JPH0611507A - ヒトポドカリキシンの測定方法 - Google Patents
ヒトポドカリキシンの測定方法Info
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- JPH0611507A JPH0611507A JP19165592A JP19165592A JPH0611507A JP H0611507 A JPH0611507 A JP H0611507A JP 19165592 A JP19165592 A JP 19165592A JP 19165592 A JP19165592 A JP 19165592A JP H0611507 A JPH0611507 A JP H0611507A
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- human podocalyxin
- podocalyxin
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Abstract
(57)【要約】 （修正有）
【目的】 簡便で所要時間が短く、かつ、ヒトポドカリ
キシンの定量も可能なヒトポドカリキシンの測定方法を
提供する。 【構成】 この測定方法は固相に結合した第１の抗ヒト
ポドカリキシン抗体と検体とを反応させた後、第１の抗
ヒトポドカリキシン抗体とは対応エピトープが異なる第
２の抗ヒトポドカリキシンモノクローナル抗体を反応さ
せ、固相に結合した該第２の抗ヒトポドカリキシンモノ
クローナル抗体を測定する方法と、固相に結合した第１
の抗ヒトポドカリキシン抗体と検体とを反応させた後、
ヒトポドカリキシンの糖鎖に特異的なレクチンを反応さ
せ、固相に結合した該レクチンを測定する方法と、さら
に、ヒトポドカリキシンを含むかもしれない検体と、粒
子に結合された抗ヒトポドカリキシンモノクローナル抗
体とを反応させ、免疫凝集反応を生起させた後、得られ
た凝集より前記ヒトポドカリキシンを測定する方法等を
含む。
キシンの定量も可能なヒトポドカリキシンの測定方法を
提供する。 【構成】 この測定方法は固相に結合した第１の抗ヒト
ポドカリキシン抗体と検体とを反応させた後、第１の抗
ヒトポドカリキシン抗体とは対応エピトープが異なる第
２の抗ヒトポドカリキシンモノクローナル抗体を反応さ
せ、固相に結合した該第２の抗ヒトポドカリキシンモノ
クローナル抗体を測定する方法と、固相に結合した第１
の抗ヒトポドカリキシン抗体と検体とを反応させた後、
ヒトポドカリキシンの糖鎖に特異的なレクチンを反応さ
せ、固相に結合した該レクチンを測定する方法と、さら
に、ヒトポドカリキシンを含むかもしれない検体と、粒
子に結合された抗ヒトポドカリキシンモノクローナル抗
体とを反応させ、免疫凝集反応を生起させた後、得られ
た凝集より前記ヒトポドカリキシンを測定する方法等を
含む。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、ヒトポドカリキシンの
測定方法に関する。本発明の方法は、腎炎の診断に適用
することができる。
測定方法に関する。本発明の方法は、腎炎の診断に適用
することができる。
【０００２】
【従来の技術】ポドカリキシンは糸球体上皮細胞に存在
する分子量約１４万の糖タンパク質である。従来、ポド
カリキシンの検出方法としては、ポドカリキシンをヤギ
又はウサギに免疫して得られたポリクローナル抗体を用
いた組織染色による方法が知られている。
する分子量約１４万の糖タンパク質である。従来、ポド
カリキシンの検出方法としては、ポドカリキシンをヤギ
又はウサギに免疫して得られたポリクローナル抗体を用
いた組織染色による方法が知られている。
【０００３】しかしながら、この従来法では、細胞等を
染色するため、組織の固定や切片の作製等極めて煩雑で
多くの時間を必要とし、また、ポドカリキシンの量を定
量するのは困難である。
染色するため、組織の固定や切片の作製等極めて煩雑で
多くの時間を必要とし、また、ポドカリキシンの量を定
量するのは困難である。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】従って、本発明の目的
は、従来法に比較して簡便で所要時間が短く、かつ、ヒ
トポドカリキシンの定量も可能なヒトポドカリキシンの
測定方法を提供することである。
は、従来法に比較して簡便で所要時間が短く、かつ、ヒ
トポドカリキシンの定量も可能なヒトポドカリキシンの
測定方法を提供することである。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明は、固相に結合し
た第１の抗ヒトポドカリキシン抗体と検体とを反応させ
た後、前記第１の抗ヒトポドカリキシン抗体とは対応エ
ピトープが異なる第２の抗ヒトポドカリキシンモノクロ
ーナル抗体を反応させ、次いで固相に結合した該第２の
抗ヒトポドカリキシンモノクローナル抗体を測定するこ
とからなる検体中のヒトポドカリキシンの測定方法（以
下、これを第１の発明と言うことがある）を提供する。
た第１の抗ヒトポドカリキシン抗体と検体とを反応させ
た後、前記第１の抗ヒトポドカリキシン抗体とは対応エ
ピトープが異なる第２の抗ヒトポドカリキシンモノクロ
