
長期保存用として、アジ化ナトリウムを最終濃度で０．
０１％となるように添加した（感作標識ラテックス懸濁
液）。

【００３７】抗原抗体反応の検出 １）０．５ｃｍ×４ｃｍに切ったフィルター（アトー
社、ＡＥ−６６６０クリアブロット・Ｐ膜）をマニュア
ルに従って、メタノール、ＰＢＳで前処理し、先端の
０．５ｃｍ×０．５ｃｍの部分を残して、パラフィンで
被覆した。 ２）フィルターを検体中に１０分間浸漬し、０．５％Ｔ
ｗｅｅｎ２０添加ＰＢＳ（以下、洗浄液と記す。）で３
回洗浄した。 ３）１％ＢＳＡ添加Ｍｇ−Ｚｎ−ＧＢＳ中にフィルター
を１０分間浸漬し、洗浄液で３回洗浄した。 ４）前述した方法で調製した感作標識ラテックス懸濁液
中にフィルターを５分間浸漬し、洗浄液で３回洗浄し
た。 ５）基質溶液（組成：１５ｍＭｐ−ニトロフェニルリン
酸、０．５ｍＭ塩化マグネシウム含有１Ｍジエタノール
アミン緩衝液（ｐＨ９．８））中にフィルターを２０分
浸漬した後、基質溶液の色調の変化を肉眼で観察した。
発色の見られた検体の最低濃度を検出限界とした。結果
を表１に示す。

【００３８】［比較例１］特異抗体の調製 実施例１で調製した抗体を使用した。検体溶液（菌懸濁液）の調製 実施例１で調製した検体を使用した。抗原抗体反応の検出 抗原に結合した特異抗体を検出するために、市販品のア
ルカリ性ホスファターゼ標識抗ウマＩｇＧ（ｈｅａｖｙ
ｃｈａｉｎ：Ｈ鎖＋ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ：Ｌ鎖）
ヤギ抗体（Ｂｅｔｈｙｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ
Ｉｎｃ．社、Ａ７０−１０６ＡＰ）を用いて実施例１の
抗原抗体反応の検出と同様に行った。なお、抗体濃度と
して１μｇ／ｍｌで使用した。実施例１と同様に検出限
界を求めた。結果を表１に示す。

【００３９】

【表１】

【００４０】表１の結果から、本発明の感作標識担体を
用いた抗原抗体反応では、標識抗体を用いた場合に比べ
１００倍高い検出限界となり、より低濃度での抗原の検
出が可能となった。

【００４１】［実施例２］下記方法により抗原、特異抗
体、感作標識担体の調製及び抗原抗体反応の検出を行っ
た。以下、特に記述のない操作は室温で行った。特異抗体の調製 実施例１で調製した蛋白質抗原ｃとＣＮＢｒ活性化セフ
ァロース４Ｂを用い、常法に従って蛋白質抗原ｃ結合ア
フィニティーカラムを調製した。実施例１で得た特異抗
体溶液を該アフィニティーカラムを通し、結合画分を
０．２Ｍグリシン−塩酸緩衝液（ｐＨ２．５）で溶出
後、直ちにトリスを加えてｐＨ８．５に調整した。その
一部を５ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に対して４℃
で一晩透析後、セントリカット Ｕ−５０（倉敷紡績
（株））で濃縮を行ない、同緩衝液でアフィニティー精
製特異抗体溶液（１０ｍｇ／ｍｌ）を調製した。検体溶液（菌懸濁液）の調製 検体溶液の調製を実施例１と同様に行った。

