JPH11511851A - 細胞計数イムノアッセイ - Google Patents
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Abstract
(57)【要約】
本発明は、検量標準、すなわち試験条件下にサンプルと同様に挙動し、その濃度が細胞の濃度と相関可能な物質を使用する細胞計数イムノアッセイに関する。このイムノアッセイはフローサイトメトリーの効率的な代替法である。
Description
【発明の詳細な説明】
発明の名称
細胞計数イムノアッセイ
発明の分野
本発明はイムノアッセイに関し、さらに詳しくはフローサイトメトリーの効率
的な代替法としての細胞計数イムノアッセイに関する。
発明の背景
1975年頃のKohler & Milsteinによるハイブリドーマ技術の開発に伴い、モノ
クローナル抗体が細胞表面分子の発見および同定に利用されるようになった。細
胞マーカーの分析は予後判定、疾患状態の分類、処置の決定および治療のモニタ
リングに重要である。たとえばヒト免疫不全ウイルス（HIV）感染においては、C
D4+／CD8+Ｔ細胞比およびCD4+Ｔリンパ球の絶対数の両者が上述の理由により重
要である。細胞膜分子の機能および数種の疾患（たとえば敗血症、火傷、自己免
疫疾患、移植片拒絶）におけるそれらの定量的変化の結果は、分子生物学におけ
る技術ならびに免疫系の状態の評価およびより正確な予後判定の能力の進歩によ
って、より深く理解されるようになっている。
細胞膜マーカーは通常、蛍光自動細胞分離分析装置（FACS）および検定すべき
細胞マーカーに特異的な蛍光標識モノクローナル抗体を用いるフローサイトメト
リーによってアッセイされる。FACS分析は、フローサイトメーターを通過して液
流中を一列に流れる細胞、または可能な限り最善のその近似値を測定する。臨床
的応用のための試験の標準化および再現性は、フローサイトメーターにより感度
が異なるため、とくに細胞の蛍光強度を定量的に測定する場合には困難である。
さらに、この装置は高価で（多くの場合20万ドル以上）、労働集約型であり、FA
CSの実施
には高度に訓練された担当者が必要になる。FACS分析はまた、装置の変動性や結
果の表現方法により信頼性が低い。通常、結果は血液１μlあたりの白血球数と
白血球分類を別個に測定する必要がある単位で表現される。これにより、１つの
臨床的結果に３つの試験の変動性が加算されることになる。そのため、同一サン
プルを別個に２回測定した場合の結果にファクター２までの差が生じることも珍
しくはない。
上述の事実を前提として、多くの研究者がフローサイトメトリーの代替として
酵素イムノアッセイを用いる細胞内または細胞上のマーカーの信頼に足りる測定
法の開発に努力してきたが、これまで成功をみていない。
Flankeら、Clin．Chem.，40(1): 38-42（1994）ならびにInt-Conf-AIDS，259
頁(1991年６月16〜21日)を収録したAIDSLINE，1993年12月にはCD4／CD8分子を定
量的に測定するための細胞マーカーELISA，Capcellia(登録商標)CD4／CD8が記載
されている。このアッセイはとくに、固相表面に吸着させた汎‐Ｔモノクローナ
ル抗体をペルオキシダーゼ標識免疫複合体によるCD4またはCD8の同時標識ととも
に用い、細胞を固相上に固定化したマイクロタイタープレート上、単一工程で実
施される。結果は、標準曲線から計算されるCD4またはCD8分子のモル濃度で表現
される。CD4分子の濃度を細胞／ｌに変換するために使用されるファクターは単
に相対的であり、基準として使用された。すなわち、このアッセイはフローサイ
トメトリーに代わる効率的な代替法の域には全く達していない。
他のアプローチには次のようなものがある。
Baumgarten，J．Immunological Methods，94: 91-98（1986）は、白血球抗原
の定量のために、マイクロプレートウエルに付着させた風乾、
メタノール固定細胞を用いる細胞ELISAの検量の必要性を記載している。試験は
各単一サンプル毎に特異的抗原と細胞タンパク質の量の両者を測定することによ
って標準化され、無傷の細胞または検討すべき細胞から調製された単離形質膜の
いずれかによって検量された。
Hessianら、J．Immunological Methods，91: 29-34（1986）は、免疫ろ過法と
アルカリホスファターゼおよびモノクローナル抗‐アルカリホスファターゼの可
溶性複合体を用いることによる、FACS分析の代替法としての細胞会合酵素イムノ
