JPH01121755A - 免疫検定キット及び免疫検定方法 - Google Patents
免疫検定キット及び免疫検定方法Info
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
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Description
【発明の詳細な説明】
この発明は細胞集団又は細胞下位集団
（５ｕｂｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓｌに特徴的な表面抗原
を検出するためのキット及びこのキットを用いた免疫分
析方法に関する。この免疫分析方法及び対応するキット
はまた１表面抗原の検出を介して細胞自体を検出するこ
とをも意図する。検出は診断に応用することができる。
を検出するためのキット及びこのキットを用いた免疫分
析方法に関する。この免疫分析方法及び対応するキット
はまた１表面抗原の検出を介して細胞自体を検出するこ
とをも意図する。検出は診断に応用することができる。
リンパ球パイプリダイゼーション法の開発及びケーラー
とミルシュタイン（Ｎａｔｕｒｅ、 １９７５゜±、
４９５−４９７）のモノクローナル抗体の発見により細
胞表面上の抗原又はマーカーの知識は飛躍的に拡大した
。特に、モノクローナル抗体の出現により、可能な限り
の広範囲の細胞の膜抗原又は表面マーカーの分析が可能
になった。これらのマーカー（又は抗原）は種々の異な
る種類のもの、すなわち、タンパク質、糖タンパク質又
は糖脂質であり得る。従って、この技術は、主として組
織又は器官マーカー、正常細胞の分化又は活性化の状態
を示すマーカー及び正常又は癌細胞の同定若しくは分類
に適用される。この技術の用途において特に重要な分野
は造血（赤血球、巨大核細胞、顆粒白血球、単球、リン
パ球）のセルラインの研究である。
とミルシュタイン（Ｎａｔｕｒｅ、 １９７５゜±、
４９５−４９７）のモノクローナル抗体の発見により細
胞表面上の抗原又はマーカーの知識は飛躍的に拡大した
。特に、モノクローナル抗体の出現により、可能な限り
の広範囲の細胞の膜抗原又は表面マーカーの分析が可能
になった。これらのマーカー（又は抗原）は種々の異な
る種類のもの、すなわち、タンパク質、糖タンパク質又
は糖脂質であり得る。従って、この技術は、主として組
織又は器官マーカー、正常細胞の分化又は活性化の状態
を示すマーカー及び正常又は癌細胞の同定若しくは分類
に適用される。この技術の用途において特に重要な分野
は造血（赤血球、巨大核細胞、顆粒白血球、単球、リン
パ球）のセルラインの研究である。
従って、例えば、モノクローナル抗体は、Ｔ及びＢリン
パ球のそれぞれの表面特徴を特定することを可能にした
。対応するマーカー又はそれらの組合わせにより、リン
パ球の分化段階及び機能的特殊化を特定することができ
る０国際会議により、ヒト白血球の表面抗原はＩＵＩＳ
−ＷＨＯサブ委員会、 １９８４において分化グループ
又は分化クラス（ＣＤ）に分類された。これはＷＨＯの
ブレティン、１９８４．６２ ＋５）、８１３−８１５
に記載されている。
パ球のそれぞれの表面特徴を特定することを可能にした
。対応するマーカー又はそれらの組合わせにより、リン
パ球の分化段階及び機能的特殊化を特定することができ
る０国際会議により、ヒト白血球の表面抗原はＩＵＩＳ
−ＷＨＯサブ委員会、 １９８４において分化グループ
又は分化クラス（ＣＤ）に分類された。これはＷＨＯの
ブレティン、１９８４．６２ ＋５）、８１３−８１５
に記載されている。
モノクローナル抗体によって可能となったこれらのマー
カーの同定により、それらの構造及び生物学的機能を知
ることが可能になった０例えば、ＣＤ４及びＣＤ８マー
カーは白血球付着機能に関与し、補助的及び誘導的機能
（ＣＤ４マーカー）又は細胞障害性及び抑制性機能（Ｃ
Ｄ８マーカー）を有するＴリンパ球上ｌこ存在する。
カーの同定により、それらの構造及び生物学的機能を知
ることが可能になった０例えば、ＣＤ４及びＣＤ８マー
カーは白血球付着機能に関与し、補助的及び誘導的機能
（ＣＤ４マーカー）又は細胞障害性及び抑制性機能（Ｃ
Ｄ８マーカー）を有するＴリンパ球上ｌこ存在する。
この確立された知識に基き、これらのマーカーを認識す
る抗体によって、特に悪性血病（白血球病、リンパ腫等
）免疫系の不全状態（自己免疫疾患、ＡＩＤＳのような
遺伝的又は後天的免疫疾患）の診断及び追跡にこれらの
マーカーを用いることが可能になった（ ＢＲＥＴＯＮ
−ＧＯＲＩＵＳ及びＶＡＩＮＣＩ薯ＥＮＫＥＲ，ＬｅＢ
ｉｏｌｏｇｉｓｔｅ、１９８７ＸＸＬＮｏ。
る抗体によって、特に悪性血病（白血球病、リンパ腫等
）免疫系の不全状態（自己免疫疾患、ＡＩＤＳのような
遺伝的又は後天的免疫疾患）の診断及び追跡にこれらの
マーカーを用いることが可能になった（ ＢＲＥＴＯＮ
−ＧＯＲＩＵＳ及びＶＡＩＮＣＩ薯ＥＮＫＥＲ，ＬｅＢ
ｉｏｌｏｇｉｓｔｅ、１９８７ＸＸＬＮｏ。
１６７、 ６３−７０： ５ＨＡＩ１． Ｉｍｍｕ
ｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ、 １９８７゜８ｔ１１
．１−３１゜ モノクローナル抗体は今や細胞分析に適用される臨床生
物学に欠かすことができない道具である。
ｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ、 １９８７゜８ｔ１１
．１−３１゜ モノクローナル抗体は今や細胞分析に適用される臨床生
物学に欠かすことができない道具である。
表面抗原の標識を用いる細胞計数方法があるが、これら
はしばしば手間がかかり、実施することが困難であり、
結果も信頼性が低い。
はしばしば手間がかかり、実施することが困難であり、
結果も信頼性が低い。
細胞表面上の抗原の正常な又は修飾された発現を測定す
るために用いられる公知の方法は２つのグループに分類
される。第１のグループでは。
るために用いられる公知の方法は２つのグループに分類
される。第１のグループでは。
抗原は、フラックスサイトメトリー（ｆｌｕｘｃｙｔｏ
ｍｅｔｙｌ （ＰＯＮＣＥＬＥＴら、Ｊ、 Ｉｍｍ
ｕｎｏｌ、 Ｍｅｔｈｏｄｓ。
ｍｅｔｙｌ （ＰＯＮＣＥＬＥＴら、Ｊ、 Ｉｍｍ
ｕｎｏｌ、 Ｍｅｔｈｏｄｓ。
１９８５、８５．６５−７４１又は定量的顕微鏡技術（
ＰＯＵＬＴＥＲら、Ｊ、 Ｉｍｍｕｎｏｌ、 Ｍｅｔｈ
ｏｄｓ、 １９８７．９８゜２２７−２３４）に基づく
、複雑で特殊な実験装置を用いて測定される。細胞抗原
を評価するためのこれらの方法は、直接的又は間接的に
フルオレッセインイソチオシアネート又はローダミンイ
ソチオシアネートのような蛍光物質又はペルオキシダー
ゼ若しくはアルカリフォスファターゼのような酵素に結
合された抗細胞抗体によって与えられる信号を測定する
ことに基づく、これらの蛍光物質又は酵素試薬を適当な
洗浄工程と共に採用すると、蛍光又は色が現われ、これ
らは細胞膜に廠密に限定されて周囲の環境に拡散しない
、これらの方法は、特殊で高価な設備（イメージアナラ
イザーがついた又はつかない蛍光顕微鏡、クライオスタ
ット及びフラックスサイトメーター）が必要なので実験
室内での使用に限られている。さらに、これらの方法に
よる細胞免疫標識の分析及び解読は、細胞学の専門家を
必要とする。
ＰＯＵＬＴＥＲら、Ｊ、 Ｉｍｍｕｎｏｌ、 Ｍｅｔｈ
ｏｄｓ、 １９８７．９８゜２２７−２３４）に基づく
、複雑で特殊な実験装置を用いて測定される。細胞抗原
を評価するためのこれらの方法は、直接的又は間接的に
フルオレッセインイソチオシアネート又はローダミンイ
ソチオシアネートのような蛍光物質又はペルオキシダー
ゼ若しくはアルカリフォスファターゼのような酵素に結
合された抗細胞抗体によって与えられる信号を測定する
ことに基づく、これらの蛍光物質又は酵素試薬を適当な
洗浄工程と共に採用すると、蛍光又は色が現われ、これ
らは細胞膜に廠密に限定されて周囲の環境に拡散しない
、これらの方法は、特殊で高価な設備（イメージアナラ
イザーがついた又はつかない蛍光顕微鏡、クライオスタ
ット及びフラックスサイトメーター）が必要なので実験
室内での使用に限られている。さらに、これらの方法に
よる細胞免疫標識の分析及び解読は、細胞学の専門家を
必要とする。
抗原を測定する方法の第２のグループは、全ての細胞の
マーカーを定量することに基づく、これらの方法は、直
接又は間接的に抗原を標識することによって行なわれる
が、より一般的には間接的に抗原を標識し、２段階ない
し４段階で行なわれる。全ての場合、最後の標識工程に
おいて採用された試薬は、例えばヨウ素１２５のような
放射免疫分析型の同位体的性質を有する（ ＢＲＯＷら
、Ｊ。
マーカーを定量することに基づく、これらの方法は、直
接又は間接的に抗原を標識することによって行なわれる
が、より一般的には間接的に抗原を標識し、２段階ない
し４段階で行なわれる。全ての場合、最後の標識工程に
おいて採用された試薬は、例えばヨウ素１２５のような
放射免疫分析型の同位体的性質を有する（ ＢＲＯＷら
、Ｊ。
Ｉｍｍｕｎｏｌ、 Ｍｅｔｈｏｄｓ、 １９７９．２６
．８７−９５１か又は最も一般的にはペルオキシダーゼ
、アルカリフォスファターゼ若しくはβ−ガラクトシダ
ーゼ（ＶＡＮ ＬＥＵＶＥＮら、Ｊ、 Ｉｍｍｕｎｏ
ｌ、 Ｍｅｔｈｏｄｓ、 １９７８゜２３、１０９
−１１６： ＭＯＲＲＩＳ、 Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａ
ｔｉｏｎ、 １９８３゜３６ （６１，７１９： ＢＡ
ＵＭＧＡＲＴＥＮ、 Ｊ、 Ｉｍｍｕｎｏｌ。
．８７−９５１か又は最も一般的にはペルオキシダーゼ
、アルカリフォスファターゼ若しくはβ−ガラクトシダ
ーゼ（ＶＡＮ ＬＥＵＶＥＮら、Ｊ、 Ｉｍｍｕｎｏ
ｌ、 Ｍｅｔｈｏｄｓ、 １９７８゜２３、１０９
−１１６： ＭＯＲＲＩＳ、 Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａ
ｔｉｏｎ、 １９８３゜３６ （６１，７１９： ＢＡ
ＵＭＧＡＲＴＥＮ、 Ｊ、 Ｉｍｍｕｎｏｌ。
Ｍｅｔｈｏｄｓ、 １９８６．９４．９１−９８１のよ
うな酵素免疫分析型の測定のための酵素であるプローブ
を有する。
うな酵素免疫分析型の測定のための酵素であるプローブ
を有する。
後者のグループの方法は、細胞材料を何回も洗浄し遠心
する必要があるのでかなり不便であり手間がかかり、危
険である。また、時々、最終的な分光学的定量を行なう
ために酵素反応の結果着色した溶液の試料を取る必要が
ある。さらに、はとんどの場合性なわれる細胞の化学的
固定において、グルタルアルデヒドやメタノールのよう
な常用される化学固定剤に対して特に感受性の高いある
種の抗原の不可逆的な破壊をもたらす（ｏＲＯＶＥＲら
、Ｊ、 Ｉｍｍｕｎｏｌ、 Ｍｅｔｈｏｄｓ、 １９８
６．９０．２７５−２８１１゜ 文献によると、数種類の抗原決定基、すなわちエピトー
プを有する抗原の分析において、このような抗原を、固
定化支持体上に不動化された抗体を用いてその１つのエ
ピトープを介して固定し、次いで酵素又は放射マーカー
を有するもう１つの抗体を用いてもう１つのエピトープ
に結合させて免疫分析を行なうことが記載されている。
する必要があるのでかなり不便であり手間がかかり、危
険である。また、時々、最終的な分光学的定量を行なう
ために酵素反応の結果着色した溶液の試料を取る必要が
ある。さらに、はとんどの場合性なわれる細胞の化学的
固定において、グルタルアルデヒドやメタノールのよう
な常用される化学固定剤に対して特に感受性の高いある
種の抗原の不可逆的な破壊をもたらす（ｏＲＯＶＥＲら
、Ｊ、 Ｉｍｍｕｎｏｌ、 Ｍｅｔｈｏｄｓ、 １９８
６．９０．２７５−２８１１゜ 文献によると、数種類の抗原決定基、すなわちエピトー
プを有する抗原の分析において、このような抗原を、固
定化支持体上に不動化された抗体を用いてその１つのエ
ピトープを介して固定し、次いで酵素又は放射マーカー
を有するもう１つの抗体を用いてもう１つのエピトープ
に結合させて免疫分析を行なうことが記載されている。
しばしばサンドイツチ法と呼ばれるこの方法は、フラン
ス国特許第２．４８７．９８３号、同第２．５００．１
６６号及び欧州特許出願筒１１９，７３６号に記載され
ている。「細胞」と言う語は時々これらの方法を適用す
べき抗原のリスト中に含まれているが、これらの文献の
いずれもこの方法を全細胞に適用することを記載してい
ない。
ス国特許第２．４８７．９８３号、同第２．５００．１
６６号及び欧州特許出願筒１１９，７３６号に記載され
ている。「細胞」と言う語は時々これらの方法を適用す
べき抗原のリスト中に含まれているが、これらの文献の
いずれもこの方法を全細胞に適用することを記載してい
ない。
上述の特許において記載された実施例の目的物を形成し
ている種々の抗原は、全ての場合、水又は生理学的流体
に可溶な、血液中の腫瘍マーカー、酵素又はホルモンの
ようなタンパク質分子のみである。一方、細胞は分子で
はないことは明らかであり、少なくとも分子よりはかな
り大きく、生理的流体に溶解しないことから分子と異な
っている。従って、サンドイツチ法は、現在まで全細胞
に適用されたことはない。
ている種々の抗原は、全ての場合、水又は生理学的流体
に可溶な、血液中の腫瘍マーカー、酵素又はホルモンの
ようなタンパク質分子のみである。一方、細胞は分子で
はないことは明らかであり、少なくとも分子よりはかな
り大きく、生理的流体に溶解しないことから分子と異な
っている。従って、サンドイツチ法は、現在まで全細胞
に適用されたことはない。
さらに、固体支持体上への細胞の免疫学的捕捉が国際出
願第８６７０２０９１号中に記載されている。
願第８６７０２０９１号中に記載されている。
これに記載された発明の目的は、移植しようとする骨髄
の試料から好ましくない細胞を除去することである。こ
れに記載された発明においては、細胞の捕捉は浮遊する
マイクロビーズ上で行なわれ、用いられる抗体は、ネッ
トワークリレーと呼ばれる複合高分子構造によって固体
支持体に結合される必要がある。ネットワークリレーに
よって、抗体を対応する細胞抗原に対して優先的に方向
づけすることが可能である。上記特許出願は、抗原の定
量的測定にこの技術を用いようとする示唆を全く与えて
いない。
の試料から好ましくない細胞を除去することである。こ
れに記載された発明においては、細胞の捕捉は浮遊する
マイクロビーズ上で行なわれ、用いられる抗体は、ネッ
トワークリレーと呼ばれる複合高分子構造によって固体
支持体に結合される必要がある。ネットワークリレーに
よって、抗体を対応する細胞抗原に対して優先的に方向
づけすることが可能である。上記特許出願は、抗原の定
量的測定にこの技術を用いようとする示唆を全く与えて
いない。
細胞の免疫的捕捉はまた、分析的用途について国際出願
８４７０３１５１号に記載されている。これに記載され
た発明の目的は、調べられる細胞が属する組織群を同定
することである（この操作は一般的にＨＬＡ分類と呼ば
れる）、細胞は、極めて特殊な支持体（ｉｌｌ微鏡カバ
ーグラス）上に特定の幾何学に従って配列されることに
よって捕捉される。結果は単に支持体を視覚的に観察す
ることによって得られ、「全又は無」的応答を生み出す
のみである。従って、従来記載された細胞の免疫的捕捉
系は、特定の細胞の膜上に現われた抗原の定量測定を可
能にはしていない、さらに、全てのこれらの系は、単一
の抗体による細胞の認識に基づいているので特異性に欠
ける。
８４７０３１５１号に記載されている。これに記載され
た発明の目的は、調べられる細胞が属する組織群を同定
することである（この操作は一般的にＨＬＡ分類と呼ば
れる）、細胞は、極めて特殊な支持体（ｉｌｌ微鏡カバ
ーグラス）上に特定の幾何学に従って配列されることに
よって捕捉される。結果は単に支持体を視覚的に観察す
ることによって得られ、「全又は無」的応答を生み出す
のみである。従って、従来記載された細胞の免疫的捕捉
系は、特定の細胞の膜上に現われた抗原の定量測定を可
能にはしていない、さらに、全てのこれらの系は、単一
の抗体による細胞の認識に基づいているので特異性に欠
ける。
この発明の主題を形成する測定方法は１、この分野にお
いて従来から知られ、用いられている方法と比較してか
なりの利点をもたらす。なぜなら、この発明の方法によ
り、細胞集団のあらゆる抗原の定量が単一の工程によっ
て可能になるからである。この定量方法は、あらゆる化
学的又は物理的な介在を経験しておらず従って生理的に
完全な状態にある細胞に対して適用することができる。
いて従来から知られ、用いられている方法と比較してか
なりの利点をもたらす。なぜなら、この発明の方法によ
り、細胞集団のあらゆる抗原の定量が単一の工程によっ
て可能になるからである。この定量方法は、あらゆる化
学的又は物理的な介在を経験しておらず従って生理的に
完全な状態にある細胞に対して適用することができる。
さらに、この発明の定量方法は、同一の細胞に担持され
た２つの異なる抗原に対して特異的な異なる２つの抗体
を用いる二重免疫認識系における本来的な性質として、
極めて高い特異性を有する。この方法は簡単で、迅速で
再現性がある。この方法は多数の試料を分析するのに非
常に適しており、多数の検体を扱う臨床実験室における
診断のために用いることに適している。
た２つの異なる抗原に対して特異的な異なる２つの抗体
を用いる二重免疫認識系における本来的な性質として、
極めて高い特異性を有する。この方法は簡単で、迅速で
