JPH07104349B2 - 細胞測定法 - Google Patents
細胞測定法Info
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- JPH07104349B2 JPH07104349B2 JP62089153A JP8915387A JPH07104349B2 JP H07104349 B2 JPH07104349 B2 JP H07104349B2 JP 62089153 A JP62089153 A JP 62089153A JP 8915387 A JP8915387 A JP 8915387A JP H07104349 B2 JPH07104349 B2 JP H07104349B2
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- cell
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- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
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- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/531—Production of immunochemical test materials
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- G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
- G01N33/54313—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being characterised by its particulate form
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- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
- G01N33/56966—Animal cells
Description
【発明の詳細な説明】 〔産業上を利用分野〕 本発明は細胞測定法に係り、特に血液塗沫標本を用いて
リンパ球であるT細胞及びB細胞を識別するのに好適な
細胞測定法に関する。
リンパ球であるT細胞及びB細胞を識別するのに好適な
細胞測定法に関する。
従来の免疫分析方法としてラジオイムノアッセイ法やエ
ンザイムイムノアッセイ法などのいろいろな標識物質を
用いて種々の分析法が考えられている。これらの分析法
の多くは、血液中の各種成分の分析に応用されており、
いわゆる体液性免疫に関係していた。これに対して、リ
ンパ球や赤血球などの血液細胞や組織細胞などを免疫学
的に調べるいわゆる細胞免疫に関しては、高感度免疫分
析技術の応用が始まったところであるといえる。
ンザイムイムノアッセイ法などのいろいろな標識物質を
用いて種々の分析法が考えられている。これらの分析法
の多くは、血液中の各種成分の分析に応用されており、
いわゆる体液性免疫に関係していた。これに対して、リ
ンパ球や赤血球などの血液細胞や組織細胞などを免疫学
的に調べるいわゆる細胞免疫に関しては、高感度免疫分
析技術の応用が始まったところであるといえる。
例えば、リンパ球にはT細胞(Tリンパ球)とB細胞
(Bリンパ球)とがある。両者はともに共通の骨髄幹細
胞から発生したものであるが、互いに協調して機能し、
マクロファージ,単球,多核白血球らと協働して免疫反
応を起こす。各種免疫疾患において、細胞性免疫に重要
な役割を演ずるT細胞,液性抗体の産生をつかさどるB
細胞の量的異常を測定することは、診断あるいは疾患の
病態を把握する上で役立つといわれている。
(Bリンパ球)とがある。両者はともに共通の骨髄幹細
胞から発生したものであるが、互いに協調して機能し、
マクロファージ,単球,多核白血球らと協働して免疫反
応を起こす。各種免疫疾患において、細胞性免疫に重要
な役割を演ずるT細胞,液性抗体の産生をつかさどるB
細胞の量的異常を測定することは、診断あるいは疾患の
病態を把握する上で役立つといわれている。
これらのT細胞,B細胞の測定は、現在次のようにされて
いる。すなわち、T細胞はヒツジ赤血球(SRBC)と試験
管内でロゼットを形成する性質あるいは特異的にT細胞
と反応する抗体(抗T細胞抗体)を用いて膜蛍光抗体法
で染色する。B細胞は、マウス赤血球(MRBC)と試験管
内でロゼットを形成する性質あるいは膜表面に免疫グロ
ブリンを保有しているので、蛍光標識抗ヒト免疫グロブ
リン血清を用いて膜蛍光抗体法で陽性細胞を観察する
(日本臨床 40巻 第985頁 秋季臨時増刊号 1982
年)。
いる。すなわち、T細胞はヒツジ赤血球(SRBC)と試験
管内でロゼットを形成する性質あるいは特異的にT細胞
と反応する抗体(抗T細胞抗体)を用いて膜蛍光抗体法
で染色する。B細胞は、マウス赤血球(MRBC)と試験管
内でロゼットを形成する性質あるいは膜表面に免疫グロ
ブリンを保有しているので、蛍光標識抗ヒト免疫グロブ
リン血清を用いて膜蛍光抗体法で陽性細胞を観察する
(日本臨床 40巻 第985頁 秋季臨時増刊号 1982
年)。
しかしながら、前述のロゼット形成反応は、その手法が
比重遠心法の採用など面倒である上にロゼット形成反応