【００４２】感作標識担体の調製 １．ポリ（グルタミン酸−リジン）の標識化 １）ポリ（グルタミン酸−リジン）（Ｓｉｇｍａ Ｃｈ
ｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ社、Ｐ０６５０、以下、
担体と記す。）２０ｍｇを５０ｍＭ炭酸緩衝液（ｐＨ
９．５）４ｍｌに溶解し、これに同緩衝液で調製したフ
ルオレセイン・イソチオシアネート（以下、ＦＩＴＣと
記す。）溶液（１０ｍｇ／ｍｌ）２０μｌを添加し、４
℃で３時間撹拌した。この溶液を１０ｍＭリン酸緩衝液
（ｐＨ７．４）で平衡化したセファデックス（Ｓｅｐｈ
ａｄｅｘ）Ｇ−２５カラムに通し、未結合ＦＩＴＣを除
いた。続いて、同緩衝液で平衡化したＤＥＡＥ−セルロ
ースカラムを通し、同緩衝液で良く洗った後、ＰＢＳで
溶出してＦＩＴＣ結合担体を回収した。次に、１０ｍＭ
リン酸緩衝液（ｐＨ６．０）に対し４℃で一晩透析し、
セントリカット Ｕ−５０で濃縮し、同緩衝液で担体と
して５ｍｇ／ｍｌとなるように濃度を調整した（ＦＩＴ
Ｃ結合担体溶液）。なお、ビュレット法で担体量を、ケ
イ光強度でＦＩＴＣ量をそれぞれ測定して求めた。以下
の操作では、ＦＩＴＣ量から担体量を算出した。 ２）ＦＩＴＣ結合担体溶液４ｍｌをとり、２００ｍＭ塩
化カリウムと１０ｍＭＮ−ヒドロキシスクシンイミドを
含有する１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）１０ｍ
ｌ、リン酸緩衝液（ｐＨ６．０）６ｍｌを添加し、塩酸
１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カル
ボジイミド１６ｍｇを添加し、２０分間撹拌した後、２
−メルカプトエタノール２８μｌを添加した。 ３）１００ｍＭ塩化カリウム含有１００ｍＭリン酸緩衝
液（ｐＨ６．０）に溶解した１０ｍｇ／ｍｌ西洋ワサビ
由来ペルオキシダーゼ（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ
Ｃｏｍｐａｎｙ社、Ｐ６７８２）溶液３ｍｌを添加
し、２時間撹拌した後、５０ｍＭ炭酸緩衝液（ｐＨ９．
５）に対して４℃で一晩透析し、セントリカット Ｕ−
５０で濃縮し、同緩衝液で担体として５ｍｇ／ｍｌとな
るように標識担体溶液を調製した。 ２．標識担体の感作 １）上記アフィニティー精製特異抗体溶液１ｍｌに、１
００ｍＭ過ヨウ素酸カリウム水溶液２００μｌを添加し
て２０分間撹拌した後、エチレングリコール１００μｌ
を添加し５分間反応させた。その後、１ｍＭ酢酸緩衝液
（ｐＨ４．４）に対して、４℃で一晩透析した。 ２）透析膜内液を回収し、５００ｍＭ炭酸緩衝液（ｐＨ
９．５）を用いてｐＨ９．５に調整した後、１．で調製
した標識担体溶液２ｍｌを添加し、２時間反応させた。 ３）４ｍｇ／ｍｌ水素化ホウ素ナトリウム水溶液２００
μｌを添加し、氷水浴中で２時間撹拌した後、ＰＢＳに
対して４℃で一晩透析した。 ４）ＰＢＳで平衡化したセファクリル（Ｓｅｐｈａｃｒ
ｙｌ） Ｓ−４００カラムでゲルろ過し、アフィニティ
ー精製特異抗体結合−標識担体（以下、感作標識担体と
記す。）画分を得た。 ５）セントリカット Ｕ−５０で濃縮後、１ｍｇ／ｍｌ
のアフィニティー精製特異抗体溶液のＳ．ｍｕｔａｎｓ
１０４４９菌体に対する凝集活性と同等の凝集活性を
有するように、ＰＢＳで感作標識担体画分を希釈し、使
用時まで４℃で保存した。

【００４３】抗原抗体反応の検出 １）９６マルチウェルプレートに検体溶液１００μｌを
加えて１５分放置後、実施例１と同様に洗浄した。 ２）ウェル内容物を除き、１％ＢＳＡを添加した洗浄液
（以下、ブロッキング溶液と記す。）でウェルを満た
し、１５分放置した。 ３）同様に洗浄し、ブロッキング溶液で希釈した感作標
識担体（特異抗体として約１μｇ／ｍｌ相当の力価）を
添加し、１５分放置した。 ４）同様に洗浄し、市販のペルオキシダーゼ用発色キッ
ト（（株）タウンズ、ＭＬ−１１１０Ａ）をマニュアル
に従い調製し、１００μｌを添加して２０分放置後、発
色を肉眼で観察した。実施例１と同様に検出限界を求め
た。結果を表２に示す。

【００４４】［比較例２］特異抗体の調製 実施例１で調製した抗体を使用した。検体溶液（菌懸濁液）の調製 実施例１で調製した検体を使用した。抗原抗体反応の検出 特異抗体を検出するために、市販品のペルオキシダーゼ
標識抗ウマＩｇＧ（ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ：Ｈ鎖＋ｌ
ｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ：Ｌ鎖）ヤギ抗体（Ｂｅｔｈｙｌ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．社、Ａ７０−１
０６Ｐ）を用いて実施例１の抗原抗体反応の検出と同様
に行った。抗体濃度として１μｇ／ｍｌで使用した。実
施例１と同様に検出限界を求めた。結果を表２に示す。

【００４５】

【表２】

【００４６】表２の結果から、本発明の感作標識担体を
用いた抗原抗体反応では、標識抗体を用いた場合に比べ
１０倍高い検出限界となり、より低濃度での抗原の検出
が可能となった。