再現性がある。この方法は多数の試料を分析するのに非
常に適しており、多数の検体を扱う臨床実験室における
診断のために用いることに適している。
この発明は、従って、以下の要素を有する、細胞集団又
は細胞下位集団に特徴的な少なくとも１つの表面抗原の
定量のためのキットに関する。
は細胞下位集団に特徴的な少なくとも１つの表面抗原の
定量のためのキットに関する。
ａ） 共有結合又は物理的吸着によってｌ又は２以上の
モノクローナル抗体が固定された固体支持体。このモノ
クローナル抗体は、調べる細胞集団の表面抗原のうち上
記特徴的な抗原とは異なる抗原に対して特異的であり、
定量しようとする抗原を担持する下位集団の細胞を支持
体上に不動化するためのものである。
モノクローナル抗体が固定された固体支持体。このモノ
クローナル抗体は、調べる細胞集団の表面抗原のうち上
記特徴的な抗原とは異なる抗原に対して特異的であり、
定量しようとする抗原を担持する下位集団の細胞を支持
体上に不動化するためのものである。
ｂ） 定量しようとする抗原を担持する細胞集団又は細
胞下位集団に特徴的な上記抗原に対して特異的なモノク
ローナル抗体であって、放射同位体標識又は酵素標識で
標識されたものを含む少なくとも１つの溶液。
胞下位集団に特徴的な上記抗原に対して特異的なモノク
ローナル抗体であって、放射同位体標識又は酵素標識で
標識されたものを含む少なくとも１つの溶液。
Ｃ） 酵素標識されたモノクローナル抗体の場合には、
酵素のための現像物（ｄｅｖｅｌｏｐｅｒ！、すなわち
、酵素のための基質及び必要な場合には酵素の活性を現
像するために必要なｌ又は２以上の試薬を含むｌ又は２
以上の溶液。
酵素のための現像物（ｄｅｖｅｌｏｐｅｒ！、すなわち
、酵素のための基質及び必要な場合には酵素の活性を現
像するために必要なｌ又は２以上の試薬を含むｌ又は２
以上の溶液。
この明細書及び特許請求の範囲において使用する「細胞
」という語は、ヒト、動物、原生動物及び微生物（細菌
及び菌類）の細胞を包含する。
」という語は、ヒト、動物、原生動物及び微生物（細菌
及び菌類）の細胞を包含する。
また、血液細胞という語は、白血球のような有核細胞並
びに赤血球及び血小板のような無核細胞を包含する。
びに赤血球及び血小板のような無核細胞を包含する。
この発明の定量方法は、全細胞、すなわち、溶解されて
いない細胞に対して適用される。
いない細胞に対して適用される。
これらの細胞は、あらゆる化学的又は物理的介在を受け
ていないので、生理的に完全な状態で分析に付される。
ていないので、生理的に完全な状態で分析に付される。
この状況は、定量のための標的に選択された膜マーカー
の完全さの最高の保証を与える。
の完全さの最高の保証を与える。
固体支持体としては、細胞懸濁液の取扱いに適したあら
ゆる装置を用いることができ、好ましくは、チューブ、
粒子磁気支持体又はポリエチレン、ポリスチレン、ポリ
塩化ビニル若しくはニトロセルロースから成る、マイク
ロウェルを有する堅固な又は可撓性のマイクロタイクー
ウェルを用いることができる。細胞の不動化のためのモ
ノクローナル抗体は共有結合又は５ＴＯＣＫＥＲと旺Ｕ
ＳＳＥＲ。
ゆる装置を用いることができ、好ましくは、チューブ、
粒子磁気支持体又はポリエチレン、ポリスチレン、ポリ
塩化ビニル若しくはニトロセルロースから成る、マイク
ロウェルを有する堅固な又は可撓性のマイクロタイクー
ウェルを用いることができる。細胞の不動化のためのモ
ノクローナル抗体は共有結合又は５ＴＯＣＫＥＲと旺Ｕ
ＳＳＥＲ。
Ｊ、 ［ｍｎ＋ｕｎｏ１． Ｍｅｔｈｏｄｓ、１９７９
．ｖｏｌ、 ２６． ｐｐ、８７−９５に開示されたよ
うな従来の物理的吸着によって固体支持体に固定するこ
とができる。好ましくは、支持体は予めタンパク質で飽
和しておく。
．ｖｏｌ、 ２６． ｐｐ、８７−９５に開示されたよ
うな従来の物理的吸着によって固体支持体に固定するこ
とができる。好ましくは、支持体は予めタンパク質で飽
和しておく。
この発明においては、支持体に固定されたモノクローナ
ル抗体は、定量しようとする抗原を担持する細胞集団を
包含する細胞集団の免疫的捕捉を許容しなければならな
いにの細胞集団がヒト細胞から成る場合には、免疫捕捉
のための好ましいモノクローナル抗体は、白血球及びヒ
トの種々の他のセルライン上に存在する）ＩＬＡ−Ａ、
−Ｂ、及び−Ｃ抗原の共通部分に対して特異的な抗りラ
ス１１１ＬＡ抗体である。これらの抗体のうち、Ｓ−ク
ラス■と呼ばれる、バイオシス社から重版されている抗
体が特に好ましい。
ル抗体は、定量しようとする抗原を担持する細胞集団を
包含する細胞集団の免疫的捕捉を許容しなければならな
いにの細胞集団がヒト細胞から成る場合には、免疫捕捉
のための好ましいモノクローナル抗体は、白血球及びヒ
トの種々の他のセルライン上に存在する）ＩＬＡ−Ａ、
−Ｂ、及び−Ｃ抗原の共通部分に対して特異的な抗りラ
ス１１１ＬＡ抗体である。これらの抗体のうち、Ｓ−ク
ラス■と呼ばれる、バイオシス社から重版されている抗
体が特に好ましい。
調べられる細胞がヒト細胞である他の場合及び調べられ
る細胞がヒト細胞ではない全ての場合において、調べら
れる細胞の型に対して適当なモノクローナル抗体はまた
、この発明における免疫捕捉のために用いることができ
る。
る細胞がヒト細胞ではない全ての場合において、調べら
れる細胞の型に対して適当なモノクローナル抗体はまた
、この発明における免疫捕捉のために用いることができ
る。
［酵素標識されたモノクローナル抗体」という表現は、
適当な試薬を用いることによって、このモノクローナル
抗体の定量を可能にする酵素と結合されたモノクローナ
ル抗体を意味する。
適当な試薬を用いることによって、このモノクローナル
抗体の定量を可能にする酵素と結合されたモノクローナ
ル抗体を意味する。
基質及び試薬は、酵素によって引き起こされる反応又は
一連の反応の最終産物が以下のような物質となるように
選択される。
一連の反応の最終産物が以下のような物質となるように
選択される。
一細胞を囲包する液体媒体へ拡散し、最終的な分光学的
又は蛍光的測定の対象物となる着色又は蛍光物質。
又は蛍光的測定の対象物となる着色又は蛍光物質。
一細胞上及びそれらが固定されている壁土に被着され、
反射又は標準的な蔭の範囲に対する場合には可視的測定
の対象となる、不溶性の着色物質、 ・ 追加的な要素として、分析キットは、細胞の不動化又は
選択された標識を担う抗体による細胞の標識の後に固体
支持体を洗浄することを意図するＩｆｉ液を含んでいて
よい。
反射又は標準的な蔭の範囲に対する場合には可視的測定
の対象となる、不溶性の着色物質、 ・ 追加的な要素として、分析キットは、細胞の不動化又は
選択された標識を担う抗体による細胞の標識の後に固体
支持体を洗浄することを意図するＩｆｉ液を含んでいて
よい。
さらなる要素として、分析キットはまた定量の標準化及
び品質管理に必要な試料を含んでいてもよい。
び品質管理に必要な試料を含んでいてもよい。
この発明はさらに、
一細胞上に存在する抗原のうち、定量しようとする抗原
とは異なる抗原を認識することができるモノクローナル
抗体であって、共有結合又は物理的吸着により固′体支
持体−に測定された１又は２以上のモノクローナル抗体
を繭いて定量じようとす衣表面抗原を有する細胞集団を
固体゛支持体上に特異的に不動化すな゛わち免疫捕捉し
、同時に、−不動化された細胞集団又はその下位集団に
属する′、定量しようとする表面抗原を、放射標識又は
酵素標識で標識され該表面抗原に対して特異的なモノク
ローナル抗体で直接的に標−する工程と、−免疫捕捉及
び標識を同時に行なわせるためにインキュベーションす
る工程と、 一固体支持体を洗浄して不動化されなかった不所望の細
胞及び放射標識又は酵素標識を有する過剰のモノクロー
ナル抗体を除去する工程と、−固定された放射能を測定
することにより、又は酵素の基質及び必要ならばｌ又は
２以上の適当な補助試薬を液に加えた後、吸光度若しく
は反射率若しくは蛍光を光学的に測定することによって
、標識された細胞集団又は下位集団中の定量ｉべき抗原
を実際に定量する工程を含む、細胞集団又は下位集団の
表面抗原の免疫定量方法を提供する。
とは異なる抗原を認識することができるモノクローナル
抗体であって、共有結合又は物理的吸着により固′体支
持体−に測定された１又は２以上のモノクローナル抗体
を繭いて定量じようとす衣表面抗原を有する細胞集団を
固体゛支持体上に特異的に不動化すな゛わち免疫捕捉し
、同時に、−不動化された細胞集団又はその下位集団に
属する′、定量しようとする表面抗原を、放射標識又は
酵素標識で標識され該表面抗原に対して特異的なモノク
ローナル抗体で直接的に標−する工程と、−免疫捕捉及
び標識を同時に行なわせるためにインキュベーションす
る工程と、 一固体支持体を洗浄して不動化されなかった不所望の細
胞及び放射標識又は酵素標識を有する過剰のモノクロー
ナル抗体を除去する工程と、−固定された放射能を測定
することにより、又は酵素の基質及び必要ならばｌ又は
２以上の適当な補助試薬を液に加えた後、吸光度若しく
は反射率若しくは蛍光を光学的に測定することによって
、標識された細胞集団又は下位集団中の定量ｉべき抗原
を実際に定量する工程を含む、細胞集団又は下位集団の
表面抗原の免疫定量方法を提供する。
この発明の分析キット及び免疫定量方法は、好ましくは
ヒト血液の形成要素、特に白血球、さらに詳細に言うと
リンパ球、Ｔリンパ球、Ｔ ４１Ｊンバ球、Ｔ８リンパ
球及びＢリンパ球並びに顆粒白血球、単球及び血小板の
表面抗原を定量するために適用される。
ヒト血液の形成要素、特に白血球、さらに詳細に言うと
リンパ球、Ｔリンパ球、Ｔ ４１Ｊンバ球、Ｔ８リンパ
球及びＢリンパ球並びに顆粒白血球、単球及び血小板の
表面抗原を定量するために適用される。
もう１つの好ましい用途は、例えばカンデイグ・アルビ
カンスのような病原性微生物の表面抗原の定量である。
カンスのような病原性微生物の表面抗原の定量である。
この発明の分析キット及び免疫定量方法はまた。腫瘍細
胞、特に泌尿器官の癌及び悪性血液箱の表面抗原の定量
に特に有用である。
胞、特に泌尿器官の癌及び悪性血液箱の表面抗原の定量
に特に有用である。
この発明の分析キット及び免疫定量方法は、調べる細胞
集団中に存在する細胞数及びこれらの細胞の表面上の測
定される抗原の密度の両方に依存した信号（吸光若しく
は発光又は放射能）を測定することを可能にする。これ
らの信号を測定することにより、調べられる細胞集団又
は下位集団によって担持されるこの抗原分子の総数の定
量が可能になり、この抗原が構造的又は機能的役割を有
しているかどうかを推定することができる。
集団中に存在する細胞数及びこれらの細胞の表面上の測
定される抗原の密度の両方に依存した信号（吸光若しく
は発光又は放射能）を測定することを可能にする。これ
らの信号を測定することにより、調べられる細胞集団又
は下位集団によって担持されるこの抗原分子の総数の定
量が可能になり、この抗原が構造的又は機能的役割を有
しているかどうかを推定することができる。
例えば、血液学において−めで重要な白血球マーカーの
場合には、健常なｉ体における多くの場合には、抗原密
度の平均値は１つの試料及び同一の細胞集団の間に実質
的に違いはな（、従って、定量すべき抗原を担持する細
胞の細胞学的数と、被検試料中に存在する抗原分子の総
数であるこの発明に従って定量される信号との間には良
い相関関係がある。逆に、病的な状態では、表面抗原の
密度は、陽性細胞の数又は比率に大きな違いがなくても
１つの同一の細胞集団中で表面抗原の密度が変化し得る
。このような病的な状態は、従来の細胞学的計数方法を
用いるよりも本発明の免疫定量方法を適用することによ
り、又は本発明のキットを用いることによってより効果
的に検出することができる。
場合には、健常なｉ体における多くの場合には、抗原密
度の平均値は１つの試料及び同一の細胞集団の間に実質
的に違いはな（、従って、定量すべき抗原を担持する細
胞の細胞学的数と、被検試料中に存在する抗原分子の総
数であるこの発明に従って定量される信号との間には良
い相関関係がある。逆に、病的な状態では、表面抗原の
密度は、陽性細胞の数又は比率に大きな違いがなくても
１つの同一の細胞集団中で表面抗原の密度が変化し得る
。このような病的な状態は、従来の細胞学的計数方法を
用いるよりも本発明の免疫定量方法を適用することによ
り、又は本発明のキットを用いることによってより効果
的に検出することができる。
この発明のもう１つの用途は、マイクロタイタープレー
トを固体支持体として用いることによって明らかになる
。この発明の分析キット及び免疫定量方法は、被検細胞
集団を構成している種々の下位集団に特徴的な一連の表
面抗原の単一のプレート上での測定を有利に行なうため
に用いることができる。この用途のために、被検集団の
全ての細胞を保持することができｌ又は２以上のモノク
ローナル抗体が予め結合された直ちに使用できるマイク
ロタイタープレートを採用し、−方、定量すべき下位集
団の１つに特徴的な抗原に対して特異的な適当なマーカ
ーと結合された一連のモノクローナル抗体を有すること
が可能である。従って、単一の操作で、１つの同一の支
持体上で、選択された下位集団の特徴づけに必要な全て
の抗原の定量を行なうことが可能になる。
トを固体支持体として用いることによって明らかになる
。この発明の分析キット及び免疫定量方法は、被検細胞
集団を構成している種々の下位集団に特徴的な一連の表
面抗原の単一のプレート上での測定を有利に行なうため
に用いることができる。この用途のために、被検集団の
全ての細胞を保持することができｌ又は２以上のモノク
ローナル抗体が予め結合された直ちに使用できるマイク
ロタイタープレートを採用し、−方、定量すべき下位集
団の１つに特徴的な抗原に対して特異的な適当なマーカ
ーと結合された一連のモノクローナル抗体を有すること
が可能である。従って、単一の操作で、１つの同一の支
持体上で、選択された下位集団の特徴づけに必要な全て
の抗原の定量を行なうことが可能になる。
この発明のこの適用は、臨床生物学における被検細胞の
抗原性の特徴づけによって例示される。第１のケースは
、従来よりＨＬＡ分類として知られる、個人の特徴づけ
の組織グループの決定によって代表される。
抗原性の特徴づけによって例示される。第１のケースは
、従来よりＨＬＡ分類として知られる、個人の特徴づけ
の組織グループの決定によって代表される。
第２のケースは、白血病又はリンパ腫のような悪性血液
病に罹患した患者のための、腫瘍細胞の分類によって代
表される。系統的に行なわれるこの診断は、これらの細
胞に特徴的な表面抗原が存在するか否北によって患者の
腫瘍細胞の型及び期限を特徴づけることから成る。
病に罹患した患者のための、腫瘍細胞の分類によって代
表される。系統的に行なわれるこの診断は、これらの細
胞に特徴的な表面抗原が存在するか否北によって患者の
腫瘍細胞の型及び期限を特徴づけることから成る。
被検細胞集団の全てを固定することができるｌ又は２以
上のモノクローナル抗体が予め固定されたマイクロタイ
クープレートと、ｍｓ細胞上に存在する抗原に対して特
異的な、酵素又は放射標識された異なるモノクローナル
抗体の溶液を含むこの発明のキットを用いることによっ
て、患者の腫瘍細胞集団に特徴的な抗原の定量が可能に
なり、従って、臨床的に特徴付けられた癌、特に悪性血
液学の１つに関連づけることが可能になる。
上のモノクローナル抗体が予め固定されたマイクロタイ
クープレートと、ｍｓ細胞上に存在する抗原に対して特
異的な、酵素又は放射標識された異なるモノクローナル
抗体の溶液を含むこの発明のキットを用いることによっ
て、患者の腫瘍細胞集団に特徴的な抗原の定量が可能に
なり、従って、臨床的に特徴付けられた癌、特に悪性血
液学の１つに関連づけることが可能になる。
この発明の方法の適用は、このように、迅速にかつ単一
の支持体上で腫瘍細胞の抗原を定性的及び定量的に測定
することを可能にする。
の支持体上で腫瘍細胞の抗原を定性的及び定量的に測定
することを可能にする。
この発明の他の用途の例示としてのべることができる１
つのケースは、２つの細胞下位集団が存在するヒトＴリ
ンパ毬の測定である。すなわち、ＣＤ４マーカー、の存
在によって特徴付けられ、陽性Ｔ４リンパ球、あるいは
より簡単にＴ４リンパ球と呼ばれるリンパ球と、ＣＤ８
マーカーの存在によって特徴付けられ、陽性Ｔ８リンパ
球（又はＴ８リンパ球）と呼ばれるリンパ球である。
つのケースは、２つの細胞下位集団が存在するヒトＴリ
ンパ毬の測定である。すなわち、ＣＤ４マーカー、の存
在によって特徴付けられ、陽性Ｔ４リンパ球、あるいは
より簡単にＴ４リンパ球と呼ばれるリンパ球と、ＣＤ８
マーカーの存在によって特徴付けられ、陽性Ｔ８リンパ
球（又はＴ８リンパ球）と呼ばれるリンパ球である。
Ｔ４／Ｔ８の数の比率を測定することは臨床生物学上で
極めて興味深いことである。実際、Ｔ４／Ｔ８比率の変
化は、脱免疫疾患、慢性感染症、ウィルス性感染特にＨ
ＩＶ疾病（ＡＩＤＳウィルス）のような種々の免疫疾患
において現われる。
極めて興味深いことである。実際、Ｔ４／Ｔ８比率の変
化は、脱免疫疾患、慢性感染症、ウィルス性感染特にＨ
ＩＶ疾病（ＡＩＤＳウィルス）のような種々の免疫疾患
において現われる。
この発明の分析キット及び免疫分析方法は、Ｔリンパ球
全体に特徴的な抗原及び／又はＴ４又はＴ８下位集団に
とって特徴的な抗原の測定に用いることができる。この
場合、被検試料のＴリンパ球は、固体支持体上に特異的
に不動化され、同時に、Ｔ４リンパ球の表面抗原は放射