に長時間を要し、しかも、血球計算板を使用する検鏡が
必要である。このようにロゼット形成反応を利用したT
細胞,B細胞の測定には多大の手間が必要であった。一
方、膜蛍光抗体法は、特異抗体の利用により正確度が高
い便利な方法であるといえる。しかし、抗体1分子に結
合させることのできる標識化合物(蛍光物質)数には限
りがあるため、検出感度の点で問題があった。
比重遠心法の採用など面倒である上にロゼット形成反応
に長時間を要し、しかも、血球計算板を使用する検鏡が
必要である。このようにロゼット形成反応を利用したT
細胞,B細胞の測定には多大の手間が必要であった。一
方、膜蛍光抗体法は、特異抗体の利用により正確度が高
い便利な方法であるといえる。しかし、抗体1分子に結
合させることのできる標識化合物(蛍光物質)数には限
りがあるため、検出感度の点で問題があった。
さらに、細胞あるいは細胞抗原の識別に酵素抗体法が利
用されている。これは、抗原と酵素標識抗体を反応させ
た後に酵素反応を起こして発色させる方法である。しか
し、発色反応の結果生じる色素は、細胞表面に沈着した
状態にあることが多く、後染色により除去されやすいと
いう問題があった。また、発色まで多段階の反応を要
し、結果を得るまでに長時間を必要とした。
用されている。これは、抗原と酵素標識抗体を反応させ
た後に酵素反応を起こして発色させる方法である。しか
し、発色反応の結果生じる色素は、細胞表面に沈着した
状態にあることが多く、後染色により除去されやすいと
いう問題があった。また、発色まで多段階の反応を要
し、結果を得るまでに長時間を必要とした。
その他、近年では金コロイド抗体法やパターン認識技術
(細胞を分類するにあたり、種々の細胞について特異的
な染色性,形状などをもとにしてパターン認識する技
術)を駆使して分類する方法も試みられているが、細胞
分類の識別精度は未だ不十分である。
(細胞を分類するにあたり、種々の細胞について特異的
な染色性,形状などをもとにしてパターン認識する技
術)を駆使して分類する方法も試みられているが、細胞
分類の識別精度は未だ不十分である。
本発明は、上記事情を考慮してなされ、その目的は細胞
のうち特にT細胞,B細胞を簡便な手法により、しかも同
時に識別,計測できて測定に要する処理工程の迅速化を
図り得る細胞測定法を提供することにある。
のうち特にT細胞,B細胞を簡便な手法により、しかも同
時に識別,計測できて測定に要する処理工程の迅速化を
図り得る細胞測定法を提供することにある。
本発明は、採取した血液からリンパ球であるT細胞とB
細胞の数を測定する方法において、 (a)光学顕微鏡用のスライド上に被検細胞を含む検体
を薄層に塗沫して乾燥固定することにより固定標本を作
成する工程と、 (b)前記T細胞と特異的に反応する抗T細胞抗体,前
記B細胞と特異的に反応する抗B細胞抗体をそれぞれ色
識別可能な着色微細ラテックス粒子に結合させて、抗T
細胞抗体結合の着色微細ラテックス粒子溶液と抗B細胞
抗体結合の着色微細ラテックス粒子溶液を前記固定標本
に滴下して該固定標本と反応させる工程と、 (c)前記反応後の固定標本をアルブミン含有のリン酸
緩衝液で洗浄して余分の反応液を除去した後、該固定標
本を着色微細ラテックス粒子を色分別光学系に供して、
前記着色微細ラテックス粒子の付着した細胞を色別に選
別してT細胞,B細胞を計測する工程と、 を含むことを特徴とする。
細胞の数を測定する方法において、 (a)光学顕微鏡用のスライド上に被検細胞を含む検体
を薄層に塗沫して乾燥固定することにより固定標本を作
成する工程と、 (b)前記T細胞と特異的に反応する抗T細胞抗体,前
記B細胞と特異的に反応する抗B細胞抗体をそれぞれ色
識別可能な着色微細ラテックス粒子に結合させて、抗T
細胞抗体結合の着色微細ラテックス粒子溶液と抗B細胞
抗体結合の着色微細ラテックス粒子溶液を前記固定標本
に滴下して該固定標本と反応させる工程と、 (c)前記反応後の固定標本をアルブミン含有のリン酸
緩衝液で洗浄して余分の反応液を除去した後、該固定標
本を着色微細ラテックス粒子を色分別光学系に供して、
前記着色微細ラテックス粒子の付着した細胞を色別に選
別してT細胞,B細胞を計測する工程と、 を含むことを特徴とする。
ここで、着色微細ラテックス粒子の大きさは、10-10mか
ら10-6m、特に好ましくは10-7mから10-9m程度にすると
細胞の識別に好適である。
ら10-6m、特に好ましくは10-7mから10-9m程度にすると
細胞の識別に好適である。
上記構成によれば、被検細胞たるT細胞,B細胞を含む検
体(患者血液)の固定標本に抗T細胞抗体結合の着色微
細ラテックス粒子溶液と抗B細胞抗体結合の着色微細ラ
テックス粒子溶液を滴下すると(抗T細胞抗体結合の着
色微細ラテックス粒子と抗B細胞抗体結合の着色微細ラ
テックス粒子は色識別性を持たせるために異なる色を呈
している)、T細胞と抗T細胞抗体との反応によりT細
胞に抗T細胞抗体対応の着色微細ラテクス粒子(例えば
青色微細ラテックス粒子)が付着し、B細胞と抗B細胞
抗体との反応によりB細胞に抗B細胞抗体対応の着色微
細ラテックス粒子(例えば赤色微細ラテクス粒子)が付
着する。その後に、固体標本に対してアルブミン含有の
リン酸緩衝液による洗浄工程を行なうと、余分の反応液
が除去でき、反応液除去後に該固定標本を色分別光学系
(例えば、分光器,血液像自動分類装置等)に供する
と、前記着色微細ラテクス粒子の付着した細胞を自動的
に且つ色別に選別でき、また、光学系を利用した選別に
よりT細胞,B細胞の数(百分率で求めたものも含む)を
迅速に且つ正確に計測することができる。