アッセイを記載している。
1987年４月28日にSchlossmanらに付与された米国特許第4,661,466号には、細
胞の部分集団を、モノクローナル抗体との反応性の程度の差に基づいて識別する
ためのモノクローナル抗体の使用が記載されている。
同様に、1987年６月30日にRoseらに付与された米国特許第4,677,061号には、
免疫性疾患のＴ細胞リンパ球部分集合のモニタリングが記載されている。Ｔ細胞
部分集合は特異的表面膜タンパク質と会合するエピトープ部位の指定されたパタ
ーンについてモニタリングされ、この場合、異なるパターンを有する細胞の比を
多重パラメーターフローサイトメトリー分析によって測定する。この比が免疫疾
患によると思われる変化を指示する。
1990年４月19日に公開されたWO 90／04180号には、免疫の活性化状態を診断す
るために可溶性CD4抗原を測定する方法が記載されている。
1992年５月29日に公開されたWO92／08981号には、総白血球抗原の測定および
細胞計数のためのこの測定値の使用が記載されている。
これらの引用文献のいずれにも、フローサイトメトリーの効率的な代替法にな
る標準化された再現性のある細胞計数イムノアッセイは記載されていない。
発明の概要
本発明は、サンプル中の総細胞集団の部分集団または部分集団の部分集合にお
ける細胞数を定量するための細胞計数イムノアッセイにおいて、
(ａ) サンプルを、修飾された固相、部分集団に特異的な第一の標識された抗
体および部分集団または部分集団の部分集合に特異的な第二の検出可能なように
標識された抗体と同時に接触させ、この場合、第一の抗体上の標識は修飾された
固相上に固定化するために使用され、第二の抗体上の標識は検出に使用され、第
一の抗体上の標識は第二の抗体上の標識とは異なり、さらに第一の抗体と第二の
抗体は同一のまたは異なる特異性を有し、部分集団中の細胞上の異なる部位に結
合することが可能であり、
(ｂ) 標識されているかまたは標識されていない検量標準を別個に、修飾され
た固相、ならびに(ｉ)検量標準が工程(ａ)の第一の抗体および第二の抗体に付着
させたのと同じ標識で二重に標識されている場合は他の反応物質は用いないで、
(ii)検量標準が標識されていないで、第一の抗体および第二の抗体と結合できる
場合には第一の抗体および第二の抗体と、(iii)検量標準が第二の抗体の場合と
同じ標識で単独に標識されていて第一の抗体と結合できる場合にはさらに第一の
抗体のみと、または(iv)検量標準が第一の抗体の場合と同じ標識で単独に標識さ
れていて第二の抗体と結合できる場合にはさらに第二の抗体のみと接触させ、た
だし、検量標準が細胞である場合には、細胞は第一の抗体および第二の抗体に付
着させたのと同じ１種または２種の標識で単独にまたは二重に標識されていて、
(ｃ) 工程(ａ)により発生するシグナルおよび工程(ｂ)により発生す
るシグナルを別個に測定し、ついで
(ｄ) 工程(ａ)の測定からの結果と工程(ｂ)から得られた結果を比較すること
によりサンプル中の部分集団または部分集団の部分集合における細胞数を定量す
る
ことからなるイムノアッセイに関する。
他の実施態様においては、本発明はサンプル中の総Ｔ細胞集団の部分集合中の
Ｔ細胞数を定量するための細胞計数イムノアッセイにおいて、
(ａ) サンプルを、修飾された固相、この修飾された固相上に固定化するため
に使用される標識で標識された抗‐汎Ｔ細胞抗体、および検出に使用される標識
であり抗‐汎Ｔ細胞抗体上の標識とは異なる標識で検出可能に標識された抗‐部
分集合特異的抗体と同時に接触させ、この場合さらに、抗‐汎Ｔ細胞抗体と抗‐
分集合特異的抗体は同一のまたは異なる特異性を有し、部分集団中の細胞上の異
なる部位に結合することが可能であり、
(ｂ) 標識されているかまたは標識されていない検量標準を別個に、修飾され
た固相、ならびに(ｉ)検量標準が工程(ａ)の抗‐汎Ｔ細胞抗体および抗‐部分集
合特異的抗体に付着させたのと同じ標識で二重に標識されている場合は他の反応
物質は使用しないで、(ii)検量標準が標識されていないで、上記両抗体に結合で
きる場合には抗‐汎Ｔ細胞抗体および抗‐部分集合特異的抗体と、(iii)検量標
準が抗‐部分集合特異的抗体の場合と同じ標識で単独に標識されていて抗‐汎Ｔ
細胞抗体と結合できる場合には第一の抗体のみと、または(iv)検量標準が抗‐汎
Ｔ細胞抗体の場合と同じ標識で単独に標識されていて抗‐部位分集合特異的抗体
と結合できる場合にはさらに抗‐分集合特異的抗体のみと接触させ、ただし検量