【００４７】［実施例３］下記方法により抗原と特異抗
体、感作標識担体の調製を行った。以下、特に記述のな
い操作は室温で行った。特異抗体の調製 １）ストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔ
ｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ）ＯＭＺ１７５株（血清
型ｆ）菌体を用い、ハマダ（Ｈａｍａｄａ）らの方法
（Ｈａｍａｄａ Ｓ． ｅｔ ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｂｉ
ａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２７，２３７：１９８３）に
準じてオートクレーブ処理後、ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｄ
ｅｘ Ａ−２５カラム、その後セファクリル（Ｓｅｐｈ
ａｃｒｙｌ）Ｓ３００カラムの各ステップにより調製し
た血清型多糖抗原を用い、常法の通りにアジュバントと
共にウサギを免疫して得た抗血清を、実施例１と同様に
して硫酸アンモニウム沈殿画分として得た。続いてメー
カーのマニュアルに従ってプロテインＧ−アフィニティ
ーカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＬＫＢ Ｂｉｏｔｅｃ
ｈｎｏｌｏｇｙ 社、１７−０６１８−０１）を用い、
免疫グロブリンＧ画分を得た。 ２）エポキシ（Ｅｐｏｘｙ）活性化セファロース（Ｓｅ
ｐｈａｒｏｓｅ） ６Ｂを常法に従って用い、血清型多
糖抗原結合アフィニティーカラムを調製した。該カラム
に上記免疫グロブリン画分を通し、実施例２の場合と同
様にして、アフィニティー精製抗体を調製した。アフィ
ニティー精製抗体は、ＰＢＳに対して４℃で一晩透析
し、セントリカット・ミニ Ｕ−５０で濃縮し、抗体濃
度が１０ｍｇ／ｍｌとなるように濃度を調整した。

【００４８】感作標識担体の調製 １．ポリ（グルタミン酸−リジン）の標識化 実施例２と同様にして、ポリ（グルタミン酸−リジン）
（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ社、
Ｐ０６５０、以下、担体と記す。）２０ｍｇを用い、西
洋ワサビ由来ペルオキシダーゼ標識担体溶液（担体とし
て５ｍｇ／ｍｌ）を得た。但し、担体量を測定するため
のＦＩＴＣ標識の導入ステップは実施しなかった。 ２．感作標識担体の調製 １）アフィニティー精製特異抗体溶液２ｍｌに１．で調
製した酵素標識担体溶液２ｍｌを添加し、静かに撹拌し
ながら１％グルタルアルデヒド水溶液１００μｌを滴下
し、２時間反応させた。 ２）ＰＢＳに対して４℃で一晩透析し、ＰＢＳで平衡化
したセファクリル（Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ） Ｓ−４００
カラムでゲルろ過し、アフィニティー精製特異抗体結合
−標識担体（以下、感作標識担体と記す。）画分を得
た。 ３）１ｍｇ／ｍｌのアフィニティー精製特異抗体溶液の
ストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃ
ｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ）ＯＭＺ１７５株に対する菌
体凝集活性と同等の凝集活性を有するように、ＰＢＳで
感作標識担体画分を希釈し、使用時まで４℃で保存し
た。

【００４９】［実施例４］下記方法により抗原と特異抗
体、感作標識担体の調製を行った。以下、特に記述のな
い操作は室温で行った。特異抗体の調製 ハマダ（Ｈａｍａｄａ）らの方法（Ｈａｍａｄａ Ｓ．
ｅｔ ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｉｍｍｕｎｏ
ｌ．，２７，２３７：１９８３）に準じて調製したスト
レプトコッカス・ソブリヌス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃ
ｕｓ ｓｏｂｒｉｎｕｓ）６７１５株（血清型ｇ）由来
の血清型多糖抗原を用い、実施例１と同様にしてウサギ
を免疫して得た特異抗体の硫酸アンモニウム沈殿画分を
得た。続いて、実施例３と同様にして免疫グロブリンＧ
画分を得た後、ＧＢＳに対して４℃で一晩透析し、セン
トリカット Ｕ−５０による濃縮を行ない、特異抗体溶
液（抗体として１０ｍｇ／ｍｌ）を得た。

【００５０】感作標識担体の調製 １．ウサギ赤血球の感作 １）ウサギ血液１ｍｌ分から得た赤血球（以下、担体と
記す。）をＰＢＳで３回洗浄し、赤血球ペレットを得
た。 ２）ＰＢＳ２ｍｌ、ＰＢＳで調製した０．０５ｍｇ／ｍ
ｌタンニン酸溶液３ｍｌを添加し、３７℃でときどき撹
拌しながら２０分間反応させた後、ＰＢＳで同様に洗浄
しタンニン酸処理赤血球ペレットを得た。 ３）ＰＢＳ２ｍｌ、特異抗体溶液（２０μｇ／ｍｌとな
るようにＰＢＳで希釈したもの）３ｍｌを３７℃でとき
どき撹拌しながら３時間反応させた後、ＰＢＳで同様に
洗浄してから同緩衝液１ｍｌ中に懸濁させ、感作担体懸
濁液を得た。 ２．感作担体の標識、ブロッキング １）感作担体懸濁液１ｍｌにＰＢＳで調製した５ｍｇ／
ｍｌウレアーゼ（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ
ｍｐａｎｙ社、Ｕ２１２５）溶液１ｍｌを添加し、静か
に撹拌しながら１％グルタルアルデヒド水溶液２００μ
ｌを滴下し、２時間反応させ、感作標識担体懸濁液を得
た。 ２）感作標識担体懸濁液を遠心分離し、感作標識担体ペ
レットを回収し、ＰＢＳで３回洗浄し、１％ＢＳＡ添加
ＰＢＳ２ｍｌ中に再懸濁し、４℃で一晩穏やかに撹拌し
た（ブロッキング）。 ３）同様に洗浄し、０．１％ＢＳＡ添加ＰＢＳ１ｍｌに
再懸濁し、使用まで４℃で保存した。