標識又・は酵素標識を担う抗ＣＤ４モノクローナル抗体
で直接的に標識され、Ｔ８リンパ球の表面抗原は適当な
標識を有する抗ＣＤ８モノクローナル抗体で直接的に標
識される。
全体に特徴的な抗原及び／又はＴ４又はＴ８下位集団に
とって特徴的な抗原の測定に用いることができる。この
場合、被検試料のＴリンパ球は、固体支持体上に特異的
に不動化され、同時に、Ｔ４リンパ球の表面抗原は放射
標識又・は酵素標識を担う抗ＣＤ４モノクローナル抗体
で直接的に標識され、Ｔ８リンパ球の表面抗原は適当な
標識を有する抗ＣＤ８モノクローナル抗体で直接的に標
識される。
試料のＴリンパ球の特異的不動化は、それ自体又は組み
合わされて試料のＴ細胞の全てを認識することができる
１又は２以上のモノクローナル抗体を用いて好ましくは
行なわれる。Ｔ細胞の全てを認識できるモノクローナル
抗体は、杭共通白血球抗体（又は抗ＣＤ４５抗体）又は
抗ＣＤ２抗体（又は抗Ｔｌｌ抗体）、抗ＣＤ ５． （
又は抗Ｔ１）抗体又は抗ＣＤ７抗体（又は抗Ｔ２抗体）
又はＷＨＯの基準によっては分類されていない他のｐａ
ｎ−Ｔ抗体のような、Ｔ細胞全体を認識することができ
る抗体である。
合わされて試料のＴ細胞の全てを認識することができる
１又は２以上のモノクローナル抗体を用いて好ましくは
行なわれる。Ｔ細胞の全てを認識できるモノクローナル
抗体は、杭共通白血球抗体（又は抗ＣＤ４５抗体）又は
抗ＣＤ２抗体（又は抗Ｔｌｌ抗体）、抗ＣＤ ５． （
又は抗Ｔ１）抗体又は抗ＣＤ７抗体（又は抗Ｔ２抗体）
又はＷＨＯの基準によっては分類されていない他のｐａ
ｎ−Ｔ抗体のような、Ｔ細胞全体を認識することができ
る抗体である。
この発明の免疫分析方法は、同一の固体支持体上のいく
つかの部分の上において、Ｔリンパ球並びにＴ４及びＴ
８リンパ球細胞集団に特徴的な抗原の定量を行なうため
に有利に用いることができる。放射能測定、吸光度若し
くは反射率又は蛍光測定による光学的測定によって信号
を測定することにより、ＣＤ４／ＣＤ８の数の比率を容
易に直接的に計算することができる。
つかの部分の上において、Ｔリンパ球並びにＴ４及びＴ
８リンパ球細胞集団に特徴的な抗原の定量を行なうため
に有利に用いることができる。放射能測定、吸光度若し
くは反射率又は蛍光測定による光学的測定によって信号
を測定することにより、ＣＤ４／ＣＤ８の数の比率を容
易に直接的に計算することができる。
同様に、同一の支持体上で、全体のリンパ球ラインを構
成しているＴリンパ球及びＢリンパ球の下位集団を測定
することも可能である。
成しているＴリンパ球及びＢリンパ球の下位集団を測定
することも可能である。
例えば、Ｔ細胞の全ての表面抗原に対して特異的なモノ
クローナル抗体又はモノクローナル抗体混合物をマイク
ロウェルの壁に吸着させることによって固定することが
できる。これらのモノクローナル抗体は、後の段階にお
いて、被検試料のＴ細胞集団全体をマイクロウェル中に
固定することを可能にする。このようにして調製された
プレートは凍結乾燥され、好ましくは４℃にて保存され
る。この段階は産業的な規模で行なうことができ、従っ
て、Ｔリンパ球全体又はＴリンパ球のいずれかの下位集
団に適用することができる′１直ちに使用できる分析キ
ットを提供することが可能である。
クローナル抗体又はモノクローナル抗体混合物をマイク
ロウェルの壁に吸着させることによって固定することが
できる。これらのモノクローナル抗体は、後の段階にお
いて、被検試料のＴ細胞集団全体をマイクロウェル中に
固定することを可能にする。このようにして調製された
プレートは凍結乾燥され、好ましくは４℃にて保存され
る。この段階は産業的な規模で行なうことができ、従っ
て、Ｔリンパ球全体又はＴリンパ球のいずれかの下位集
団に適用することができる′１直ちに使用できる分析キ
ットを提供することが可能である。
血液又はいずれの適当な正常又は病的生物学的流体を起
源“とする、測定すべき細胞を含む試料は調製後そのま
ま、特に公知の方法により密度勾配遠心によって調製し
た後、さらに特には例えばファルマシア社製ＦＩＣＯＬ
Ｌ−ＰＬＡＱＬＩＥのような高密度培地中での遠心によ
って調製した後そのまま用いることができる。血液リン
パ球を定量するために、被検血液試料を、溶解緩衝液と
呼ばれ赤血球を溶解する溶液で処理することもできる。
源“とする、測定すべき細胞を含む試料は調製後そのま
ま、特に公知の方法により密度勾配遠心によって調製し
た後、さらに特には例えばファルマシア社製ＦＩＣＯＬ
Ｌ−ＰＬＡＱＬＩＥのような高密度培地中での遠心によ
って調製した後そのまま用いることができる。血液リン
パ球を定量するために、被検血液試料を、溶解緩衝液と
呼ばれ赤血球を溶解する溶液で処理することもできる。
適当な細胞懸濁液の一部が、固体支持体、例えば予め調
製されたマクロタイタープレートのマイクロウェルのよ
うな支持体と接触させられ、同時に、標的細胞集団に特
異的なモノクローナル抗体であって放射標識又は酵素標
識を有するモノクローナル抗体と接触させられる。放射
標識は、例えば、公知の方法（Ｆ、Ｃ，ＧＲＥＥＮＷＯ
ＯＤ、Ｗ、Ｍ。
製されたマクロタイタープレートのマイクロウェルのよ
うな支持体と接触させられ、同時に、標的細胞集団に特
異的なモノクローナル抗体であって放射標識又は酵素標
識を有するモノクローナル抗体と接触させられる。放射
標識は、例えば、公知の方法（Ｆ、Ｃ，ＧＲＥＥＮＷＯ
ＯＤ、Ｗ、Ｍ。
ＨＵＮＴＥＲら、 Ｂｉｏｃｈｅｎ＋、 Ｊ、 １９６
３．８９．１１４）にょってクロラミンＴの存在下でヨ
ウ素１２５または１３１でモノクローナル抗体を標識す
ることによって調製することができる。また、酵素標識
は、モノクローナル抗体をアルカリフォスファターゼ、
ペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ又はアセチル
コリンエステラーゼのような酵素と、公知の方法（例え
ば、Ｍ、 ０°５ｕｌｌｉｖａｎ。
３．８９．１１４）にょってクロラミンＴの存在下でヨ
ウ素１２５または１３１でモノクローナル抗体を標識す
ることによって調製することができる。また、酵素標識
は、モノクローナル抗体をアルカリフォスファターゼ、
ペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ又はアセチル
コリンエステラーゼのような酵素と、公知の方法（例え
ば、Ｍ、 ０°５ｕｌｌｉｖａｎ。
Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、 １９
８１．７３．１４７１又はそれに基づ（方法によって結
合することによって調製することができる。ある場合に
は、放射能物質の取扱いに伴う不利及び試ｉの保存期間
が短いことを避けるために、放射標識よりも酵素標識の
方が好ましく用いられる。
８１．７３．１４７１又はそれに基づ（方法によって結
合することによって調製することができる。ある場合に
は、放射能物質の取扱いに伴う不利及び試ｉの保存期間
が短いことを避けるために、放射標識よりも酵素標識の
方が好ましく用いられる。
インキュベーション時間、すなわち、細胞の不動化及び
同時的な標識のために必要な時間は。
同時的な標識のために必要な時間は。
好ましくは１時間以下である。この時間内に、固体支持
体は必要ならば細胞の不動化を改善するために遠心する
ことができる。この固体支持体、例えばマイクロタイタ
ープレートは、次いで洗浄されて非吸着細胞が除去され
、同時に酵素標識又は放射標識を有する過剰のモノクロ
ーナル抗体も除去される。
体は必要ならば細胞の不動化を改善するために遠心する
ことができる。この固体支持体、例えばマイクロタイタ
ープレートは、次いで洗浄されて非吸着細胞が除去され
、同時に酵素標識又は放射標識を有する過剰のモノクロ
ーナル抗体も除去される。
例えばヨウ素１２５のような放射標識が用いられる場合
には、細胞に付随する放射能は適当ないずれかの方法に
よりガンマ計数管で測定され、例えばこれは、細胞をア
ルカリ溶液（例えば水酸化ナトリウム溶液）に溶解し、
吸着バッファーを用いて放射能を含む溶液を回収した後
に行なうことができる。
には、細胞に付随する放射能は適当ないずれかの方法に
よりガンマ計数管で測定され、例えばこれは、細胞をア
ルカリ溶液（例えば水酸化ナトリウム溶液）に溶解し、
吸着バッファーを用いて放射能を含む溶液を回収した後
に行なうことができる。
酵素プローブをモノクローナル抗体に対して使用した場
合には、測定すべき抗原を有するｉＩＩ胞ポピユレーシ
ョンが固定されている固相支持体に、酵素に対する基質
および一種以上の補助試薬を含有した溶液を添加する。
合には、測定すべき抗原を有するｉＩＩ胞ポピユレーシ
ョンが固定されている固相支持体に、酵素に対する基質
および一種以上の補助試薬を含有した溶液を添加する。
この補助試薬は、プローブ酵素が関与した反応により既
述の最終生産物、即ち、培地に可溶または不溶の呈色生
成物、または培地に可溶の蛍光性生成物の何れかを生じ
るものでψる。その結果、上記溶液を添加することによ
り呈色または蛍光が生じる。その後、この方法で処理し
た試料からの光シグナルを、各々の場合に適切な装置、
即ち、透過型もしくは反射型の光度計、または各種の型
の蛍光光度計を用いて測定する。固相支持体が滴定用マ
イクロプレートである場合には、分光光度計用のタイタ
ーチックプレー１−リーダー（Ｔｉｔｅｒｔｅｋ ｐｌ
ａｔｅ ｒｅａｄｅｒ ）または蛍光光度法による読取
りのためのフルオロスキャンプレートリーダー（Ｆｌｕ
ｑｒｏｓｃａｎ ｐｌａｔｅ ｒｅａ、ｄｅｒ ）のよ
うに、生物学研究所において一般に使用されている自動
リーダーを用いることによって、−枚の同じプレートに
おける全てののウェルについて連続的に光シグナルを読
取ることができる。
述の最終生産物、即ち、培地に可溶または不溶の呈色生
成物、または培地に可溶の蛍光性生成物の何れかを生じ
るものでψる。その結果、上記溶液を添加することによ
り呈色または蛍光が生じる。その後、この方法で処理し
た試料からの光シグナルを、各々の場合に適切な装置、
即ち、透過型もしくは反射型の光度計、または各種の型
の蛍光光度計を用いて測定する。固相支持体が滴定用マ
イクロプレートである場合には、分光光度計用のタイタ
ーチックプレー１−リーダー（Ｔｉｔｅｒｔｅｋ ｐｌ
ａｔｅ ｒｅａｄｅｒ ）または蛍光光度法による読取
りのためのフルオロスキャンプレートリーダー（Ｆｌｕ
ｑｒｏｓｃａｎ ｐｌａｔｅ ｒｅａ、ｄｅｒ ）のよ
うに、生物学研究所において一般に使用されている自動
リーダーを用いることによって、−枚の同じプレートに
おける全てののウェルについて連続的に光シグナルを読
取ることができる。
酵素プローブとしてアルカリホスファターゼが使用され
る場合には、この酵素はベーリンガー・マンハイム（Ｂ
ｏｅｈｒｉｎｏｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ ）が提唱した
方法（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ）に従ってモノクローナル
抗体と結合される。この酵素に対する好ましい基質は、
分光光度計で最終的な読取りを行なうときにはパラニト
ロフェニルホスフェート、蛍光光度計で読取るときには
４−メチルウンベリフエリルホスフエートである。また
、不溶性呈色反応生成物を得るための５−ブロモ−４−
クロロインドール−３−イルホスフェートも好適な基質
である。同様に、β−ガラクトシダーゼを酵素プローブ
として使用することができ、その場合の好ましい基質は
、オルトニトロフＩニルーβ−Ｄ−ガラクトピラノシド
または４−メチルウシペリフェリルーβ−ローガラクト
ピラノシドであろう。
る場合には、この酵素はベーリンガー・マンハイム（Ｂ
ｏｅｈｒｉｎｏｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ ）が提唱した
方法（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ）に従ってモノクローナル
抗体と結合される。この酵素に対する好ましい基質は、
分光光度計で最終的な読取りを行なうときにはパラニト
ロフェニルホスフェート、蛍光光度計で読取るときには
４−メチルウンベリフエリルホスフエートである。また
、不溶性呈色反応生成物を得るための５−ブロモ−４−
クロロインドール−３−イルホスフェートも好適な基質
である。同様に、β−ガラクトシダーゼを酵素プローブ
として使用することができ、その場合の好ましい基質は
、オルトニトロフＩニルーβ−Ｄ−ガラクトピラノシド
または４−メチルウシペリフェリルーβ−ローガラクト
ピラノシドであろう。
モノクローナル抗体は、パーオキシダーゼと好適に結合
することができる。この場合の結合工程は、Ｍ、Ｂ、讐
Ｉ ＬＳＯＮおよびＰ、に、ＮＡＫＡＮＥ著「免疫蛍光
法および関連染色技法Ｊ （Ｗ、Ｋｎａｐｐ、に、に
ｏｌｕｂａｒおよびＧ、１４ｉｃｋｓ ｌｆＡ、Ｅｌｓ
ｅｖｉｅｒ／北オランダ、アムステルダム、１９７８．
２１５−２２４頁）の記述から導かれる。酵素結合の形
成のための曲記■程との比較によって明らかな変更は以
下の点に関するものである。
することができる。この場合の結合工程は、Ｍ、Ｂ、讐
Ｉ ＬＳＯＮおよびＰ、に、ＮＡＫＡＮＥ著「免疫蛍光
法および関連染色技法Ｊ （Ｗ、Ｋｎａｐｐ、に、に
ｏｌｕｂａｒおよびＧ、１４ｉｃｋｓ ｌｆＡ、Ｅｌｓ
ｅｖｉｅｒ／北オランダ、アムステルダム、１９７８．
２１５−２２４頁）の記述から導かれる。酵素結合の形
成のための曲記■程との比較によって明らかな変更は以
下の点に関するものである。
・パーオキシダーゼ／抗体のモル比は、市記プロトコー
ルにおいては２であるのに対して３である。
ルにおいては２であるのに対して３である。
・パーオキシダーゼの炭水化物ユニットの酸化は、過ヨ
ウ素酸ナトリウムの所定の濃度における３３％のりダク
ションによって、より穏やかなものである。
ウ素酸ナトリウムの所定の濃度における３３％のりダク
ションによって、より穏やかなものである。
モノクローナル抗体と結合したパーオキシダーゼの発現
に使用した試薬は、酵素の基質である過酸を水素、およ
び適当なりロモーゲン、例えば、呈色しかつ培地に可溶
の最終反応生成物を傳るためのオル１〜フエニレンジア
ミンもしくは２．２＝−アジノ−ビス（３−エチルベン
ゾチアゾリン）−〇−スルホン酸（すなわち＾ＢＴＳ＞
、または不溶性の最終生成物を得るための３．３−一
ジアミノベンジジン、３−アミノ−９−エチルカルバゾ
ール４−クロロ−α−ナフトール、または培地に可溶の
蛍光性反応生成物を得るためのパラヒドロキシフェニル
プロピオン酸を含有する。
に使用した試薬は、酵素の基質である過酸を水素、およ
び適当なりロモーゲン、例えば、呈色しかつ培地に可溶
の最終反応生成物を傳るためのオル１〜フエニレンジア
ミンもしくは２．２＝−アジノ−ビス（３−エチルベン
ゾチアゾリン）−〇−スルホン酸（すなわち＾ＢＴＳ＞
、または不溶性の最終生成物を得るための３．３−一
ジアミノベンジジン、３−アミノ−９−エチルカルバゾ
ール４−クロロ−α−ナフトール、または培地に可溶の
蛍光性反応生成物を得るためのパラヒドロキシフェニル
プロピオン酸を含有する。
好ましい形態としては、この発明によるＴ， Ｔ４およ
びＴ８リンパ球の抗原特性を測定するためのキットは、
下記ａ）〜ｃ２）の構成要素を具備する。
びＴ８リンパ球の抗原特性を測定するためのキットは、
下記ａ）〜ｃ２）の構成要素を具備する。
ａ）１種もしくはそれ以上のＴリンパ球に対するモノク
ローナル抗体が、ウェルに固定されている滴定用マイク
ロプレート、 ｂｌ）少なくとも１種のパーオキシダーゼでラベルした
Ｔリンパ球に対するモノクローナル抗体を含有する溶液
、 ｂｌ）少なくとも１種のパーオキシダーゼでラベルした
ＣＤ４抗原に対するモノクローナル抗体を含有する溶液
、 ｂ３）少なくとも１種のパーオキシダーゼでラベルした
ＣＤ８抗原に対するモノクローナル抗体を含有する溶液
、 ｃｌ）適当な緩釘液中に酵素の基質である過酸化水素を
含有する溶液、および Ｃ２）Ｍｌ酵素性性発現を認識可能な形態にするために
使用されるりｄモーグンを含有する溶液。
ローナル抗体が、ウェルに固定されている滴定用マイク
ロプレート、 ｂｌ）少なくとも１種のパーオキシダーゼでラベルした
Ｔリンパ球に対するモノクローナル抗体を含有する溶液
、 ｂｌ）少なくとも１種のパーオキシダーゼでラベルした
ＣＤ４抗原に対するモノクローナル抗体を含有する溶液
、 ｂ３）少なくとも１種のパーオキシダーゼでラベルした
ＣＤ８抗原に対するモノクローナル抗体を含有する溶液
、 ｃｌ）適当な緩釘液中に酵素の基質である過酸化水素を
含有する溶液、および Ｃ２）Ｍｌ酵素性性発現を認識可能な形態にするために
使用されるりｄモーグンを含有する溶液。
この発明の他の好ましい態様は、アセチルコリンエステ
ラーゼと結合したモノクローナル抗体の使用である。
ラーゼと結合したモノクローナル抗体の使用である。
アセチルコリンエステラーゼは、フランス国特許２５５
０７９９号の記述から誘導される工程、または、公知の
技法によって抗体フラグメン１−を調製し、適当な異種
二官能性試薬との反応によって酵素を変性させ、および
最終的に得られた生成物を結合させることを概略含む工
程を用いて酵素と好ましく結合する。免疫酵素結合体を
構成するだめの他の公知の工程もまたこの場合に使用す
ることができる。
０７９９号の記述から誘導される工程、または、公知の