体(患者血液)の固定標本に抗T細胞抗体結合の着色微
細ラテックス粒子溶液と抗B細胞抗体結合の着色微細ラ
テックス粒子溶液を滴下すると(抗T細胞抗体結合の着
色微細ラテックス粒子と抗B細胞抗体結合の着色微細ラ
テックス粒子は色識別性を持たせるために異なる色を呈
している)、T細胞と抗T細胞抗体との反応によりT細
胞に抗T細胞抗体対応の着色微細ラテクス粒子(例えば
青色微細ラテックス粒子)が付着し、B細胞と抗B細胞
抗体との反応によりB細胞に抗B細胞抗体対応の着色微
細ラテックス粒子(例えば赤色微細ラテクス粒子)が付
着する。その後に、固体標本に対してアルブミン含有の
リン酸緩衝液による洗浄工程を行なうと、余分の反応液
が除去でき、反応液除去後に該固定標本を色分別光学系
(例えば、分光器,血液像自動分類装置等)に供する
と、前記着色微細ラテクス粒子の付着した細胞を自動的
に且つ色別に選別でき、また、光学系を利用した選別に
よりT細胞,B細胞の数(百分率で求めたものも含む)を
迅速に且つ正確に計測することができる。
ここで、本発明の長所を従来法との比較において説明す
る。
る。
従来より汎用されている抗体の標識法を蛍光色素の代表
であるFITC(fluorescein isothiocyanate)と抗ヒトア
ルブミン抗体を例にとって説明する。一定量の抗体に対
してFITCを加えてゆくと、FITC量を増すことによって単
位蛋白質量あたりの蛍光標識量(F/P比)の高い標識抗
体が得られる。通常、F/P=2前後の蛍光抗体を用いる
ことが多く、F/P=3程度の標識抗体を調整することも
できるが、抗体活性はむしろ低下してしまうことが多
い。このように抗体1分子あたりの有効な標識分子数に
は限度があり、また、細胞抗原1分子に標識抗体が1分
子しか結合することができないため、十分な検出感度が
得られていなかった。
であるFITC(fluorescein isothiocyanate)と抗ヒトア
ルブミン抗体を例にとって説明する。一定量の抗体に対
してFITCを加えてゆくと、FITC量を増すことによって単
位蛋白質量あたりの蛍光標識量(F/P比)の高い標識抗
体が得られる。通常、F/P=2前後の蛍光抗体を用いる
ことが多く、F/P=3程度の標識抗体を調整することも
できるが、抗体活性はむしろ低下してしまうことが多
い。このように抗体1分子あたりの有効な標識分子数に
は限度があり、また、細胞抗原1分子に標識抗体が1分
子しか結合することができないため、十分な検出感度が
得られていなかった。
本発明では、抗体を結合させた微細粒子を光学的(色
別)に識別する方法を採用しており、上記従来法に比較
して高感度に細胞を計測可能である。
別)に識別する方法を採用しており、上記従来法に比較
して高感度に細胞を計測可能である。
次に、従来の酵素抗体法との比較においては、酵素抗体
法で必要とされていた発色反応は不要となるため、測定
操作に必要な手間が大幅に省けて、短時間で簡便な細胞
計測を実現できる。
法で必要とされていた発色反応は不要となるため、測定
操作に必要な手間が大幅に省けて、短時間で簡便な細胞
計測を実現できる。
また、T細胞,B細胞の検出のために、従来、同一検体に
ついて複数枚数の標本が必要とされていたが、本発明の
方法により同一標本を用いて、T細胞,B細胞の同時計測
が可能となる。また、多重染色を不要とし、その分、処
理工程の簡略化を図ると共に、多重染色により最初に染
色された色素が脱色するという問題も生じない。
ついて複数枚数の標本が必要とされていたが、本発明の
方法により同一標本を用いて、T細胞,B細胞の同時計測
が可能となる。また、多重染色を不要とし、その分、処
理工程の簡略化を図ると共に、多重染色により最初に染
色された色素が脱色するという問題も生じない。
さらに、本発明では前記(b)の反応が短時間で済むの
で(例えば、実施例に記載のように着色微細ラテックス
粒子溶液と固定標本とを37℃で30分間程度の反応で済
む)、処理工程の迅速化をさらに助長させる。
で(例えば、実施例に記載のように着色微細ラテックス
粒子溶液と固定標本とを37℃で30分間程度の反応で済
む)、処理工程の迅速化をさらに助長させる。
本発明の実施例について説明する。
(T細胞,B細胞の同時分析) 光学顕微鏡用のスライド上に患者血液(検体)を薄層に
塗沫して乾燥固定することにより固定標本を作成する。
次いで、抗T細胞抗体を結合させた粒子径0.03μmの青
色ラテックス微細粒子の溶液と、抗B細胞抗体を結合さ
せた粒子径0.03μmの赤色ラテックス微細粒子の溶液を
先の固定標本と37℃,30分間反応させる。その後、1%
手血清アルブミン含有の0.1Mリン酸緩衝液(PH7.4)で
充分洗浄して余分の反応液を除去し、その後、光学顕微
鏡を用いて青色及び赤色のラテックス微細粒子が付着し
た細胞を目視計測することによってT細胞,B細胞の百分
率を求める。その結果を第1表に示す。
塗沫して乾燥固定することにより固定標本を作成する。
次いで、抗T細胞抗体を結合させた粒子径0.03μmの青
色ラテックス微細粒子の溶液と、抗B細胞抗体を結合さ
せた粒子径0.03μmの赤色ラテックス微細粒子の溶液を
先の固定標本と37℃,30分間反応させる。その後、1%
手血清アルブミン含有の0.1Mリン酸緩衝液(PH7.4)で
充分洗浄して余分の反応液を除去し、その後、光学顕微
鏡を用いて青色及び赤色のラテックス微細粒子が付着し
た細胞を目視計測することによってT細胞,B細胞の百分
率を求める。その結果を第1表に示す。
また、上記と同様の方法によって調整及び反応させた標