【００５１】［実施例５］下記方法により抗原と特異抗
体、感作標識担体の調製を行った。以下、特に記述のな
い操作は室温で行った。特異抗体の調製 特開昭６０−７３４６３号公報に記載したバクテロイデ
ス・ジンジバリス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｇｉｎｇ
ｉｖａｌｉｓ）３８１株−現在の分類に従うと、ポルフ
ィロモナス・ジンジバリス（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａ
ｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）３８１株−に対するモノク
ローン抗体Ｎｏ．１を産生するハイブリドーマ株を使用
した。

【００５２】同ハイブリドーマ株をマウス腹腔内に投与
して得た腹水の５０％硫安沈殿画分を、本発明の実施例
３記載のプロテインＧカラムで同様に処理し、特異抗体
を得た。１００ｍＭ塩化カリウム含有１００ｍＭリン酸
緩衝液（ｐＨ６．０）に対して４℃で一晩透析し、セン
トリカット Ｕ−５０で濃縮し、同緩衝液を用いて抗体
溶液（抗体として１０ｍｇ／ｍｌ）を調製した

【００５３】感作標識担体の調製 ラテックス粒子の感作、標識 １）１００ｍＭ塩化カリウムと５ｍＭＮ−ヒドロキシス
クシンイミドを含有する１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ
６．０）５ｍｌにラテックス懸濁液（日本合成ゴム
（株）、ＩＭＭＵＴＥＸ Ｇ０５０１）２０μｌを添加
し、さらに塩酸１−エチル−３−（３−ジメチルアミノ
プロピル）カルボジイミド４ｍｇを添加し、２０分間撹
拌した後、２−メルカプトエタノール７μｌを添加した
（ラテックス溶液）。 ２）１）の反応溶液中に上記モノクローン抗体溶液２０
μｌと１００ｍＭ塩化カリウム含有１００ｍＭリン酸緩
衝液（ｐＨ６．０）に溶解した１０ｍｇ／ｍｌ西洋ワサ
ビ由来ペルオキシダーゼ溶液１００μｌとを速やかに添
加して２時間撹拌した後、遠心分離を行ないラテックス
のペレットを回収した。 ３）１．５Ｍ塩化ナトリウム含有１０ｍＭリン酸緩衝液
（ｐＨ７．４）を用いてラテックスのペレットを再懸濁
し、遠心分離を３回繰り返して洗浄した後、ＰＢＳで同
様にして２回洗浄した。 ４）１％ＢＳＡ添加ＰＢＳで再懸濁し、３０分間ローテ
ーターでゆっくり回転させた後に同様にして２回洗浄
し、０．１％ＢＳＡ添加ＰＢＳ中にラテックスとして
０．５Ｗ／Ｖ％となるように懸濁し、４℃で保存した。

【００５４】［実施例６］下記方法により抗原と感作標
識担体の調製を行った。以下、特に記述のない操作は室
温で行った。抗原溶液の調製 実施例１で得た蛋白質抗原ｃを用い、ＧＢＳで１ｍｇ／
ｍｌ蛋白質抗原ｃ溶液を調製した。感作標識担体の調製 １．ラテックス粒子の抗原感作 １）ラテックス懸濁液（日本合成ゴム（株）、ＩＭＭＵ
ＴＥＸ Ｇ２１０１）５０μｌ及び上記抗原溶液５０μ
ｌとＧＢＳ４００μｌとをチューブに加え、ローテータ
ーでゆっくり撹拌しながら、３７℃で２時間処理した。 ２）遠心分離により未吸着の抗原を除き、抗原感作ラテ
ックスをＰＢＳで３回洗浄した後、ＧＢＳ２００μｌ中
に懸濁させた（抗原感作ラテックス懸濁液）。 ２．抗原感作ラテックスの標識化、ブロッキング １）ＧＢＳを用いて１０ｍｇ／ｍｌ西洋ワサビ由来ペル
オキシダーゼ溶液を調製し、その１００μｌを１．の抗
原感作ラテックス懸濁液２００μｌ中に添加して、ロー
テーターでゆっくり回転させながら４℃で一晩処理し
た。 ２）遠心分離によりラテックスを回収した後、ＧＢＳに
よる洗浄を５回行ない、１％ＢＳＡ添加ＰＢＳ５００μ
ｌ中に懸濁し、ローテーターでゆっくり回転させながら
４℃で一晩処理した。 ３）遠心分離でラテックスを回収した後、０．１％ＢＳ
Ａ添加ＰＢＳで３回洗浄し、同溶液中にラテックスとし
て０．５％Ｗ／Ｖとなるように懸濁し、使用時まで４℃
で保存した。