技法によって抗体フラグメン１−を調製し、適当な異種
二官能性試薬との反応によって酵素を変性させ、および
最終的に得られた生成物を結合させることを概略含む工
程を用いて酵素と好ましく結合する。免疫酵素結合体を
構成するだめの他の公知の工程もまたこの場合に使用す
ることができる。
アセチルコリンエステラーゼ結合抗体によって認識され
る［１１＋２１抗原と特に関連する酵素活性の発現は、
例えばプラデレス（Ｐｒａｄｅｌ Ｉｅｓ ）らによっ
て記述されたように（＾ｎａ１．ｃｈｅ１．．５７（１
９８５） １１７０−１１７３＞ 、実験条件に適す
るように変更した公知の方法によって好適に行なわれる
。この方法では、Ｉ酵素の基質としてアセチルコリンを
用い、またクロモーゲンとしてエルマン試薬（Ｅｌ１ｍ
ａｎ’５ｒｅａＱｅｎｔ） 、即ち５．５−一ジチオー
２−ニトロ安息香酸を用いる。
る［１１＋２１抗原と特に関連する酵素活性の発現は、
例えばプラデレス（Ｐｒａｄｅｌ Ｉｅｓ ）らによっ
て記述されたように（＾ｎａ１．ｃｈｅ１．．５７（１
９８５） １１７０−１１７３＞ 、実験条件に適す
るように変更した公知の方法によって好適に行なわれる
。この方法では、Ｉ酵素の基質としてアセチルコリンを
用い、またクロモーゲンとしてエルマン試薬（Ｅｌ１ｍ
ａｎ’５ｒｅａＱｅｎｔ） 、即ち５．５−一ジチオー
２−ニトロ安息香酸を用いる。
列記されたクロモーゲンはそのままで、または水溶性の
塩の形態で使用する。
塩の形態で使用する。
この発明による抗原の測定の結果は、実施された実験に
おいて適当であればいかなる形態でも表現することがで
きる。就中、これらの結果は、被験試料の所定の容積中
（例えば、血液１μＱ当り）に存在する特定の抗原（例
えば、ＣＤ４抗原）の分子の総数として現すことができ
る。また、被験試料中において、ある抗原の分子数と他
の抗原の分子数との割合（例えば、被験血液試料中の−
ＣＤ８抗原に対するＣＤ４抗原の割合、即ち、Ｃ［１４
／ ＣＤａ比）として表現することができる。
おいて適当であればいかなる形態でも表現することがで
きる。就中、これらの結果は、被験試料の所定の容積中
（例えば、血液１μＱ当り）に存在する特定の抗原（例
えば、ＣＤ４抗原）の分子の総数として現すことができ
る。また、被験試料中において、ある抗原の分子数と他
の抗原の分子数との割合（例えば、被験血液試料中の−
ＣＤ８抗原に対するＣＤ４抗原の割合、即ち、Ｃ［１４
／ ＣＤａ比）として表現することができる。
被験試料中の特定の抗原の分子数は、好ましくは、測定
される抗原をもった適当な［細胞または細胞プレバレー
ジョンについて成立する標準領域を使用して測定するこ
とができる。この標準領域は、公知の対照法によってＪ
め検定される。これらの標準は、好ましくは、それらの
起源が測定の被験物を形成する細胞と同一の［Ｉ胞、ま
たは所望の抗体を有する確立された！ｌ１ｌｉｉＩ系の
ｌｌｌｌｌ１１、またはこれらのＩｌ胞に由来するｉ！
’ｉ！物、例えば脱調製物のいずれかからなる。
される抗原をもった適当な［細胞または細胞プレバレー
ジョンについて成立する標準領域を使用して測定するこ
とができる。この標準領域は、公知の対照法によってＪ
め検定される。これらの標準は、好ましくは、それらの
起源が測定の被験物を形成する細胞と同一の［Ｉ胞、ま
たは所望の抗体を有する確立された！ｌ１ｌｉｉＩ系の
ｌｌｌｌｌ１１、またはこれらのＩｌ胞に由来するｉ！
’ｉ！物、例えば脱調製物のいずれかからなる。
これらの標準は、その後、被験試料と全く同じ方法で処
理される。櫻られたシグナルは、被験試料を用いて測定
し′たシグナルの比較の対象となる標準領域を形成する
ために使用される。続いて行なわれる計算は通常通りで
ある。
理される。櫻られたシグナルは、被験試料を用いて測定
し′たシグナルの比較の対象となる標準領域を形成する
ために使用される。続いて行なわれる計算は通常通りで
ある。
被験試料中の２種の抗原の分子数の比を測定するために
、上述の標準系を使用し、最終的に所望の比を計算する
ことができる。多くの場合においてより簡単に実現でき
ることは、所望の抗原の各々を用いて得られた特定のシ
グナルの比を直接計算することおよび、必要であれば、
使用した試料の容積比のような明らかなファクターを用
いることによってそれを修正することである。これによ
り所望の比を直ちに得ることができる。
、上述の標準系を使用し、最終的に所望の比を計算する
ことができる。多くの場合においてより簡単に実現でき
ることは、所望の抗原の各々を用いて得られた特定のシ
グナルの比を直接計算することおよび、必要であれば、
使用した試料の容積比のような明らかなファクターを用
いることによってそれを修正することである。これによ
り所望の比を直ちに得ることができる。
この発明による免疫検定方法は、簡便、迅速かつ再現可
能である。その使用は、多数の試料の分析に非常に適し
ている。公知のの方法と比較したときの利点を理解する
ために、本発明による方法の種々の工程を解析する。
能である。その使用は、多数の試料の分析に非常に適し
ている。公知のの方法と比較したときの利点を理解する
ために、本発明による方法の種々の工程を解析する。
固相支持体上でのＩｌ［ｌ１２１の固定化は、通常は最
も困難で、また測定を実施する上で最も重要な工程であ
る。しばしば用いられる手段は、ポリ−［−リジンを用
いて処理し、又は処理しないウェル内において、グルタ
ルアルデヒドまたはメタノールを用いて細胞を化学的な
固定することである（「、Ｖ＾Ｎ ＬＥＵＶＥＮら、Ｊ
、Ｉｖｎｕｎｏｌ、ＭｅｔＭｄｓ 、 １９７８．２３
．１０９）。しかしながら、この方法で行なわれた化学
的な固定は、所望の特異的な検出を減少もしくヰ抑綱す
る可能性がある。逆に、非常に重大な不利益となる１１
細胞の偽陽性ラベリングを導く可能性もある（ ０ＲＯ
ＶＥＲおよびＭＡＲ８ＨＡＬＬ、 Ｊ、Ｉｖｎｕｎｏｌ
、Ｍｅｔｈｏｄｓ 、 １９８６．９０、２７５−
２８１ ） 。
も困難で、また測定を実施する上で最も重要な工程であ
る。しばしば用いられる手段は、ポリ−［−リジンを用
いて処理し、又は処理しないウェル内において、グルタ
ルアルデヒドまたはメタノールを用いて細胞を化学的な
固定することである（「、Ｖ＾Ｎ ＬＥＵＶＥＮら、Ｊ
、Ｉｖｎｕｎｏｌ、ＭｅｔＭｄｓ 、 １９７８．２３
．１０９）。しかしながら、この方法で行なわれた化学
的な固定は、所望の特異的な検出を減少もしくヰ抑綱す
る可能性がある。逆に、非常に重大な不利益となる１１
細胞の偽陽性ラベリングを導く可能性もある（ ０ＲＯ
ＶＥＲおよびＭＡＲ８ＨＡＬＬ、 Ｊ、Ｉｖｎｕｎｏｌ
、Ｍｅｔｈｏｄｓ 、 １９８６．９０、２７５−
２８１ ） 。
更に、化学的固定はいくつかのステップで行なわれる。
細胞の遠心、固定される混合物の調製、固定、および固
定された細胞の数回の洗浄である。
定された細胞の数回の洗浄である。
場合によっては、メタノールを用いた固定の曲に、マイ
クロウェル内において、３７℃で１［胞を乾燥させるこ
とも提案されている（ＢＡｔｌＭＧＡＲＴＥＮ、 Ｊ。
クロウェル内において、３７℃で１［胞を乾燥させるこ
とも提案されている（ＢＡｔｌＭＧＡＲＴＥＮ、 Ｊ。
Ｉｕｕｎｏｌ、Ｎｅｔｈｏｄｓ 、 １９８６．９４．
９ｌ−９８） 、実際、それがある脆い抗原を破壊する
という事実に加えて、３７℃でのＩ［胞の乾燥は細胞周
縁原形質膜を透過性にし、そのため表面抗原だけでなｃ
ａｒｍ質内抗県内抗原ラベリングが容易になる。その結
果、測定を表面抗原に限定することを望む場合には、厄
介なバックグラウンドや偽陽性の増大を招く。
９ｌ−９８） 、実際、それがある脆い抗原を破壊する
という事実に加えて、３７℃でのＩ［胞の乾燥は細胞周
縁原形質膜を透過性にし、そのため表面抗原だけでなｃ
ａｒｍ質内抗県内抗原ラベリングが容易になる。その結
果、測定を表面抗原に限定することを望む場合には、厄
介なバックグラウンドや偽陽性の増大を招く。
さらに、この工程の胃現性は疑わしい。実際、検定用マ
イクロウェル内への［ｌ胞の＠茸および細胞の乾燥は、
複数の実験の間で変化する可能性がある。最後に、この
測定は、細胞乾燥工程のみで２時間以上かかるために実
行するのに時間がかかる。
イクロウェル内への［ｌ胞の＠茸および細胞の乾燥は、
複数の実験の間で変化する可能性がある。最後に、この
測定は、細胞乾燥工程のみで２時間以上かかるために実
行するのに時間がかかる。
リンパ沫ポピユレーションの固定化は、マイクロウェル
内に吸着されたポリクローナル抗体を使用することによ
っても達成されている（ ５ＴＯＣＫＥＲおよびＨＥＵ
ＳＳＥＲ、Ｊ、Ｉｍｎ＋ｕｎｏ１．Ｎｅｔｈｏｄｓ 、
１９７９．２６．８７−９５）。分析しようとする単
一のポピユレーションとは関係ない細胞まで固定化され
る可能性は別として、ポリクローナル抗体を用いると、
これがラベル抗体で測定されるべき抗原と反応するため
、これに応じて最終的に測定されるシグナルの誠少を導
く不利を生じる。
内に吸着されたポリクローナル抗体を使用することによ
っても達成されている（ ５ＴＯＣＫＥＲおよびＨＥＵ
ＳＳＥＲ、Ｊ、Ｉｍｎ＋ｕｎｏ１．Ｎｅｔｈｏｄｓ 、
１９７９．２６．８７−９５）。分析しようとする単
一のポピユレーションとは関係ない細胞まで固定化され
る可能性は別として、ポリクローナル抗体を用いると、
これがラベル抗体で測定されるべき抗原と反応するため
、これに応じて最終的に測定されるシグナルの誠少を導
く不利を生じる。
固相支持体上、特に検定用つＩル内に吸着され又は固定
された高度に特異的で且つ関連したモノクローナル抗体
を使用することによって、所望の１ＩＩｌ胞を独占的に
捕獲することが可能となる。この場合、捕獲されない他
のｌ［Ｉ飽ポピユレーションは、測定す・べき抗原のラ
ベリングが完結した際に行なわれる洗浄操作によって除
去される。更に、この工程においては、［Ｉ胞を化学的
または物理的に支持体に固定するための種々の操作が省
略されているから、化学的または物理的な要因で抗原の
特性が変性することはない。
された高度に特異的で且つ関連したモノクローナル抗体
を使用することによって、所望の１ＩＩｌ胞を独占的に
捕獲することが可能となる。この場合、捕獲されない他
のｌ［Ｉ飽ポピユレーションは、測定す・べき抗原のラ
ベリングが完結した際に行なわれる洗浄操作によって除
去される。更に、この工程においては、［Ｉ胞を化学的
または物理的に支持体に固定するための種々の操作が省
略されているから、化学的または物理的な要因で抗原の
特性が変性することはない。
したがって、本発明によると、モノクローナル抗体で［
Ｉ胞を固定することによって、測定すべき抗原をもった
細胞を固定するための工程を簡略化することが可能にな
ると同時に、結果の信頼性をより向上し得ることがる。
Ｉ胞を固定することによって、測定すべき抗原をもった
細胞を固定するための工程を簡略化することが可能にな
ると同時に、結果の信頼性をより向上し得ることがる。
［Ｉ胞ポピユレーションに適用される免疫検定は、通常
、２つもしくは３つの連続した工程からなる間接法によ
る１１１１１１のラベリングににって行なわれ１、特定
のシグナルを与えるプローブはラベリングのＲ終工程で
細胞に固定される。２工程のＩＩＩ胞のう゛ ベリング
において、そこに含まれる主要な試薬としては、β−ガ
ラクトシダーゼに結合した抗免疫グロブリン（抗１ｇ）
抗体（Ｃ０ＢＢＯＬＤら、Ｊ、ｌ１ｌｌｌｌｊｎ（）１
、Ｍｅｔｈｏｄｓ 、 １９７１．４４、１２５−１３
３ ） 、７）レカリホスフ１ターゼに結合した抗１ｇ
（ＨＥＳＳＩＡ、ｔ４ 、 Ｊ、１ｍ１ｕｎｏ１．Ｍｅ
ｔｈｏ、ｄｓ 、 １９８６．９１．２９−３４）また
はヨウ素１２５でラベルした抗Ｉｇ（Ｓ＾νＩＯＮ、
Ｊ、Ｉｎｕｎｕｎｏｌ、Ｍｅｔｈｏ、ｄｓ 、 １９８
７．９７．４９−５６）を使用する。パーオキシダーゼ
−抗パーオキシダーゼ試桑を用いるラベリング技法は３
工程で行なわれる（ＶＡＮ ＬＥＵＶＥＮ。
、２つもしくは３つの連続した工程からなる間接法によ
る１１１１１１のラベリングににって行なわれ１、特定
のシグナルを与えるプローブはラベリングのＲ終工程で
細胞に固定される。２工程のＩＩＩ胞のう゛ ベリング
において、そこに含まれる主要な試薬としては、β−ガ
ラクトシダーゼに結合した抗免疫グロブリン（抗１ｇ）
抗体（Ｃ０ＢＢＯＬＤら、Ｊ、ｌ１ｌｌｌｌｊｎ（）１
、Ｍｅｔｈｏｄｓ 、 １９７１．４４、１２５−１３
３ ） 、７）レカリホスフ１ターゼに結合した抗１ｇ
（ＨＥＳＳＩＡ、ｔ４ 、 Ｊ、１ｍ１ｕｎｏ１．Ｍｅ
ｔｈｏ、ｄｓ 、 １９８６．９１．２９−３４）また
はヨウ素１２５でラベルした抗Ｉｇ（Ｓ＾νＩＯＮ、
Ｊ、Ｉｎｕｎｕｎｏｌ、Ｍｅｔｈｏ、ｄｓ 、 １９８
７．９７．４９−５６）を使用する。パーオキシダーゼ
−抗パーオキシダーゼ試桑を用いるラベリング技法は３
工程で行なわれる（ＶＡＮ ＬＥＵＶＥＮ。
１９７８）。
他の方法は、これも３工程であるが、分析される抗原性
マーカーに特異的なモノクローナル抗体、次いでピオチ
ンを含有する抗マウスＩＱ抗体、および最後に、ストレ
プトアビジン（５ｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎｅ ）−バー
オキシダーゼ結合体（ＢＡＩＩＭＧＡＲＴＥＮ、 １９
８６）またはストレブ］・アビジン−アルカリホスファ
ターゼ結合体（ＩＧＩＥＴＳＥＭＥら、Ｊ、ｌｌ１ｌＩ
ＩｕｎＯ１，ＭＯｔｈＯｄＳ 。
マーカーに特異的なモノクローナル抗体、次いでピオチ
ンを含有する抗マウスＩＱ抗体、および最後に、ストレ
プトアビジン（５ｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎｅ ）−バー
オキシダーゼ結合体（ＢＡＩＩＭＧＡＲＴＥＮ、 １９
８６）またはストレブ］・アビジン−アルカリホスファ
ターゼ結合体（ＩＧＩＥＴＳＥＭＥら、Ｊ、ｌｌ１ｌＩ
ＩｕｎＯ１，ＭＯｔｈＯｄＳ 。
１９８７．９７．１２３−１３１ ＞を使用する。
細胞上に物理的もしくは化学的な介在物を設けることな
く全てのＩｌ！Ｉ飽を免疫捕獲（１ｌｌｌｌｕｎＯｃａ
ｌ）ｔｔｌｒｅ）するステップと、ｔｊｔ躬性同性同位
元素プローブａｄｉｏｉｓｏｔｏｐｉｃ ｐｒｏｂｅ
） ｔたは酵素プローブを直接的に有する１種もしくは
それ以上のモノクローナル抗体を用いてこれらの［１１
１１の全部もしくは一部をラベリングするステップとを
、１つの工程で同時に行なう本発明による方法は、［１
１１ｍそれ自身の選択された膜抗原を定石的に測定する
ことを可能にする第一の方法である。
く全てのＩｌ！Ｉ飽を免疫捕獲（１ｌｌｌｌｕｎＯｃａ
ｌ）ｔｔｌｒｅ）するステップと、ｔｊｔ躬性同性同位
元素プローブａｄｉｏｉｓｏｔｏｐｉｃ ｐｒｏｂｅ
） ｔたは酵素プローブを直接的に有する１種もしくは
それ以上のモノクローナル抗体を用いてこれらの［１１
１１の全部もしくは一部をラベリングするステップとを
、１つの工程で同時に行なう本発明による方法は、［１
１１ｍそれ自身の選択された膜抗原を定石的に測定する
ことを可能にする第一の方法である。
この発明によると、免疫学的に固定された細胞の直接ラ
ベリングは以下の事項を可能にする。
ベリングは以下の事項を可能にする。
・間接ラベリングの場合に、ラベリングのための連続し
た工程の間でａ返される介在操作（数回にわたる細胞の
遠心、ラベリング試薬の除去および再懸濁）を排除する
こζによる測定方法のｉ＊化、 ・試薬の節約、 ・工程および操作数の減少による信頼性の改善、・時間
の節約、および ・従来の機器の使用だけで同時に多数の試料を処理する
可能性。
た工程の間でａ返される介在操作（数回にわたる細胞の
遠心、ラベリング試薬の除去および再懸濁）を排除する
こζによる測定方法のｉ＊化、 ・試薬の節約、 ・工程および操作数の減少による信頼性の改善、・時間
の節約、および ・従来の機器の使用だけで同時に多数の試料を処理する
可能性。
ｌｌｌ１飽ポピユレーシヨンの固定化と、測定すべき１
［１ｍサブボビュレーシジン抗原の直接ラベリングを同
時に行なう場合、そのためのインキュベーション時間は
短い。■リンパ球、およびＴ４およびＴ８リンパ球サブ
ポピユレーションの測定において、上記インキュベーシ
ョンに要する時間は１ｗ＃間以内である。
［１ｍサブボビュレーシジン抗原の直接ラベリングを同
時に行なう場合、そのためのインキュベーション時間は
短い。■リンパ球、およびＴ４およびＴ８リンパ球サブ
ポピユレーションの測定において、上記インキュベーシ
ョンに要する時間は１ｗ＃間以内である。
固相支持体を洗浄した後、正確で且つ測定が簡単なシグ
ナル（放射能または吸光または発光）を観測するための
従来の機器を使用することによって、実際の測定を行な
う。
ナル（放射能または吸光または発光）を観測するための
従来の機器を使用することによって、実際の測定を行な
う。
従って、全体的に、この発明による方ｉは多くの利点を
有する。それは、迅速であり、信頼性が高く、ＩＦｌ済
的であり、かつ単純である。
有する。それは、迅速であり、信頼性が高く、ＩＦｌ済
的であり、かつ単純である。
この発明による方法は、細胞濃度の広い範囲にわたって
、細胞ポピユレーションの表面抗原を測定することを可
能にする。
、細胞ポピユレーションの表面抗原を測定することを可
能にする。
細胞数についてのこの方法のＳ度は、測定された纜胞ボ
ピュレー、シジンの抗原密度に依存する。
ピュレー、シジンの抗原密度に依存する。
所望であれば、各々の抗原について、この発明の方法に
よって測定することができる抗原の最少モル濃度を規定
することができる。