ーナル抗体を反応させ、次いで固相に結合した該第２の
抗ヒトポドカリキシンモノクローナル抗体を測定するこ
とからなる検体中のヒトポドカリキシンの測定方法（以
下、これを第１の発明と言うことがある）を提供する。
【０００６】また、本発明は、固相に結合した第１の抗
ヒトポドカリキシン抗体と検体とを反応させた後、ヒト
ポドカリキシンの糖鎖に特異的なレクチンを反応させ、
固相に結合した該レクチンを測定することからなる検体
中のヒトポドカリキシンの測定方法（以下、これを第２
の発明と言うことがある）を提供する。
ヒトポドカリキシン抗体と検体とを反応させた後、ヒト
ポドカリキシンの糖鎖に特異的なレクチンを反応させ、
固相に結合した該レクチンを測定することからなる検体
中のヒトポドカリキシンの測定方法（以下、これを第２
の発明と言うことがある）を提供する。
【０００７】さらにまた、本発明は、ヒトポドカリキシ
ンを含むかもしれない検体と、粒子に結合された抗ヒト
ポドカリキシンモノクローナル抗体とを反応させ、免疫
凝集反応を生起させた後、得られた凝集より前記ヒトポ
ドカリキシンを測定することから成るヒトポドカリキシ
ンの測定方法（以下、これを第３の発明と言うことがあ
る）を提供する。
ンを含むかもしれない検体と、粒子に結合された抗ヒト
ポドカリキシンモノクローナル抗体とを反応させ、免疫
凝集反応を生起させた後、得られた凝集より前記ヒトポ
ドカリキシンを測定することから成るヒトポドカリキシ
ンの測定方法（以下、これを第３の発明と言うことがあ
る）を提供する。
【０００８】さらにまた、本発明は、ヒトポドカリキシ
ンを含むかもしれない検体と、抗ヒトポドカリキシンモ
ノクローナル抗体とを反応させ、免疫凝集反応を生起さ
せた後、得られた凝集より前記ヒトポドカリキシンを測
定することから成るヒトポドカリキシンの測定方法（以
下、これを第４の発明と言うことがある）を提供する。
ンを含むかもしれない検体と、抗ヒトポドカリキシンモ
ノクローナル抗体とを反応させ、免疫凝集反応を生起さ
せた後、得られた凝集より前記ヒトポドカリキシンを測
定することから成るヒトポドカリキシンの測定方法（以
下、これを第４の発明と言うことがある）を提供する。
【０００９】以下、本発明を詳細に説明する。
【００１０】上述のように、第１の発明の方法では、抗
ヒトポドカリキシン抗体を固相に結合したものを用い
る。固相としては、従来の免疫分析において用いられて
いるいずれのものをも用いることができ、例えば、プラ
スチック製のマイクロタイタープレートのウェルや、後
述の実施例のように磁性粒子等を好ましく用いることが
できる。
ヒトポドカリキシン抗体を固相に結合したものを用い
る。固相としては、従来の免疫分析において用いられて
いるいずれのものをも用いることができ、例えば、プラ
スチック製のマイクロタイタープレートのウェルや、後
述の実施例のように磁性粒子等を好ましく用いることが
できる。
【００１１】固相に固定化する抗ヒトポドカリキシン抗
体は、ポリクローナル抗体でもモノクローナル抗体でも
よい。モノクローナル抗体を用いる場合には、後述する
第２のモノクローナル抗体と対応エピトープの異なるも
のを用いる必要がある。
体は、ポリクローナル抗体でもモノクローナル抗体でも
よい。モノクローナル抗体を用いる場合には、後述する
第２のモノクローナル抗体と対応エピトープの異なるも
のを用いる必要がある。
【００１２】抗ヒトポドカリキシン抗体の固相への結合
は、従来からこの分野において周知の方法により行うこ
とができ、例えば、マイクロタイタープレートのウェル
等に結合する場合には１μｇ／ｍｌ程度の濃度の抗体溶
液を固相に加え、４℃で一夜放置することにより行うこ
とができる。また、固相が磁性粒子の場合には、後述の
実施例において詳述する方法により結合させることがで
きる。結合後、タンパク質の非特異的吸着部位をブロッ
クするために、常法に基づき、ＢＳＡのようなタンパク
質でブロッキングを行う。
は、従来からこの分野において周知の方法により行うこ
とができ、例えば、マイクロタイタープレートのウェル
等に結合する場合には１μｇ／ｍｌ程度の濃度の抗体溶
液を固相に加え、４℃で一夜放置することにより行うこ
とができる。また、固相が磁性粒子の場合には、後述の
実施例において詳述する方法により結合させることがで
きる。結合後、タンパク質の非特異的吸着部位をブロッ
クするために、常法に基づき、ＢＳＡのようなタンパク
質でブロッキングを行う。
【００１３】次いで、このように固相に結合された抗ヒ
トポドカリキシン抗体と、検体を反応させ、検体中のヒ
トポドカリキシンを、抗原抗体反応により前記固相に結
合された抗ヒトポドカリキシン抗体を介して固相に結合
される。検体は、ヒトポドカリキシンを含むかもしれな
いものであれば何であってもよい。検体としては例えば
尿を挙げることができる。この抗原抗体反応は好ましく
は４℃〜４５℃、さらに好ましくは２５〜３８℃で行う
ことができ、また、反応時間は、好ましくは１０分〜１
８時間、さらに好ましくは１０分〜１時間程度である。
トポドカリキシン抗体と、検体を反応させ、検体中のヒ
トポドカリキシンを、抗原抗体反応により前記固相に結
合された抗ヒトポドカリキシン抗体を介して固相に結合
される。検体は、ヒトポドカリキシンを含むかもしれな
いものであれば何であってもよい。検体としては例えば