【００５５】［実施例７］下記方法により抗原、特異抗
体、感作標識担体の調製を行った。以下、特に記述のな
い操作は室温で行った。特異抗体の調製 ハマダらの方法（Ｈａｍａｄａ Ｓ． ｅｔ ａｌ．，
ＭｉｃｒｏｂｉａｌＩｍｍｕｎｏｌ．，２７，２３７：
１９８３）に準じて調製したストレプトコッカス・ミュ
ータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ）Ｍ
Ｔ８１４８株（血清型ｃ）由来の血清型多糖抗原を用
い、実施例３と同様にしてウサギ抗血清より免疫グロブ
リンＧ画分を得た。続いて、実施例３と同様にして調製
した血清型多糖抗原結合アフィニティーカラムを用い
て、アフィニティー精製抗体を得た。５ｍＭリン酸緩衝
液（ｐＨ７．０）中にアフィニティー精製特異抗体とし
て１０ｍｇ／ｍｌとなるように調製した。

【００５６】感作標識担体の調製 １．ポリ（グルタミン酸−リジン）の標識化 担体としてポリ（グルタミン酸−リジン）（Ｓｉｇｍａ
ＣｈｅｍｉｃａｌＣｏｍｐａｎｙ社、Ｐ０６５０）を
用い、実施例２と同様にして、カルボジイミド法により
西洋ワサビ由来ペルオキシダーゼ結合担体溶液（以下、
標識担体と記す。担体として５ｍｇ／ｍｌ含有）を得
た。 ２．標識担体の感作 １）実施例２と同様にして、アフィニティー精製特異抗
体を過ヨウ素酸カリウム／水素化ホウ素ナトリウム処理
した後、標識担体を添加して反応させ、同様にしてセフ
ァクリル（Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ） Ｓ−４００カラムに
より、アフィニティー精製特異抗体感作標識担体溶液を
得た。 ２）１ｍｇ／ｍｌのアフィニティー精製特異抗体溶液の
ストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃ
ｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ）ＭＴ８１４株に対する菌体凝集
活性と同等の凝集活性を有するように、ＰＢＳで感作標
識担体画分を希釈し、使用時まで４℃で保存した。

【００５７】［実施例８］下記方法により抗原と特異抗
体、感作標識担体の調製を行った。以下、特に記述のな
い操作は室温で行った。特異抗体の調製 特開平６−４３１６６号公報に記載した、ポルフィロモ
ナス・ジンジバリス（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇ
ｉｎｇｉｖａｌｉｓ）３８１株の菌体表層多糖に対する
ウサギ抗血清の硫酸アンモニウム沈殿画分を使用した。 １）実施例３と同様にして、硫酸アンモニウム沈澱画分
から免疫グロブリンＧ画分を得た。１００ｍＭ塩化ナト
リウム、２ｍＭエチレンジアミン四酢酸二ナトリウム
（以下、ＥＤＴＡと記す。）を含有する１００ｍＭ炭酸
緩衝液（ｐＨ４．５）に対して４℃で一晩透析した後、
セントリカット Ｕ−５０で濃縮し、同緩衝液を用いて
１０ｍｇ／ｍｌの特異抗体溶液を調製した。 ２）特異抗体溶液３ｍｌに、同緩衝液に溶解した１０ｍ
ｇ／ｍｌブタ胃由来ペプシン溶液１００μｌを添加し、
３７℃で１日反応させた。 ３）１Ｍリン酸一水素二ナトリウム水溶液でｐＨ７．０
に中和した後、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）で
平衡化したセファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）Ｇ−１
００カラムでゲルろ過した。 ４）Ｆ（ａｂ´）₂画分を回収後にセントリカット Ｕ
−１０（倉敷紡績（株））で濃縮し、Ｆ（ａｂ´）₂溶
液を得た（Ｆ（ａｂ´）₂として５ｍｇ／ｍｌ）。 ５）Ｆ（ａｂ´）₂溶液１ｍｌに１００ｍＭ２−メルカ
プトエチルアミン、１０ｍＭＥＤＴＡを含有する１０ｍ
Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）１００μｌを添加し、３
７℃で９０分静置した。 ６）２ｍＭＥＤＴＡを含有する１０ｍＭリン酸緩衝液
（ｐＨ６．０）で平衡化したセファデックス（Ｓｅｐｈ
ａｄｅｘ） Ｇ−１００カラムでゲルろ過し、Ｆａｂ´
画分を回収した。 ７）エポキシ（Ｅｐｏｘｙ）活性化セファロース（Ｓｅ
ｐｈａｒｏｓｅ） ６Ｂ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＬＫＢ
Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ 社、１７−０４８０−
０１）を用いて常法に従って菌体表層多糖結合アフィニ
ティーカラムを調製し、実施例３と同様にしてアフィニ
ティー精製Ｆａｂ´溶液を得た。 ８）２ｍＭＥＤＴＡを含有する１０ｍＭリン酸緩衝液
（ｐＨ６．０）に対して４℃で一晩透析し、セントリカ
ット Ｕ−１０で濃縮し、同緩衝液を用いてＦａｂ´溶
液（Ｆａｂ´として１０ｍｇ／ｍｌ）を得た。