よって測定することができる抗原の最少モル濃度を規定
することができる。
したがって、例えば、選択した固相支持体が検定用マイ
クロプレートで、被験細胞がヒトリンパ球である場合に
は、分析された細胞の数が２００μ℃マイク−ロウＩル
当り数１０６〜２００，０００である場合に意味のある
測定が欅られることが観察されている。この際の下限は
被験細胞上の測定すべき抗ｌｒｔ密度および選ばれた検
出技法の感度に起因する。
クロプレートで、被験細胞がヒトリンパ球である場合に
は、分析された細胞の数が２００μ℃マイク−ロウＩル
当り数１０６〜２００，０００である場合に意味のある
測定が欅られることが観察されている。この際の下限は
被験細胞上の測定すべき抗ｌｒｔ密度および選ばれた検
出技法の感度に起因する。
また、上限は固相支持体のサイズおよび形状に本質的に
依存する。固相支持体が管からなる場合も同じことが当
てはまる・。
依存する。固相支持体が管からなる場合も同じことが当
てはまる・。
記録されたシグナル（放射能カウント、または光度測定
）は、慣例的な操作条件の下で、使用した細胞の数の関
数として十分かつ均一な検ｆｆｉ線を得ることを可能に
することが実証されている。
）は、慣例的な操作条件の下で、使用した細胞の数の関
数として十分かつ均一な検ｆｆｉ線を得ることを可能に
することが実証されている。
更に必要であれば、同一の抗原のいくつかの異なるエピ
トープに特異的ないくつかの胃なるモノクローナル抗体
を、一つの同じ表面抗原に同時に固定することによって
、この方法の感度を改善することができる。これは、ヨ
ウ素１２５でラベルした０ＫＴ４およびＳＴ４抗体を同
時に使用した、イチカワ系（ヒト■系）のＩ［Ｉ胞のＣ
Ｄ４抗体の測定ににっで実証されている。
トープに特異的ないくつかの胃なるモノクローナル抗体
を、一つの同じ表面抗原に同時に固定することによって
、この方法の感度を改善することができる。これは、ヨ
ウ素１２５でラベルした０ＫＴ４およびＳＴ４抗体を同
時に使用した、イチカワ系（ヒト■系）のＩ［Ｉ胞のＣ
Ｄ４抗体の測定ににっで実証されている。
測定したシグナルは、抗００４抗体の各々を単独で用い
て得られたシグナルと比較して約５０％増加した。
て得られたシグナルと比較して約５０％増加した。
以下の実施例においては、下記の用語もしくはそれらの
Ｗｓ詣が無差別に使用されるであろう。
Ｗｓ詣が無差別に使用されるであろう。
ＢＳＡ ：ウシ白酒アルブミン
ＰＢＳ ： Ｉ）１１７．４のリン酸緩衝生理食塩水Ｐ
ＯＤ ：バーオキシダーゼ 、 ＩＣＩＧ ：免疫グロブリンＧ ＩａＭ ：免疫グロブリン刊 抗Ｔ ＩｇＧもしくは抗Ｔ ： ■リンパ球に対する抗体 抗ＣＤ４ ＩΩＧもしくは抗ＣＤ４ ：００４抗原に対する抗体 抗ＣＤ８ ＩａＣｉもしくは抗ＣＤ８ ： ＣＯＳ抗原に対する抗体 ＣＩ）Ｉｌｌ ： １分間当りのカウント数ｄｌ）ｌ
： １分間当りの１Ｉ１１壊数実施例１（ペルオキ
シドでラベルされた抗体によるヒ゛ト血液すンプル中の
ＣＤ４ 及びＣＤ８抗原分子濃度の酵素免疫 検定（Ｅｎｚｙｍ ｉｌｌｌｍｕｎｏｍｅｔｒｉｃ ａ
ｓｓａｙ）Ａ）検定キットの作製 ａ）プレー１−の作製 、 使ｆｌｌＬ、７：７し〒トＬｔ、ＩｊｌｊＮｌｊ、
（商品１ 号６．４３９４ ）により販売されている９
８個のマイクロウェルを備えたプラスチック製の滴定用
マイクロプレートである。各々のマイクロウェルに、全
てのＴリンパ ・球の固定（すなわち■リンパ球の免疫
捕獲に作用）に用いられる蹟製抗ＣＤ２モノクロナール
抗体（５Ｊ１１と呼ばれる）を含有した溶液２００μ２
を入れる。
ＯＤ ：バーオキシダーゼ 、 ＩＣＩＧ ：免疫グロブリンＧ ＩａＭ ：免疫グロブリン刊 抗Ｔ ＩｇＧもしくは抗Ｔ ： ■リンパ球に対する抗体 抗ＣＤ４ ＩΩＧもしくは抗ＣＤ４ ：００４抗原に対する抗体 抗ＣＤ８ ＩａＣｉもしくは抗ＣＤ８ ： ＣＯＳ抗原に対する抗体 ＣＩ）Ｉｌｌ ： １分間当りのカウント数ｄｌ）ｌ
： １分間当りの１Ｉ１１壊数実施例１（ペルオキ
シドでラベルされた抗体によるヒ゛ト血液すンプル中の
ＣＤ４ 及びＣＤ８抗原分子濃度の酵素免疫 検定（Ｅｎｚｙｍ ｉｌｌｌｍｕｎｏｍｅｔｒｉｃ ａ
ｓｓａｙ）Ａ）検定キットの作製 ａ）プレー１−の作製 、 使ｆｌｌＬ、７：７し〒トＬｔ、ＩｊｌｊＮｌｊ、
（商品１ 号６．４３９４ ）により販売されている９
８個のマイクロウェルを備えたプラスチック製の滴定用
マイクロプレートである。各々のマイクロウェルに、全
てのＴリンパ ・球の固定（すなわち■リンパ球の免疫
捕獲に作用）に用いられる蹟製抗ＣＤ２モノクロナール
抗体（５Ｊ１１と呼ばれる）を含有した溶液２００μ２
を入れる。
５ｒｉｉとしてＢＩＯ８ＹＳ、Ｃ０ｕｉｅＯｎｅ、 Ｆ
ｒａｎｃｅから販売されているこの抗体は、ρ■７．４
のリンＭ緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中において、１０μ
ｙ／ｒｒｄｌ濃度で用いられる。モノクロナール抗体の
吸着は４℃で１２時間行なう。過剰量の抗体はプレート
を裏返して取除く。
ｒａｎｃｅから販売されているこの抗体は、ρ■７．４
のリンＭ緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中において、１０μ
ｙ／ｒｒｄｌ濃度で用いられる。モノクロナール抗体の
吸着は４℃で１２時間行なう。過剰量の抗体はプレート
を裏返して取除く。
リン酸緩酌生理食塩水中に、０，１％のゼラチンと０．
５％の８８へとを含有する溶液が好ましい。この溶９２
５０μ℃を斉々のマイクロウェルに入れ、ウニ・ル９考
面をタンパク質で飽和させる。この操作は３７℃で１時
間行なう、その後、プレートを食塩加すン酸ｓｕｉ液で
３回洗浄する。このよう略して作製されたプレートｅ
ｉ結乾燥し、密閉されたプラスチック性の包み中に４℃
で保存する。
５％の８８へとを含有する溶液が好ましい。この溶９２
５０μ℃を斉々のマイクロウェルに入れ、ウニ・ル９考
面をタンパク質で飽和させる。この操作は３７℃で１時
間行なう、その後、プレートを食塩加すン酸ｓｕｉ液で
３回洗浄する。このよう略して作製されたプレートｅ
ｉ結乾燥し、密閉されたプラスチック性の包み中に４℃
で保存する。
ｂ）モノクロナール抗体−ペルオキシダーゼ複合体溶液
のＷ８製 Ｂｏｅｈｒｉｎａｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｉ Ｂｉｏｃｈ
ｅｍｉｃａ （商品番号８１４．３９３ ＞により販売
されて０るベル１オキシダーゼ（ＰＯＤ）を用いる。
。
のＷ８製 Ｂｏｅｈｒｉｎａｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｉ Ｂｉｏｃｈ
ｅｍｉｃａ （商品番号８１４．３９３ ＞により販売
されて０るベル１オキシダーゼ（ＰＯＤ）を用いる。
。
抗体とペルオキシダーゼとを結合させるこの方法は、０
．３６モルの蒸留水中に１．５ｑのＰＯＤを用い、これ
に０．２Ｍの過ヨウ素酸ナトリウム溶液５０μｇを加え
てペルオキシダーゼの酸化を行なうことを除き、エム、
ビイ、ウィルソンとビイ、ケイ、ナカネが［免疫蛍光法
およびその関連技術］ （ダブル、クナツプ、ケイ、コ
ラパー、およびシイＪウィックにより発行されたエルセ
ピア−／北オランダ、アムステルダム ２１５〜２２４
頁）に記載された方法と同じである。この結果物は、５
００μβの炭ｉ！ｌｌｉ液に含有されている２ｒＩＩｇ
（ｐ抗ＣＤ４ ＩＧＧと結合される。水素化ホウ素ナト
リウムで処理した後、ＰＢＳに対して透析を行ない、こ
れを９゜２２１ＪＩ＆のメンブランフィルタ−でろ過し
て１．ＯＧ ＝ 、ＰＯＤ２１ｉ合体を滅菌し、これを
無菌条件下（４℃）、に１−当り０．５勺のＩｇＧを含
む′ｍ度でガラスチューブ内に保存する。この試薬は少
なくとも１年間安定である。
．３６モルの蒸留水中に１．５ｑのＰＯＤを用い、これ
に０．２Ｍの過ヨウ素酸ナトリウム溶液５０μｇを加え
てペルオキシダーゼの酸化を行なうことを除き、エム、
ビイ、ウィルソンとビイ、ケイ、ナカネが［免疫蛍光法
およびその関連技術］ （ダブル、クナツプ、ケイ、コ
ラパー、およびシイＪウィックにより発行されたエルセ
ピア−／北オランダ、アムステルダム ２１５〜２２４
頁）に記載された方法と同じである。この結果物は、５
００μβの炭ｉ！ｌｌｉ液に含有されている２ｒＩＩｇ
（ｐ抗ＣＤ４ ＩＧＧと結合される。水素化ホウ素ナト
リウムで処理した後、ＰＢＳに対して透析を行ない、こ
れを９゜２２１ＪＩ＆のメンブランフィルタ−でろ過し
て１．ＯＧ ＝ 、ＰＯＤ２１ｉ合体を滅菌し、これを
無菌条件下（４℃）、に１−当り０．５勺のＩｇＧを含
む′ｍ度でガラスチューブ内に保存する。この試薬は少
なくとも１年間安定である。
抗ＣＤ８１！ＪＧ−ＰＯＤ複合体も同社の方・法で調製
する。また、ＩｇＭ−ＰＯＤ複合体も同様の方法で調製
できる。
する。また、ＩｇＭ−ＰＯＤ複合体も同様の方法で調製
できる。
Ｃ）発現試薬（ｃｊｅｖｅｌｏｐｉｎｇｒｅａｇｅｎｔ
）の調製発現試薬は以下の方法で調製される。クエン酸
−水和珈を水に溶解して２．１％の・水溶液を作り、こ
れに７１水酸化ナトリウム水溶液を加えてｐ１１５に調
整し、０，１ＭシトレートＩＩ液を調製する。そ・して
、得られたシトレート緩勤液２０ｄごとに３０１１１ｆ
ｆのオルトフェニレンジアミンジヒドロクロライドを加
える。次いで、最後に３．０％過酸化水素（酢素の基質
）４０μ９を、オル１〜フエニレンジアミンを含有する
シトレー１へ緩衝欧２Ｑｒｄごとに加える。
）の調製発現試薬は以下の方法で調製される。クエン酸
−水和珈を水に溶解して２．１％の・水溶液を作り、こ
れに７１水酸化ナトリウム水溶液を加えてｐ１１５に調
整し、０，１ＭシトレートＩＩ液を調製する。そ・して
、得られたシトレート緩勤液２０ｄごとに３０１１１ｆ
ｆのオルトフェニレンジアミンジヒドロクロライドを加
える。次いで、最後に３．０％過酸化水素（酢素の基質
）４０μ９を、オル１〜フエニレンジアミンを含有する
シトレー１へ緩衝欧２Ｑｒｄごとに加える。
Ｂ）、免疫検定方法
ａ）膿胞の調製
検定すべき血液サンプル２ｄを取る。これを、２ｄのリ
ン酸緩衝生理食塩水と混合する。得られた氾合物３ｄ
＠ ［Ｃ０ＬＬ−ＰＡＱｔｌＥ （Ｐｈａｔｍａｃ ｉ
ａにより販売されている）上にデポジットする。室温で
３０分間、４００ ｘ ｙで遠心分離すると、単核細胞
を含有したサスペンションリングが生成する。このサス
ペンション全体を、１ｄとして回収し、青られたサスペ
ンションのｅ ｘ １００μ２を先に作製したプレート
の６個のマイクロウェルに分配して入れる。
ン酸緩衝生理食塩水と混合する。得られた氾合物３ｄ
＠ ［Ｃ０ＬＬ−ＰＡＱｔｌＥ （Ｐｈａｔｍａｃ ｉ
ａにより販売されている）上にデポジットする。室温で
３０分間、４００ ｘ ｙで遠心分離すると、単核細胞
を含有したサスペンションリングが生成する。このサス
ペンション全体を、１ｄとして回収し、青られたサスペ
ンションのｅ ｘ １００μ２を先に作製したプレート
の６個のマイクロウェルに分配して入れる。
ｂ）ＩＩ胞のインキュベーション
−先に得られたＰＯＤ−抗体複合体を、１％のタンパク
基質（例えば、ＢＳ＾やスキムミルクパウダー）を含有
するＰＢＳで１００倍に希釈し、この溶液１００μ２を
以下のように各々のマイクロウェルにデポジットする。
基質（例えば、ＢＳ＾やスキムミルクパウダー）を含有
するＰＢＳで１００倍に希釈し、この溶液１００μ２を
以下のように各々のマイクロウェルにデポジットする。
・２卸のマイクロウェルには、それぞれＰＯＤ−抗ＣＤ
４複合体溶液１００μＱを満たす。
４複合体溶液１００μＱを満たす。
・他の２個のマイクリウェルには、それぞれＰＯＤ−抗
ＣＤ８複合体溶液１０９μ−ａを満たす。
ＣＤ８複合体溶液１０９μ−ａを満たす。
・その他の２個のマイクロウェルには、それぞれ１％タ
ンパク基質溶液１００．μ℃を渦たす（空試験反応）。
ンパク基質溶液１００．μ℃を渦たす（空試験反応）。
支持体へのａ胞の固定を改善するために、室温で１時間
プレー１−を放置した後、１５０ Ｘ Ｃ１で３分間遠
心する。
プレー１−を放置した後、１５０ Ｘ Ｃ１で３分間遠
心する。
Ｃ）固定された酵素の発現と測定
プレートを突返して内容物を捨て、マイクロウェルを空
にする。そして、これを２００μβのＰＢＳで４回洗浄
する。２００μりの発現試薬（直ちに使用するように調
製したもの）を、各々のウェルに加える。弱めた照明下
に、室温で２０分間インキュベートを行なう。その後、
分光光度計（Ｔｉｔｅｒｔｅｋ Ｍｕｌｔｉｓｋａｎ
ａｐｐａｒａｔｕｓ−ｒ＋ｏｖ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉ
ｅｓ ３１０Ｃ型）で４９２ｒ＋ｍにおける光学密度を
測定する。
にする。そして、これを２００μβのＰＢＳで４回洗浄
する。２００μりの発現試薬（直ちに使用するように調
製したもの）を、各々のウェルに加える。弱めた照明下
に、室温で２０分間インキュベートを行なう。その後、
分光光度計（Ｔｉｔｅｒｔｅｋ Ｍｕｌｔｉｓｋａｎ
ａｐｐａｒａｔｕｓ−ｒ＋ｏｖ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉ
ｅｓ ３１０Ｃ型）で４９２ｒ＋ｍにおける光学密度を
測定する。
ｄ）結果の標準化および記載
これらの実験を標準化するために、ボンセレ７ ’ｌ”
（ＰＯＮＣＥＬＥＴ）等の細胞蛍光光度法（Ｊ、Ｉｍ
ｍｕｎ。
（ＰＯＮＣＥＬＥＴ）等の細胞蛍光光度法（Ｊ、Ｉｍ
ｍｕｎ。
１、Ｍｅｔｈｏｄｓ 、１９８５年、８５．６５〜７
４）により、ＣＤ４抗原およびＣＤ８抗原について予め
検定されたヒト全リンパ球Ｉｌ製物を用いる。それぞれ
ＣＤ４抗原およびＣＤ８抗原に関する２つの基準範囲を
作製するために、この基準調製物の既知量を用いる。こ
の基準範囲と比較して、各々のサンプルに対応する抗原
数を計算する。
４）により、ＣＤ４抗原およびＣＤ８抗原について予め
検定されたヒト全リンパ球Ｉｌ製物を用いる。それぞれ
ＣＤ４抗原およびＣＤ８抗原に関する２つの基準範囲を
作製するために、この基準調製物の既知量を用いる。こ
の基準範囲と比較して、各々のサンプルに対応する抗原
数を計算する。
Ｕ康な提供者から得たヒトの血液２０個のサンプ□ルに
ついて（ｑられた光学密度と、ＣＤ４抗原分子およびＣ
Ｄ８抗原分子の相当数と、これらの抗原数の比（ＣＤ４
／ＣＤ８）とを、下記第１表に示す。
ついて（ｑられた光学密度と、ＣＤ４抗原分子およびＣ
Ｄ８抗原分子の相当数と、これらの抗原数の比（ＣＤ４
／ＣＤ８）とを、下記第１表に示す。
実施例２（アルカリホスホターゼでラベルされた抗体に
よる、ヒト白液サンプ ル中のＣＤ４抗原およびＣＤ８抗原分 子濃度の酵素免疫検定） この検定は実施例１と同様の方法で行なう。
よる、ヒト白液サンプ ル中のＣＤ４抗原およびＣＤ８抗原分 子濃度の酵素免疫検定） この検定は実施例１と同様の方法で行なう。
モノクロナール抗体−アルカリホスホターゼ複合体は、
８ｏｃｈｒｉｎａｅｒ Ｎａｎｎｈｅｉｍ−Ｂｉｏｃｈ
ｅｌｉｃａ （参照５６７．７４４）により示された方
法でｉｌｌ！ｌ！する。この複合体とともに検定すべき
ｌ［胞を１時間インキュベートした債、次のような発現
溶液を加えることによって固定化された酵素を発現させ
る。この溶液は、蒸留水中に１．２％のジェタノールア
ミンを含有したＭｉｉ液中に、１ｑ／−のパラニトロフ
ェニルホスフェートを含有させ、且つ希塩酸でＤＨ９，
８Ｍ製したものである。発現溶液を添加してから２時間
（３７℃）経過後、分光光度計を用いて４０５ｎｍにお
ける光学、密度を測定する。
８ｏｃｈｒｉｎａｅｒ Ｎａｎｎｈｅｉｍ−Ｂｉｏｃｈ
ｅｌｉｃａ （参照５６７．７４４）により示された方
法でｉｌｌ！ｌ！する。この複合体とともに検定すべき
ｌ［胞を１時間インキュベートした債、次のような発現
溶液を加えることによって固定化された酵素を発現させ
る。この溶液は、蒸留水中に１．２％のジェタノールア
ミンを含有したＭｉｉ液中に、１ｑ／−のパラニトロフ
ェニルホスフェートを含有させ、且つ希塩酸でＤＨ９，
８Ｍ製したものである。発現溶液を添加してから２時間
（３７℃）経過後、分光光度計を用いて４０５ｎｍにお
ける光学、密度を測定する。
この結果を実施例１と同様に計算し記載する。
実施例３（ヨウ素１２５でラベルされた抗体による、ヒ
ト血液サンプル中のＣＤ４ 抗原およびＣＤ８抗原分子濃度の放 射性免疫検定） エフ、シイ、グリーンウッドおよびブイ、エム、ハンタ
ー等が、Ｂ１０ＣｈｅＩｆ１．Ｊ、１９６３年、 ８９
． ｉ１４に記載した方法を用い、ヨウ素１２５でラベ
ルされた抗体を調製した。
ト血液サンプル中のＣＤ４ 抗原およびＣＤ８抗原分子濃度の放 射性免疫検定） エフ、シイ、グリーンウッドおよびブイ、エム、ハンタ
ー等が、Ｂ１０ＣｈｅＩｆ１．Ｊ、１９６３年、 ８９
． ｉ１４に記載した方法を用い、ヨウ素１２５でラベ
ルされた抗体を調製した。
ｐＨ７，２のリン酸！ａ衝生理食塩水５０μα中に含有
されている５０μ９の抗ＣＤ４または抗ＣＤ８モノクロ
ナール抗体を、３７ＭＢｑのヨウ１Ａ１２５（ヨウ化ナ
トリウムの形で）およびリン酸緩函生理食塩水１ｄ当り
０．３３■のクロラミン■を含有する溶液３０μ℃と混
合する。１分間振どう後、２．５１１５Ｆ／ｄのメタ臣
亜硫酸ナトリウムを含有する溶液１００μａを加えて、
モノクロナール抗体をラベルする反応を終了させる。こ
のようにして調製した溶液を２０１０カラム（Ｐｈａｒ
ｎ＋ａｃ ｉａ社社製セファデックス０２５Ｍに通し、