尿を挙げることができる。この抗原抗体反応は好ましく
は４℃〜４５℃、さらに好ましくは２５〜３８℃で行う
ことができ、また、反応時間は、好ましくは１０分〜１
８時間、さらに好ましくは１０分〜１時間程度である。
【００１４】次いで、洗浄後、固相に結合された前記抗
ヒトポドカリキシン抗体とは対応エピトープが異なる第
２の抗ヒトポドカリキシンモノクローナル抗体を前記固
相に結合された検体中のヒトポドカリキシンと反応させ
る。好ましい反応温度及び反応時間は上記と同様であ
る。これにより、第２の抗ヒトポドカリキシンモノクロ
ーナル抗体は、ヒトポドカリキシン及び第１の抗ヒトポ
ドカリキシン抗体を介して固相に結合される。
ヒトポドカリキシン抗体とは対応エピトープが異なる第
２の抗ヒトポドカリキシンモノクローナル抗体を前記固
相に結合された検体中のヒトポドカリキシンと反応させ
る。好ましい反応温度及び反応時間は上記と同様であ
る。これにより、第２の抗ヒトポドカリキシンモノクロ
ーナル抗体は、ヒトポドカリキシン及び第１の抗ヒトポ
ドカリキシン抗体を介して固相に結合される。
【００１５】次いで、洗浄後、固相に結合された第２の
抗ヒトポドカリキシンモノクローナル抗体を測定する。
これは、免疫分析の分野において常用されている種々の
方法により行うことができる。例えば、第２の抗ヒトポ
ドカリキシンモノクローナル抗体を、酵素、蛍光、ビオ
チン、放射標識等で標識しておき、これらの標識を測定
することにより固相に結合した第２の抗ヒトポドカリキ
シンモノクローナル抗体を測定することができる。これ
らのうち、酵素による標識が好ましく、酵素としてはペ
ルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラク
トシダーゼ及びグルコースオキシダーゼ等を用いること
ができる。標識の検出は、対応する基質と酵素標識とを
反応させ、反応の結果生じる色素、蛍光、発光等を測定
することにより行うことができる。あるいは、第２の抗
ヒトポドカリキシンモノクローナル抗体が標識されてい
ない場合には、第２の抗ヒトポドカリキシンモノクロー
ナル抗体に対する、標識された第３の抗体を反応させ、
この標識に基づき第３抗体を測定することによっても第
２の抗ヒトポドカリキシンモノクローナル抗体を測定す
ることができる。
抗ヒトポドカリキシンモノクローナル抗体を測定する。
これは、免疫分析の分野において常用されている種々の
方法により行うことができる。例えば、第２の抗ヒトポ
ドカリキシンモノクローナル抗体を、酵素、蛍光、ビオ
チン、放射標識等で標識しておき、これらの標識を測定
することにより固相に結合した第２の抗ヒトポドカリキ
シンモノクローナル抗体を測定することができる。これ
らのうち、酵素による標識が好ましく、酵素としてはペ
ルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラク
トシダーゼ及びグルコースオキシダーゼ等を用いること
ができる。標識の検出は、対応する基質と酵素標識とを
反応させ、反応の結果生じる色素、蛍光、発光等を測定
することにより行うことができる。あるいは、第２の抗
ヒトポドカリキシンモノクローナル抗体が標識されてい
ない場合には、第２の抗ヒトポドカリキシンモノクロー
ナル抗体に対する、標識された第３の抗体を反応させ、
この標識に基づき第３抗体を測定することによっても第
２の抗ヒトポドカリキシンモノクローナル抗体を測定す
ることができる。
【００１６】なお、上記した第１及び第２の抗ヒトポド
カリキシン抗体は、ヒトポドカリキシンに対して特異的
なＦａｂやＦ（ａｂ’）2 のような免疫グロブリン断片
であってもよい。特許請求の範囲における「抗体」とい
う語は、ヒトポドカリキシンに特異的なこれらの断片を
も包含する意味で用いている（第２ないし第４の発明に
ついても同じ）。なお、これらの断片の調製方法はこの
分野において周知であり、下記実施例にも記載されてい
る。
カリキシン抗体は、ヒトポドカリキシンに対して特異的
なＦａｂやＦ（ａｂ’）2 のような免疫グロブリン断片
であってもよい。特許請求の範囲における「抗体」とい
う語は、ヒトポドカリキシンに特異的なこれらの断片を
も包含する意味で用いている（第２ないし第４の発明に
ついても同じ）。なお、これらの断片の調製方法はこの
分野において周知であり、下記実施例にも記載されてい
る。
【００１７】第２の発明の方法では、検体中のヒトポド
カリキシンを、上記と同様にして抗ヒトポドカリキシン
抗体を介して固相に結合した後、ヒトポドカリキシンの
糖鎖と特異的に反応するレクチンを作用させ、洗浄後、
固相に結合されたレクチンを測定する。ヒトポドカリキ
シンとレクチンとの反応も上記と同様な反応温度及び反
応時間で好ましく行うことができる。また、結合したレ
クチンの測定も、ヒトポドカリキシンと反応させるレク
チンとして標識したものを用い、この標識に基づきレク
チンを測定することにより行うことができる。標識とし
ては上記と同様なものを用いることができ、その検出も
上記と同様に行うことができる。
カリキシンを、上記と同様にして抗ヒトポドカリキシン
抗体を介して固相に結合した後、ヒトポドカリキシンの
糖鎖と特異的に反応するレクチンを作用させ、洗浄後、
固相に結合されたレクチンを測定する。ヒトポドカリキ