【００５８】感作標識担体の調製 １．ポリ（グルタミン酸−リジン）の重合化 １）ポリ（グルタミン酸−リジン）（Ｓｉｇｍａ Ｃｈ
ｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ 社、Ｐ０６５０）を用
い、実施例２と同様にしてＦＩＴＣ結合ポリ（グルタミ
ン酸−リジン）溶液を調製した。１０ｍＭリン酸緩衝液
（ｐＨ６．０）で平衡化したセファクリル（Ｓｅｐｈａ
ｃｒｙｌ） Ｓ−４００カラムを通し、分子量が約２０
万から約３０万の画分を分取し、セントリカット Ｕ−
５０で濃縮後、同緩衝液を用いて担体として５ｍｇ／ｍ
ｌとした。 ２）担体溶液１０ｍｌ静かに撹拌しながら２％グルタル
アルデヒド水溶液４００μｌを滴下し、３時間反応させ
た。 ３）同緩衝液で平衡化したセファロース（Ｓｅｐｈａｒ
ｏｓｅ） ＣＬ−２Ｂカラムを通し、分子量が約１５０
万から約２００万の画分（以下、担体と記す。）を採取
し、セントリカット Ｕ−５０で濃縮し、同緩衝液を用
いて担体として１ｍｇ／ｍｌとした。 ２．メルカプトスクシニル化担体の調製 １）担体溶液４ｍｌに、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド
に溶解した６ｍｇ／ｍｌＳ−アセチルメルカプト無水コ
ハク酸溶液４００μｌを添加し、３０分反応させた。 ２）１００ｍＭＥＤＴＡ水溶液８０μｌ、１Ｍトリス−
塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）４００μｌ、１Ｍヒドロキシ
ルアミン−塩酸（ｐＨ７．０）４００μｌを添加し、３
０℃で５分間反応させた。 ３）前出のセファクリル（Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ） Ｓ−
４００カラムを通してメルカプトスクシニル化担体を回
収、セントリカット Ｕ−５０で濃縮後、同緩衝液でメ
ルカプトスクシニル化担体溶液（担体として２ｍｇ／ｍ
ｌ）を調製した。 ３．マレイミド化標識の調製 １）同緩衝液を用いて２ｍｇ／ｍｌβ−ガラクトシダー
ゼ（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ
社、Ｇ５６３５、以下標識と記す。）溶液を調製し、そ
の１０ｍｌにＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドに溶解した
５０ｍｇ／ｍｌのＮ，Ｎ’−ｏ−フェニレンジマレイミ
ド溶液５０μｌを添加し、３０℃で２０分間反応させ
た。 ２）１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）で平衡化した
セファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ） Ｇ−２５カラム
でゲルろ過し、セントリカット Ｕ−５０で濃縮し、マ
レイミド化標識溶液（標識として４ｍｇ／ｍｌ）を得
た。 ４．マレイミド化Ｆａｂ´の調製 １）Ｆａｂ´溶液２００μｌに１００ｍＭ２−メルカプ
トエチルアミン、１０ｍＭＥＤＴＡを含有する１００ｍ
Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）２０μｌを添加し、３７
℃で９０分間反応させた後、１００ｍＭ酢酸緩衝液（ｐ
Ｈ５．０）７００μｌを添加した。 ２）Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミドに溶解した５０ｍｇ
／ｍｌのＮ，Ｎ’−ｏ−フェニレンジマレイミド溶液５
０μｌを添加し、３０℃で２０分間反応させた。 ３）１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）で平衡化した
セファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ） Ｇ−２５カラム
を通し、セントリカット Ｕ−１０で濃縮し、同緩衝液
を用いてマレイミド化Ｆａｂ´溶液（Ｆａｂ´として２
ｍｇ／ｍｌ）を調製した。 ５．感作標識担体の調製 １）メルカプトスクシニル化担体溶液５００μｌにマレ
イミド化Ｆａｂ´溶液１５０μｌとマレイミド化標識溶
液２ｍｌを速やかに添加し、４℃で一晩静置した。 ２）特異抗体調製時に使用した血清型多糖抗原結合アフ
ィニティーカラムを通し、同様にして抗原結合画分を得
た。 ３）ＰＢＳに対して４℃で一晩透析し、セントリカット
Ｕ−５０で濃縮した。ＰＢＳを用いて、１ｍｇ／ｍｌ
のアフィニティー精製特異抗体溶液のポルフィロモナス
・ジンジバリス（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎ
ｇｉｖａｌｉｓ）３８１株に対する菌体凝集活性と同等
の凝集活性を有するように感作標識担体画分を希釈し、
使用時まで４℃で保存した。