放射性元素でラベルした抗体を含有する流出液フラクシ
ョンを集める。実施例１と同様の方法で！ｉＩｌ製した
ヒト白液単核ＩＩ胞を含有する細胞サスペンション１０
０μ２を４個のマイクロウェルに入れ、検定を行なう。
されている５０μ９の抗ＣＤ４または抗ＣＤ８モノクロ
ナール抗体を、３７ＭＢｑのヨウ１Ａ１２５（ヨウ化ナ
トリウムの形で）およびリン酸緩函生理食塩水１ｄ当り
０．３３■のクロラミン■を含有する溶液３０μ℃と混
合する。１分間振どう後、２．５１１５Ｆ／ｄのメタ臣
亜硫酸ナトリウムを含有する溶液１００μａを加えて、
モノクロナール抗体をラベルする反応を終了させる。こ
のようにして調製した溶液を２０１０カラム（Ｐｈａｒ
ｎ＋ａｃ ｉａ社社製セファデックス０２５Ｍに通し、
放射性元素でラベルした抗体を含有する流出液フラクシ
ョンを集める。実施例１と同様の方法で！ｉＩｌ製した
ヒト白液単核ＩＩ胞を含有する細胞サスペンション１０
０μ２を４個のマイクロウェルに入れ、検定を行なう。
各つエルに１５０，０００ Ｃ１）ＩＩが導入されるよ
うに、５％のＢＳＡを含有するＰＢＳ緩衝液中に溶解し
た放射活性抗体の希釈溶液１００μ℃を各々のつエルに
デ、ポジットする。２個のマイクロウェルの各々には、
抗ＣＤ４−１２８１複合体の溶液１００μ２を洞たし、
ま１ζ他の２［！Ｉのマイクロウェルの各々には、抗Ｃ
Ｄ８−１２ＳＩ複合体の溶液１００μｇを瀧だす。細胞
の固定は、室温で１時間インキュベートした後、１５０
Ｘ ｆｆで３分間潰心分離することにより改善される
。プレートを寝返して、マイクロウェルを空にする。こ
のマイクロウェルをつＩル当り２００ｔｔ （ｌのＰＢ
Ｓで４回洗浄する。そして、１Ｍ水酸化すトリウム７５
μｇを各々のつエルに入れる。１０分軽重ｍに吸収緩衝
液で各々の内容物を回収し、次いでＴカウンター（ＬＫ
［３マルチウエルカウンター）で放射活性をカウントす
る。
うに、５％のＢＳＡを含有するＰＢＳ緩衝液中に溶解し
た放射活性抗体の希釈溶液１００μ℃を各々のつエルに
デ、ポジットする。２個のマイクロウェルの各々には、
抗ＣＤ４−１２８１複合体の溶液１００μ２を洞たし、
ま１ζ他の２［！Ｉのマイクロウェルの各々には、抗Ｃ
Ｄ８−１２ＳＩ複合体の溶液１００μｇを瀧だす。細胞
の固定は、室温で１時間インキュベートした後、１５０
Ｘ ｆｆで３分間潰心分離することにより改善される
。プレートを寝返して、マイクロウェルを空にする。こ
のマイクロウェルをつＩル当り２００ｔｔ （ｌのＰＢ
Ｓで４回洗浄する。そして、１Ｍ水酸化すトリウム７５
μｇを各々のつエルに入れる。１０分軽重ｍに吸収緩衝
液で各々の内容物を回収し、次いでＴカウンター（ＬＫ
［３マルチウエルカウンター）で放射活性をカウントす
る。
この結果を実施例１と同様に計算し記載する。
光？密度の値は、ｄｕ＋でのカラン１−の結果で置換え
られる。
られる。
実施例４（本発明の方法の有効性の！Ｉ認）実施例１に
記載したペルオキシダーゼ免疫検定により、２０個のヒ
ト血液サンプルについて、ヒトＴＩＩ胞のＣＤ４抗原お
よびＣＤ８抗原を測定した。
記載したペルオキシダーゼ免疫検定により、２０個のヒ
ト血液サンプルについて、ヒトＴＩＩ胞のＣＤ４抗原お
よびＣＤ８抗原を測定した。
また、Ｔａ２［胞閣性数に対するＴ４１［胞閣性数の比
率も、普通の細胞学的なカウント方法（ダブル、ダブル
、エルバー等、Ｌａｎｃｅｔ、 １９８４年、（８３８
５）、１０４２〜１０４５ ）によって検定した。
率も、普通の細胞学的なカウント方法（ダブル、ダブル
、エルバー等、Ｌａｎｃｅｔ、 １９８４年、（８３８
５）、１０４２〜１０４５ ）によって検定した。
ＩＰＩ素免疫検定により傳られたＣＤ４／ ＣＯ３比と
細胞学的なカウントによって得られたＴ４／ Ｔ８比と
の相関係数γは、０．７２ある。
細胞学的なカウントによって得られたＴ４／ Ｔ８比と
の相関係数γは、０．７２ある。
同様に、他の７［！ｌのヒト血液サンプルについて、本
発明に従ってヨウ素１２５によるラベリングを用いた放
射免疫検定で測定したＣＤ４／ ＣＯ３比と、細胞数を
カウントして検定したＴ４／Ｔ８とを比較した。
発明に従ってヨウ素１２５によるラベリングを用いた放
射免疫検定で測定したＣＤ４／ ＣＯ３比と、細胞数を
カウントして検定したＴ４／Ｔ８とを比較した。
この相関係数γは０，８７である。
この２つのケースにおいて、１ｑられた相関係数は以下
のことを示している。これら２つの方法によってをられ
た結果には、全体として満足すべき一致があるにもかか
わらず、上記２つの比が提供する情報は等しくない。す
なわち、本発明による抗原の検定はＩＩ胞生学的方法よ
る場合のように、陽性！［胞数だけでなく、各々のサン
プルの陽性細胞上の問題になっている抗原の密度に関す
る情報の提供をも可能とすることが明らかである。それ
故に、本発明において記載した技法によって冑られた情
報は、参照として挙げた普通の技法（ダブル、ダブル、
エルバー等、ｔａｎｃｃｔ、 １９８４年、（８３８５
）、１０４２〜１０４５ ）によって侍られた情報より
も完全なものである。
のことを示している。これら２つの方法によってをられ
た結果には、全体として満足すべき一致があるにもかか
わらず、上記２つの比が提供する情報は等しくない。す
なわち、本発明による抗原の検定はＩＩ胞生学的方法よ
る場合のように、陽性！［胞数だけでなく、各々のサン
プルの陽性細胞上の問題になっている抗原の密度に関す
る情報の提供をも可能とすることが明らかである。それ
故に、本発明において記載した技法によって冑られた情
報は、参照として挙げた普通の技法（ダブル、ダブル、
エルバー等、ｔａｎｃｃｔ、 １９８４年、（８３８５
）、１０４２〜１０４５ ）によって侍られた情報より
も完全なものである。
実施例５（ペルオキシダーゼでラベルした抗体による、
ヒト血液サンプル中の Ｔリンパ球のＣＤ４およびＣＤ８抗原 分子Ｓ度の酵素免疫検定） ｌ１細胞の分離工程の変更と係数技術（ダブル。
ヒト血液サンプル中の Ｔリンパ球のＣＤ４およびＣＤ８抗原 分子Ｓ度の酵素免疫検定） ｌ１細胞の分離工程の変更と係数技術（ダブル。
ダブル、エルバー等、Ｌａｎｃｅｔ、 １９８４年、（
８３８５）、１０４２〜１０４５）のために必要なイン
キュベーション時間の変更により、上述した実施例１の
条件と比べて検定時間を短縮し得ることを示すことが本
実施例の目的である。
８３８５）、１０４２〜１０４５）のために必要なイン
キュベーション時間の変更により、上述した実施例１の
条件と比べて検定時間を短縮し得ることを示すことが本
実施例の目的である。
Ａ）全血からＩｌ［ｌ１１を分離する方法の影響ａ）短
時間の遠心分離を含む技法 検定用血液サンプルから０．５−とり、これと１．５ｄ
のリン酸緩衝生理食塩水を混合する。１．５−のＦｉＣ
ＯＩ １−Ｐａｑｕｅ （ｐＨａｒｌａＣｉａから販売
されている）を５ｄの溶血管に入れ、ＰＢＳで希釈した
白液サンプルをフィコール（Ｆｉｃｏｌｌ） 層の表面
にデボ ・ジットする。室温において９００ ｘ ５
ＳＦで５分間の遠心分離を行なった後、単核細胞を含
有するサスペンションリング０．５７を取除く。このサ
ンプルに１．５ ｄのＰＢＳを加える。
時間の遠心分離を含む技法 検定用血液サンプルから０．５−とり、これと１．５ｄ
のリン酸緩衝生理食塩水を混合する。１．５−のＦｉＣ
ＯＩ １−Ｐａｑｕｅ （ｐＨａｒｌａＣｉａから販売
されている）を５ｄの溶血管に入れ、ＰＢＳで希釈した
白液サンプルをフィコール（Ｆｉｃｏｌｌ） 層の表面
にデボ ・ジットする。室温において９００ ｘ ５
ＳＦで５分間の遠心分離を行なった後、単核細胞を含
有するサスペンションリング０．５７を取除く。このサ
ンプルに１．５ ｄのＰＢＳを加える。
ｂ）赤白法のｉｍ溶解を含む技法
血液からｆｉｌｌ！ｌを分離する他の迅速な方法は、赤
白法を溶解する緩転液を用いることである。どの実施例
にも使用できる溶解緩衝液は、以下の組成を有する。
白法を溶解する緩転液を用いることである。どの実施例
にも使用できる溶解緩衝液は、以下の組成を有する。
・塩化アンモニウム： ８．２９ｇ
・重ｖ４酸カリウム：１ｇ
・エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム塩：蒸留水１Ｍ
１当り０．０３０７ＳＦで、１１８を７．３に調整した
もの ５ｄの溶解緩折液と０．２５０−の白液とを混合する。
１当り０．０３０７ＳＦで、１１８を７．３に調整した
もの ５ｄの溶解緩折液と０．２５０−の白液とを混合する。
１０分間振どう後、この混合物をｅｏｏ Ｘ ｇで１０
分間遠心する。生成した細胞残渣を１−のＰＨ緩衝液に
溶解する。
分間遠心する。生成した細胞残渣を１−のＰＨ緩衝液に
溶解する。
実施例１の条件下で引続き行なわれるＣＤ４とＣＤ８の
検定によって、また実施例１に記載した白液から単核ａ
ｒＱを単離する技法と比較することによって、全血から
単核［１ｌｌａを分離する方法のこれらの２つの変形例
は、検定する血液サンプルからすべてのリンパ球を集め
られることが確認された。
検定によって、また実施例１に記載した白液から単核ａ
ｒＱを単離する技法と比較することによって、全血から
単核［１ｌｌａを分離する方法のこれらの２つの変形例
は、検定する血液サンプルからすべてのリンパ球を集め
られることが確認された。
Ｂ）免疫捕獲およびＩＩＩ胞をラベルづるのに要するイ
ンキュベーション時間の影響 この検定を迅速にするために、実施例１で用いた１時間
という時間を短縮して検定を迅速イヒすることができる
かどうかを確認するため、それぞれがウェル当り２０，
０００個の１１１核細胞を含有する同一のサンプルから
得られた結果を、細胞の捕獲およびラベリングのための
時間を１０分から１時間まで変化させて比較した。得ら
れた結果を第２表に示す。他のすべての検定条件は実施
例１と同じである。
ンキュベーション時間の影響 この検定を迅速にするために、実施例１で用いた１時間
という時間を短縮して検定を迅速イヒすることができる
かどうかを確認するため、それぞれがウェル当り２０，
０００個の１１１核細胞を含有する同一のサンプルから
得られた結果を、細胞の捕獲およびラベリングのための
時間を１０分から１時間まで変化させて比較した。得ら
れた結果を第２表に示す。他のすべての検定条件は実施
例１と同じである。
第２表
ネ試薬ブランクに対応するこれらの光学密度は、ｉｕｌ
の不存在下で得られるものである。複合体あるいは基質
（省略しである）とともに１１飽が存在するとき得られ
るコントロール値は、示された値よりも大きくない。
の不存在下で得られるものである。複合体あるいは基質
（省略しである）とともに１１飽が存在するとき得られ
るコントロール値は、示された値よりも大きくない。
これらの結果は以下のことを示している。
・非特異的信号（試薬ブランク）は常に低い値であり、
かつ複合体が存在する時間が短くなるにつれて、より低
い値になる。
かつ複合体が存在する時間が短くなるにつれて、より低
い値になる。
・１０分間の接触後、この特異信号は精密にかつ再現性
良く分析的に処理できる値に達する。このことは実施例
１の条件と比べて、結果において実質に精度を失うこと
なく、検定を実施するのに質する時間を著しく短縮する
ことが可能である。
良く分析的に処理できる値に達する。このことは実施例
１の条件と比べて、結果において実質に精度を失うこと
なく、検定を実施するのに質する時間を著しく短縮する
ことが可能である。
実際に、もし自１液サンプルの調製および免疫捕獲にお
いて達成することができる時間節約が互いに加われば、
本発明のキットおよび方法によって、すべての白液サン
プルのＣＤ４とＣ［１８抗原の検定（この例には限定さ
れない）が、９６１１！ｌのウェルを有するプレート当
り１０個または２０個のサンプルの割合で、検定に要す
る全時間（実験室でサンプルを受領してから）を１時間
以内とすること可能になる。この生産性のレベルは、す
でに知られているすべての代替技法の生産性よりも侃れ
ている。
いて達成することができる時間節約が互いに加われば、
本発明のキットおよび方法によって、すべての白液サン
プルのＣＤ４とＣ［１８抗原の検定（この例には限定さ
れない）が、９６１１！ｌのウェルを有するプレート当
り１０個または２０個のサンプルの割合で、検定に要す
る全時間（実験室でサンプルを受領してから）を１時間
以内とすること可能になる。この生産性のレベルは、す
でに知られているすべての代替技法の生産性よりも侃れ
ている。
実施例６（アセチルコリンエステラーゼでラベルした抗
体による、ヒ１−血液す ンプル中のヒｈ Ｔリンパ球におけ るＣＤ５抗原分子濃度の免疫検定） Ａ）検定キットの作製 ａ）固体支持体 実施例１に記載した方法で作製した滴定用マイクロプレ
ーｌへを用いる。
体による、ヒ１−血液す ンプル中のヒｈ Ｔリンパ球におけ るＣＤ５抗原分子濃度の免疫検定） Ａ）検定キットの作製 ａ）固体支持体 実施例１に記載した方法で作製した滴定用マイクロプレ
ーｌへを用いる。
ｂ）モノクロナール抗体−アセチルコリンエステラーゼ
複合体 エレクトフォーラス エレクトリカス（Ｅｌｅｃｔ。
複合体 エレクトフォーラス エレクトリカス（Ｅｌｅｃｔ。
ｏｈｏｒｕｓ ｅｌｅｃｔｒｉｃｕｓ ）由来のアセチ
ルコリンエステラーゼを用いる。これは仏国特許第２，
５５０，７９９号に記載された技法によって得られる。
ルコリンエステラーゼを用いる。これは仏国特許第２，
５５０，７９９号に記載された技法によって得られる。
この酵素と抗ＣＤ５抗体が結合したものはＳＴ１と呼ば
れ、バイオシス（ＢＩＯ５ＹＳ）から販売されている。
れ、バイオシス（ＢＩＯ５ＹＳ）から販売されている。
ヨシタケ等によってＥｕｒ、Ｊ、ＢｉｏｃｈｅＩＭ、１
０１ （１９７９） ３９５〜３９９に記載された方
法に従い、結合を行なう。
０１ （１９７９） ３９５〜３９９に記載された方
法に従い、結合を行なう。
Ｃ）発現試薬
この試薬は酵素（アセチルチオコリン）に対する基質と
エルマン試薬を含み、かつ以下の組成を有するものであ
る。
エルマン試薬を含み、かつ以下の組成を有するものであ
る。
・アセチルチオコリンニア、５ｘ１０→Ｈ・ｐＨ７，４
の１Ｎリン酸ナトリウム緩衝液中に溶解した５、５°−
ジチオ−２−ニトロ安息香酸（ＤＴＮＢ） ： ５ｘ
１０４ Ｍこの溶液は、使用する齢に蒸留水で１００
侶に希釈する。
の１Ｎリン酸ナトリウム緩衝液中に溶解した５、５°−
ジチオ−２−ニトロ安息香酸（ＤＴＮＢ） ： ５ｘ
１０４ Ｍこの溶液は、使用する齢に蒸留水で１００
侶に希釈する。
８）免疫検定方法
ａ）実施例１に記載した方法を用いて単核細胞を分離す
る。
る。
ｂ）実施例５と同様に、免疫捕獲および細胞をラベルす
るためのインキュベーシミンを２０分間行なう。
るためのインキュベーシミンを２０分間行なう。
Ｃ）固定化酵素の調製と測定
１００μ２０発現試薬を各々のマイクロウェルに加える
。４５分間インキュベー１−シた後、４１２ｎＩにおけ
る吸収を測定する。既知の数のＴ！ｌ［ｌ１１を含有す
るサンプルを測定した光学密度を第３表に示す。これら
の実験条件下では、試薬ブランクは特に弱く、０．００
２〜０．００３の光学密度に対応している。
。４５分間インキュベー１−シた後、４１２ｎＩにおけ
る吸収を測定する。既知の数のＴ！ｌ［ｌ１１を含有す
るサンプルを測定した光学密度を第３表に示す。これら
の実験条件下では、試薬ブランクは特に弱く、０．００
２〜０．００３の光学密度に対応している。
第３表
これらの結果は、このようにして開発された本技法の優
れた感度を表わしている。実際に、５４０個のＴリンパ
球（すなわち３２００万のＣＤ５抗原分子）を含有する
つエルにおいて、０．０３０の光学密度が得られた。こ
れは精密な測定が可能であり、１０侶のバックグラウン
ドと等しく、検定用ウェル当り約５Ｘ１０−１１モルの
Ｃ［１５抗原に対応する。この感度は、最も高感度の放
射活性トレーサーを用いた既知の最高の免疫検定におけ
る感度と同程度である。
れた感度を表わしている。実際に、５４０個のＴリンパ
球（すなわち３２００万のＣＤ５抗原分子）を含有する
つエルにおいて、０．０３０の光学密度が得られた。こ
れは精密な測定が可能であり、１０侶のバックグラウン
ドと等しく、検定用ウェル当り約５Ｘ１０−１１モルの
Ｃ［１５抗原に対応する。この感度は、最も高感度の放
射活性トレーサーを用いた既知の最高の免疫検定におけ
る感度と同程度である。
実施例７（活性ｔとｌ−Ｔリンパ球上に発現した異なっ
た抗原の測定） ■リンパ球の活性化は、免疫系が緊張するたびに、例え
ば、伝染性の病理、臓器移植およびある異常免疫疾患の
ときに早期に行なわれる生理学的プロセスである。この
自然のプロセスはまた、実験室内において、特にｉｎ
ｖｉｔｒｏでのリンパ球混合＠養法またはリンパ芽球転
換試験（ｌｙｍｐｈｏｂｌａｓｔｉｃ ｔｒａｎｓｆｏ
ｒＩＩｌａｔｉｏｎ ｔｅｓｔ ）のような試験におい
て、普通に用いられる。後者の場合には、フイ］−ヘム
アグルチニン（ＰＨＡ ） 、コンカナバリンへまたは
他のレクチンのような試薬を使用することによって、ポ
リクローン性活性化が得られる。■リンパ球の活性化は
、いくつかの膜マーカー、特にＣＤ２５抗原（インター
ロイキン２のりセブター）またはＣＤ ２抗原の相当の
増加を伴う。したがって、これらの抗原は活性化状態の
優れたマーカーであり、それらの測定は、臨床生物学に
おいて、および上述したような実験室での研究にとって
非常に興味深いものである。全ての場合において、放射
性試薬の使用は回避される。
た抗原の測定） ■リンパ球の活性化は、免疫系が緊張するたびに、例え