標準が細胞である場合には、細胞は抗体に付着させたのと同じ
１種または２種の標識で単独にまたは二重に標識されていて、
(ｃ) 工程(ａ)により発生するシグナルおよび工程(ｂ)により発生するシグナ
ルを別個に測定し、ついで
(ｄ) 工程(ａ)の測定からの結果と工程(ｂ)から得られた結果を比較すること
によりサンプル中の総Ｔ細胞集団の部分集合中のＴ細胞数を定量する
ことからなるイムノアッセイに関する。
図面の簡単な説明
図１は、サンプルの吸光度に対するサンプルのFACS分析により得られた血液１
μlあたりのCD3+／CD4+細胞数の標準曲線である。
図２は、希釈標準液の吸光度、すなわち所定量の吸光度を産生するのに必要な
標準の濃度を示す。
図３は、pg／ml単位での標準の濃度に対し血液１μlあたりのCD3+／CD4+細胞
の濃度を検量するため、図１および２のデータを組み合わせた図である。
発明の詳細な説明
本明細書において用いられる「検量標準」の語は、試験されるサンプルと同様
に挙動し、その濃度は細胞の濃度に相関する物質を意味する。この物質は単独も
しくは二重標識された細胞、サンプルと同様に機能するように設計が可能であり
その濃度はサンプル中の細胞と相関させることができる粒子または任意の材料と
することができる。
検量標準は標識されていても標識されていなくてもよいが、検量標準が細胞で
ある場合には単独または二重標識される。検量標準が第一の抗体および第二の抗
体に付着させたのと同じ標識で二重に標識されている場合には、検量標準は修飾
された固相のみと反応させ、他の反応物質は
使用しない。検量標準が標識されていないで、第一の抗体および第二の抗体に結
合できる場合は、それは修飾された固相ならびに第一の抗体および第二の抗体と
反応させる。検量標準が第二の抗体の場合と同じ標識で単独に標識されていて、
第一の抗体に結合できる場合は、それは修飾された固相および第一の抗体のみと
反応させる。検量標準が第一の抗体の場合と同じ標識で単独に標識されていて、
第二の抗体に結合できる場合は、それは修飾された固相および第二の抗体のみと
反応させる。
標準は本技術分野の熟練者には周知の方法であるフローサイトメトリーを用い
て検量することができる。検量の他の方法には免疫細胞化学的方法または細胞計
数器を用いる方法が包含される。
検量標準として使用できる物質の例にはそれらに限定されるものではないが、
ビオチンおよびフルオレセイン標識デキストラン、ビオチンおよびフルオレセイ
ン標識ウシ血清アルブミン、ならびにビオチン化フルオレセインがある。ビオチ
ンおよびフルオレセイン標識デキストランならびにビオチン化フルオレセインは
市販品を入手できる。ビオチンおよびフルオレセイン標識ウシ血清アルブミンは
以下の実施例に例示する標準技術を用いて作成できる。
本発明の細胞計数イムノアッセイは、フローサイトメトリーの正確で効率的な
代替法を提供する。本発明は、高価な装置を必要とせず、サンプルたとえば血液
または他の細胞含有標本中の総細胞集団の部分集団または部分集団の部分集合に
おける細胞数の定量を可能にする。
本発明の細胞計数イムノアッセイは、第一の標識された抗体、第二の検出可能
に標識された抗体、修飾された固相およびサンプルを一緒に反応させる同時固相
イムノアッセイまたは不均一系サンドイッチイムノアッセイである。固相または
支持体は標識された第一の抗体または捕獲試
薬と結合するように修飾される。すなわち第一の抗体上の標識は検出のためでは
なく固相への固定化のために使用される。通常、固相および第一の抗体は免疫系
もしくは非免疫系の特異的結合ペアのメンバーにより直接的または間接的に修飾
される。たとえば、固相がストレプトアビジンで修飾された場合には、第一の抗
体はビオチンで標識されることになる。固相の修飾は本技術分野の熟練者には周
知の方法を用いて行われる。同様に第一の抗体の標識にも本技術分野の熟練者に
は周知の方法が使用される。
免疫特異的結合ペアの例には、抗原／抗体系またはハプテン／抗‐プテン系が
ある。フルオレセイン／抗‐フルオレセイン、ビオチン／抗‐ビオチン、ジニト
ロフェノール／抗‐ジニトロフェノール等を挙げることができる。結合ペアの抗
体メンバーは、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体またはそれらの免疫反
応性フラグメントであれ、本技術分野の熟練者には周知の慣用方法によって産生
させることができる。免疫反応性抗体フラグメントまたは免疫反応性フラグメン
トの語は、抗体の結合領域を含有するフラグメントを意味する。このようなフラ