シンとレクチンとの反応も上記と同様な反応温度及び反
応時間で好ましく行うことができる。また、結合したレ
クチンの測定も、ヒトポドカリキシンと反応させるレク
チンとして標識したものを用い、この標識に基づきレク
チンを測定することにより行うことができる。標識とし
ては上記と同様なものを用いることができ、その検出も
上記と同様に行うことができる。
【００１８】第３の発明の発明の方法において用いられ
る粒子としては、好ましくは直径0.05〜１０μｍのラテ
ックス、直径0.5 〜１０μｍのゼラチン粒子及び動物赤
血球を挙げることができる。粒子への抗体の結合方法は
この分野において周知であり、抗体の溶液中に粒子を分
散させることにより容易に行うことができる。
る粒子としては、好ましくは直径0.05〜１０μｍのラテ
ックス、直径0.5 〜１０μｍのゼラチン粒子及び動物赤
血球を挙げることができる。粒子への抗体の結合方法は
この分野において周知であり、抗体の溶液中に粒子を分
散させることにより容易に行うことができる。
【００１９】粒子上に抗ヒトポドカリキシンモノクロー
ナル抗体が結合されている粒子と、検体とを例えば黒色
のスライドグラス上で混合し、凝集して沈殿する粒子の
有無を観察することにより検体中のヒトポドカリキシン
を検出することができる。また、吸光度測定によりヒト
ポドカリキシンを定量することも可能である。
ナル抗体が結合されている粒子と、検体とを例えば黒色
のスライドグラス上で混合し、凝集して沈殿する粒子の
有無を観察することにより検体中のヒトポドカリキシン
を検出することができる。また、吸光度測定によりヒト
ポドカリキシンを定量することも可能である。
【００２０】第４の発明の方法では、抗ヒトポドカリキ
シンモノクローナル抗体を含む溶液と検体とを混合す
る。検体中にヒトポドカリキシンが存在すると、混合液
の濁度が増大するので、混合液の濁度変化を観察するこ
とにより検体中のヒトポドカリキシンを検出することが
できる。
シンモノクローナル抗体を含む溶液と検体とを混合す
る。検体中にヒトポドカリキシンが存在すると、混合液
の濁度が増大するので、混合液の濁度変化を観察するこ
とにより検体中のヒトポドカリキシンを検出することが
できる。
【００２１】なお、上記第１ないし第４の発明におい
て、抗ヒトポドカリキシンモノクローナル抗体として
は、下記実施例において得られた高感度なモノクローナ
ル抗体ＰＣＸ−１Ｃ３（微工研菌寄第１３０２４号）を
好ましく用いることができる。
て、抗ヒトポドカリキシンモノクローナル抗体として
は、下記実施例において得られた高感度なモノクローナ
ル抗体ＰＣＸ−１Ｃ３（微工研菌寄第１３０２４号）を
好ましく用いることができる。
【００２２】ヒトポドカリキシンは腎炎患者中で健常人
よりも量が多くなっているので、本発明の方法は、腎炎
の診断に適用することができる。
よりも量が多くなっているので、本発明の方法は、腎炎
の診断に適用することができる。
【００２３】
【実施例】以下、本発明を実施例によりさらに具体的に
説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定される
ものではない。
説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定される
ものではない。
【００２４】実施例１抗ヒトポドカリキシンウサギＩｇＧの作製 ヒトポドカリキシン１mg／ml溶液２mlとフロイントのコ
ンプリートアジュバント２mlを充分混合しエマルジョン
とした。これを日本家兎（２．５Ｋｇ）の背皮内（１０
０μｌ／１ケ所）１０ケ所及び大腿部（３００μｌ／１
ケ所）２ケ所に１ケ月おきに３回免疫した。このウサギ
の血清を耳より採血し血清を２０ml得た。
ンプリートアジュバント２mlを充分混合しエマルジョン
とした。これを日本家兎（２．５Ｋｇ）の背皮内（１０
０μｌ／１ケ所）１０ケ所及び大腿部（３００μｌ／１
ケ所）２ケ所に１ケ月おきに３回免疫した。このウサギ
の血清を耳より採血し血清を２０ml得た。
【００２５】この血清２０mlを４０％飽和硫安で沈殿さ
せ、遠心によりＩｇＧ分画を得た。さらにファルマシア
・スーパーロース１２カラムでこのＩｇＧ分画を精製
し、アルブミンを除いたＩｇＧ分画を得た。
せ、遠心によりＩｇＧ分画を得た。さらにファルマシア
・スーパーロース１２カラムでこのＩｇＧ分画を精製
し、アルブミンを除いたＩｇＧ分画を得た。
【００２６】抗ヒトポドカリキシンマウス抗体の作製 ヒトポドカリキシン１０μｇをマウス腹腔にアジュバン
トと共に数回免疫し、その血清力価が上昇したことを確
認した。追加免疫（静脈内）後３日目に脾臓を取り出
し、脾細胞を得た。これとマウスミエローマ細胞をポリ
エチレングリコール２０００の存在下（２：１細胞）に
融合させ、ハイブリドーマ細胞を作製した。この細胞を
１週間ＣＯ2 気下３７℃で培養し、その培養上清の抗ヒ
トポドカリキシン抗体の有無を調べた。９６ウェル中４
２ウェルで抗体産生を認めた。この陽性ウェル中の細胞
を限界希釈法により希釈し２週間培養し、同様に培養上
清の抗ヒトポドカリキシン抗体の有無を調べた。９６ウ
ェル中８ウェルで強い抗体産生を認めた。再度このウェ
ルの細胞を限界希釈し同様の培養を行なった。９６ウェ