ば、伝染性の病理、臓器移植およびある異常免疫疾患の
ときに早期に行なわれる生理学的プロセスである。この
自然のプロセスはまた、実験室内において、特にｉｎ
ｖｉｔｒｏでのリンパ球混合＠養法またはリンパ芽球転
換試験（ｌｙｍｐｈｏｂｌａｓｔｉｃ ｔｒａｎｓｆｏ
ｒＩＩｌａｔｉｏｎ ｔｅｓｔ ）のような試験におい
て、普通に用いられる。後者の場合には、フイ］−ヘム
アグルチニン（ＰＨＡ ） 、コンカナバリンへまたは
他のレクチンのような試薬を使用することによって、ポ
リクローン性活性化が得られる。■リンパ球の活性化は
、いくつかの膜マーカー、特にＣＤ２５抗原（インター
ロイキン２のりセブター）またはＣＤ ２抗原の相当の
増加を伴う。したがって、これらの抗原は活性化状態の
優れたマーカーであり、それらの測定は、臨床生物学に
おいて、および上述したような実験室での研究にとって
非常に興味深いものである。全ての場合において、放射
性試薬の使用は回避される。
これらの抗原は、第４表に記載した内容で実施例１に記
述した方法を用いて測定される。
述した方法を用いて測定される。
第 ４ 表
２５ｘ １０３個の使用した単核細胞に対して４５０ｎ
ＩＩｌで測定した光学濃度の値を下の第５表に示し、Ｐ
ＨＡを用いた刺激を与えていない細胞と３日間刺激を与
えた後の同じＩｌ［胞との比較を示した。
ＩＩｌで測定した光学濃度の値を下の第５表に示し、Ｐ
ＨＡを用いた刺激を与えていない細胞と３日間刺激を与
えた後の同じＩｌ［胞との比較を示した。
第 ５ 表
これらの結果は、活性化を行なった場合に、２種の被験
抗原の特定のシグナルが相当増加することを示している
。
抗原の特定のシグナルが相当増加することを示している
。
実施例８（Ｂリンパ球に存在するＣＤ２２及び■［＾−
０ｒ（またはクラス■ＨＬＡ）の測定） この実施例では、ｆｌＡＪＩ系の［Ｉ胞における上記抗
ａのｍ定を＋ａ明する。ＩＩＡＪ Ｉ系！［１１１２！
ハ、ＰＩＩＬＶＥＲＴＡ［ＴによってＪ、ＣＩ ｉｎ、
Ｐａｔｈｏｌ、、１９６５．１８．２６１−２７４に記
載されたヒト Ｂリンパ様［Ｉ生糸である。
０ｒ（またはクラス■ＨＬＡ）の測定） この実施例では、ｆｌＡＪＩ系の［Ｉ胞における上記抗
ａのｍ定を＋ａ明する。ＩＩＡＪ Ｉ系！［１１１２！
ハ、ＰＩＩＬＶＥＲＴＡ［ＴによってＪ、ＣＩ ｉｎ、
Ｐａｔｈｏｌ、、１９６５．１８．２６１−２７４に記
載されたヒト Ｂリンパ様［Ｉ生糸である。
細胞の免疫捕獲のために、Ｃ０２２抗原の測定のための
Ｓ−クラス■抗体（ＢＩＯ３ＹＳ）またはクラスＩＩＨ
［＾（またはＨＬＡ＝Ｏｒ＞抗原のためのＳＢ ４抗体
（ＢＩＯ３ＹＳ）のいずれかを実施例１に示した検定用
ウェル内に吸着させた。
Ｓ−クラス■抗体（ＢＩＯ３ＹＳ）またはクラスＩＩＨ
［＾（またはＨＬＡ＝Ｏｒ＞抗原のためのＳＢ ４抗体
（ＢＩＯ３ＹＳ）のいずれかを実施例１に示した検定用
ウェル内に吸着させた。
ａ ） ＣＤ２２抗原の測定
実施例３に示した方法によって、ヨウ素１２５を用いて
５Ｂ２２抗体（ＢＩＯ３ＹＳ）をラベルした。Ｃ０２２
抗原の測定は、ＣＤ ４およびＣＤ ８抗原について実
施例３に示した方法で行なった。５ｘｌＯ’個のＲＡＪ
！系綱胞と、１０” Ｃｏｎのラベルした５Ｂ２２抗
体とをマイクロウェルに連続的に導入した。４℃で１時
間保った後、プレー１〜を裏返すことによってマイクロ
ウェルを空にした後、ウェル当り２００ｕ ＱのＰＢＳ
を用いて４回洗浄した。細胞に固定した放射能は回収さ
れ、実施例３と同様にカウントされた。
５Ｂ２２抗体（ＢＩＯ３ＹＳ）をラベルした。Ｃ０２２
抗原の測定は、ＣＤ ４およびＣＤ ８抗原について実
施例３に示した方法で行なった。５ｘｌＯ’個のＲＡＪ
！系綱胞と、１０” Ｃｏｎのラベルした５Ｂ２２抗
体とをマイクロウェルに連続的に導入した。４℃で１時
間保った後、プレー１〜を裏返すことによってマイクロ
ウェルを空にした後、ウェル当り２００ｕ ＱのＰＢＳ
を用いて４回洗浄した。細胞に固定した放射能は回収さ
れ、実施例３と同様にカウントされた。
これにより、試薬ブランク（［１Ｉ１２１無し）につい
てハ５０ｄｐｎ＋ 、 ５ｘｌＯ’ ＩＩＩのｆｌＡ
ＪＩ［ｌ胞を有するつＩルについては７［３０ｄｏＩＭ
のカウントが得られた。
てハ５０ｄｐｎ＋ 、 ５ｘｌＯ’ ＩＩＩのｆｌＡ
ＪＩ［ｌ胞を有するつＩルについては７［３０ｄｏＩＭ
のカウントが得られた。
ｂ ） ＨＬＡ−Ｏｒ抗原の測定
つＩルに１０８個の細胞、次いで実施例１に記述した方
法によりバーオキシグーゼでラベルしたＳ−クラス■抗
体の複合体を入れた。測定は、実施例１と同様の手順に
従って行なった。この結果、光学濃度１．８４０が得ら
れた。また、細胞を含まない試薬ブランクでは光学濃度
０．１０５が得られた。
法によりバーオキシグーゼでラベルしたＳ−クラス■抗
体の複合体を入れた。測定は、実施例１と同様の手順に
従って行なった。この結果、光学濃度１．８４０が得ら
れた。また、細胞を含まない試薬ブランクでは光学濃度
０．１０５が得られた。
実施例９（ヒト血液の■リンパ球およびＢリンパ球に存
在する抗原の測定のた めの、本発明による方法の使用） Ａ）プレートの作製 使用したプレートは、次の点を除き、実施例１と同様に
作製されたと同じ滴定用マイクロブレ−１−である。即
ち、この実施例で使用するマイクロプレートは、少なく
とも夫々５μｇ／戒の濃度で用いられる全てのＩリンパ
球およびＢリンパ球を固定できるモノクローナル抗体（
それぞれＢＩＯ３ＹＳ製゛のＳ−クラスＩとＢＩＯ３Ｙ
Ｓ製のＳ−クラス■）がプレートの各ウェルに同時に吸
着されている。
在する抗原の測定のた めの、本発明による方法の使用） Ａ）プレートの作製 使用したプレートは、次の点を除き、実施例１と同様に
作製されたと同じ滴定用マイクロブレ−１−である。即
ち、この実施例で使用するマイクロプレートは、少なく
とも夫々５μｇ／戒の濃度で用いられる全てのＩリンパ
球およびＢリンパ球を固定できるモノクローナル抗体（
それぞれＢＩＯ３ＹＳ製゛のＳ−クラスＩとＢＩＯ３Ｙ
Ｓ製のＳ−クラス■）がプレートの各ウェルに同時に吸
着されている。
Ｂ）免疫検定
実施例１または実施例５の条件の下に、フィコール（Ｆ
ｉｃｏｌｌ）を用いて全血から単核細胞を分離した後、
ＰＢＳ緩衝液７５μ２に懸濁した８００００個の１１Ｓ
ＩＳ３１１１！２１を各ウェルに入れた。つＩルのいく
つかにおいて、ＢＩＯ３ＹＳ製の５Ｔ１１抗体（抗ＣＤ
２）を用いてＴリンパ球を測定した。Ｂリンパ球は、他
のウェルにおいて、抹消Ｂリンパ球を認識するＢＩＯ３
ＹＳ製のＳＢ ３抗体（抗ＣＤ３７ ）を用いて測定し
た。これらの抗体は、最初に、実施例１に記述した手順
に従ってパーオキシダーゼと結合する。実際の測定は実
施例１と同様に行なう。
ｉｃｏｌｌ）を用いて全血から単核細胞を分離した後、
ＰＢＳ緩衝液７５μ２に懸濁した８００００個の１１Ｓ
ＩＳ３１１１！２１を各ウェルに入れた。つＩルのいく
つかにおいて、ＢＩＯ３ＹＳ製の５Ｔ１１抗体（抗ＣＤ
２）を用いてＴリンパ球を測定した。Ｂリンパ球は、他
のウェルにおいて、抹消Ｂリンパ球を認識するＢＩＯ３
ＹＳ製のＳＢ ３抗体（抗ＣＤ３７ ）を用いて測定し
た。これらの抗体は、最初に、実施例１に記述した手順
に従ってパーオキシダーゼと結合する。実際の測定は実
施例１と同様に行なう。
Ｃ）結果
１！！験試料中に含有される■リンパ球およびＢリンパ
諒の絶対数は、予め作製した検量線と比較することによ
って測定した。この検量線は、参照技術に五りＴおよび
Ｂリンパ球を既にカウントした中核細胞に対し、同一の
処理を行なうことにより確立した。
諒の絶対数は、予め作製した検量線と比較することによ
って測定した。この検量線は、参照技術に五りＴおよび
Ｂリンパ球を既にカウントした中核細胞に対し、同一の
処理を行なうことにより確立した。
代わりに、適切な基準によって、結果を被験試料中のＣ
Ｄ ２およびＣＤ３７のモル比として表現することもで
きる。
Ｄ ２およびＣＤ３７のモル比として表現することもで
きる。
実施例１０（ｔｌ−血小板のＧｐＩＩｂ−ｍ：ａおよび
ＣＤ９抗原の測定） この測定は、ヨウ素１２５で放射能ラベルした（ ｒａ
ｄ ｉｏ Ｉａｂｅ ｌｅｄ ）モノクローナル抗体を
使用し、実施例３に従って行なう。
ＣＤ９抗原の測定） この測定は、ヨウ素１２５で放射能ラベルした（ ｒａ
ｄ ｉｏ Ｉａｂｅ ｌｅｄ ）モノクローナル抗体を
使用し、実施例３に従って行なう。
Ｐ［＾５Ｍｌ０ＮＩ流液（Ｌａｂｏｒａｔｏｉｒｅ Ｒ
，Ｂｅ１ｌｏｎ）の存在の下で遠心によってヒト白液か
ら血小板を単離した。チューブ内で、リン酸ａ？ｆｆｌ
生理食塩水（ＰＢＳ）５ｄを加えた血液５ｄと、ＰＬＡ
ＳＭＩＯＮ １０ ｄを混合した。その後、チューブを
１５００ｒｌ）ＩＩＩで１０分間遠心した。上澄に集ま
った血小板をピペットで吸引した。それらを、血小板［
：ｌ液１ボリューム（ｖｏｌｕｍｅ）をＰＢＳ １０ｄ
と混合することによりＰＢＳ中で１回洸浄し、次いで１
０００Ｘ （＋で１０分間遠心した。最後に、血小板残
渣を集め、ＰＢＳ （２ｄ）に再懸濁した。血小板を
カウントし、それらの濃度をＰＢＳ Ｉ−当り２．５ｘ
１０１１個に調整した。
，Ｂｅ１ｌｏｎ）の存在の下で遠心によってヒト白液か
ら血小板を単離した。チューブ内で、リン酸ａ？ｆｆｌ
生理食塩水（ＰＢＳ）５ｄを加えた血液５ｄと、ＰＬＡ
ＳＭＩＯＮ １０ ｄを混合した。その後、チューブを
１５００ｒｌ）ＩＩＩで１０分間遠心した。上澄に集ま
った血小板をピペットで吸引した。それらを、血小板［
：ｌ液１ボリューム（ｖｏｌｕｍｅ）をＰＢＳ １０ｄ
と混合することによりＰＢＳ中で１回洸浄し、次いで１
０００Ｘ （＋で１０分間遠心した。最後に、血小板残
渣を集め、ＰＢＳ （２ｄ）に再懸濁した。血小板を
カウントし、それらの濃度をＰＢＳ Ｉ−当り２．５ｘ
１０１１個に調整した。
モノクローナル抗体ｌ０Ｂ２ （ＩｍＩｕｎｏｔｅｃｋ
）による血小板の捕獲、およびモノクローナル抗体Ｐ
２（Ｉｎ＋ｌｌ１ｕｎｏｔｅｃｋ ）を用いたＧｐＩＩ
ｂ−ＩＩ ａのラベリングによって、ＧｐＩＩｂ−Ｉ
［ａ抗原を測定し１ご。
）による血小板の捕獲、およびモノクローナル抗体Ｐ
２（Ｉｎ＋ｌｌ１ｕｎｏｔｅｃｋ ）を用いたＧｐＩＩ
ｂ−ＩＩ ａのラベリングによって、ＧｐＩＩｂ−Ｉ
［ａ抗原を測定し１ご。
ＣＤ ９抗原の測定は、モノクローナル抗体Ｐ２を用い
た免疫捕獲およびモノクローナル抗体ｌ０Ｂ２を用いた
ラベリングによって行なった。２０００００９の血小板
を含む試料について、ｄｐＩＩＩ数を測定した。
た免疫捕獲およびモノクローナル抗体ｌ０Ｂ２を用いた
ラベリングによって行なった。２０００００９の血小板
を含む試料について、ｄｐＩＩＩ数を測定した。
結果を第６表に示す。
第 ６ 表
実施例１〜１（ヒト顆粒球［ｌ胞に存在するＣＤ１５抗
原の決定） ＣＤ１５抗原は、ヒト顆粒球（多核白血球とも呼ばれる
）の良好な特異的マーカーである。これらの細胞は、血
液中の他の白血球サブポピユレーションと同様、この抗
原によって評価し得る。この評価は、例えば膀胱炎また
は腎孟腎炎のような泌尿系感染のケースにおいて、顆粒
球の存在を評価するためにも有用である。この実施例に
おいては、全血に由来し且つ以下に示すようにして分離
された顆粒球について、測定を行なった。
原の決定） ＣＤ１５抗原は、ヒト顆粒球（多核白血球とも呼ばれる
）の良好な特異的マーカーである。これらの細胞は、血
液中の他の白血球サブポピユレーションと同様、この抗
原によって評価し得る。この評価は、例えば膀胱炎また
は腎孟腎炎のような泌尿系感染のケースにおいて、顆粒
球の存在を評価するためにも有用である。この実施例に
おいては、全血に由来し且つ以下に示すようにして分離
された顆粒球について、測定を行なった。
次の点以外は血小板について実施例１０で記載したのと
類似の方法により、単球細胞と共に、顆粒球を赤血球か
ら分離した。即ち、この実施例ではＩＩ［胞を含んだチ
ューブを４５分間だけ室温に敢置し、液体表面から採取
した５００μａ容積中の白血球サスペンションを回収し
た。
類似の方法により、単球細胞と共に、顆粒球を赤血球か
ら分離した。即ち、この実施例ではＩＩ［胞を含んだチ
ューブを４５分間だけ室温に敢置し、液体表面から採取
した５００μａ容積中の白血球サスペンションを回収し
た。
全ての白血球のａｌ１１１ｇ！に存在するＣＤ４５抗原
に特異的なモノクローナル抗体で、顆粒球を固定した。
に特異的なモノクローナル抗体で、顆粒球を固定した。
抗−［Ｃ＾抗体（ＢＩＯ８ＹＳ）を用い、実施例１に示
したようにして、これを滴定プレートのマイクロウェル
中に吸収させた。
したようにして、これを滴定プレートのマイクロウェル
中に吸収させた。
測定は、実施例１の技術によりパーオキシダーゼでラベ
ルした抗−ＣＤ１５モノクロ一ナル抗体５ＨＹ−１５ａ
（ＢＩＯ３ＹＳ）を用いて行なった。
ルした抗−ＣＤ１５モノクロ一ナル抗体５ＨＹ−１５ａ
（ＢＩＯ３ＹＳ）を用いて行なった。
こうして夫々のウェル中に導入された合計１２，５００
個の細胞について、顆粒球のＣＤ１５抗体の特異的シグ
ナルは、［Ｉ胞の存在下で且つ酵素複合体の不存在下に
おいて得られた試要ブランク粗光学密度、即ち顆粒球の
内因性パーオキシダーゼに起因する粗光学密度の０．１
００を補正した後では、ｏ、ｅｉｅであった。
個の細胞について、顆粒球のＣＤ１５抗体の特異的シグ
ナルは、［Ｉ胞の存在下で且つ酵素複合体の不存在下に
おいて得られた試要ブランク粗光学密度、即ち顆粒球の
内因性パーオキシダーゼに起因する粗光学密度の０．１
００を補正した後では、ｏ、ｅｉｅであった。
実施例１２（酵素免疫検定法による白血病フェノタイプ
の評価） 白画病患者におけるｌｌ１ｌ！瘍Ｉ［ｌｐａの７エノタ
イビングは、患者の白血病［１１ｉ （Ｔ、８．ｌ’ｉ
粒球、骨髄芽沫等）のタイプ及び起源を特定するために
行なわれる系統的な診断試験である。通常、この試験は
モノクローナル抗体のセットを用い、且つ顕微鏡下で陽
性ｉ［１Ｉ１２１を′ｆ；Ａ察および計数することによ
る免疫蛍光技術によって行なわれる。Ｉｌ［ｌｌａのラ
ベリングを分析するために、流ｔｌＪｉ！Ｉｌ胞計測沫
も用いられる。
の評価） 白画病患者におけるｌｌ１ｌ！瘍Ｉ［ｌｐａの７エノタ
イビングは、患者の白血病［１１ｉ （Ｔ、８．ｌ’ｉ
粒球、骨髄芽沫等）のタイプ及び起源を特定するために
行なわれる系統的な診断試験である。通常、この試験は
モノクローナル抗体のセットを用い、且つ顕微鏡下で陽
性ｉ［１Ｉ１２１を′ｆ；Ａ察および計数することによ
る免疫蛍光技術によって行なわれる。Ｉｌ［ｌｌａのラ
ベリングを分析するために、流ｔｌＪｉ！Ｉｌ胞計測沫
も用いられる。
本発明の方法でモノクローナル抗体を使用することによ
って、急性または慢性白血病の臨床的に重要且つ主要な
グループを同定することが可能となり、また試験される
異なった抗原の相対的密度に関する情報の提供が可能と
なる。
って、急性または慢性白血病の臨床的に重要且つ主要な
グループを同定することが可能となり、また試験される
異なった抗原の相対的密度に関する情報の提供が可能と
なる。
この実施例では、白血病ＩＩＩ胞に存在する抗原に特異
的な、下記６種類のパーオキシダーゼ結合モノクローナ
ル抗体を作製した。
的な、下記６種類のパーオキシダーゼ結合モノクローナ
ル抗体を作製した。
φＳＴ１及び５Ｔ１１（ＢＩＯ３ＹＳ） ：抗ＣＤ５お
よび抗ＣＤ２ ・５Ｂ３（ＢＩＯ３ＹＳ） ：抗Ｃ［１３７・５−Ｃ
ＡＬＬ＾（ＳＡＮＯＦＴ） ：抗ＣＡＬＬＡ （又
は抗ＣＤ１０） −５−ｃｌａｓｓ ｎ （ＢＩＯ３ＶＳ）：抗Ｈ［＾
−０ｒ（又は抗クラスｎ−ＨＬ＾）・ＳＭＹＩＳ（ＢＩ
Ｏ８ＹＳ） ：抗Ｃ０１５滴定用マイクロプレートは
、抗ＣＤ４５モノクローナル抗体（Ｓ−ＬＣ＾、［１Ｉ
Ｏ８ＹＳ）及び抗りラスＩ−ＨＬＡ−Ｅ−ツクローナル
抗体（Ｓ−ｃｌａｓｓＩ 、ＢＩＯ３ＹＳ）の氾合物を
、市もって吸着することにより調製した。
よび抗ＣＤ２ ・５Ｂ３（ＢＩＯ３ＹＳ） ：抗Ｃ［１３７・５−Ｃ
ＡＬＬ＾（ＳＡＮＯＦＴ） ：抗ＣＡＬＬＡ （又
は抗ＣＤ１０） −５−ｃｌａｓｓ ｎ （ＢＩＯ３ＶＳ）：抗Ｈ［＾
−０ｒ（又は抗クラスｎ−ＨＬ＾）・ＳＭＹＩＳ（ＢＩ
Ｏ８ＹＳ） ：抗Ｃ０１５滴定用マイクロプレートは
、抗ＣＤ４５モノクローナル抗体（Ｓ−ＬＣ＾、［１Ｉ
Ｏ８ＹＳ）及び抗りラスＩ−ＨＬＡ−Ｅ−ツクローナル
抗体（Ｓ−ｃｌａｓｓＩ 、ＢＩＯ３ＹＳ）の氾合物を
、市もって吸着することにより調製した。
上記６種類のモノクローナル抗体を用い、慢性リンパ性
白血病Ｂ （ＣＬＬ−８）のフェノタイプ評価を行なっ
た。また、従来の方法による特徴付けを行なった。
白血病Ｂ （ＣＬＬ−８）のフェノタイプ評価を行なっ
た。また、従来の方法による特徴付けを行なった。
夫々のウェルに導入された合計８０，０００個の単核細
胞について、４９２ｎｍで測定した光学密度を下記第７
表に示す。同表には、細胞を含まない対照ウェルについ
て測定した光学密度を併記する。Ｉｌｌ胞は含むが、パ
ーオキシダーゼでラベルした抗体は含まない対照ウェル
における光学密度は０．１１０である。
胞について、４９２ｎｍで測定した光学密度を下記第７
表に示す。同表には、細胞を含まない対照ウェルについ
て測定した光学密度を併記する。Ｉｌｌ胞は含むが、パ
ーオキシダーゼでラベルした抗体は含まない対照ウェル
における光学密度は０．１１０である。
第７表
上記の結果に示されるように、研究対照の白画病細胞は
多量のＣＤ５抗原、ＣＤ３７抗原およびクラス■−ＨＬ
＾抗原を有する。しかし、ＣＬＬ−８４−特徴的なＣＤ
１５抗原、ＣＡＬＬＡ抗原およびＣＤ２抗原は全く或い
は極く僅かしか存在しない。