グメントは、Fc部分を欠くフラグメントとして定義されるFab型フラグメントた
とえば、無傷の抗体の重鎖成分を連結するジスルフィド結合を還元的に切断して
得られるFab、Fab′およびF(ab′)2とすることができる。特異的結合ペアの抗原
メンバーが免疫原性でなく、たとえばハプテンである場合は、それを免疫原性に
するため担体タンパク質に共有結合させることができる。
非免疫系結合ペアには２つの成分が互いに自然の親和性を共有するが抗体では
ない系が包含される。非免疫系結合ペアの例には、ビオチン‐アビジンもしくは
ビオチン‐ストレプトアビジン、葉酸‐葉酸結合タン
パク質、相補性プローブ核酸等がある。
適当な支持体には、合成ポリマー支持体、たとえば、ポリスチレン、ポリプロ
ピレン、置換ポリスチレンたとえばアミノ化もしくはカルボキシル化ポリスチレ
ン、ポリアクリルアミド；ポリアミド；ポリ塩化ビニル等；ガラスビーズ；アガ
ロース；ニトロセルロース；ナイロン；ポリビニリデンジフルオリド；表面修飾
ナイロン等の支持体が包含される。好ましい支持体は、ポリスチレンマイクロプ
レートである。
第二の抗体もしくは検出抗体は、第一の抗体上の標識とは異なる標識によって
検出可能なように標識される。それは、上述の免疫系もしくは非免疫系の特異的
結合ペアのメンバーにより慣用技術を用いて直接的または間接的に標識すること
ができる。シグナル検出を容易にするためには、抗体または特異的結合ペアのメ
ンバーをレポーティング系の成分で標識する。たとえば、第二の抗体はフルオレ
セインに接合することができた。フルオレセインは酵素標識抗‐フルオレセイン
抗体を用いることにより直接的または間接的に標識することができる。
「レポーティング系」の語は、選択されたレポーターおよびレポーターを抗体
または特異的結合ペアの成分に連結する任意の手段を意味する。すなわちレポー
ターは、抗体または特異的結合ペアのメンバーに直接的または間接的に共有結合
または非共有結合により連結することができる。レポーターは放射性同位元素、
酵素、蛍光原、磁性、化学発光または電気化学材料とすることができる。一般的
に使用される放射性同位元素には125Iおよび3Hの２種がある。標準的な放射性同
位元素標識操作には、125IについてはクロラミンＴ、ラクトペルオキシダーゼお
よびBolton-Hunter法が、3Hについては還元メチル化法がある。
酵素は好ましいレポーターである。これらには西洋ワサビペルオキシ
ダーゼ、アルカリホスファターゼ、β‐ガラクトシダーゼ、グルコースオキシダ
ーゼ、ルシフェラーゼ、β‐ラクタマーゼ、ウレアーゼおよびリゾチームが包含
される。酵素による標識は、ジアルデヒド、カルボジイミドカップリング剤、ホ
モ二官能性架橋剤等を用いると容易になる。選択される標識方法は酵素および標
識される材料上の利用される官能基ならびに接合条件に対する両者の耐容性に依
存する。標識は、Engvall & Pearlmann，Immunochemistry 8，871（1971），Avr
ameas & Ternynck，Immunochemistry 8，1175(1971)，Ishikawaら，J．Immunoas
say 4(3): 209-327（1983）およびJablonski，Anal．Biochem．148: 199（1985
）に記載の方法を含む任意の慣用方法を用いて達成できる。標識は、たとえばス
ペーサーまたは特異的結合ペアの他のメンバーを使用する間接的方法により達成
することができる。酵素活性の検出は、一般的に知られた方法により、発色、蛍
光、磁性、化学発光または電気化学変化を測定することにより簡易化できる。
第一および第二の抗体は同一のまたは異なる特異性を有し、部分集団中の細胞
上の異なる部位に結合することができる。
第一および第二の抗体は上述のように、ポリクローナル抗体、モノクローナル
抗体またはそれらの免疫反応性抗体フラグメントであってよい。このような抗体
および／または免疫反応性抗体フラグメントは本技術分野の熟練者には周知の標
準方法を用いて作成することができる。
サンプルを修飾された固相、第一の標識された抗体および第二の検出可能に標
識された抗体と反応させたのち、サンプルは、さらに以下の実施例に記載のよう
に、存在する可能性がある内因性ペルオキシダーゼの不活性化、細胞の固定およ
びサンプルがHIV感染患者から得られた場合には存在する可能性があるヒト免疫
不全ウイルスの不活性化に働く不活
性化剤による処置に付すことができる。
細胞中または細胞上の任意のマーカーが、本発明の細胞計数イムノアッセイを