【００５９】［実施例９］下記方法により抗原と特異抗
体、感作標識担体の調製を行った。以下、特に記述のな
い操作は室温で行った。特異抗体の調製 特開平６−４３１６６号公報に記載した、アクチノバチ
ルス・アクチノマイセテムコミタンス（Ａｃｔｉｎｏｂ
ａｃｉｌｌｕｓ ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｍｃｏｍｉ
ｔａｎｓ）Ｙ４株の菌体表層多糖に対するウサギ抗血清
の硫酸アンモニウム沈殿画分を使用した。

【００６０】実施例８と同様にして、プロテインＧ−ア
フィニティーカラム、菌体表層多糖結合アフィニティー
カラム、濃縮を行ない、アフィニティー精製Ｆａｂ´溶
液（Ｆａｂ´として１０ｍｇ／ｍｌ）を得た。

【００６１】感作標識担体の調製 １．ポリ（グルタミン酸−リジン）の重合化 １）実施例８と同様にして得たＦＩＴＣ結合重合化ポリ
（グルタミン酸−リジン）（以下、担体と記す。）溶液
（担体として１ｍｇ／ｍｌ）を使用した。 ２．ピリジルスルフィド化担体の調製 １）担体溶液２ｍｌに、１００ｍＭＥＤＴＡ水溶液１０
０μｌ、１００ｍＭ２−メルカプトエチルアミン２００
μｌを添加し、３７℃で９０分反応させた。 ２）Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミドに溶解した１００ｍ
ｇ／ｍｌの４，４´−ジチオジピリジン溶液２０μｌを
添加し、３０℃で１０分反応させた。 ３）１０ｍＭリン酸緩衝液で平衡化したセファロース
（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）ＣＬ−２Ｂカラムを通し、担体
画分を回収した。 ４）セントリカット Ｕ−５０で濃縮し、同緩衝液を用
いてピリジルスルフィド化担体溶液（担体として１ｍｇ
／ｍｌ相当）を調製した。 ３．感作標識担体の調製 １）ピリジルスルフィド化担体溶液１ｍｌにＦａｂ´溶
液５０μｌを添加し、続いて１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐ
Ｈ６．０）に溶解した２ｍｇ／ｍｌβ−ガラクトシダー
ゼ（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ
社、Ｇ５６３５、以下標識と記す。）溶液１０ｍｌを添
加し、４時間反応させた。 ２）同緩衝液で平衡化したセファロース（Ｓｅｐｈａｒ
ｏｓｅ） ＣＬ−２Ｂカラムを通し、感作標識担体画分
を回収した。 ３）ＰＢＳに対して４℃で一晩透析し、セントリカット
Ｕ−５０で濃縮した。 ４）１ｍｍｇ／ｍｌのアフィニティー精製特異抗体溶液
のアクチノバチルス・アクチノマイセテムコミタンス
（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｔｉｎｏｍｙｃ
ｅｔｅｍｃｏｍｉｔａｎｓ）Ｙ４株に対する菌体凝集活
性と同等の凝集活性を有するように、ＰＢＳを用いて感
作標識担体画分を希釈し、５％ＢＳＡ添加ＰＢＳを１／
１００容量添加し、使用時まで４℃で保存した。

【００６２】［実施例１０］下記内容からなるＳ．ｍｕ
ｔａｎｓの検出用検査セットを作成した。 １．パラフィン・ペレット ２．プラスチック・カップ ３．プラスチック・スポイト ４．反応用チューブ（抗Ｓ．ｍｕｔａｎｓ抗体をコーテ
ィングしたプラスチック・チューブ） 実施例７で調製した特異抗体溶液（抗体として５０μｇ
／ｍｌ）でポリスチレン製チューブの表面を処理した
後、ＢＳＡでブロッキング処理し、０．１％ＢＳＡ添加
ＰＢＳで満たしたもの。 ５．感作標識担体（実施例２で調製した感作標識担体の
凍結乾燥品） 抗体１０μｇとＢＳＡ５０μｇを含有する。使用時に溶
解液５ｍｌを加え、溶解後使用する。 ６．溶解液（感作標識担体の溶解液） ＰＢＳ ７．発色用試薬Ａ ５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０）中に１，
２−フェニレンジアミン（１ｍｇ／ｍｌ）とＢＳＡ（１
０μｇ／ｍｌ）を含有する。 ８．発色用試薬Ｂ １ｍｇ／ｍｌ過酸化水素水溶液 ９．陽性対照 下記所定のｃｆｕに相当するＳ．ｍｕｔａｎｓ懸濁液
を、ブラウン・ホジナイザー（Ｂ．Ｂｒａｕｎ Ｍｅｌ
ｓｕｎｇｅｎ ＡＧ．製，Ｔｙｐｅ８５３０２２）で処
理して得た上清のミリポアフィルターろ過液 １×１０²ｃｆｕ／ｍｌ、１×１０⁴ｃｆｕ／ｍｌ、１×
１０⁶ｃｆｕ／ｍｌ １０．洗浄液 ０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含有するＰＢＳ １１．反応停止液 ２Ｎ硫酸 １２．砂時計 １３．取扱説明書 １）パラフィン・ペレットを５分間噛んだ後、唾液をプ
ラスチック・カップに取る。 ２）プラスチック・スポイトで唾液を１ｍｌ取り、反応
用チューブの底の部分を加え、１０分放置する。陽性対
照も同様に操作し、被験唾液の結果と比較する。 ３）唾液を捨て、洗浄液で反応用チューブを３回洗浄す
る。 ４）プラスティック・スポイトで溶解液２ｍｌを取り、
感作標識担体を溶解し、その１ｍｌを反応用チューブ添
加し、１０分間放置する。 ５）３）と同様に洗浄する。 ６）発色用試薬Ａを１０滴を加え良く混ぜてから５分放
置した後、発色用試薬Ｂを２滴加えそのまま放置し、発
色の程度を観察する。 ７）発色を認めたら反応停止液を５滴加える。