本を血液像自動分類装置に供し、赤色及び青色粒子の付
着した細胞を選別することにより、T細胞,B細胞の百分
率を求めたところ従来法と一致する良好な結果を迅速に
得ることができた。
本を血液像自動分類装置に供し、赤色及び青色粒子の付
着した細胞を選別することにより、T細胞,B細胞の百分
率を求めたところ従来法と一致する良好な結果を迅速に
得ることができた。
以上説明したように、本発明によれば、T細胞,B細胞を
簡便な手法により、しかも同時に識別,計測できて測定
に要する処理工程の迅速化を図り得る。
簡便な手法により、しかも同時に識別,計測できて測定
に要する処理工程の迅速化を図り得る。
Claims (1)
- 【請求項1】採取した血液からリンパ球であるT細胞と
B細胞の数を測定する方法において、 (a)光学顕微鏡用のスライド上に被検細胞を含む検体
を薄層に塗沫して乾燥固定することにより固定標本を作
成する工程と、 (b)前記T細胞と特異的に反応する抗T細胞抗体,前
記B細胞と特異的に反応する抗B細胞抗体をそれぞれ色
識別可能な着色微細ラテックス粒子に結合させて、抗T
細胞抗体結合の着色微細ラテックス粒子溶液と抗B細胞
抗体結合の着色微細ラテックス粒子溶液を前記固定標本
に滴下して該固定標本と反応させる工程と、 (c)前記反応後の固定標本をアルブミン含有のリン酸
緩衝液で洗浄して余分の反応液を除去した後、該固定標
本を色分別光学系に供して、前記着色微細ラテックス粒
子の付着した細胞を色別に選別してT細胞,B細胞を計測
する工程と、 を含むことを特徴とする細胞測定法。
Priority Applications (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP62089153A JPH07104349B2 (ja) | 1987-04-11 | 1987-04-11 | 細胞測定法 |
DE19883811566 DE3811566A1 (de) | 1987-04-11 | 1988-04-06 | Verfahren zur zellmessung |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP62089153A JPH07104349B2 (ja) | 1987-04-11 | 1987-04-11 | 細胞測定法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPS63255660A JPS63255660A (ja) | 1988-10-21 |
JPH07104349B2 true JPH07104349B2 (ja) | 1995-11-13 |
Family
ID=13962904
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP62089153A Expired - Lifetime JPH07104349B2 (ja) | 1987-04-11 | 1987-04-11 | 細胞測定法 |
Country Status (2)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPH07104349B2 (ja) |
DE (1) | DE3811566A1 (ja) |
Families Citing this family (18)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
FR2638849B1 (fr) * | 1988-11-04 | 1994-03-18 | Chemunex Sa | Procede d'amplification d'un signal fluorescent pour la recherche specifique de la presence eventuelle de particules et application a la detection et a la numeration desdites particules |
FR2638848B1 (fr) * | 1988-11-04 | 1993-01-22 | Chemunex Sa | Procede de detection et/ou de dosage dans un milieu liquide ou semi-liquide d'au moins une substance organique, biologique ou medicamenteuse soluble, par une methode d'agglutination |
GR1000686B (el) * | 1989-11-16 | 1992-10-08 | Ortho Diagnostic Systems Inc | Μεθοδος παραγωγης ενος αντιδραστηριου κολλοειδους μεταλλου που περιεχει κολλοειδη τεμαχιδια μεταλλου με προκαθορισμενο μεγεθος. εθος. |
JPH03225277A (ja) * | 1990-01-31 | 1991-10-04 | Fujirebio Inc | 多項目の免疫化学的測定法 |
JP2690802B2 (ja) * | 1990-04-24 | 1997-12-17 | オリンパス光学工業株式会社 | 免疫学的検査法 |