用い定量的に測定できる。この細胞計数イムノアッセイを用いて定量的に測定で
きる細胞の例には、CD4+Ｔ細胞、CD8+Ｔ細胞、Ｂ細胞、活性化Ｂ細胞、活性化Ｔ
細胞、CMV感染顆粒球、EBV感染B細胞、HIV感染単球等がある。
好ましい実施態様においては、本発明は、サンプル中の総Ｔ細胞集団の部分集
合におけるＴ細胞数を定量するためのＴ細胞計数イムノアッセイにおいて、
(ａ) サンプルを、修飾された固相、この修飾固相上に固定化するために使用
される標識で標識された抗‐汎Ｔ細胞抗体、および検出に使用される標識であり
抗‐汎Ｔ細胞抗体上の標識とは異なる標識で検出可能に標識された抗‐部分集合
特異的抗体と同時に接触させ、この場合さらに、抗‐汎Ｔ細胞抗体と抗‐部分集
合特異的抗体は同一のまたは異なる特異性を有し、部分集団中の細胞上の異なる
部位に結合することが可能であり、
(ｂ) 標識されているかまたは標識されていない検量標準を別個に、修飾され
た固相、ならびに(ｉ)検量標準が工程(ａ)の抗‐汎Ｔ細胞抗体および抗‐部分集
合特異的抗体に付着させたのと同じ標識で二重に標識されている場合は他の反応
物質は使用しないで、(ii)検量標準が標識されていないで、上記両抗体に結合で
きる場合には抗‐汎Ｔ細胞抗体および抗‐部分集合特異的抗体と、(iii)検量標
準が抗‐部分集合特異的抗体の場合と同じ標識で単独に標識されていて抗‐汎Ｔ
細胞抗体と結合できる場合には第一の抗体のみと、または(iv)検量標準が抗‐汎
Ｔ細胞抗体の場合と同じ標識で単独に標識されていて抗‐部位分集合特異的抗体
と
結合できる場合にはさらに抗‐部分集合特異的抗体のみと接触させ、ただし検量
標準が細胞である場合には、細胞は抗体に付着させたのと同じ１種または２種の
標識で単独にまたは二重に標識されていて、
(ｃ) 工程(ａ)により発生するシグナルおよび工程(ｂ)により発生するシグナ
ルを別個に測定し、ついで
(ｄ) 工程(ａ)の測定からの結果と工程(ｂ)から得られた結果を比較すること
によりサンプル中の総Ｔ細胞集団の部分集合中のＴ細胞数を定量する
ことからなるイムノアッセイに関する。
抗‐汎Ｔ細胞抗体は、たとえば、抗‐CD2抗体または抗‐CD3抗体であってよい
。好ましい抗‐汎Ｔ細胞抗体は抗‐CD3抗体である。CD3抗原はＴ細胞受容体(TcR
)と呼ばれる。それは複雑な多重鎖構造を有し、免疫応答に際してＴ細胞の活性
化に関与する。それは実際、末梢循環中のすべての成熟Ｔ細胞上ならびに胸腺に
存在する前駆細胞（胸腺細胞）に見出される。
抗‐部分集合特異的抗体は、抗‐CD4抗体、抗‐CD8抗体、抗‐CD25抗体等とす
ることができる。好ましい抗‐部分集合特異的抗体は抗‐CD4抗体である。
CD4抗原は、末梢Ｔ細胞（CD8陰性のＴ細胞）の約２／３に見出され、単球およ
び大部分の胸腺細胞上にも認められる。機能的には、CD4はＴ細胞による外来抗
原の認識に関与する補助分子である。CD4を発現するＴ細胞の集合は、「ヘルパ
ー」Ｔ細胞を提供するものと考えられる。CD4は、HIVが感染時に細胞に結合する
ために必要な細胞受容体であることが明らかにされている。疾患が進行すると、
血液中のCD4+Ｔリンパ球の分画が減少する。疾患制御センター(The Center for
Disease Control)
は血液１μlあたり200 CD4+Ｔ細胞未満のレベルをAIDSの症例定義に用いること
を推奨している。AIDS患者は１年に２〜３回CD4+Ｔ細胞レベルを測定することが
薦められている。血液１μlあたり500 CD4+細胞未満のレベルが多くの場合、抗
ウイルス療法開始の目安として用いられている。CD4+Ｔ細胞の数はまた一般に、
患者の臨床試験への組み込みの基準としても用いられている。CD4+Ｔリンパ球の
絶対数は、ヒト免疫不全ウイルス（HIV）感染における予後の判定、疾患状態の
分類、処置の決定、および治療のモニタリングに重要である。
以下の実施例は本発明を例示する意図であり、本発明に対する限定と理解すべ
きではない。
実施例１
Ａの部．抗体試薬の合成
１．抗‐CD3‐ビオチン抗体
抗‐CD3モノクローナル抗体溶液（BioDesign）を0.1Ｍ NaHCO3に対して透析し
、ついで0.1Ｍ NaHCO3中１mg／mlに調整した。ビオチンアミドカプロン酸Ｎ‐ヒ
ドロキシスクシンイミドエステル(Molecular Probes)をジメチルスルホキシド中
0.75mg／mlに溶解した。４mlの抗体溶液に400μlのビオチン溶液を加え、２時間
室温で混合し、ついで400μlの２Ｍトリス塩酸塩、pH 8.0を加えて15分間混合し