【００６３】［実施例１１］下記内容からなるＳ．ｍｕ
ｔａｎｓの検出用検査セットを作成した。 １．滅菌つまようじ ２．プラスチック・カップ ３．プラスチック・スポイト ４．反応用チューブ（抗Ｓ．ｍｕｔａｎｓ抗体をコーテ
ィングしたプラスチック・チューブ） 実施例７で調製した多糖抗原をウマに免疫して得た特異
抗体溶液（抗原特異的免疫グロブリンとして５０μｇ／
ｍｌ）でポリスチレン製チューブの表面を処理した後、
ＢＳＡでブロッキング処理し、０．１％ＢＳＡ添加ＰＢ
Ｓで満たしたもの。 ５．感作標識担体（実施例７で調製した感作標識担体の
凍結乾燥品） 抗体１０μｇとＢＳＡ５０μｇを含有する。

【００６４】使用時に溶解液５ｍｌを加え、溶解後使用
する。 ６．溶解液（感作標識担体の溶解液） ＰＢＳ ７．発色用試薬Ａ ５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０）中に１，
２−フェニレンジアミン（１ｍｇ／ｍｌ）とＢＳＡ（１
０μｇ／ｍｌ）を含有する。 ８．発色用試薬Ｂ １ｍｇ／ｍｌ過酸化水素水溶液 ９．陽性対照 下記所定のｃｆｕに相当するＳ．ｍｕｔａｎｓ懸濁液の
凍結乾燥品 １×１０²ｃｆｕ、１×１０⁴ｃｆｕ、１×１０⁶ｃｆ
ｕ、１×１０⁸ｃｆｕ １０．洗浄液 ０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含有するＰＢＳ １１．反応停止液 ２Ｎ硫酸 １２．抗原抽出液Ａ ８Ｍ亜硝酸ナトリウム水溶液 １３．抗原抽出液Ｂ ２Ｍ酢酸水溶液 １４．抗原中和液 ４Ｎ水酸化ナトリウム水溶液 １５．砂時計 １６．取扱説明書 １）滅菌つまようじを用いて歯垢を採取し、プラスチッ
ク・カップに取る。 ２）プラスチック・スポイトを用いて、抗原抽出液Ａを
２滴、続いて抗原抽出液Ｂを２滴加え、室温で５分間放
置する。陽性対照も以下同様に操作し、被験サンプルの
結果と比較する。 ３）抗原中和液１滴、溶解液８滴を添加してよく混和し
た後、その２滴を反応用チューブに加える。 ４）プラスティック・スポイトで溶解液２ｍｌを取り、
感作標識担体を溶解し、その１ｍｌを反応用チューブ添
加し、１０分間放置する。 ５）洗浄液で反応用チューブを２回洗浄する。 ６）発色用試薬Ａを１０滴を加え良く混ぜてから５分放
置した後、発色用試薬Ｂを２滴加えそのまま放置し、発
色の程度を観察する。 ７）発色を認めたら反応停止液を５滴加える。

【００６５】なお、上記本発明の検出用検査セットに係
る実施例１０、実施例１１はいずれも発色を定性的に検
出するものであるが、定量的に検出する場合は、公知の
定量用酵素免疫測定法キットの標識抗体又は標識抗原の
代わりに本発明の感作標識担体を用い、測定条件等を変
えることで容易に高感度の定量用検査セットに適用する
ことができる。

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 抗原又は抗体と標識物質とを担体を介し
   て一体化してなることを特徴とする感作標識担体。
2. 【請求項２】 標識物質として酵素を用いる請求項１記
   載の感作標識担体。
3. 【請求項３】 検体中の抗体又は抗原を請求項１又は２
   記載の感作標識担体と抗原抗体反応させた後、反応した
   担体の標識物質が基質と作用することにより生じる発
   色、蛍光・発光又は放射能を検出することにより、上記
   検体中の抗原又は抗体を検出することを特徴とする抗原
   又は抗体の検出方法。
4. 【請求項４】 請求項１又は２記載の感作標識担体と、
   該担体を用いて抗原抗体反応を行うための試薬と、標識
   物質の活性を検出するための試薬とを具備してなる検体
   中の抗原又は抗体を検出するための検出用検査セット。