ル中２９ウェルが抗体を産生しており、これをフラスコ
にて培養しその一部をＤＭＳＯ １０％含有ＦＣＳにサ
スペンドし（５×106 個／ml）液体Ｎ2 中に保存した。
トと共に数回免疫し、その血清力価が上昇したことを確
認した。追加免疫（静脈内）後３日目に脾臓を取り出
し、脾細胞を得た。これとマウスミエローマ細胞をポリ
エチレングリコール２０００の存在下（２：１細胞）に
融合させ、ハイブリドーマ細胞を作製した。この細胞を
１週間ＣＯ2 気下３７℃で培養し、その培養上清の抗ヒ
トポドカリキシン抗体の有無を調べた。９６ウェル中４
２ウェルで抗体産生を認めた。この陽性ウェル中の細胞
を限界希釈法により希釈し２週間培養し、同様に培養上
清の抗ヒトポドカリキシン抗体の有無を調べた。９６ウ
ェル中８ウェルで強い抗体産生を認めた。再度このウェ
ルの細胞を限界希釈し同様の培養を行なった。９６ウェ
ル中２９ウェルが抗体を産生しており、これをフラスコ
にて培養しその一部をＤＭＳＯ １０％含有ＦＣＳにサ
スペンドし（５×106 個／ml）液体Ｎ2 中に保存した。
【００２７】次に各ウェルの上清を用い、ヒトポドカリ
キシンに対する反応性を調べた。５０ｎｇ／ウェルでヒ
トポドカリキシンを４℃、一夜タイターテックプレート
に感作し、２％ＢＳＡ／０．０２Ｍリン酸緩衝液でポス
トコートした。これに培養上清５０μｌを加え、３７
℃、１時間加温した。これを２０ｍＭリン酸緩衝化生理
食塩水ｐＨ７．４（０．５％Tween-20含有）（以下ＰＢ
Ｓ−Ｔと略す）で４回洗浄し抗マウスＩｇＧ−ＰＯＤ標
識抗体５０μｌ（１０００倍希釈 タゴ社品）を加え、
３７℃、１時間加温した。上記ＰＢＳ−Ｔで４回洗浄
し、ＡＢＴＳ溶液２００μｌ（１mg／mlＡＢＴＳ，０．
０１％Ｈ2 Ｏ2,ｐＨ５．５）を加え４℃で一夜放置しそ
の吸光度を測定した。
キシンに対する反応性を調べた。５０ｎｇ／ウェルでヒ
トポドカリキシンを４℃、一夜タイターテックプレート
に感作し、２％ＢＳＡ／０．０２Ｍリン酸緩衝液でポス
トコートした。これに培養上清５０μｌを加え、３７
℃、１時間加温した。これを２０ｍＭリン酸緩衝化生理
食塩水ｐＨ７．４（０．５％Tween-20含有）（以下ＰＢ
Ｓ−Ｔと略す）で４回洗浄し抗マウスＩｇＧ−ＰＯＤ標
識抗体５０μｌ（１０００倍希釈 タゴ社品）を加え、
３７℃、１時間加温した。上記ＰＢＳ−Ｔで４回洗浄
し、ＡＢＴＳ溶液２００μｌ（１mg／mlＡＢＴＳ，０．
０１％Ｈ2 Ｏ2,ｐＨ５．５）を加え４℃で一夜放置しそ
の吸光度を測定した。
【００２８】その結果１０ウェルの細胞が強く抗体を産
生していた。これらの細胞を２５ｍｌフラスコで培養
し、さらに７５ｍｌフラスコで培養した。この細胞をプ
リスタン処理マウス腹腔中に注射し、腹水を採取した。
この腹水を精製し、抗ヒトポドカリキシンマウスＩｇＧ
を得た。これらのモノクローナル抗体の１つを産生する
ハイブリドーマをＰＣＸ−１Ｃ３と命名し、微工研に寄
託した。受託番号は微工研菌寄第１３０２４号である。
生していた。これらの細胞を２５ｍｌフラスコで培養
し、さらに７５ｍｌフラスコで培養した。この細胞をプ
リスタン処理マウス腹腔中に注射し、腹水を採取した。
この腹水を精製し、抗ヒトポドカリキシンマウスＩｇＧ
を得た。これらのモノクローナル抗体の１つを産生する
ハイブリドーマをＰＣＸ−１Ｃ３と命名し、微工研に寄
託した。受託番号は微工研菌寄第１３０２４号である。
【００２９】抗ヒトポドカリキシンウサギＩｇＧ結合磁性粒子の作製 カルボキシシラン化フェライト粒子（粒径０．３μｍ，
日本ペイント社製）１％けん濁水溶液１ｍｌに水溶性カ
ルボジイミド（ナカライテスク社製）１ｍｇを添加し攪
拌した。室温で１０分間反応させ、５０００ガウスの永
久磁石でこのフェライト粒子を集磁させた。上清を除去
し、抗ヒトポドカリキシンＩｇＧ・No.１溶液（１mg／m
l ｐＨ４．５）を加え、室温で一度エンドオーバーエ
ンドミキサーで攪拌した。このけん濁液を上述の永久磁
石で処理し、フェライト粒子を集磁させた。上清を除去
後、ＰＢＳ−Ｔで４回洗浄し、２％ＢＳＡ含有トリス溶
液に保存した。これにより、抗ヒトポドカリキシンウサ
ギＩｇＧ結合フェライト粒子を調製した。
日本ペイント社製）１％けん濁水溶液１ｍｌに水溶性カ
ルボジイミド（ナカライテスク社製）１ｍｇを添加し攪
拌した。室温で１０分間反応させ、５０００ガウスの永
久磁石でこのフェライト粒子を集磁させた。上清を除去
し、抗ヒトポドカリキシンＩｇＧ・No.１溶液（１mg／m
l ｐＨ４．５）を加え、室温で一度エンドオーバーエ
ンドミキサーで攪拌した。このけん濁液を上述の永久磁
石で処理し、フェライト粒子を集磁させた。上清を除去
後、ＰＢＳ−Ｔで４回洗浄し、２％ＢＳＡ含有トリス溶
液に保存した。これにより、抗ヒトポドカリキシンウサ
ギＩｇＧ結合フェライト粒子を調製した。
【００３０】抗ヒトポドカリキシンマウスＩｇＧ結合ア
ルカリホスファターゼの作製 抗ヒトポドカリキシンマウスＩｇＧ（No. ４）４mgを
０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ４．２、１ｍＭ ＥＤＴＡ含
有）２ｍｌに０．２ｍｇのペプシンを加え、３７℃２４
時間攪拌した。この反応液を予め０．１Ｍリン酸，ｐＨ
６．３で平衝化させたUltrogel AcA44でゲル濾過した。