WO1992009878A1 (en) * | 1990-11-23 | 1992-06-11 | Coulter Corporation | Method and apparatus for optically screening microscopic cells |
WO1994007138A1 (en) | 1992-09-14 | 1994-03-31 | Fodstad Oystein | Detection of specific target cells in specialized or mixed cell population and solutions containing mixed cell populations |
FR2695939B1 (fr) * | 1992-09-24 | 1995-03-03 | Prolabo Sa | Cellules transformées, humaines, animales ou végétales encapsulant dans leurs cytoplasmes au moins une particule de latex. |
NO180658C (no) | 1994-03-10 | 1997-05-21 | Oeystein Fodstad | Fremgangsmåte og anordning for deteksjon av spesifikke målceller i spesialiserte eller blandede cellepopulasjoner og opplösninger som inneholder blandede cellepopulasjoner |
US5658745A (en) * | 1995-02-17 | 1997-08-19 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Cell enumeration immunoassay |
US5882933A (en) * | 1995-06-08 | 1999-03-16 | Coulter International Corp. | Method for determination of leukocytes and hemoglobin concentration in blood |
NO308755B1 (no) * | 1996-12-20 | 2000-10-23 | Iystein Fodstad | FremgangsmÕte til karakterisering av unormale celler, anvendelse og sett for utførelse av fremgangsmÕten |
DE19742227A1 (de) * | 1997-09-25 | 1999-04-01 | Juergen Prof Dipl Phys Wolfrum | Verfahren zum Sequenzieren eines einzelnen DNA-Moleküls |
DE19824419A1 (de) * | 1998-05-30 | 1999-12-02 | Hp Chemie Research And Dev Ltd | Programmierung der räumlichen Schneidkoordinaten von Wasserstrahlschneidvorrichtungen |
DE10157032A1 (de) * | 2001-11-21 | 2003-06-12 | Evotec Ag | Verfahren und Vorrichtung zum Sortieren von Partikeln |
DE102010043276A1 (de) * | 2010-11-03 | 2012-05-03 | Siemens Aktiengesellschaft | Magnetische Zelldetektion |
DE102011054659A1 (de) * | 2011-10-20 | 2013-04-25 | AeroMegt GmbH | Verfahren und Vorrichtung zum Messen von Aerosolen in einem großen Volumenstrom |
WO2014104019A1 (ja) * | 2012-12-26 | 2014-07-03 | デンカ生研株式会社 | 尿中ポドサイトの検出方法 |
Family Cites Families (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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1987
- 1987-04-11 JP JP62089153A patent/JPH07104349B2/ja not_active Expired - Lifetime
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1988
- 1988-04-06 DE DE19883811566 patent/DE3811566A1/de not_active Withdrawn
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JPS63255660A (ja) | 1988-10-21 |
DE3811566A1 (de) | 1988-10-27 |
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