多量のＣＤ５抗原、ＣＤ３７抗原およびクラス■−ＨＬ
＾抗原を有する。しかし、ＣＬＬ−８４−特徴的なＣＤ
１５抗原、ＣＡＬＬＡ抗原およびＣＤ２抗原は全く或い
は極く僅かしか存在しない。
実施例１３（泌尿系の癌に附随する
抗原の測定）
本発明のキット及び方法は、特に泌尿系の癌における腫
瘍ｗｉ胞の測定に特別に通しており、例えば化学工業等
の非常、に危険な環境に曝される作業者のように危険度
の高い集団のマススクリーニングに適用することができ
る。
瘍ｗｉ胞の測定に特別に通しており、例えば化学工業等
の非常、に危険な環境に曝される作業者のように危険度
の高い集団のマススクリーニングに適用することができ
る。
この実施例は、膀胱癌に附随する抗原、ヒト泌尿系乳頭
腫（Ｃ，Ｃ，旧ｇｂｙ ＆ Ｌ、！＋、Ｆｒａｎｋｓ、
Ｂで、ｔ、Ｊ、Ｃａｎｃｃｒ、 １９７０．２４．７４
８−７５４ ）に由来するＦｌ−Ｔ４セルライン上の抗
原の測定に対する本発明の適用を示す。
腫（Ｃ，Ｃ，旧ｇｂｙ ＆ Ｌ、！＋、Ｆｒａｎｋｓ、
Ｂで、ｔ、Ｊ、Ｃａｎｃｃｒ、 １９７０．２４．７４
８−７５４ ）に由来するＦｌ−Ｔ４セルライン上の抗
原の測定に対する本発明の適用を示す。
細胞の免疫捕獲を目的としたプレートを実施例１のよう
にして調製し、クラスＩ −ＨＬ＾抗原を認識して全て
の上皮細胞を保持できるＳ−クラスＩモノクローナル抗
体（ＢＩＱＳＹＳ）をウェルに吸着させた。
にして調製し、クラスＩ −ＨＬ＾抗原を認識して全て
の上皮細胞を保持できるＳ−クラスＩモノクローナル抗
体（ＢＩＱＳＹＳ）をウェルに吸着させた。
実施例１（酵素ラベリング）または実施例３（ラジオア
イソト−プラベリング）の方法により、膀胱癌に附随す
るＦｒ、原を認識するモノクローナル抗体１２Ｆ６（Ｓ
ＡＮＯＦＩ）について、ラベルされた複合体を得た。
イソト−プラベリング）の方法により、膀胱癌に附随す
るＦｒ、原を認識するモノクローナル抗体１２Ｆ６（Ｓ
ＡＮＯＦＩ）について、ラベルされた複合体を得た。
測定のために、７５μ２の細胞サスペンションを４つの
マイクロウェルに充暖したく即ち、１ウェル当り５０・
１０３（１）。パーオキシダーゼを結合し・たモノクロ
ーナル抗体１２Ｆｅ（ＳＡＮＯＦＩ）の複合体を２つの
ウェル中に導入し、またヨウ素１２５でラベルした抗体
１２［６を他の２つのウェルに導入した（ １００．Ｏ
ＯＯｃｐｍ／ウェル）。酵素免疫検定法または放ｑ１免
疫検定法の適用により青られた結果を第８表に示す。
マイクロウェルに充暖したく即ち、１ウェル当り５０・
１０３（１）。パーオキシダーゼを結合し・たモノクロ
ーナル抗体１２Ｆｅ（ＳＡＮＯＦＩ）の複合体を２つの
ウェル中に導入し、またヨウ素１２５でラベルした抗体
１２［６を他の２つのウェルに導入した（ １００．Ｏ
ＯＯｃｐｍ／ウェル）。酵素免疫検定法または放ｑ１免
疫検定法の適用により青られた結果を第８表に示す。
第８表
実施例１４（イーストカンジダアルビカンスの膜抗原の
酵素免疫検定） カンジダアルビカンス［Ｉ胞（セロタイプ１７）は、パ
リのバスツールコレクションインステイチュート（Ｉｎ
ｓｔｉｔｕｔ Ｐａ５ｔｅｕｒ Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ
、Ｐａｒｉｓ ）に起源を有する。このイーストを、常
法により固体の合成培地上で１８１間＠養した。細胞を
計数し、ＰＢＳ緩！！ｉ液１−中に細胞１０６個を含有
する細胞サスペンションを調製した。
酵素免疫検定） カンジダアルビカンス［Ｉ胞（セロタイプ１７）は、パ
リのバスツールコレクションインステイチュート（Ｉｎ
ｓｔｉｔｕｔ Ｐａ５ｔｅｕｒ Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ
、Ｐａｒｉｓ ）に起源を有する。このイーストを、常
法により固体の合成培地上で１８１間＠養した。細胞を
計数し、ＰＢＳ緩！！ｉ液１−中に細胞１０６個を含有
する細胞サスペンションを調製した。
Ｔ、Ｃｈａｒｄｅｓの論文（Ｆａｃｕｌｔｙ ｏｆ ｐ
ＨａｒｌｌｌａＣＶ’；ＵｎｉＶｅｒｓｉｔｙ ｏｆ
Ｎｏｎｔｐｅｌｌｉｅｒ Ｉ、１９８８ ）に記載され
たようにして、リンパ球交雑により抗カンジダアルビカ
ンスモノクローナル杭体を作製した。
ＨａｒｌｌｌａＣＶ’；ＵｎｉＶｅｒｓｉｔｙ ｏｆ
Ｎｏｎｔｐｅｌｌｉｅｒ Ｉ、１９８８ ）に記載され
たようにして、リンパ球交雑により抗カンジダアルビカ
ンスモノクローナル杭体を作製した。
免疫捕獲には抗体ＣＡ４を用い、実施例１の条件下での
測定にはパーオキシダーゼでラベルした抗体ＣＡｌ２を
用いた。
測定にはパーオキシダーゼでラベルした抗体ＣＡｌ２を
用いた。
４９２ｎｍで測定された光学密度値は、導入した細胞を
含むウェルで１．０２−５ 、細胞を含まない対照ａｔ
についてはＯ、（Ｊ８０であった。
含むウェルで１．０２−５ 、細胞を含まない対照ａｔ
についてはＯ、（Ｊ８０であった。
実施例１５く磁性ビーズ上で行なわれる酵素免疫検定）
アセデルコリンエステラーゼでラベルされた複合抗体お
よび磁性ビーズで形成された粒状支持体で、ヒ１へＴリ
ンパ球の００５抗原を測定する。
よび磁性ビーズで形成された粒状支持体で、ヒ１へＴリ
ンパ球の００５抗原を測定する。
細胞を捕獲するために用いた支持体は、ＤＹＮＡＢＥ＾
Ｏ８として知られる磁性ビーズからなる。このビーズは
、ＢＹＯＳＹＳから０ＹＮ−１１１０１の商品番号で市
販されており、その表面に被検試料中の全てのＴリンパ
球を固定できる抗ＣＤ２抗原を有している。これらのビ
ーズは、測定の特性を改善するために、使用する曲に族
ＣＤ２杭休の溶液で再度処理される。
Ｏ８として知られる磁性ビーズからなる。このビーズは
、ＢＹＯＳＹＳから０ＹＮ−１１１０１の商品番号で市
販されており、その表面に被検試料中の全てのＴリンパ
球を固定できる抗ＣＤ２抗原を有している。これらのビ
ーズは、測定の特性を改善するために、使用する曲に族
ＣＤ２杭休の溶液で再度処理される。
これは、ビーズの（サスペンション１０μ２を抗体２５
μ９を含むＰＢＳ緩旨液の溶液と混合し、ゆっくりと１
時間振Ｓすることにより行なう。続いて、ビーズをＰＢ
Ｓ緩訂液で４回洗浄した後、ＰＢＳ緩酎液耐’ｄ中に保
存する。
μ９を含むＰＢＳ緩旨液の溶液と混合し、ゆっくりと１
時間振Ｓすることにより行なう。続いて、ビーズをＰＢ
Ｓ緩訂液で４回洗浄した後、ＰＢＳ緩酎液耐’ｄ中に保
存する。
゛測定に際しては、ビーズのサスペンション２００ｕＱ
と、Ｆｉｃｏｌ Ｉ−Ｐａｑｕｅ（ＰＩ−１’ＡＲＨＡ
ｃＩへ）を用いて全白から分離された単核１ｌｌｌｉ胞
のサスペンション８０μＱとを５ｄのチューブに導入し
た。次いで、実施例６で用いたのと同じアセチルコリン
でラベルした抗体ＳＴ１の複合体を添加した。
と、Ｆｉｃｏｌ Ｉ−Ｐａｑｕｅ（ＰＩ−１’ＡＲＨＡ
ｃＩへ）を用いて全白から分離された単核１ｌｌｌｉ胞
のサスペンション８０μＱとを５ｄのチューブに導入し
た。次いで、実施例６で用いたのと同じアセチルコリン
でラベルした抗体ＳＴ１の複合体を添加した。
ゆっくりと１時間振冴した後、磁石を用いてビーズを分
離し、ビーズに固定された１ｌｉＩＵ＠をＰＢＳ緩衝液
で洗浄した（５回）。
離し、ビーズに固定された１ｌｉＩＵ＠をＰＢＳ緩衝液
で洗浄した（５回）。
ａｍに結合されたアセチルコリンエステラーゼの活性を
、実施例６と同じ方法で発現させた。ｊｑられた光学密
度シグナルは、ラベルした細胞の存在下では０．１６８
、細胞なしで得たブランクでは０゜０６２の値を示し
た。
、実施例６と同じ方法で発現させた。ｊｑられた光学密
度シグナルは、ラベルした細胞の存在下では０．１６８
、細胞なしで得たブランクでは０゜０６２の値を示し
た。
出頴人代理入弁理土鈴江武彦
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 （１）ａ）細胞ポピュレーションの表面抗原のうち特徴
的抗原以外のものに向けられる一以上のモノクローナル
抗体が、共有結合または物理的吸着によって固定される
固相支持体と、 ｂ）測定さるべき細胞ポピユレーシヨンまたは細胞サブ
ポプレーシヨンの抗原特性に対して特異的で、且つ放射
性プローブまたは酵素プローブでラベルされたモノクロ
ーナル抗体が夫々の溶液に含有されている一以上の溶液
と、 ｃ）酵素プローブでラベルされた抗体の場合には、該酵
素の活性発現に必要な試薬を供給する一以上の溶液と、 ｄ）更に、それが適当なときには、洗浄用緩面溶液およ
び／または測定の標準化や品質制御を可能とするサンプ
ルを含む追加構成要素と を構成要素として具備した、細胞ポピュレーションまた
は細胞サブポピュレーシヨンの表面抗原特性を測定する
ためのキット。 （２）構成要素ａ）が、測定さるべき抗原をもった細胞
ポピュレーシヨン又は細胞サブポピュレーシヨンを含む
細胞を固定するための抗体または抗体類をウェル中に固
定した滴定用マイクロプレートからなる固相支持体であ
る請求項１に記載のキット。 （３）構成要素ａ）が、粒状の磁性支持体である請求項
１に記載のキット。 （４）構成要素ａ）は、一以上のクラス I ＨＬＡモノ
クローナル抗体が固定された固相支持体である請求項１
〜３の何れかに記載のキット。 （５）固定されたモノクローナル抗体が、Ｓ−クラス
I と称される抗体である請求項４に記載のキット。 （６）構成要素ｂ）のモノクローナル抗体が、ヨウ素１
２５−またはヨウ素１３１−ラジオアイソトーププロー
ブでラベルされている請求項１〜３の何れかに記載のキ
ット。 （７）構成要素ｂ）のモノクローナル抗体が、酵素プロ
ーブでラベルされている請求項１〜３の何れかに記載の
キット。 （８）構成要素ｂ）のモノクローナル抗体がパーオキシ
ダーゼでラベルされ、且つ構成要素ｃ）が過酸化水素、
並びにｏ−フェニレンジアミン、２，２′−アジノ−ビ
ス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン）酸、
３，３′−ジアミノベンジジン、３−アミノ−９−エチ
ルカルバゾール及びこれらの水溶性塩からなる群から選
択されるクロモーゲンを必須成分として含有する請求項
７に記載のキット。 （９）構成要素ｂ）のモノクローナル抗体がアルカリホ
スファターゼでラベルされ、且つ構成要素ｃ）がｐ−ニ
トロフェニルホスフェート、４−メチルウンベリフエリ
ルホスフエート又は５−ブロモ−４−クロロインドール
−３−イルホスフエートからなる請求項７に記載のキッ
ト。 （１０）構成要素ｂ）のモノクローナル抗体がβ−ガラ
クトシダーゼでラベルされ、且つ構成要素ｃ）がｏ−ニ
トロフェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド、又は４−
メチルウンベリフエリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド
からなる請求項７に記載のキット。 （１１）構成要素ｂ）のモノクローナル抗体がアセチル
コリンエステラーゼでラベルされ、且つ構成要素ｃ）が
アセチルチオコリンと、５，５′−ジチオ−２−ニトロ
安息香酸またはその水溶性塩とを必須成分として含有す
る請求項７に記載のキット。 （１２）白血球、リンパ球、Ｔ−リンパ球、Ｂ−リンパ
球、顆粒球および血小板のようなヒト血液有形成分にお
ける表面抗原の何れか一つ又は幾つかを測定するための
、請求項１に記載のキット。 （１３）Ｔ４リンパ球またはＴ８リンパ球と称されるヒ
トＴリンパ球に存在するＣＤ４抗原またはＣＤ８抗原を
測定するための請求項１２に記載のキット。 （１４）病原性微生物における表面抗原の何れか一つ又
は幾つかを測定するための請求項１に記載のキット。 （１５）病原性微生物がカンジダアルビカンスである請
求項１４に記載のキット。 （１６）腫瘍細胞における膜抗原の何れか一つ又は幾つ
かを測定するための請求項１に記載のキット。 （１７）腫瘍細胞が、泌尿系癌細胞または悪性血液病細
胞である請求項１６に記載のキット。 （１８）構成要素ａ）は、細胞ポピュレーシヨンの表面
抗原に対して特異的な一以上のモノクローナル抗体をウ
ェル中に固定した滴定用マイクロプレートであり、また
構成要素ｂ）は、固定された細胞ポピュレーションの一
部をなす細胞サブポプレーシヨンの表面抗原に対して特
異的なモノクローナル抗体を含有する幾つかの溶液から
なる請求項１または２に記載のキット。 （１９）Ｔ、Ｔ４、Ｔ８及びＢリンパ球サブポピュレー
ションの特異的抗原を測定するための請求項１８に記載
のキット。 （２０）悪性血液病における腫瘍細胞の表面抗原性エク
イップメントを構成する異なった抗原の特徴付けおよび
測定のための請求項１８に記載のキット。 （２１）ａ）測定さるべき抗原を有する細胞ポピユレー
ション又は測定さるべき抗原を有するサブポピュレーシ
ョンを含む細胞ポピユレーシヨンを、予め固相支持体に
固定され且つ細胞表面に存在する測定すべき抗原以外の
抗原を認識し得る一以上のモノクローナル抗体を用いる
ことにより、共有結合または物理的吸着で前記固相支持
体上に固定すると共に、同じステップにおいて、測定さ
るべき抗原に対して特異的で且つラジオアイソトーププ
ローブ又は酵素プローブを有する少なくとも一つのモノ
クローナル抗体で前記細胞ポピュレーションをラベリン
グする工程と、 ｂ）所定期間のインキユベーシヨンを行なう工程と、 ｃ）固定されなかった細胞および過剰の抗体を除去する
ために、支持体を洗浄する工程と、 ｄ）抗体が酵素プローブを有する場合には、該酵素の活
性を発現するために必要な試薬または試薬類（基質およ
びクロモーゲン）を添加する工程と、 ｅ）放射能の計数または光シグナル（発色または蛍光）
の測定の何れかを、もし過当であるならば標準領域と対
照して行なうことにより、結果を読みとる工程と を具備した、細胞ポピュレーション又は細胞サブポピュ
レーションにおける表面抗原の免疫検定のための方法。 （２２）固相支持体が請求項１または２に規定したもの
である請求項２１に記載の方法。（２３）ラベリングを
目的としたモノクローナル抗体が酵素プローブを有する
請求項２１または２２に記載の方法。 （２４）酵素プローブがパーオキシダーゼで、且つ該酵
素の活性が過酸化水素、並びにｏ−フェニレンジアミン
、２，２′−アジノ−ビス（３−エチルベンゾチアゾリ
ン−６−スルホン）酸、３，３′−ジアミノベンジジン
、３−アミノ−９−エチルカルバゾール及びこれらの水
溶性塩からなる群から選択されるクロモーゲンによって
発現される請求項２３に記載の方法。 （２５）酵素プローブがアルカリホスファターゼで、且
つ該酵素の活性がｐ−ニトロフェニルホスフェート、４
−メチルウンベリフエリルホスフエート又は５−ブロモ
−４−クロロインドール−３−イルホスフェートによっ
て発現される請求項２３に記載の方法。 （２６）酵素プローブがβ−ガラクトシダーゼで、且つ
該酵素の活性がｏ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクト
ピラノシド、又は４−メチルウンペリフェリル−β−Ｄ
−ガラクトピラノシドによって発現される請求項３に記
載の方法。 （２７）酵素プローブがアセチルコリンエステラーゼで
、旦つ該酵素の活性がアセチルチオコリンと、クロモー
ゲンとしての５，５′−ジチオ−２−ニトロ安息香酸ま
たはその水溶性塩によつて発現される請求項２３に記載
の方法。 （２８）ラベリングを目的としたモノクローナル抗体が
ヨウ素１２５またはヨウ素１３１のラジオアイソトープ
プローブである請求項２１または２２に記載の方法。 （２９）測定を行なうのに要する全体の時間が１時間以
下である請求項２１または２２に記載の方法。 （３０）固相支持体に固定されるモノクローナル抗体ま
たはモノクローナル抗体類が、クラス I ＨＬＡ抗体で
ある請求項２１に記載の方法。 （３１）固相支持体に固定されるモノクローナル抗体が
、Ｓ−クラス I と称される抗体である請求項３０に記
載の方法。 （３２）ヒト白液有形成分における一以上の表面抗原を
測定するための請求項２１に記載の方法。 （３３）ヒト血液有形成分が白血球、Ｔ−リンパ球、Ｔ
４マーカーを有するＴ４リンパ球と称されるリンパ球、
Ｔ８マーカーを有するＴ８リンパ球と称されるＴリンパ
球、Ｂ−リンパ球、顆粒球および血小板である請求項２
１に記載のキット。 （３４）病原性微生物における何れか一つ又は幾つかの
表面抗原を測定するための請求項２１に記載の方法。 （３５）病原性微生物がカンジダアルビカンスである請
求項３４に記載の方法。 （３６）腫瘍細胞における何れか一つ又は幾つかの膜抗
原を測定するための請求項２１に記載の方法。 （３７）腫瘍細胞が泌尿系癌細胞または悪性血液病細胞
である請求項３６に記載の方法。（３８）細胞ポピユレ
ーションを、このポピュレーシヨンの表面抗原に特異的
な一以上のモノクローナル抗体を用いて滴定用マイクロ
プレート上に固定し、また同じステップにおいて、固定
されたポピュレーシヨンを構成する細胞サブポピュレー
シヨンを、夫々が測定さるべき細胞サブポピュレーショ
ンの一つにおける表面抗原に対して特異的なモノクロー
ナル抗体を含む幾つかの溶液で直接ラベリングする請求
項２１および２２に記載の方法。（３９）Ｔ、Ｔ４、Ｔ
８およびＢリンパ球サブポピュレーシヨンにおける特異
抗原を測定するための請求項３８に記載の方法。 （４０）悪性血液病の腫瘍細胞における表面抗原性エク
イツプメントを構成する異なつた抗原の特徴付けおよび
測定のための請求項３８に記載の方法。
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