分子量約１０万のタンパク分画をプールし、限外濾過法
により１mlまで濃縮した。これにより抗ヒトポドカリキ
シンマウスＦ（ａｂ′）2 ２mgを得た。
ルカリホスファターゼの作製 抗ヒトポドカリキシンマウスＩｇＧ（No. ４）４mgを
０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ４．２、１ｍＭ ＥＤＴＡ含
有）２ｍｌに０．２ｍｇのペプシンを加え、３７℃２４
時間攪拌した。この反応液を予め０．１Ｍリン酸，ｐＨ
６．３で平衝化させたUltrogel AcA44でゲル濾過した。
分子量約１０万のタンパク分画をプールし、限外濾過法
により１mlまで濃縮した。これにより抗ヒトポドカリキ
シンマウスＦ（ａｂ′）2 ２mgを得た。
【００３１】 (a) ＧＭＢ−化アルカリフォスファターゼの調製 アルカリフォスファターゼ５mgを０．２Ｍリン酸緩衝液
ｐＨ７．０に溶かし、これにＮ−（γ−マレイイミドブ
チルオキシ）サクシンイミド２０μｇ／１００μｌＤＭ
Ｆ溶液を加え、室温で１時間反応させた。この反応液を
０．１Ｍトリス−HCl ，ｐＨ７．０で平衡化させたセ
ファデックスＧ−２５脱塩カラム（ファルマシア社製）
で未反応のＧＭＢＳを分離し、ＧＭＢ化アルカリホスフ
ァターゼ５ｍｇを得た。
ｐＨ７．０に溶かし、これにＮ−（γ−マレイイミドブ
チルオキシ）サクシンイミド２０μｇ／１００μｌＤＭ
Ｆ溶液を加え、室温で１時間反応させた。この反応液を
０．１Ｍトリス−HCl ，ｐＨ７．０で平衡化させたセ
ファデックスＧ−２５脱塩カラム（ファルマシア社製）
で未反応のＧＭＢＳを分離し、ＧＭＢ化アルカリホスフ
ァターゼ５ｍｇを得た。
【００３２】 （ｂ）抗ヒトポドカリキシンマウスＦａｂ−ＳＨの調製 予め作製された抗ヒトポドカリキシンマウスＦ（ａ
ｂ′）2 ２mg／ml １mlに０．２Ｍ ２−メルカプトエ
チルアミン塩酸塩水溶液５０μｌを加え ３７℃で２時
間加温し、反応液を０．１Ｍ酢酸緩衝液（１ｍＭ ＥＤ
ＴＡ含有、ｐＨ７．０）で平衡化したＧ−２５カラムで
脱塩しＦａｂ′２mgを得た。
ｂ′）2 ２mg／ml １mlに０．２Ｍ ２−メルカプトエ
チルアミン塩酸塩水溶液５０μｌを加え ３７℃で２時
間加温し、反応液を０．１Ｍ酢酸緩衝液（１ｍＭ ＥＤ
ＴＡ含有、ｐＨ７．０）で平衡化したＧ−２５カラムで
脱塩しＦａｂ′２mgを得た。
【００３３】尿中ヒトポドカリキシンの測定 抗ヒトポドカリキシンウサギＩｇＧ結合フェライト粒子
２５０μｌ（０．０２％）に尿１０μｌを加え、３７℃
で１０分間反応させた。この反応チューブを５０００ガ
ウスの永久磁石に３０秒間セットし、フェライト粒子を
集磁した。この粒子を２０ｍＭトリス緩衝化生理食塩水
（０．２％Tween −２０含有 ｐＨ７．２）ＴＢＳ−Ｔ
で４回洗浄した。このチューブにヒトポドカリキシンマ
ウスＩｇＧＦａｂ結合−アルカリホスファターゼ２５０
μｌ（１μｇ／ml溶液）を加え、よく攪拌し、３７℃で
１０分間反応させた。
２５０μｌ（０．０２％）に尿１０μｌを加え、３７℃
で１０分間反応させた。この反応チューブを５０００ガ
ウスの永久磁石に３０秒間セットし、フェライト粒子を
集磁した。この粒子を２０ｍＭトリス緩衝化生理食塩水
（０．２％Tween −２０含有 ｐＨ７．２）ＴＢＳ−Ｔ
で４回洗浄した。このチューブにヒトポドカリキシンマ
ウスＩｇＧＦａｂ結合−アルカリホスファターゼ２５０
μｌ（１μｇ／ml溶液）を加え、よく攪拌し、３７℃で
１０分間反応させた。
【００３４】前述と同様にフェライト粒子を集磁し、４
回ＴＢＳ−Ｔで洗浄した。これにＡＭＰＰＤ溶液（０．
０２％ＡＭＰＰＤ、０．０４％ＢＤＭＱ、０．１ｍＭ M
gCl2、０．１Ｍジエタノールアミン，ｐＨ９．９）２０
０μｌを加え、３７℃で５分間反応させ、その発光をア
ロカルミノメーターで２秒間カウントした。
回ＴＢＳ−Ｔで洗浄した。これにＡＭＰＰＤ溶液（０．
０２％ＡＭＰＰＤ、０．０４％ＢＤＭＱ、０．１ｍＭ M
gCl2、０．１Ｍジエタノールアミン，ｐＨ９．９）２０
０μｌを加え、３７℃で５分間反応させ、その発光をア
ロカルミノメーターで２秒間カウントした。
【００３５】表１はヒトポドカリキシン濃度と発光量を
示している。
示している。
【表１】
【００３６】上記と同じ方法で人の尿を検体として尿中
ヒトポドカリキシンを測定した。この結果を表２に示
す。
ヒトポドカリキシンを測定した。この結果を表２に示
す。
【表２】
【００３７】実施例２ Wheat Germ Agglutinin (WGA)-アルカリホスファターゼ
結合物の調製 ＷＧＡ５mgを５０ｍＭ炭酸緩衝液（ｐＨ８．０）１mlに
溶かし、１０ｍＭクミノチオラン（０．２Ｍ 炭酸緩衝
液１ｍＭ ＥＤＴＡ・２Na、ｐＨ８．０）５μｌ加え、
３７℃で３０分間反応させた。この反応液を予め１０ｍ
Ｍリン酸緩衝液ｐＨ７．０で平衡化されたＧ−２５の脱
塩カラムに通し、未反応のイミノチオランを除去した。
このイミノチオラン化ＷＧＡ５mgに実施例（ａ）で調製
したＧＭＢ−アルカリホスファターゼで５mgを反応させ
た。３７℃、２時間攪拌後、０．１Ｍ ２−メルカプト
エチルアミン２０μｌを加え３７℃で１時間放置した。
この反応液をファルマシアＦＰＬＣによりSuperose１２
カラムで分画した。ＷＧＡ−ＡＬＰの比率が２：１の分