た。この溶液をリン酸緩衝食塩溶液（PBS）に対して４℃で透析し、ついで0.1％
クロロアセトアミド含有PBS中２％ウシ血清アルブミン４mlを添加した。
２．抗‐CD4‐フルオレセイン抗体
抗‐CD4モノクローナル抗体溶液(Ancell)を0.1Ｍ NaHCO3中１mg／mlに調整し
、ついで0.1Ｍ NaHCO3に対して透析した。６‐（フルオレセイン‐５‐（および
‐６）カルボキシアミド）ヘキサン酸スクシンイミド
エステル(MolecularProbes)をジメチルスルホキシド中に１mg／mlに溶解した。
抗体溶液１mlにフルオレセイン溶液100μlを加え、２時間室温で混合し、ついで
100μlの２Ｍトリス塩酸塩、pH 8.0を添加して30分間混合した。この溶液をリン
酸緩衝食塩溶液(PBS)に対し４℃で透析し、ついで0.1％クロロアセトアミド含有
PBS中２％ウシ血清アルブミン１mlを添加した。
Ｂの部．
10例の正常人および10例のAIDS患者からEDTA血液を３つの試験管に収集した。
１つの試験管は、蛍光自動細胞分離分析装置（FACS）により確立された操作に従
い(Morbidity and Mortality Weekly Report，ヒト免疫不全ウイルス（HIV）感
染患者におけるCD4+Ｔ細胞測定の実施に関する1994年改訂ガイドライン，U.S．D
epartment of Health and Human Services，Public Health Services，Centers
for Disease Control，43巻，R号，1994年3月4日）CD3+／CD4+リンパ球含量を分
析した。簡略に述べれば、CD3抗原およびCD4抗原が細胞の表面に存在すれば、細
胞をそれぞれそれらと反応する２種の蛍光標識モノクローナル抗体と反応させる
。定義により、Ｔ細胞はそれらの表面にCD3抗原を有する。ヘルパーＴ細胞（HIV
によって感染されうる総Ｔ細胞の部分集合）はCD4およびCD3の両者を有する。FA
CSの結果は蛍光抗‐CD3モノクローナル抗体および蛍光抗‐CD4モノクローナル抗
体の両者で標識された総リンパ球の％として記録される。
EDTA血液の第二の試験管は血液学的分析(総白血球数および白血球分類)に使用
した。総白血球数は自動細胞計数器（Coulter）を用いて測定し、総白血球／１
μl血液として記録する。染色スライドの顕微鏡検査から、手動白血球分類によ
り形態学的にリンパ球である白血球の％を記
録する。これらの２つの分析を組み合わせると、リンパ球数／１μl血液が得ら
れる。この結果を、それらの表面にCD3およびCD4を発現するリンパ球の％（FACS
の結果）と組み合わせるとCD3+／CD4+リンパ球数／１μl血液の計算が可能にな
る。
第三の試験管については、以下に述べるように、本発明の細胞計数イムノアッ
セイを用いて試験する。
0.1mlの血液を１mlの溶解試薬(1.68Ｍ塩化アンモニウム，0.1Ｍ炭酸水素カリ
ウム，１mM EDTA，pH 7.4)に加えた。５分後、白血球細胞を微小遠心分離器(Sor
vall)の最大速度で10分間遠心分離して、溶解した赤血球細胞から分離した。白
血球細胞ペレットを0.5mlの抗体試薬［UCHT1抗‐CD3モノクローナル抗体（BioDe
sign）をビオチンで標識し、QS4120抗‐CD4モノクローナル抗体（Ancell）をフ
ルオレセインで標識した。これらを４％BSAおよび0.09％クロロアセトアミド含
有PBS中それぞれ５μg／mlおよび20μg／mlで使用した］中に再懸濁して最初の
白血球の１：５希釈液を調製した。１：５希釈液0.1mlを0.4mlの抗体試薬に添加
して最初の白血球の１：25希釈液も調製した。各希釈液(１：５および１：25)に
ついて、0.1mlのサンプルをストレプトアビジン被覆マイクロプレート（DuPont
）のウエルに二重に添加した。ビオチン化およびフルオレセイン化デキストラン
(検量標準)(Molecular Probes)もウエルに二重に添加した。
２時間室温に放置したのち、0.05mlの不活性化試薬（75％エタノール中0.1％
ナトリウムアジド，0.002％錫酸ナトリウム，0.01％過酸化水素）を各ウエルに
加えた。30分の室温でのインキュベーション時に、不活性化試薬は内因性細胞ペ
ルオキシダーゼを不活性化し、サンプルからのHIV粒子があればそれを不活性化
し、細胞を固定した。マイクロプレ
ートをついでプレート洗浄液（DuPont）で６回洗浄して未反応抗体を除去した。