画をプールし、ＷＧＡ結合アルカリホスファタ−ゼとし
た。
結合物の調製 ＷＧＡ５mgを５０ｍＭ炭酸緩衝液（ｐＨ８．０）１mlに
溶かし、１０ｍＭクミノチオラン（０．２Ｍ 炭酸緩衝
液１ｍＭ ＥＤＴＡ・２Na、ｐＨ８．０）５μｌ加え、
３７℃で３０分間反応させた。この反応液を予め１０ｍ
Ｍリン酸緩衝液ｐＨ７．０で平衡化されたＧ−２５の脱
塩カラムに通し、未反応のイミノチオランを除去した。
このイミノチオラン化ＷＧＡ５mgに実施例（ａ）で調製
したＧＭＢ−アルカリホスファターゼで５mgを反応させ
た。３７℃、２時間攪拌後、０．１Ｍ ２−メルカプト
エチルアミン２０μｌを加え３７℃で１時間放置した。
この反応液をファルマシアＦＰＬＣによりSuperose１２
カラムで分画した。ＷＧＡ−ＡＬＰの比率が２：１の分
画をプールし、ＷＧＡ結合アルカリホスファタ−ゼとし
た。
【００３８】尿中ヒトポドカリキシンの測定 抗ヒトポドカリキシンマウスＩｇＧ結合フェライト粒子
２５０μｌ（０．０２％）に尿１０μｌを加え、３７℃
で１０分間反応させた。この反応チューブを５０００ガ
ウスの永久磁石に３０秒間セットし、フェライト粒子を
集磁した。この粒子を２０ｍＭトリス緩衝化生理食塩水
（０．２％Tween −２０含有 ｐＨ７．２）ＴＢＳ−Ｔ
で４回洗浄した。このチューブにＷＧＡ結合−アルカリ
ホスファターゼ２５０μｌ（１μｇ／ml溶液）を加え、
よく攪拌し、３７℃で１０分間反応させた。
２５０μｌ（０．０２％）に尿１０μｌを加え、３７℃
で１０分間反応させた。この反応チューブを５０００ガ
ウスの永久磁石に３０秒間セットし、フェライト粒子を
集磁した。この粒子を２０ｍＭトリス緩衝化生理食塩水
（０．２％Tween −２０含有 ｐＨ７．２）ＴＢＳ−Ｔ
で４回洗浄した。このチューブにＷＧＡ結合−アルカリ
ホスファターゼ２５０μｌ（１μｇ／ml溶液）を加え、
よく攪拌し、３７℃で１０分間反応させた。
【００３９】前述と同様にフェライト粒子を集磁し、４
回 ＴＢＳ−Ｔで洗浄した。これにＡＭＰＰＤ溶液
（０．０２％ＡＭＰＰＤ、０．０４％ＢＤＭＱ、０．１
ｍＭ MgCl2 ０．１Ｍジエタノールアミン，ｐＨ９．
９）２００μｌを加え ３７℃で５分間反応させ、その
発光をアロカルミノメーターで２秒間カウントした。
回 ＴＢＳ−Ｔで洗浄した。これにＡＭＰＰＤ溶液
（０．０２％ＡＭＰＰＤ、０．０４％ＢＤＭＱ、０．１
ｍＭ MgCl2 ０．１Ｍジエタノールアミン，ｐＨ９．
９）２００μｌを加え ３７℃で５分間反応させ、その
発光をアロカルミノメーターで２秒間カウントした。
【００４０】表３はヒトポドカリキシン濃度と発光量を
示している。
示している。
【表３】
【００４１】
【発明の効果】上記から明らかなように、本発明の方法
によると、検体中のヒトポドカリキシンを簡便な操作で
短時間にしかも高精度に測定できる。
によると、検体中のヒトポドカリキシンを簡便な操作で
短時間にしかも高精度に測定できる。
Claims (7)
- 【請求項１】 固相に結合した第１の抗ヒトポドカリキ
シン抗体と検体とを反応させた後、前記第１の抗ヒトポ
ドカリキシン抗体とは対応エピトープが異なる第２の抗
ヒトポドカリキシンモノクローナル抗体を反応させ、次
いで固相に結合した該第２の抗ヒトポドカリキシンモノ
クローナル抗体を測定することからなる検体中のヒトポ
ドカリキシンの測定方法。 - 【請求項２】 固相に結合した抗ヒトポドカリキシン抗
体と検体とを反応させた後、ヒトポドカリキシンの糖鎖
に特異的なレクチンを反応させ、固相に結合した該レク
チンを測定することからなる検体中のヒトポドカリキシ
ンの測定方法。 - 【請求項３】 ヒトポドカリキシンを含むかもしれない
検体と、粒子に結合された抗ヒトポドカリキシンモノク
ローナル抗体とを反応させ、免疫凝集反応を生起させた
後、得られた凝集より前記ヒトポドカリキシンを測定す
ることから成るヒトポドカリキシンの測定方法。 - 【請求項４】 粒子が0.05〜１０μｍのラテックス、直
径0.5 〜１０μｍのゼラチン粒子及び動物赤血球から成
る群より選択される請求項３記載の方法。 - 【請求項５】 ヒトポドカリキシンを含むかもしれない
検体と、抗ヒトポドカリキシンモノクローナル抗体とを
反応させ、免疫凝集反応を生起させた後、得られた凝集
より前記ヒトポドカリキシンを測定することから成るヒ
トポドカリキシンの測定方法。 - 【請求項６】 前記抗ヒトポドカリキシンモノクローナ
ル抗体はモノクローナル抗体ＰＣＸ−１Ｃ３である請求
項１、３、４又は５のいずれか１項に記載の方法。 - 【請求項７】 前記抗ヒトポドカリキシン抗体はモノク
ローナル抗体ＰＣＸ−１Ｃ３である請求項２記載の方
法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP19165592A JP2932837B2 (ja) | 1992-06-25 | 1992-06-25 | ヒトポドカリキシンの測定方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP19165592A JP2932837B2 (ja) | 1992-06-25 | 1992-06-25 | ヒトポドカリキシンの測定方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0611507A true JPH0611507A (ja) | 1994-01-21 |