各ウエルに0.1mlの検出試薬［50％正常ウサギ血清，１％カゼインならびに0.0
9％クロロアセトアミド含有PBS中、HRP（Boehringer-Mannheim)で標識した１：2
00親和性精製ヒツジ抗フルオレセインポリクローナル抗体］を添加した。30分の
室温でのインキュベーション時に、抗‐フルオレセイン‐HRPは、ビオチン化抗
‐CD3モノクローナル抗体を介してストレプトアビジン被覆マイクロプレートに
結合している細胞の表面上のフルオレセイン化抗‐CD4モノクローナル抗体に結
合した。マイクロプレートをついでプレート洗浄緩衝液で６回洗浄して未反応検
出試薬を除去した。
TMB(テトラメチルベンジジン)基質(Proteins International) 0.1mlを各ウエ
ルに添加した。１時間の室温でのインキュベーション時に、ウエル内にHRPが存
在すればTMBから発色シグナルを生じた。TMB停止液（ProteinsInternational）0
.1mlを加えて酵素反応を停止させた。各ウエルにおける吸光度を650nmの基準フ
ィルター付きMolecular Devicesのプレートリーダーを用い450nmで測定した。
Ｃの部．標準の検量
FACSの結果をサンプルの血液学的結果と組み合わせて各サンプルについての値
を血液１μlあたりのCD3+／CD4+細胞の単位で発生させた。
与えられたサンプルによりアッセイにおいて得られる吸光度は、アッセイの揺
動により変動することがある。これは各アッセイ毎に同濃度の標準の試験を平行
して行い、検量曲線（または標準曲線）を発生させることによって制御できる。
標準曲線の変化は、サンプルの結果をそのアッセイにおいて観察され
た吸光度を生じるのに必要な標準の濃度に換算して計算することにより、サンプ
ルの吸光度をアッセイの変動に対して補正するために使用する。それにより各サ
ンプルの結果はデキストラン標準のpg／ml数で得られる結果と等しくなる。
この実験を１回行いまた多くのサンプルをFACSによって試験しておけば、血液
１μlあたりのCD3+／CD4+細胞数に相当するデキストラン標準のpg／ml量の決定
が可能になる。これはアッセイの変動によって変化することはない。
各サンプルに相当するデキストラン標準のpg／ml量がわかるので、各サンプル
に相当する血液１μlあたりのCD3+／CD4+細胞数を計算できる。
実施例２
ビオチンおよびフルオレセイン標識ウシ血清アルブミンの合成
10mgのウシ血清アルブミン(Sigma)を10mlの0.1Ｍ NaHCO3に溶解した。それぞ
れ0.5mgのビオチンアミドカプロン酸Ｎ‐ヒドロキシスクシンイミドエステル（M
olecular Probes）および６‐（フルオレセイン‐５‐（および‐６）カルボキ
シアミド）ヘキサン酸スクシンイミドエステル（Molecular Probes）をジメチル
スルホキシド１ml中に溶解した。２つの溶液を室温で２時間混合し、ついでリン
酸緩衝食塩溶液に対して透析した。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ
Ｇ０１Ｎ 33/543 ５９７ Ｇ０１Ｎ 33/543 ５９７
(72)発明者 ボブロウ，マーク・ノーマン
アメリカ合衆国マサチユーセツツ州02173
−6701．レキシントン．バトルグリーンロ
ード11
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １．サンプル中の総細胞集団の部分集団または部分集団の部分集合中の細胞数を 定量するためのイムノアッセイにおいて、 (ａ) サンプルを、修飾された固相、部分集団に特異的な第一の標識された 抗体および部分集団または部分集団の部分集合に特異的な第二の検出可能なよう に標識された抗体と同時に接触させ、この場合、第一の抗体上の標識は修飾され た固相上に固定化するために使用され、第二の抗体上の標識は検出に使用され、 第一の抗体上の標識は第二の抗体上の標識とは異なり、さらに第一の抗体と第二 の抗体は同一のまたは異なる特異性を有し、部分集団中の細胞上の異なる部位に 結合することが可能であり、 (ｂ) 標識されているかまたは標識されていない検量標準を別個に、修飾さ れた固相、ならびに(ｉ)検量標準が工程(ａ)の第一の抗体および第二の抗体に付 着させたのと同じ標識で二重に標識されている場合は他の反応物質は用いないで 、(ii)検量標準が標識されていないで、第一の抗体および第二の抗体と結合でき る場合には第一の抗体および第二の抗体と、(iii)検量標準が第二の抗体の場合 と同じ標識で単独に標識されていて第一の抗体と結合できる場合にはさらに第一 