| JP2932837B2 JP2932837B2 (ja) | 1999-08-09 |
Family
ID=16278268
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP19165592A Expired - Lifetime JP2932837B2 (ja) | 1992-06-25 | 1992-06-25 | ヒトポドカリキシンの測定方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2932837B2 (ja) |
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2002037099A1 (fr) * | 2000-10-27 | 2002-05-10 | International Reagents Corporation | Procede de diagnostic de la nephropathie |
| JP2008122410A (ja) * | 2000-10-27 | 2008-05-29 | Masanori Hara | 腎障害の検査方法 |
| WO2010143423A1 (ja) * | 2009-06-10 | 2010-12-16 | 国立大学法人 新潟大学 | 糖尿病性腎症の検査方法 |
| WO2010143422A1 (ja) * | 2009-06-10 | 2010-12-16 | 国立大学法人 新潟大学 | 腎疾患の検査方法 |
| US8105840B2 (en) | 2007-09-27 | 2012-01-31 | Niigata University | Urine pretreatment agent for urinary protein quantitation, urine pretreatment method, and urinary protein quantitation method |
| US8828387B2 (en) | 2009-07-08 | 2014-09-09 | Actgen Inc | Antibody having anti-cancer activity |
-
1992
- 1992-06-25 JP JP19165592A patent/JP2932837B2/ja not_active Expired - Lifetime
Cited By (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2002037099A1 (fr) * | 2000-10-27 | 2002-05-10 | International Reagents Corporation | Procede de diagnostic de la nephropathie |
| EP1336845A1 (en) * | 2000-10-27 | 2003-08-20 | International Reagents Corporation | Method of diagnosing nephropathy |
| US6969591B2 (en) | 2000-10-27 | 2005-11-29 | Masanori Hara | Method for diagnosing nephropathy |
| EP1336845A4 (en) * | 2000-10-27 | 2006-06-07 | Masanori Hara | METHOD FOR DIAGNOSING NEPHROPATHY |
| JP2008122410A (ja) * | 2000-10-27 | 2008-05-29 | Masanori Hara | 腎障害の検査方法 |
| US8105840B2 (en) | 2007-09-27 | 2012-01-31 | Niigata University | Urine pretreatment agent for urinary protein quantitation, urine pretreatment method, and urinary protein quantitation method |
| WO2010143423A1 (ja) * | 2009-06-10 | 2010-12-16 | 国立大学法人 新潟大学 | 糖尿病性腎症の検査方法 |
| WO2010143422A1 (ja) * | 2009-06-10 | 2010-12-16 | 国立大学法人 新潟大学 | 腎疾患の検査方法 |
| US8828387B2 (en) | 2009-07-08 | 2014-09-09 | Actgen Inc | Antibody having anti-cancer activity |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2932837B2 (ja) | 1999-08-09 |
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