の抗体のみと、または(iv)検量標準が第一の抗体の場合と同じ標識で単独に標識 されていて第二の抗体と結合できる場合にはさらに第二の抗体のみと接触させ、 ただし、検量標準が細胞である場合には、細胞は第一の抗体および第二の抗体に 付着させたのと同じ１種または２種の標識で単独にまたは二重に標識されていて 、 (ｃ) 工程(ａ)により発生するシグナルおよび工程(ｂ)により発生するシグ ナルを別個に測定し、ついで (ｄ) 工程(ａ)の測定からの結果と工程(ｂ)から得られた結果を比較するこ とによりサンプル中の部分集団または部分集団の部分集合における細胞数を定量 する ことからなるイムノアッセイ。 ２．定量される細胞はCD4+Ｔ細胞、CD8+Ｔ細胞、Ｂ細胞、活性化Ｂ細胞、活性化 Ｔ細胞、ならびにCMV感染顆粒球、EBV感染Ｂ細胞およびHIV感染単球からなる群 より選択される請求項１記載のイムノアッセイ。 ３．サンプル中の総Ｔ細胞集団の部分集合におけるＴ細胞数を定量するＴ細胞計 数イムノアッセイにおいて、 (ａ) サンプルを、修飾された固相、この修飾固相上に固定化するために使 用される標識で標識された抗‐汎Ｔ細胞抗体、および検出に使用される標識であ り抗‐汎Ｔ細胞抗体上の標識とは異なる標識で検出可能に標識された抗‐部分集 合特異的抗体と同時に接触させ、この場合さらに、抗‐汎Ｔ細胞抗体と抗‐部分 集合特異的抗体は同一のまたは異なる特異性を有し、部分集団中の細胞上の異な る部位に結合することが可能であり、 (ｂ) 標識されているかまたは標識されていない検量標準を別個に、修飾さ れた固相、ならびに(ｉ)検量標準が工程(ａ)の抗‐汎Ｔ細胞抗体および抗‐部分 集合特異的抗体に付着させたのと同じ標識で二重に標識されている場合は他の反 応物質は使用しないで、(ii)検量標準が標識されていないで、上記両抗体に結合 できる場合には抗‐汎Ｔ細胞抗体および抗‐部分集合特異的抗体と、(iii)検量 標準が抗‐部分集合特異的抗体の場合と同じ標識で単独に標識されていて抗‐汎 Ｔ細胞抗体と結合できる場合には第一の抗体のみと、または(iv)検量標準が抗‐ 汎Ｔ細胞抗体の場合と同じ標識で単独に標識されていて抗‐部位分 集合特異的抗体と結合できる場合にはさらに抗‐部分集合特異的抗体のみと接触 させ、ただし検量標準が細胞である場合には、細胞は抗体に付着させたのと同じ １種または２種の標識で単独にまたは二重に標識されていて、 (ｃ) 工程(ａ)により発生するシグナルおよび工程(ｂ)により発生するシグ ナルを別個に測定し、ついで (ｄ) 工程(ａ)の測定からの結果と工程(ｂ)から得られた結果を比較するこ とによりサンプル中の総Ｔ細胞集団の部分集合中のＴ細胞数を定量する ことからなるイムノアッセイ。 ４．部分集団中の定量される細胞はCD4+Ｔ細胞であり、標識された抗‐汎Ｔ細胞 抗体はビオチン化抗‐CD3モノクローナル抗体であり、検出可能に標識された抗 ‐部分集合特異的抗体はフルオレセイン標識抗‐CD4モノクローナル抗体であり 、検量標準はビオチンおよびフルオレセイン標識デキストランである請求項３記 載のイムノアッセイ。 ５．固相は非免疫結合ペアの第一のメンバーで修飾されている請求項１または３ 記載のイムノアッセイ。 ６．固相は免疫結合ペアの第一のメンバーで修飾されている請求項１または３記 載のイムノアッセイ。 ７．第一の抗体は、非免疫結合ペアの第二のメンバーで修飾されている請求項５ 記載のイムノアッセイ。 ８．第一の抗体は、免疫結合ペアの第二のメンバーで修飾されている請求項６記 載のイムノアッセイ。 ９．第二の抗体は非免疫結合ペアのメンバーで検出可能に修飾されている請求項 １または３記載のイムノアッセイ。 10．第二の抗体は免疫結合ペアのメンバーで検出可能に修飾されている請求項１ または３記載のイムノアッセイ。 11．抗体の少なくとも１種はモノクローナル抗体である請求項１または３記載の イムノアッセイ。 12．検量標準はビオチンおよびフルオレセインで標識されたデキストラン、ビオ チンおよびフルオレセインで標識されたウシ血清アルブミン、ならびにビオチン 化フルオレセインからなる群より選択される請求項１または３記載のイムノアッ セイ。 13．工程(ａ)の生成物を不活性化試薬と反応させ、内因性ペルオキシダーゼを不 活性化し、サンプル中の細胞を固定し、サンプル中に存在する可能性があるヒト 免疫不全ウイルスを不活性化する請求項１または３記載のイムノアッセイ。
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